Гуманізоване антитіло до cxcr4 для лікування раку

Реферат: UA 106529 C2 (12) UA 106529 C2 Винахід належить до гуманізованого антитіла, його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, які здатні зв'язуватися з CXCR4, а також індукувати конформаційні зміни гомодимерів та/або гетеродимерів CXCR4, до їх застосування для лікування раку, до фармацевтичної композиції, що містить таке антитіло, і процесу вибору такого антитіла. UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується нового антитіла, зокрема, гуманізованого моноклонального антитіла, здатного специфічно зв'язуватися з рецепторами хемокінів (CXCR), а також аміно- і нуклеїновокислотної послідовностей, що кодують таке антитіло. В одному аспекті винахід стосується нового антитіла, похідних сполук чи функціональних фрагментів, здатних специфічно зв'язуватися з CXCR4, які виявляють сильну протипухлинну активність. Винахід також стосується застосування такого антитіла як лікарського засобу для профілактичного та/або терапевтичного лікування раку, а також у процедурах або наборах, пов'язаних з діагностикою раку. Нарешті, винахід стосується композицій, що містять таке антитіло в комбінації або в кон'югації з іншою протираковою сполукою (сполуками), такою як антитіла, токсини, цитотоксичні/цитостатичні агенти, та їх застосування для профілактики та/або лікування деяких видів раку. Хемокіни є невеликими секретованими пептидами, які контролюють міграцію лейкоцитів по хімічному градієнту ліганду, відомому як хемокіновий градієнт, особливо в імунних реакціях (Zlotnick A. et al., 2000). Вони розділені на дві основні підродини, CC і CXC, залежно від положення їх NH2-кінцевих залишків цистеїну, і зв'язуються з рецепторами, спряженими з Gбілком, дві основні підродини яких позначаються як CCR і CXCR. Досі було виявлено більш 50 людських хемокінів та 18 хемокінових рецепторів. Багато раків мають складну хемокінову мережу, яка впливає на імунно-клітинну інфільтрацію пухлини, а також на ріст, виживання, міграцію пухлинних клітин та ангіогенез. Імунні клітини, ендотеліальні клітини і пухлинні клітини самі експресують хемокінові рецептори і можуть реагувати на хемокінові градієнти. Дослідження зразків біопсії людського раку і мишачих моделей раку показали, що експресія хемокінових рецепторів раковими клітками пов'язана зі збільшенням метастатичного потенціалу. Злоякісні клітини від різних типів раку мають різні профілі експресії хемокінових рецепторів, але найпоширенішим є хемокіновий рецептор-4 (CXCR4). Клітини щонайменше 23 різних типів людських раків епітеліального, мезенхімального і гемопоетичного походження експресують CXCR4-рецептор (Balkwill F. et al., 2004). Хемокіновий рецептор-4 (також відомий як фузин, CD184, LESTR або HUMSTR) існує у вигляді двох ізоформ, що містять 352 або 360 амінокислот. Залишок Asn11 глікозилований, залишок Tyr21 модифікований шляхом додаванням сульфатної групи, а Cys109 і Cys186 зв'язані дисульфідним містком на позаклітинній частині рецептора (Juarez J. et al., 2004). Цей рецептор експресується різними видами нормальних тканин, наївними T-клітинами (не T-клітинами пам'яті), регуляторними Т-клітинами, В-клітинами, нейтрофілами, ендотеліальними клітинами, первинними моноцитами, дендритними клітинами, натуральними кілерами, CD34+ гемопоетичними стовбуровими клітинами і на низькому рівні у серці, кишечнику, печінці, нирках і головному мозку. CXCR4 відіграє ключову роль у переміщенні лейкоцитів, B-клітинному лімфопоезі і мієлопоезі. CXCR4-рецептор є надекспресованим у великій кількості раків, включаючи, без обмеження ними, рак товстої кишки (Ottaiano A. et al., 2004), молочної залози (Kato M. et al., 2003), передміхурової залози (Sun Y.X. et al., 2003), легенів [дрібноклітинна і недрібноклітинна карцинома (Phillips R.J. et al., 2003)], яєчника (Scotton C.J. et al., 2002), підшлункової залози (Koshiba T. et al., 2000), нирок, головного мозку (Barbero S et al., 2002), гліобластому і лімфоми. Унікальним лігандом рецептора CXCR4, описаним досі, є фактор стромальних клітин-1 (SDF-1) або CXCL12. SDF-1 секретується у великій кількості в лімфатичних вузлах, кістковому мозку, печінці, легенях, і меншою мірою в нирках, головному мозку і шкірі. CXCR4 також розпізнається антагоністичним хемокіном, вірусним макрофагальним запальним білком II (vmipii), який кодується людським вірусом герпесу III типу. Вісь CXCR4/SDF-1 відіграє ключову роль у раку і безпосередньо бере участь у міграції, інвазії, що веде до метастазування. Дійсно, ракові клітини експресують CXCR4-рецептор, вони мігрують і входять у системний кровотік. Потім ракові клітини затримуються у судинному руслі в органах, які продукують високі рівні SDF-1, де вони проліферують, індукують ангіогенез і формують метастатичні пухлини (Murphy PM., 2001). Ця вісь також бере участь у проліферації клітин через активацію шляху позаклітинної сигнал-регульованої кінази (ERK) (Barbero S. et al., 2003) і ангіогенезі (Romagnani P., 2004). Дійсно, CXCR4-рецептор і його ліганд SDF-1 чітко підсилює ангіогенез шляхом стимуляції експресії VEGF-А, який, у свою чергу, збільшує експресію CXCR4/SDF-1 (Bachelder R.E. et al., 2002). Відомо також, що пухлина-асоційовані макрофаги (TAM) накопичуються в гіпоксичних областях пухлин і стимулюються до взаємодії з пухлинними клітинами і підсилюють ангіогенез. Було відзначено, що гіпоксія селективно підвищує експресію CXCR4 у різних типах клітин, включаючи TAM (Mantovani A. et al., 2004). Недавно було показано, що вісь CXCR4/SDF-1 регулює переміщення/хомінг CXCR4+ гемопоетичних стовбурових клітин/клітин-попередників (HSC) і може відігравати роль у 1 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 неоваскуляризації. Дані свідчать про те, що, крім HSC, функціональний CXCR4 також експресується на стовбурових клітинах з інших тканин (ранніх тканинних стовбурових клітинах = TCSC), так що SDF-1 може відігравати ключову роль у хемотаксисі CXCR4+TCSC, необхідного для регенерації органа/тканини, але ці TCSC можуть також бути клітинним джерелом розвитку раку (теорія ракових стовбурових клітин). Походження раку зі стовбурових клітин було продемонстровано для людської лейкемії і недавно для декількох солідних пухлин, таких як пухлини головного мозку і молочної залози. Є кілька прикладів CXCR4+ пухлин, які можуть походити з нормальних CXCR4+ тканино-/органоспецифічних стовбурових клітин, наприклад лейкемії, пухлини головного мозку, дрібноклітинний рак легенів, рак молочної залози, гепатобластома, рак яєчників і шийки матки (Kucia M. et al., 2005). Вплив на метастази раку шляхом впливу на рецептор CXCR4 було продемонстровано in vivo за допомогою моноклонального антитіла, спрямованого проти рецептора CXCR4 (Muller A. et al., 2001). Стисло, було показано, що моноклональне антитіло, спрямоване проти CXCR4рецептора (Mab (МКА) 173, R&D Systems), значно зменшує кількість метастазів у лімфатичних вузлах на моделі ортотопічного раку молочної залози (MDA-MB231) у мишей SCID. Інше дослідження (Phillips R.J. et al., 2003) також показало важливу роль осі SDF-1/CXCR4 у метастазуванні на моделі ортотопічної карциноми легенів (A549) за допомогою поліклональних антитіл проти SDF-1, але в даному дослідженні не було впливу ані на ріст пухлини, ані на ангіогенез. Ряд інших досліджень також описує інгібування або метастазів in vivo за допомогою кіРНК-дуплексів CXCR4 (Liang Z. et al., 2005), біостійких антагоністів пептиду CXCR4 (Tamamura H. et al., 2003), або пухлинного росту in vivo з використанням низькомолекулярного антагоніста CXCR4, такого як AMD 3100 (Rubin J.B. et al., 2003; De Falco V. et al., 2007), чи МКА (патент WO2004/059285 A2). Отже, CXCR4 є затвержденою терапевтичною мішенню при раках. Хемокіновий рецептор-2 (CXCR2), інший хемокіновий рецептор, також описується як цікава мішень в онкології. Дійсно, CXCR2 передає аутокринний клітинний ростовий сигнал у декількох типах пухлинних клітин і також може впливати на ріст пухлини непрямим шляхом за рахунок посилення ангіогенезу (Tanaka T. et al. 2005). Хемокіновий рецептор CXCR2 включає 360 амінокислот. Він експресується головним чином в ендотеліальних клітинах і специфічно під час неоваскуляризації. CXCR2-рецептор зв'язують декілька хемокінів: CXCL5, -6, -7, IL-8, GRO-α, -β і -γ, які належать до ERL+ проангіогенних хемокінів. CXCR2-рецептор частково має гомологічну послідовність із CXCR4-рецептором: 37 % ідентичної послідовності і 48 % гомологічної послідовності. Вісь CXCR2/ліганди залучена у декількох механізмах пухлинного росту, таких як метастазування (Singh RK. et al., 1994), клітинна проліферація (Owen J.D. et al., 1997) і ERL+ хемокін-опосередкований ангіогенез (Strieter R.M. et al., 2004; Romagnani et al., 2004). Нарешті, пухлина-асоційовані макрофаги і нейтрофіли є ключовими елементами індукованого запаленням пухлинного росту, і хемокіни, такі як CXCL5, IL-8 та GRO-α, ініціюють залучення нейтрофілів. Димеризація з'явилася як загальний механізм регуляції функції рецепторів, пов'язаних з Gбілком, до яких належать хемокінові рецептори (Wang J. and Norcross M., 2008). Було показано, що гомо- і гетеродимеризація у відповідь на зв'язування хемокіном необхідна для ініціювання і зміни передачі сигналу від великої кількості хемокінових рецепторів. Дедалі більше фактів підтримує концепцію, що рецепторні димери або олігомери, імовірно, є основною функціональною одиницею хемокінових рецепторів. Димери хемокінових рецепторів присутні під час відсутності лігандів, а хемокіни індукують конформаційні зміни рецепторних димерів. CXCR4, як відомо, формує гомодимери, а також гетеродимери, наприклад, з δ-опіоїдним рецептором (DOR) (Hereld D., 2008) або CCR2 (Percherancier Y. et al., 2005). В останньому прикладі пептиди, отримані із трансмембранних доменів CXCR4, інгібували активацію шляхом блокування ліганд-індукованих конформаційних переходів димеру (Percherancier Y. et al., 2005). Інше дослідження показало, що пептид CXCR4-ТМ4, синтетичний пептид трансмембранної ділянки CXCR4, зменшує перенесення енергії між протомерами гомодимерів CXCR4 та інгібує SDF-1-індуковану міграцію і полімеризацію актину у злоякісних клітинах (Wang J. et al., 2006). Зовсім недавно також було описано, що CXCR7 формує функціональні гетеродимери з CXCR4 і підсилює SDF-1-індуковану передачу сигналу (Sierro F. et al., 2007). Інші приклади конститутивних гетеродимерів включають дослідження, що показують взаємодію CXCR1 і CXCR2, а також формування відповідних гомодимерів. Для кожного з них була відзначена відсутність взаємодій з іншим GPCR (альфа(1А)-адренорецептором), що вказує на специфічність взаємодії CXCR1 і CXCR2 (Wilson S. et al., 2005). Як згадувалося раніше, рецептори CXCR4 і CXCR2 є цікавими пухлинними мішенями. Вплив на ці рецептори повинен дуже ефективно інгібувати пухлинний ріст і метастазування шляхом зменшення проліферації пухлинних клітин, ангіогенезу, міграції та інвазії пухлинних клітин, 2 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 залучення нейтрофілів і макрофагів у пухлину і шляхом інгібування CXCR4-ракових стовбурових клітин. Одним із запропонованих аспектів даного винаходу є створення гуманізованого моноклонального антитіла, індукуючого конформаційні зміни CXCR4-димерів. Винахід охоплює CXCR4-МКА hz515H7 (або його фрагменти), здатне зв'язувати та індукувати конформаційні зміни як гомодимерів CXCR4, так і гетеродимерів CXCR4/CXCR2, яке має високу протипухлинну активність. Hz515H7 індукує конформаційні зміни як гомодимерів CXCR4, так і гетеродимерів CXCR4/CXCR2. Ця нова властивість повинна становити інтерес для застосування в терапії раку з урахуванням важливої ролі цих двох хемокінових рецепторів при раку. Вже виявлено, що вплив як гомо-, так і гетеродимерів рецепторів підсилює терапевтичний ефект МКА. Дійсно, було продемонстровано, наприклад, що МКА (h7C10), яке впливає на обидва гібридні рецептори IGF-1R та інсулін/IGF-1, більш потужно інгібує пухлинний ріст in vivo, ніж МКА, що впливає винятково на IGF-1R (Pandini G., 2007). Крім того, анти-CXCR4-МКА hz515H7 є мовчазним антагоністом для CXCR4, воно не змінює базальний сигнал в аналізах in vitro, але інгібує SDF-1-індуковану передачу сигналу в різних 2+ аналізах (GTPγS-зв'язування, вивільнення Ca ), а також здатне інгібувати SDF-1-індуковану міграцію пухлинних клітин in vitro. Молекули, що діють як часткові агоністи або як зворотні агоністи, демонструють внутрішню активність за відсутності лігандів. Ці типи молекул стабілізують, відповідно, високоафінний або низькоафінний стан GPCR, навіть за відсутності ліганду, тим самим активуючи або інгібуючи низхідні сигнальні каскади (Galandin et al., 2007; Kenakin, 2004). У випадку МКА hz515H7 воно поводиться як мовчазний антагоніст без жодної внутрішньої активності щодо CXCR4-рецептора за відсутності SDF-1. Ця фармакологічна риса може бути пов'язана з менш несприятливими побічними ефектами у порівнянні із частковими або зворотними агоністами, як ми вже відзначали для лігандів опіоїдних рецепторів (Bosier and Hermans, 2007). Дійсно, функціональна активність МКА hz515H7 повністю залежить від наявності SDF-1, і відсутність модуляції активності рецептора CXCR4 буде спостерігатися в тканинах і органах, у яких ліганд SDF-1 не експресується, не секретується або не доставляється кровотоком. Таким чином, МКА hz515H7, імовірно, буде менш токсичним у порівнянні з іншими лігандами рецептора CXCR4 з позитивною або негативною ефективністю. Крім того мовчазні антагоністи складають меншу частину видів у фармакологічній області (Wurch et al., 1999, Kenakin, 2004). Дивно, але винахідникам вдалося уперше створити гуманізоване антитіло, яке здатне зв'язуватися з CXCR4, але також здатне викликати конформаційні зміни гомодимерів та/або гетеродимерів CXCR4. Зокрема, антитіло за винаходом здатне викликати конформаційні зміни гомодимерів CXCR4, а також гетеродимерів CXCR4/CXCR2. У наступній заявці вираз у множині "димери CXCR4" слід розуміти як такий, що охоплює гомодимери CXCR4, а також гетеродимери CXCR4/CXCR2. На даному етапі слід зазначити, що такі гуманізовані антитіла ніколи не були описані у відомому рівні техніки. Крім того, необхідно відзначити, що існування гетеродимерів CXCR4/CXCR2 ніколи не було описано. Частиною винаходу є відкриття існування гетеродимеру, утвореного CXCR4 і CXCR2. Так, в окремому аспекті даний винахід стосується виділеного комплексу, що включає або складається з гетеродимеру CXCR4/CXCR2. Сполука CXCR4-частини зазначеного гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2 є однією із двох людських ізоформ CXCR4, вибраних із групи, що складається з: - хемокінового (C-X-C-мотив) рецептора 4 ізоформи b [Homo sapiens], що має послідовність, зазначену під реєстраційним номером Genbank NP_003458 (SEQ ID № 1); - хемокінового (C-X-C-мотив) рецептора 4 ізоформи а [Homo sapiens], що має послідовність, зазначену під реєстраційним номером Genbank NP_001008540 (SEQ ID № 2); - альтернативного транскрипційного варіанта сплайсингу або природного варіанта, що має щонайменше 95 % ідентичність із однією з цих ізоформ b або a з SEQ ID № 1 або 2; і - його фрагмента, який може специфічно розпізнаватися його природним лігандом фактором стромальних клітин-1 (SDF-1) і краще має щонайменше 100, 150 і 200 амінокислот у довжину. Сполука CXCR2-частини зазначеного гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2 вибрана з групи, що складається з: - рецептора бета інтерлейкіну-8 [Homo sapiens], що має послідовність, зазначену під реєстраційним номером Genbank NP_001548 (SEQ ID № 3); - альтернативного транскрипційного варіанта сплайсингу або природного варіанта, що має щонайменше 95 % ідентичність із цим рецептором бета інтерлейкіну-8 з SEQ ID № 3; і 3 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - його фрагмента, який може специфічно розпізнаватися ІЛ-8 і краще має щонайменше 100, 150 і 200 амінокислот у довжину. У даному окремому аспекті даний винахід також включає виділену РНК або ДНК, що кодує поліпептид, який включає зазначений гетеродимерний комплекс CXCR4/CXCR2. Цей винахід також включає нуклеїнову конструкцію, краще, експресійний вектор, наприклад, плазміду, що кодує зазначений гетеродимерний комплекс CXCR4/CXCR2. Винахід також включає композицію, яка включає щонайменше одну нуклеїнову конструкцію, краще, експресійний вектор, наприклад, плазміду, що кодує CXCR4-частину зазначеного гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2, і другу конструкцію, краще, експресійний вектор, наприклад, плазміду, що кодує CXCR2-частину зазначеного гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2. У цьому аспекті винахід також розкриває спосіб одержання рекомбінантної клітини-хазяїна, що експресує зазначений гетеродимерний комплекс CXCR4/CXCR2, де цей спосіб включає етап трансформації зазначеної клітини-хазяїна: а) нуклеїновою конструкцією, краще, експресійним вектором, наприклад, плазмідою, що кодує зазначений гетеродимерний комплекс CXCR4/CXCR2; або б) щонайменше однією нуклеїновою конструкцією, краще, експресійним вектором, наприклад, плазмідою, що кодує CXCR4-частину зазначеного гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2, і другою конструкцією, краще, експресійним вектором, наприклад, плазмідою, що кодує CXCR2-частину зазначеного гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2. Зазначена клітина-хазяїн є еукаріотичною клітиною, наприклад, клітиною ссавця. Нуклеїнова конструкція (конструкції), що кодує зазначений гетеродимерний комплекс CXCR4/CXCR2, кодує також перший маркер, який зв'язаний (зокрема, за допомогою ковалентного зв'язку) з CXCR4-послідовністю, наприклад, маркер luc (люцефераза), і другий маркер, який зв'язаний (зокрема, за допомогою ковалентного зв'язку) з CXCR2-послідовністю, наприклад, маркер GFP (тобто для аналізу BRET). Винахід також розкриває спосіб вибору сполуки, яка виявляє протиракову активність або яка може бути використана для одержання композиції для лікування раку, який характеризується тим, що включає етап: а) контактування рекомбінантної клітини-хазяїна за даним винаходом, яка експресує зазначений гетеродимерний комплекс CXCR4/CXCR2, з аналізованою сполукою; і б) визначення того, чи здатна ця сполука модулювати, краще, інгібувати, активність цього гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2 у рекомбінантній клітині-хазяїні. У першому аспекті предметом даного винаходу є процес створення і вибору гуманізованих антитіл відповідно до винаходу. У першому аспекті винахід стосується процесу вибору гуманізованого анти-CXCR4-антитіла або одного з його функціональних фрагментів чи похідних, здатних інгібувати як ліганд-залежну, так і ліганд-незалежну активацію CXCR4, при цьому зазначений процес включає такі етапи: i) скринінг створених гуманізованих антитіл і вибір антитіл, здатних специфічно зв'язувати CXCR4, а також модулювати CXCR4-активацію; ii) тестування антитіл, вибраних на етапі i), і вибір антитіл, здатних індукувати конформаційні зміни гомодимерів CXCR4, а потім iii) тестування антитіл, вибраних на етапі ii), і вибір антитіл, здатних індукувати конформаційні зміни гетеродимерів CXCR4/CXCR2. Під виразом "модулювати" слід розуміти посилення або інгібування. Краще, вибрані антитіла за винаходом повинні інгібувати CXCR4-активацію. Як було пояснено раніше, індукція конформаційних змін димерів CXCR4 є основним аспектом винаходу, тому що такі антитіла будуть викликати реальний інтерес у більшої кількості пацієнтів. Створення антитіла може бути реалізоване будь-яким способом, відомим фахівцям у даній області, таким як, наприклад, з рекомбінантних гуманізованих антитіл, розроблених із секвенованих CDR мишачих антитіл, секретованих при злитті мієломної клітини із клітинами селезінки від імунізованих мишей або інших видів, сумісних з вибраними мієломними клітинами [Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]. Імунізовані тварини можуть включати трансгенних мишей з людськими імуноглобуліновими локусами, які потім безпосередньо продукують людські антитіла. Інше можливе втілення могло б полягати в застосуванні методики фагового дисплея для скринінгу бібліотек. Етап скринінгу i) може бути реалізований будь-яким способом або процесом, відомим фахівцям у даній області. Як необмежувальні приклади можна згадати ІФА, BIAcore, імуногістохімію, FACS-аналіз і функціональні скринінги. Кращий спосіб полягає в скринінгу за 4 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою FACS-аналізу на CXCR4-трансфектантах і щонайменше на пухлинній клітинній лінії, щоб переконатися, що продуковані антитіла також здатні розпізнавати нативний рецептор на пухлинних клітинах. Цей процес буде описаний більш точно в наведених далі прикладах. Під виразом "модулювати CXCR4-активацію" розуміється модуляція щонайменше однієї з активностей, зазначених нижче в прикладах 4, 5, 7 та 11 для мишачого антитіла, 16, 17 та 19 для химерного антитіла, і 27, 24 та 28 для гуманізованого антитіла: Кращими для модуляції є: - специфічне зв'язування на клітинних мембранах ліганду SDF-1 рецептором CXCR4 (див. приклади 4, 16, 27), зокрема, шляхом конкурування на мембрані трансформованих еукаріотичних клітин, таких як мембрани СНО-K1, стабільно експресуючих людський рецептор CXCR4 дикого типу; - специфічне зв'язування на клітинних мембран GTPγS рецептором CXCR4 (див. приклади 5, 17, 24), зокрема, на мембрані трансформованих еукаріотичних клітин, наприклад, клітин NIH3T3, стабільно і конститутивно експресуючих рецептор CXCR4 дикого типу; - CXCR4-опосередковане інгібування продукції цАМФ (див. приклад 7); і - CXCR рецептор-опосередкована мобілізація внутрішньоклітинних депо кальцію (див. приклади 11, 19, 28). Ще краще, ця модуляція щонайменше одного з цих видів активності є інгібуванням активності. У кращому втіленні етапів вибору ii) та iii) процесу за винаходом зазначені етапи ii) та iii) полягають в оцінці антитіл за допомогою BRET-аналізу на клітинах, експресуючих CXCR4Rluc/CXCR4-YFP і CXCR4-rluc/CXCR2-YFP, відповідно, і у виборі антитіл, здатних інгібувати щонайменше 40 %, краще, 45 %, 50 %, 55 % і найкраще 60 % BRET-сигналу. Методика BRET є методикою, що відома як репрезентативна для білкової димеризації [Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89]. Методика BRET, використовувана в етапах процесу ii) та iii), добре відома фахівцям у даній області і буде докладно описана в наступних прикладах. Більш конкретно, BRET (bioluminescence resonance energy transfer, резонансне перенесення енергії біолюмінесценції) є нерадіаційним перенесенням енергії, що виникає між біолюмінесцентним донором (люциферазою Renilla (Rluc)) і флуоресцентним акцептором, мутантом GFP (green fluorescent protein, зелений флуоресцентний білок) або YFP (yellow fluorescent protein, жовтий флуоресцентний білок). У даному випадку був використаний EYFP (enhanced yellow fluorescent protein, посилений жовтий флуоресцентний білок). Ефективність перенесення залежить від орієнтації та відстані між донором і акцептором. Крім того, передача енергії може відбуватися тільки тоді, коли дві молекули перебувають у безпосередній близькості (1-10 нм). Ця властивість використовується для проведення аналізу білково-білкових взаємодій. Дійсно, з метою вивчення взаємодії між двома учасниками перший з них генетично зливають з люциферазою Renilla, а другий з жовтим мутантом GFP. Гібридні білки, як правило, але не обов'язково, експресуються клітинами ссавців. У присутності свого мембранно-проникного субстрату (коелентеразину) Rluc випромінює синє світло. Якщо мутант GFP перебуває ближче 10 нм до Rluc, то може виникнути передача енергії, і буде виявлений додатковий жовтий сигнал. Сигнал BRET вимірюється як співвідношення між світлом, випромінюваним акцептором, і світлом, випромінюваним донором. Таким чином, BRET-сигнал буде збільшуватися в міру зближення двох гібридних білків, або якщо конформаційна зміна зблизить Rluc і GFP-мутант. Якщо BRET-аналіз включений у краще втілення, то для виміру конформаційних змін димерів CXCR4 можна використовувати будь-який спосіб, відомий фахівцям у даній області. Не обмежуючись, можна відзначити такі методики: FRET (fluorescence resonance energy transfer, резонансне перенесення енергії флуоресценції), HTRF (homogenous time resolved fluorescence, гомогенна флуоресценція з часовим розрізненням), FLIM (fluoroscence lifetime imaging microscopy, флуоресцентна мікроскопія із зображенням за часом життя флуоресценції) або SWFCCS (single wavelength fluoroscence cross-correlation spectroscopy, крос-кореляційна спектроскопія флуоресценції однієї довжини хвилі). Також можуть бути використані інші класичні методики, наприклад, коімунопреципітація, Alpha Screen, хімічне зшивання, подвійний гібрид, афінна хроматографія, ІФА і фар-вестернблотинг. У окремому аспекті процесу відповідно до винаходу етап ii) полягає в оцінці антитіл за допомогою BRET-аналізу на клітинах, експресуючих обидва CXCR4-Rluc/CXCR4-YFP, і у виборі антитіл, здатних інгібувати щонайменше 40 % BRET-сигналу. В іншому окремому аспекті процесу відповідно до винаходу етап iii) полягає в оцінці антитіл за допомогою BRET-аналізу на клітинах, експресуючих обидва CXCR4-Rluc/CXCR2-YFP, і у 5 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виборі антитіл, здатних інгібувати щонайменше 40 % BRET-сигналу. У другому аспекті, предметом винаходу є виділене гуманізоване антитіло або один з його функціональних фрагментів чи похідних, одержуваних зазначеним способом. Зазначене гуманізоване антитіло або один з його зазначених фрагментів чи похідних здатні специфічно зв'язуватися з людським CXCR4 і, більше того, при необхідності, краще, здатні інгібувати природне приєднання його ліганду; також зазначене гуманізоване антитіло здатне індукувати конформаційні зміни димерів CXCR4. Вираз "функціональні фрагменти і похідні" докладно будуть визначений нижче в даному описі. Тут слід розуміти, що винахід не стосується антитіл у природній формі, тобто вони перебувають не в їхньому природньому середовищі, але що вони можуть бути виділені чи отримані шляхом очищення із природних джерел, або отримані шляхом генетичної рекомбінації, або шляхом хімічного синтезу, і що вони можуть містити неприродні амінокислоти, як буде описано нижче. Зокрема, відповідно до іншого аспекту винаходу, описане антитіло або один з його функціональних фрагментів чи похідних, при цьому зазначене гуманізоване антитіло характеризується тим, що воно містить щонайменше одну ділянку, що визначає комплементарність (CDR), визначену відповідно до IMGT, вибрану серед CDR, що містять амінокислотну послідовність SEQ ID №№ 4-9. У відповідності із другим аспектом винахід пов'язаний з виділеним гуманізованим антитілом або його похідним чи функціональним фрагментом, що містять щонайменше один CDR, вибраний поміж CDR з послідовністю SEQ ID №№ 4, 5, 6, 7, 8 чи 9, або щонайменше один CDR, визначений відповідно до IMGT, з послідовністю, яка щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентична після оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 4, 5, 6, 7, 8 чи 9. Під "функціональним фрагментом" антитіла розуміється, зокрема, фрагмент антитіла, такий як фрагменти Fv, scFv (sc позначає одноланцюговий), Fab, F(ab') 2, Fab', scFv-Fc, або димерні антитіла або будь-який фрагмент, з такою ж специфічністю до CXCR4, як у батьківського антитіла, час напівжиття якого був збільшений. Такі функціональні фрагменти будуть докладно описані нижче в даному описі. Під "похідною сполукою" або "похідним" антитіла розуміється, зокрема, зв'язучий білок, що містить пептидну матрицю і щонайменше один з CDR вихідного антитіла для підтримання здатності розпізнавати CXCR4. Такі похідні сполуки, добре відомі фахівцям у даній області, будуть описані більш докладно в даному описі. В іншому втіленні винаходу, похідна сполука або похідне може містити щонайменше 2, краще, щонайменше 3, ще краще, 4, ще краще, 5 або, найкраще, 6 CDR вихідного антитіла. Ще краще, винахід включає гуманізовані антитіла, їх похідні сполуки або їх функціональні фрагменти відповідно до даного винаходу, отримані шляхом генетичної рекомбінації або хімічного синтезу. Відповідно до кращого втілення гуманізоване антитіло відповідно до винаходу або його похідні сполуки чи функціональні фрагменти характеризуються тим, що вони складаються з моноклональних антитіл. Під "моноклональним антитілом" розуміється антитіло, отримане з популяції по суті однорідних антитіл. Більш конкретно, окремі антитіла популяції є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутніми у мінімальних пропорціях. Іншими словами, моноклональне антитіло є однорідним антитілом, отриманим в результаті росту окремого клону клітин (наприклад, гібридоми, еукаріотичної клітини-хазяїна, трансфекованої молекулою ДНК, що кодує однорідне антитіло, прокаріотичної клітини-хазяїна, трансфекованоїмолекулою ДНК, що кодує однорідне антитіло і т.д.), і в цілому характеризується важкими ланцюгами одного і тільки одного класу та підкласу і легкими ланцюгами тільки одного типу. Моноклональні антитіла є високоспецифічними і спрямовані проти одного антигену. Крім того, на відміну від одержання поліклональних антитіл, які звичайно включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант, або епітопів, кожне моноклональне антитіло спрямоване проти одного епітопа антигену. Тут слід розуміти, що винахід не стосується гуманізованих антитіл у природній формі, тобто вони взяті не з їхнього природного середовища, але що вони виділені чи отримані шляхом очищення із природних джерел, або отримані шляхом генетичної рекомбінації, або шляхом хімічного синтезу, і, таким чином, вони можуть містити неприродні амінокислоти, як буде описано нижче. Зокрема, відповідно до кращого втілення винаходу гуманізоване антитіло або його похідні 6 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сполуки чи функціональні фрагменти характеризуються тим, що вони містять важкий ланцюг, який містить щонайменше один CDR, вибраний поміж CDR з амінокислотними послідовностями SEQ ID №№ 4, 5 чи 6, або щонайменше один CDR послідовності, яка щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентична після оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 4, 5 чи 6; або вони містять легкий ланцюг, що містить щонайменше один CDR, вибраний поміж CDR амінокислотних послідовностей SEQ ID №№ 7, 8 чи 9, або щонайменше один CDR послідовності, яка щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентична після оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 7, 8 чи 9. Краще, гуманізовані антитіла за винаходом або одна з їх похідних сполук чи функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони містять важкий ланцюг, який містить такі три CDR, відповідно, CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, де: - CDR-H1 містить послідовність SEQ ID № 4 або послідовність, щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 %, ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 4; - CDR-H2 містить послідовність SEQ ID № 5 або послідовність, щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 %, ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 5; і - CDR-H3 містить послідовність SEQ ID № 6 або послідовність, щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 %, ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 6. Відповідно до окремого втілення, антитіла або одна з їх похідних сполук чи функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони містять важкий ланцюг, що містить CDR-H1 з послідовністю SEQ ID № 4, CDR-H2 з послідовністю SEQ ID № 5 і CDR-H3 з послідовністю SEQ ID № 6. Ще краще, антитіла за винаходом або одна з їх похідних сполук чи функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони містять легкий ланцюг, який містить такі три CDR, відповідно, CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, де: - CDR-L1 містить послідовність SEQ ID № 7 або послідовність, щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 %, ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 7; - CDR-L2 містить послідовність SEQ ID № 8 або послідовність, щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 %, ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 8, і - CDR-L3 містить послідовність SEQ ID № 9 або послідовність, щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 %, ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 9. Відповідно до окремого втілення, антитіла або одна з їх похідних сполук чи функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони містять легкий ланцюг, що містить CDR-L1 з послідовністю SEQ ID № 7, CDR-L2 з послідовністю SEQ ID № 8 і CDR-L3 з послідовністю SEQ ID № 9. У даному описі терміни "поліпептиди", "поліпептидні послідовності", "пептиди" і "білки", застосовувані до сполук антитіл або їх послідовностей, є взаємозамінними. Тут слід розуміти, що винахід не стосується антитіл у природній формі, тобто вони взяті не з їхнього природного середовища, але виділені або отримані шляхом очищення із природних джерел, або отримані шляхом генетичної рекомбінації, або шляхом хімічного синтезу, і, таким чином, вони можуть містити неприродні амінокислоти, як буде описано нижче. Унікальна нумерація IMGT була створена для порівняння варіабельних доменів незалежно від антигенного рецептора, типу ланцюга або виду [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. В унікальній нумерації IMGT консервативні амінокислоти завжди займають ту саму позицію, наприклад, цистеїн 23 (1-CYS), триптофан 41 (CONSERVED-TRP), гідрофобна амінокислота 89, цистеїн 104 (2-CYS), фенілаланін або триптофан 118 (J-PHE або J-TRP). Унікальна нумерація IMGT передбачає стандартизоване розмежування каркасних ділянок (FR1IMGT: позиції 1-26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 і FR4-IMGT: 118-128) і ділянок, що визначають комплементарність: CDR1-IMGT: 27-38, CDR2-IMGT: 56-65 і CDR3-IMGT: 105-117. Оскільки розриви є незайнятими позиціями, то довжини CDR-IMGT (показані в дужках і розділені крапками, наприклад, [8.8.13]) стають важливою інформацією. Унікальна нумерація IMGT використовується в 2D-графічних зображеннях, позначених як IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current 7 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], і в 3D-структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]. Існує три CDR важкого ланцюга і три CDR легкого ланцюга. Термін "CDR" в однині чи множині використовується тут для позначення, залежно від випадку, однієї з цих ділянок або декількох, або навіть усіх цих ділянок, які містять більшість амінокислотних залишків, відповідальних за афінне зв'язування антитіла з антигеном або епітопом, який вона розпізнає. У контексті даного винаходу, "відсоток ідентичності" двох нуклеїновокислотних або амінокислотних послідовностей позначає відсоток ідентичних нуклеотидів або амінокислотних залишків у двох порівнюваних послідовностях, отриманий після оптимального вирівнювання; цей відсоток не є чисто статистичним, і відмінності між двома послідовностями розподіляються випадково по усій їх довжині. Порівняння двох нуклеїновокислотних або амінокислотних послідовностей традиційно проводиться шляхом порівняння цих послідовностей після їх оптимального вирівнювання; зазначене порівняння може здійснюватися по сегментах або за допомогою "вікна вирівнювання". Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути здійснене, на додаток до ручного, за допомогою алгоритму локальної гомології Сміта-Уотермана (1981) [Ad. App. Math. 2:482], за допомогою алгоритму локальної гомології Нідлмана-Вунша (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], за допомогою способу пошуку подібності Пірсона і Ліпмана (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], або за допомогою комп'ютерного програмного забезпечення з використанням цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA і TFASTA у пакеті програмного забезпечення Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, або за допомогою програмного забезпечення для порівняння BLAST NR або BLAST P). Відсоток ідентичності двох нуклеїновокислотних або амінокислотних послідовностей визначають шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей, при цьому порівнювана нуклеїновокислотна або амінокислотна послідовність може включати додавання або делеції в порівнянні з референсною послідовністю для оптимального вирівнювання цих двох послідовностей. Відсоток ідентичності розраховується шляхом визначення числа позицій, у яких нуклеотид або амінокислотний залишок ідентичний у двох послідовностях, краще, у двох повних послідовностях, ділення цієї кількості ідентичних позицій на загальну кількість позицій у вікні вирівнювання і множення отриманого результату на 100, щоб одержати відсоток ідентичності цих двох послідовностей. Наприклад, програма BLAST "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250), доступна на сайті http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, може бути використана з параметрами за замовчуванням (зокрема, з параметрами "штраф за відкриття делеції": 5 і "штраф за подовження делеції": 2; вибраною матрицею буде, наприклад, матриця "BLOSUM 62", запропонована в програмі); відсоток ідентичності двох порівнюваних послідовностей розраховується безпосередньо в програмі. Серед амінокислотних послідовностей, що мають щонайменше 80 %, краще, 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичності з референсною амінокислотною послідовністю, кращими прикладами є ті, що містять референсну послідовність, певні модифікації, зокрема делецію, додавання або заміну щонайменше однієї амінокислоти, усікання або подовження. У випадку заміни однієї або більш ніж однієї послідовної або непослідовної амінокислоти кращими є такі заміни, у яких замінені амінокислоти є заміненими на "еквівалентні" амінокислотами. Вираз "еквівалентні амінокислоти" використовується тут для позначення будь-яких амінокислот, які можуть бути замінені однією зі структурних амінокислот, але без значної модифікації біологічних активностей відповідних антитіл і таких специфічних прикладів, які будуть визначені пізніше. Еквівалентні амінокислоти можуть бути визначені або на підставі їх структурної гомології з амінокислотами, які вони заміняють, або за результатами порівняльних досліджень біологічної активності різних антитіл, на яку вони здатні. Як необмежувальний приклад, наведена нижче таблиця 1 показує заміни, можливі без одержання значної модифікації біологічної активності відповідного модифікованого антитіла; зворотні заміни, зрозуміло, також можливі в тих саме умовах. Таблиця 1 Вихідний залишок Ala (A) Arg (R) Asn (N) Заміна(и) Val, Gly, Pro Lys, His Gln 55 8 UA 106529 C2 Продовження таблиця 1 Вихідний залишок Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Glu (G) Gly (G) His (H) Ile (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) 5 10 15 20 25 30 35 40 Заміна(и) Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu Ile, Val, Met Arg Leu Tyr Ala Thr, Cys Ser Tyr Phe, Trp Leu, Ala Фахівцям у даній області відомо, що на сучасному рівні техніки найбільша варіабельність (довжини і складу) серед шести CDR спостерігається у трьох CDR важкого ланцюга, і, зокрема, у CDR-H3 цього важкого ланцюга. Отже, буде очевидно, що кращими характерними CDR антитіл за винаходом або однієї з їх похідних сполук чи функціональних фрагментів будуть три CDR важкого ланцюга. Інше втілення винаходу розкриває антитіло або його похідні сполуки чи функціональні фрагменти, що містять важкий ланцюг із трьома такими CDR: CDR-H1 з послідовністю SEQ ID № 4 або з послідовністю, щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичною після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 4; CDR-H2 з послідовністю SEQ ID № 5 або з послідовністю, щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичною після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 5; і CDR-H3 з послідовністю SEQ ID № 6 або з послідовністю, щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичною після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 6; і легкий ланцюг із трьома такими CDR: CDR-L1 з послідовністю SEQ ID № 7 або з послідовністю, щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичною після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 7; CDR-L2 з послідовністю SEQ ID № 8 або з послідовністю, щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичною після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 8; і CDR-L3 з послідовністю SEQ ID № 9 або з послідовністю, щонайменше на 80 %, краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичною після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 9. Інший аспект винаходу стосується функціональних фрагментів гуманізованого антитіла, описаного вище. Фахівцю в даній області буде очевидно, що функціональний фрагмент обов'язково є зв'язуючим фрагментом, тобто фрагментом, здатним зв'язуватися з тією самою мішенню, що й батьківське антитіло. Крім того, функціональний фрагмент зберігає функцію батьківського антитіла. Зокрема, функціональний фрагмент за винаходом здатний модулювати активацію CXCR4. Ще краще, функціональний фрагмент відповідно до винаходу здатний інгібувати активацію CXCR4. В одному втіленні, активація CXCR4 є ліганд-залежною; в іншому втіленні зазначена активація CXCR4 є ліганд-незалежною. У кращому втіленні функціональний фрагмент за винаходом зберігає функцію батьківського антитіла, яка полягає в модуляції активності гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2. Краще, зазначені функціональні фрагменти зберігають здатність інгібувати активність гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2. 9 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Більш конкретно, винахід націлений на антитіло або його похідні сполуки чи функціональні фрагменти, які характеризуються тим, що зазначений функціональний фрагмент вибраний поміж фрагментів Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, scFv-Fc або димерних антитіл або будь-яких фрагментів, час напівжиття яких був збільшений, наприклад, пегилованих фрагментів. Такі функціональні фрагменти антитіла відповідно до винаходу складаються, наприклад, з фрагментів Fv, scFv (sc позначає одноланцюговий), Fab, F(ab') 2, Fab', scFv-Fc, або димерних антитіл або будь-яких фрагментів, час напівжиття яких був збільшений у результаті хімічної модифікації, такої як додавання поліалкіленгліколю, такого як поліетиленгліколь (пегилювання) (пегиловані фрагменти називаються Fv-ПЕГ, scFv-ПЕГ, Fab-ПЕГ, F(ab') 2-ПЕГ або Fab'-ПЕГ), або шляхом включення в ліпосому; мікросферу або PLGA (частинки на основі співполімерів молочної і гліколевої кислот), при цьому зазначений фрагмент має щонайменше один характерний CDR гуманізованого антитіла за винаходом, який здатний виявляти загалом активність, хоча б часткову, антитіла, з якого він узятий. Краще, зазначені функціональні фрагменти будуть складатися з або включати часткову послідовність варіабельного важкого або легкого ланцюга антитіла, з якого вони отримані, при цьому зазначена часткова послідовність повинна бути достатньою, щоб зберегти таку ж специфічність зв'язування, як у антитіла, з якого вона отримана, і достатню афінність, краще, рівну щонайменше 1/100, ще краще, щонайменше 1/10 афінності антитіла, з якого вона отримана. Такий функціональний фрагмент буде містити як мінімум 5 амінокислот, краще, 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 або 100 послідовних амінокислот послідовності антитіла, з якого він отриманий. Краще, цими функціональними фрагментами будуть фрагменти типу Fv, scFv, Fab, F(ab') 2, F(ab'), scFv-Fc або димерні антитіла, які в цілому мають таку ж специфічність зв'язування, як і антитіло, з якого вони отримані. Відповідно до даного винаходу, фрагменти антитіла за винаходом можуть бути отримані з антитіл описаними вище способами, такими як розщеплення ферментами, такими як пепсин або папаїн, та/або розщеплення дисульфідних містків шляхом хімічного відновлення. Фрагменти антитіла також можуть бути отримані за допомогою методик генетичної рекомбінації, також відомих фахівцям у даній області, або шляхом пептидного синтезу, наприклад, за допомогою автоматичних пептидних синтезаторів, наприклад, таких, що поставляються компанією Applied Biosystems, і т.д. Більш конкретно, винахід стосується різних варіантів гуманізованого антитіла мишачого МКА 515H7, які називаються в даному описі як i) МКА HZ515H7, Hz515H7 або hz515H7, ii) МКА HZ515H7-2, Hz515H7-2 або hz515H7-2, або iii) будь-яка комбінація легкого ланцюга та/або важкого ланцюга зазначених варіантів антитіл. Для більшої ясності в таблиці 2а нижче представлені різні амінокислотні послідовності, що відповідають CDR гуманізованих варіантів (також називаних формами) hz515H7 і hz515H7-2 за винаходом; у таблиці 2b наведені різні амінокислотні послідовності, що відповідають варіабельним доменам і послідовностям повної довжини різних варіантів гуманізованої форми hz515H7 за винаходом; у таблиці 2c наведені різні амінокислотні послідовності, що відповідають варіабельним доменам і послідовностям повної довжини гуманізованої форми hz515H7-2 за винаходом. Таблиця 2а Антитіло Hz515H7 CDR Важкий ланцюг CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 10 Легкий ланцюг CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 SEQ ID № 4 5 6 7 8 9 UA 106529 C2 Таблиця 2b Антитіло Hz515H7 Варіабельні домени Повні послідовності (без сигнального пептиду) Важкий ланцюг VH1 VH1 D76N VH1 V48L D76N VH2 VH1 VH1 D76N VH1 V48L D76N VH2 Легкий ланцюг VL1 VL1 T59A E61D VL2 VL2.1 VL2.2 VL2.3 VL3 VL1 VL1 T59A E61D VL2 VL2.1 VL2.2 VL2.3 VL3 SEQ ID № 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Таблиця 2c Антитіло Hz515H7 Варіабельні домени Повні послідовності (без сигнального пептиду) 5 10 15 20 Важкий ланцюг «консенсусні» VH1 «консенсусні» VH1 Легкий ланцюг «консенсусні» VL1 «консенсусні» VL1 SEQ ID № 85 86 87 88 89 90 91 92 Як приклад, щоб уникнути сумнівів, вираз "VH1" є подібним виразам "VH Варіант 1", "VH варіант 1", "VH Var 1" або "VH var 1". Одержання "консенсусних" послідовностей описано в прикладі 22. Інший конкретний аспект даного винаходу стосується гуманізованого антитіла або його похідної сполуки чи функціональних фрагментів, які характеризуються тим, що константні ділянки легкого ланцюга і важкого ланцюга, отримані з людського антитіла, є ділянками лямбда або каппа, і гамма-1, гамма-2 або гамма-4, відповідно. Винахід стосується мишачої гібридоми, здатної секретувати моноклональне антитіло, зареєстроване у Французькій колекції культур мікроорганізмів (CNCM, Інститут Пастера, Париж, Франція) 25 червня 2008 р. за номером I-4019. Зазначена гібридома була отримана шляхом злиття спленоцитів імунізованих мишей Balb/c і клітин мієломної лінії Sp 2/O-Ag 14. Мишаче моноклональне антитіло, позначене в даному документі як 515H7, секретується гібридомою, зареєстрованою в CNCM 25 червня 2008 р. за номером I-4019. Винахід також описує химерні антитіла. Химерне антитіло є антитілом, яке містить природну варіабельну ділянку (легкого ланцюга і важкого ланцюга), отриману з антитіла даного виду, у комбінації з константними ділянками легкого ланцюга і важкого ланцюга антитіла виду, гетерологічного зазначеному даному виду. Ці антитіла або їх химерні фрагменти можуть бути отримані за допомогою методик генетичної рекомбінації. Наприклад, химерне антитіло може бути отримане шляхом клонування рекомбінантної ДНК, яка містить промотор і послідовність, що кодує варіабельну ділянку 11 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нелюдського, моноклонального антитіла відповідно до винаходу, особливо мишачого, і послідовність, що кодує константну ділянку людського антитіла. Химерне антитіло відповідно до винаходу, закодоване таким рекомбінантним геном, буде, наприклад, химерою миші і людини, при цьому специфічність цього антитіла буде визначатися варіабельною ділянкою, отриманою з мишачої ДНК, а його изотип буде визначатися константною ділянкою, отриманою з людської ДНК. Способи одержання химерних антитіл описані, наприклад, у Verhoeyn et al. (Bioessays, 8:74, 1988). В іншому втіленні винахід стосується важкого ланцюга химерного антитіла (називаного c515H7 VH), що містить варіабельну ділянку з послідовністю SEQ ID № 83. В іншому втіленні винахід стосується легкого ланцюга химерного антитіла (називаного c515H7 VL), що містить варіабельну ділянку з послідовністю SEQ ID № 84. В окремому кращому втіленні химерне антитіло або його похідна сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить послідовність важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID № 83, і послідовність легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID № 84. Термін "гуманізоване антитіло", використовуваний у даному документі, стосується антитіла, яке містить щонайменше один важкий ланцюг і один легкий ланцюг, при цьому зазначені важкий і легкий ланцюги містять CDR-ділянки, отримані з антитіла нелюдського походження, а інші частини молекули антитіла отримані з одного (або декількох) людських антитіл. Під виразом "гуманізоване антитіло" даний винахід також має на увазі антитіла тільки з одним гуманізованим ланцюгом, і другии химерним або мишачим ланцюгом. Краще, "гуманізоване антитіло" за винаходом складається із двох гуманізованих ланцюгів, тобто і важкий ланцюг, і легкий ланцюг є гуманізованими. Гуманізовані антитіла за винаходом або їх фрагменти можуть бути отримані за допомогою методик, відомих фахівцям у даній області (наприклад, таких, які описані в документах Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; і Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Такі гуманізовані антитіла є кращими для їх застосування в способах, використовуваних у діагностиці in vitro або профілактиці та/або терапевтичному лікуванні in vivo. Іншою методикою гуманізації, також відомою фахівцям у даній області, є, наприклад, методика "CDR-щеплення", описана PDL у патентах EP 0451261, EP 0682040, EP 0939127, EP 0566647 або US 5530101, US 6180370, US 5585089 і US 5693761. Також можна відзначити патенти США 5639641 або 6054297, 5886152 і 5877293. Винахід стосується гуманізованих антитіл, отриманих з мишачого антитіла 515H7, описаного вище. У кращому виді константні ділянки легких ланцюгів і важких ланцюгів, отримані з людського антитіла, є, відповідно, ділянками лямбда або каппа і гамма-1, гамма-2 або гамма-4. Більш конкретно, винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла, що містить i) каркасну ділянку, гомологічну відповідній каркасній ділянці важкого ланцюга людського антитіла, і ii) CDR, гомологічні відповідним CDR антитіла, отриманого з різних видів ссавців, де зазначені CDR включають CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, що містять відповідно послідовності SEQ ID №№ 4, 5 і 6. Інакше кажучи, винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла, який містить CDR, що складаються з CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, при цьому зазначені CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3 відповідно містять послідовності SEQ ID №№ 4, 5 і 6. Фахівцю в даній області буде очевидно, що різні зародкові лінії можуть бути вибрані для гуманізації антитіла 515H7, даючи потім різні форми гуманізованого 515H7. Зокрема, у кращому необмежувальному втіленні різні зародкові лінії можуть бути використані для кодування послідовності v-генів, у той час як ті ж самі зародкові лінії будуть зберігати j-гени. Для даного винаходу, зародкові лінії, які можуть бути використані, вибрані на підставі двох додаткових критеріїв: - довжина в амінокислотах кожної CDR повинна бути ідентичною для мишачої CDR і еквівалентної зародкової лінії, і - зародкова послідовність по амінокислотах повинна мати щонайменше 70 % ідентичність із батьківською мишачою послідовністю. Щоб уникнути сумнівів, нагадаємо, що даний винахід охоплює дві кращі необмежувальні гуманізовані форми (також називані версіями) одного й того самого антитіла 515H7. Перша з них, називана Hz515H7, складається з гуманізованого антитіла, отриманого із зародковими лініями IGHV3-49*04 (SEQ ID № 77) і IGHJ4*01 (SEQ ID № 81) для важкого ланцюга, і IGKV41*01 (SEQ ID № 78) і IGKJ1*01 (SEQ ID № 82) для легкого ланцюга. Друга, називана Hz515H7-2, складається з гуманізованого антитіла, отриманого із зародкових ліній IGHV3-73*01 (SEQ ID № 12 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 79) і IGHJ4*01 (SEQ ID № 81) для важкого ланцюга, і IGKV2D-40*01 (SEQ ID № 80) і IGKJ1*01 (SEQ ID № 82) для легкого ланцюга. В іншому втіленні винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7, що містить варіабельну область із послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID №№ 10, 11, 12, 13, 85 або 87. В іншому втіленні винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7, що містить варіабельну область із послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID №№ 10, 11, 12 або 13. В іншому втіленні винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить варіабельну область із послідовністю SEQ ID № 85. В іншому втіленні винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить варіабельну область із послідовністю SEQ ID № 87. У ще одному втіленні винахід стосується варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7-2 з послідовністю SEQ ID № 87, яка містить одну або більш ніж одну амінокислотну заміну, вибрану з групи, що складається з H35S, V48L, R50F, A61D, D76N і A81L. У ще одному втіленні винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла, що містить повну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID №№ 21, 22, 23, 24, 89 або 91. У ще одному втіленні винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла, що містить повну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID №№ 21, 22, 23 або 24. В іншому втіленні винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить повну послідовність SEQ ID № 89. В іншому втіленні винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить повну послідовність SEQ ID № 91. У ще одному втіленні винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H72 з послідовністю SEQ ID № 91, яка містить одну або більш ніж одну амінокислотну заміну, вибрану з групи, що складається з H35S, V48L, R50F, A61D, D76N і A81L. Більш конкретно, винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла, що містить i) каркасну ділянку, гомологічну відповідній каркасній ділянці легкого ланцюга людського антитіла, і ii) CDR, гомологічні відповідним CDR антитіла, отриманого з різних видів ссавців, де зазначені CDR включають CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, що містять відповідно послідовності SEQ ID №№ 7, 8 і 9. Інакше кажучи, винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла з CDR, що включають CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, де зазначені CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 відповідно містять SEQ ID №№ 7, 8 і 9. В іншому втіленні винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла, що містить варіабельну область із послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID №№ 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 86 або 88. В іншому втіленні винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7, що містить варіабельну область із послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID №№ 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20. В іншому втіленні винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить варіабельну область із послідовністю SEQ ID № 86. В іншому втіленні винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить варіабельну область із послідовністю SEQ ID № 88. У ще одному втіленні винахід стосується варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7-2 з послідовністю SEQ ID № 88, яка містить одну або більш ніж одну амінокислотну заміну, вибрану з групи, що складається з L9S, I21M, D40A, L43Q, Y59A, A61D, D66A, S69T, G74E, D76Y та/або V89L. В іншому втіленні винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла, який містить повну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID №№ 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 90 або 92. В іншому втіленні винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7, який містить повну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID №№ 25, 26, 27, 28, 29, 30 або 31. В іншому втіленні винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить повну послідовність SEQ ID № 90. В іншому втіленні винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить повну послідовність SEQ ID № 92. 13 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У ще одному втіленні винахід також стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла H515H7-2 з послідовністю SEQ ID № 92, яка містить одну або більш ніж одну амінокислотну заміну, вибрану з групи, що складається з L9S, I21M, D40A, L43Q, Y59A, A61D, D66A, S69T, G74E, D76Y та/або V89L. Більш конкретно, винахід стосується гуманізованого антитіла або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, які характеризуються тим, що містять важкий і легкий ланцюги, кожен з яких має i) каркасні ділянки, гомологічні відповідним каркасним ділянкам важкого і легкого ланцюгів людського антитіла, і ii) CDR, гомологічні відповідним CDR антитіла, отриманого від різних видів ссавців, де зазначені CDR включають CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3 важкого ланцюга, що містять відповідно послідовності SEQ ID №№ 4, 5 і 6, і CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 легкого ланцюга, що містять відповідно послідовності SEQ ID №№ 7, 8 і 9. Інакше кажучи, винахід стосується гуманізованого антитіла або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, які характеризуються тим, що містять важкий і легкий ланцюги, де зазначений важкий ланцюг має CDR, які включають CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, а зазначений легкий ланцюг має CDR, які включають CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, де зазначені CDR-H1, CDRH2і CDR-H3 містять відповідно послідовності SEQ ID №№ 4, 5 і 6, а зазначені CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 містять відповідно SEQ ID №№ 7, 8 і 9. В іншому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID №№ 10, 11, 12, 13, 83, 85 або 87, і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID №№ 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 84, 86 або 88. В іншому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла H515H7, що містить варіабельну область важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID №№ 10, 11, 12 або 13, і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID №№ 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20. В іншому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить варіабельну область важкого ланцюга SEQ ID № 85 і варіабельну область легкого ланцюга SEQ ID № 86. В іншому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить варіабельну область важкого ланцюга SEQ ID № 87 і варіабельну область легкого ланцюга SEQ ID № 88. В іншому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить варіабельну область важкого ланцюга SEQ ID № 85 і варіабельну область легкого ланцюга SEQ ID № 88. В іншому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить варіабельну область важкого ланцюга SEQ ID № 87 і варіабельну область легкого ланцюга SEQ ID № 86. У ще одному втіленні винахід також стосується гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 87, яка містить одну або більш ніж одну амінокислотну заміну, вибрану з групи, що складається з H35S, V48L, R50F, A61D, D76N і A81L, і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID №88, яка містить одну або більш ніж одну амінокислотну заміну, вибрану з групи, що складається з D40A, L43Q, Y59A, A61D, S69T, G74E і D76Y. У ще одному втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла, що містить гуманізований важкий ланцюг у комбінації з химерним легким ланцюгом. У ще одному втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла, що містить химерний важкий ланцюг у комбінації з гуманізованим легким ланцюгом. Зокрема, винахід описує гуманізоване антитіло або його похідну сполуку чи функціональний фрагмент, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 83 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID №№ 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 86 або 88. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла c515H7 VH/Hz515H7 VL1 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 83 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 14. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла c515H7 VH/Hz515H7 VL1 T59A E61D або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 83 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 15. 14 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла c515H7 VH/Hz515H7 VL2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 83 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 16. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла c515H7 VH/Hz515H7 VL2.1 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 83 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 17. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла c515H7 VH/Hz515H7 VL2.2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 83 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 18. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла c515H7 VH/Hz515H7 VL2.3 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 83 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 19. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла c515H7 VH/Hz515H7 VL3 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 83 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 20. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 83 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 86. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла c515H7 VH/Hz515H7 VL1-2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 83 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 88. В іншому втіленні винахід описує гуманізоване антитіло або його похідну сполуку чи функціональний фрагмент, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, що містить із SEQ ID №№ 10, 11, 12, 13, 85 або 87, і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 84. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1/c515H7 VL або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 10 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 84. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 D76N/c515H7 VL або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 11 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 84. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 V48L D76N/c515H7 VL або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 12 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 84. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH2/c515H7 VL або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 13 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 84. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 85 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 84. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/c515H7 VL або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 87 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 84. У ще одному втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID №№ 21, 22, 23, 24, 89 або 91, і легкий ланцюг з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID №№ 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 90 або 92. В іншому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла H515H7, що містить важкий ланцюг з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID №№ 21, 22, 23 або 24, і 15 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 легкий ланцюг з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID №№ 25, 26, 27, 28, 29, 30 або 31. В іншому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 89 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 90. В іншому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 91 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 92. В іншому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла H515H7-2, що містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 91, яка містить одну або більш ніж одну амінокислотну заміну, вибрану з групи, що складається з H35S, V48L, R50F, A61D, D76N і A81L, і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 92, яка містить одну або більш ніж одну амінокислотну заміну, вибрану з групи, що складається з D40A, L43Q, Y59A, A61D, S69T, G74E і D76Y. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 D76N VL2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 11 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 16. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 D76N VL2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 22 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 27. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 VL2.1 D76N або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 11 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 17. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 VL2.1 D76N або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 22 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 28. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 VL2.2 D76N або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 11 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 18. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 VL2.2 D76N або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 22 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 29. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 VL2.3 D76N або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 11 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 19. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 VL2.3 D76N або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 22 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 30. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1, або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 12 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 14. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 23 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 25. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 V48L D76N T59A VL1 E61D або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 12 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 15. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 V48L D76N T59A VL1 E61D або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 23 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 26. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 VL1 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 10 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 14. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 VL1 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 21 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 25. 16 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1/Hz515H7 VL1-2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 10 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 88. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 D76N/Hz515H7 VL1-2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 11 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 88. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 V48L D76N/Hz515H7 VL1-2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 12 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 88. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH2/Hz515H7 VL1-2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 13 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 88. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1/Hz515H7 VL12 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 21 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 92. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 D76N/Hz515H7 VL1-2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 22 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 92. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1 V48L D76N/Hz515H7 VL1-2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 23 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 92. В іншому кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH2/Hz515H7 VL1-2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 24 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 92. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL1 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 87 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 14. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL1 T59A E61D або або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 87 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 15. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 87 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 16. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2.1 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 87 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 17. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2.2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 87 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 18. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2.3 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 87 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 19. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL3 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 87 і варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID № 20. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL1 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 91 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 25. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 17 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 VL1 T59A E61D або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 91 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 26. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 91 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 27. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2.1 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 91 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 28. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2.2 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 91 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 29. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2.3 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 91 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 30. У кращому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL3 або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, що містять важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 91 і легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID № 31. Слід розуміти, що наведені вище приклади комбінацій VH/VL не є обмежувальними. Фахівець у даній області міг би, звичайно, без зайвих витрат і без застосування винахідницьких навичок перебрати усі комбінації VH і VL, розкриті в даному описі. Фахівець зможе у такий спосіб одержати всі гуманізовані антитіла, що відповідають всім комбінаціям усіх VH і VL, розкритих у даній заявці. Новий аспект даного винаходу стосується виділеної нуклеїнової кислоти, яка характеризується тим, що вона вибрана поміж таких нуклеїнових кислот (включаючи будь-який вироджений генетичний код): а) нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує важкий ланцюггуманізованого антитіла, або його похідну сполуку чи функціональний фрагмент відповідно до даного винаходу; б) нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує легкий ланцюг гуманізованого антитіла, або його похідну сполуку чи функціональний фрагмент відповідно до даного винаходу; в) нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує гуманізоване антитіло або його похідну сполуку чи функціональний фрагмент відповідно до даного винаходу; г) нуклеїнової кислоти, комплементарної нуклеїновій кислоті, визначеній в а), б) або в); д) нуклеїнової кислоти довжиною не менше 18 нуклеотидів, здатної до гібридизації в умовах високої жорсткості щонайменше з важким ланцюгом, що містить нуклеїновокислотні послідовності SEQ ID №№ 38-41, 49-52, 93 або 95, краще, щонайменше з однією з трьох її CDR відповідно до CDR-нумерації IMGT або Кабата; і е) нуклеїнової кислоти довжиною не менше 18 нуклеотидів, здатної до гібридизації в умовах високої жорсткості щонайменше з легким ланцюгом, що містить нуклеїновокислотні послідовності SEQ ID №№ 42-48, 53-59, 94 або 96, краще, щонайменше з однією з трьох її CDR відповідно до CDR-нумерації IMGT або Кабата. Винахід також стосується виділеної нуклеїновокислотної молекули, яка містить нуклеїновокислотну послідовність, що кодує варіабельну область важкого ланцюга гуманізованого антитіла, при цьому нуклеотидна послідовність зазначеної варіабельної області важкого ланцюга містить нуклеотидну послідовність CDR-H1 SEQ ID № 32, нуклеотидну послідовність CDR-H2 SEQ ID № 33 і нуклеотидну послідовність CDR-H3 SEQ ID № 34. Винахід також стосується виділеної нуклеїновокислотної молекули, яка містить нуклеїновокислотну послідовність, що кодує варіабельну область легкого ланцюга гуманізованого антитіла, при цьому нуклеотидна послідовність зазначеної варіабельної області легкого ланцюга містить нуклеотидну послідовність CDR-L1 SEQ ID № 35 або 60; нуклеотидну послідовність CDR-L2 SEQ ID № 36 або 61 і нуклеотидну послідовність CDR-L3 SEQ ID № 37 або 62. Винахід також стосується виділеної нуклеїновокислотної молекули, яка містить нуклеїновокислотну послідовність, що кодує варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга гуманізованого антитіла, при цьому нуклеотидна послідовність зазначеної варіабельної області важкого ланцюга включає нуклеотидну послідовність CDR-H1 SEQ ID № 32; нуклеотидну послідовність CDR-H2 SEQ ID № 33 і нуклеотидну послідовність CDR-H3 SEQ ID № 34; а нуклеотидна послідовність зазначеної варіабельної області легкого ланцюга включає нуклеотидну послідовність CDR-L1 SEQ ID № 35 або 60, нуклеотидну послідовність CDR-L2 SEQ ID № 36 або 61 і нуклеотидну послідовність CDR-L3 SEQ ID № 37 або 62. 18 UA 106529 C2 5 У таблиці 3а нижче представлені оптимізовані нуклеотидні послідовності, що відповідають CDR антитіла hz515H7 за винаходом; у таблиці 3b наведені різні оптимізовані нуклеотидні послідовності, що відповідають варіабельним доменам і послідовностям повної довжини різних варіантів гуманізованого антитіла hz515H7 за винаходом. У таблиці 3c наведені різні оптимізовані нуклеотидні послідовності, що відповідають варіабельним доменам і послідовностям повної довжини гуманізованої версії hz515H7-2 за винаходом. Таблиця 3a Антитіло Hz515H7 оптимізована (оптимізовані) CDR Важкий ланцюг CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 Легкий ланцюг CDR-L1 CDR-L1 (bis) CDR-L2 CDR-L2 (bis) CDR-L3 CDR-L3 (bis) SEQ ID № 32 33 34 35 60 36 61 37 62 Таблиця 3b Антитіло Hz515H7 Важкий ланцюг VH1 VH1 D76N VH1 V48L D76N VH2 Варіабельні домени VH1 VH1 D76N VH1 V48L D76N VH2 Повні послідовності (без сигнального пептиду) Легкий ланцюг VL1 VL1 T59A E61D VL2 VL2.1 VL2.2 VL2.3 VL3 VL1 VL1 T59A E61D VL2 VL2.1 VL2.2 VL2.3 VL3 SEQ ID № 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 Таблиця 3c Антитіло Hz515H7-2 Варіабельні домени Важкий ланцюг Легкий ланцюг VH1 VH1 Повні послідовності (без сигнального пептиду) VL1 VL1 SEQ ID № 93 94 95 96 10 15 Вираз "оптимізована послідовність" означає, що кодони, які кодують конститутивні амінокислоти білка, що представляє інтерес (у цьому випадку це варіабельні домени антитіла), були оптимізовані для кращого розпізнавання механізмами трансляції у певному типі клітин, у цьому випадку - в клітинах ссавців. У зв'язку із цим, амінокислотна послідовність даного білка, кодована оптимізованою послідовністю, є ідентичною неоптимізованій послідовності, але її 19 UA 106529 C2 5 10 нуклеотидна послідовність відрізняється. Оптимізація також включає адаптацію вмісту G/C і запобігання стабільній вторинній структурі РНК (як приклад див. Kim et al., 1997 Gene 199(12):293-301). Наприклад, нуклеотидна послідовність мишачої CDR-H1 (SEQ ID № 71) була оптимізована і відповідає нуклеотидній послідовності гуманізованої CDR-H1 (SEQ ID № 32), де кодони ggg, act і gat (що кодують залишки Gly, Thr і Asp, відповідно) були замінені на кодони ggc, acc і gac, відповідно (які також кодують залишки Gly, Thr і Asp, відповідно). Що стосується CDR-H2 і CDR-H3 (SEQ ID №№ 72 і 73, відповідно), то вони також були оптимізовані і відповідали оптимізованим CDR з SEQ ID №№ 33 і 34, відповідно. Це також стосується трьох CDR легкого ланцюга (SEQ ID №№ 74, 75 і 76, відповідно) із двома оптимізованими гуманізованими формами, що відповідають VL1, VL2 і VL3 (SEQ ID №№ 35, 36 і 37, відповідно) і VL2.1, VL2.2 і VL2.3 (SEQ ID №№ 60, 61 і 62, відповідно). У наступній таблиці 4 наведені вихідні CDR, тобто мишачі неоптимізовані послідовності. Таблиця 4 Антитіло 515H7 мишачий CDR Важкий ланцюг CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 Легкий ланцюг CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 SEQ ID № 71 72 73 74 75 76 15 20 25 30 35 40 45 50 Терміни "нуклеїнова кислота", "нуклеїнова послідовність", "нуклеїновокислотна послідовність", "полінуклеотид", "олігонуклеотид", "полінуклеотидна послідовність" і "нуклеотидна послідовність", які використовуються рівнозначно в даному описі, позначають чітку послідовність нуклеотидів, модифікованих або не модифікованих, яка визначає фрагмент або ділянку нуклеїнової кислоти, що містить або не містить неприродні нуклеотиди, яка є або дволанцюговою ДНК, або одноланцюговою ДНК, або продуктами транскрипції зазначених ДНК. Тут також слід згадати, що даний винахід не стосується нуклеотидних послідовностей в їх природному хромосомному середовищі, тобто в природному стані. Послідовності за даним винаходом були виділені та/або очищені, тобто були взяті прямо або опосередковано, наприклад, шляхом копіювання, при цьому їх середовище було щонайменше частково модифіковане. Тут також слід згадати виділені нуклеїнові кислоти, отримані шляхом генетичної рекомбінації, наприклад, за допомогою клітин-хазяїв, або отримані шляхом хімічного синтезу. Під "нуклеїновими послідовностями, що демонструють відсоток ідентичності щонайменше 80 %, краще, 85 %, 90 %, 95 % і 98 %, після оптимального вирівнювання із кращою послідовністю" розуміють нуклеїнові послідовності, які демонструють у порівнянні з референсною нуклеотидною послідовністю певні модифікації, такі як, зокрема, делецію, усікання, подовження, химерне злиття та/або заміщення, зокрема, точкове. Краще це послідовності, які кодують ті ж самі амінокислотні послідовності, що й референсна послідовність, і зв'язані з виродженням генетичного коду, або комплементарні послідовності, які можуть специфічно гібридизуватися з референсними послідовностями, краще, в умовах високої жорсткості, зокрема таких, що визначені нижче. Гібридизація в умовах високої жорсткості означає, що температурні умови і умови іонної сили вибирають таким чином, щоб вони дозволяли підтримувати гібридизацію двох комплементарних фрагментів ДНК. Винятково як приклад, умови високої жорсткості етапу гібридизації для визначення полінуклеотидних фрагментів, описаних вище, краще, є такими. ДНК-ДНК- або ДНК-РНК-гібридизацію здійснюють у два етапи: (1) прегібридизація при 42 °C протягом трьох годин у фосфатному буфері (20 мМ, рН 7,5), що містить 5× SSC (цитратносольовий буфер) (1× SSC відповідає розчину 0,15 M NaCl+0,015 М цитрату натрію), 50 % формаміду, 7 % додецилсульфату натрію (SDS), 10× розчин Денхардта, 5 % сульфату декстрану і 1 % ДНК сперми лосося; (2) власне гібридизація протягом 20 годин при температурі залежно від довжини зонда (наприклад: 42 °C для зонда довжиною більше 100 нуклеотидів), а потім два 20-хвилинних промивання при температурі 20 °C у 2× SSC+2 % SDS, одне 20хвилинне промивання при 20 °C у 0,1× SSC+0,1 % SDS. Останнє промивання здійснюють в 0,1× SSC+0,1 % SDS протягом 30 хвилин при температурі 60 °C для зонда довжиною більше 100 нуклеотидів. Гібридизаційні умови високої жорсткості, описані вище для полінуклеотиду певного розміру, фахівець у даній області може адаптувати для олігонуклеотидів більшої або меншої 20 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 довжини відповідно до процедур, описаних в Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001). Винахід також стосується вектора, що містить нуклеїнову кислоту, описану у винаході. Винахід особливо націлений на клонуючі та/або експресійні вектори, які містять таку нуклеотидну послідовність. Вектори за винаходом краще містять елементи, які дозволяють експресувати та/або секретувати нуклеотидні послідовності в даній клітині-хазяїні. Таким чином, вектор повинен містити промотор, сигнали ініціації та термінації трансляції, а також придатні ділянки регуляції транскрипції. Він повинен бути здатним підтримувати в стабільному стані клітину-хазяїна і додатково може мати специфічні сигнали, які обумовлюють секрецію трансльованого білка. Фахівці в даній області вибирають і оптимізують ці різні елементи відповідно до використовуваної клітини-хазяїна. Із цією метою нуклеотидні послідовності можуть бути вставлені у вектори автономної реплікації у вибраному хазяїні, або можуть бути інтегративними векторами вибраного хазяїна. Такі вектори одержують за допомогою способів, які використовуються зараз фахівцями в даній області, і отримані клони можуть бути введені в придатного хазяїна за допомогою стандартних способів, таких як ліпофекція, електропорація, тепловий шок або хімічні способи. Вектори є, наприклад, векторами плазмідного або вірусного походження. Вони використовуються для трансформації клітин-хазяїв, щоб клонувати або експресувати нуклеотидні послідовності за винаходом. Винахід також включає клітини-хазяї, які трансформовані за допомогою вектора, описаного в даному винаході, або містять його. Клітина-хазяїн може бути вибрана із прокаріотичних або еукаріотичних систем, наприклад, бактеріальних клітин, а також дріжджових клітин або клітин тварин, зокрема, клітин ссавців. Можна також використовувати клітини комах або рослин. Винахід також стосується тварин, за винятком людини, які містять щонайменше одну трансформовану клітину відповідно до винаходу. Інший аспект винаходу зв'язаний зі способом продукції антитіла відповідно до винаходу або одного з його функціональних фрагментів, який характеризується тим, що включає такі етапи: а) культивування клітини-хазяїна відповідно до винаходу в середовищі в придатних культуральних умовах; і б) виділення зазначеного антитіла або одного з його функціональних фрагментів, отриманих у такий спосіб, з культурального середовища або зазначених культивованих клітин. Трансформовані клітини відповідно до винаходу можуть бути використані в способах одержання рекомбінантних поліпептидів відповідно до винаходу. Способи одержання поліпептиду відповідно до винаходу в рекомбінантній формі, що характеризуються використанням вектора та/або клітини, трансформованої вектором відповідно до винаходу, також входять у даний винахід. Краще, клітину, трансформовану вектором відповідно до винаходу, культивують в умовах, які дозволяють експресувати зазначений поліпептид, і зазначений рекомбінантний пептид виділяють. Як вже було сказано, клітина-хазяїн може бути вибрана із прокаріотичних або еукаріотичних систем. Зокрема, можна визначити нуклеотидні послідовності за винаходом, що сприяють секреції у такій прокаріотичній або еукаріотичній системі. Вектор відповідно до винаходу, що несе таку послідовність, таким чином, може бути вигідно використаний для продукції рекомбінантних білків, призначених для секреції. Дійсно, очищенню цих цільових рекомбінантних білків буде сприяти той факт, що вони перебувають у супернатанті клітинної культури, а не усередині клітин-хазяїв. Також можна одержати поліпептиди за винаходом шляхом хімічного синтезу. Такий спосіб одержання також є предметом винаходу. Фахівцю в даній області відомі способи хімічного синтезу, наприклад, методики з використанням твердих фаз (зокрема, див. Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed.) або методики з використанням частково твердих фаз, шляхом конденсації фрагментів або шляхом класичного синтезу в розчині. Поліпептиди, отримані шляхом хімічного синтезу і здатні містити відповідні неприродні амінокислоти, також входять у винахід. Антитіла або їх похідні сполуки чи функціональні фрагменти, які можуть бути отримані за допомогою способу за винаходом, також входять у даний винахід. Відповідно до ще одного аспекту, даний винахід стосується антитіла, описаного вище, яке характеризується тим, що воно, крім того, здатне специфічно зв'язуватися з рецептором сімейства людських хемокінів та/або здатне специфічно інгібувати передачу сигналу від такого рецептора. 21 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно до нового втілення винахід стосується антитіла або його похідних сполук чи функціональних фрагментів, що складаються з антитіла, яке є биспецифічним у тому розумінні, що воно містить другий мотив, здатний взаємодіяти з яким-небудь рецептором, залученим у розвиток пухлин, таким як, наприклад, VEGFR, VEGF, EGFR, IGF-1R, HER2neu, HGF, cMET, FGF, тетраспаніни, інтегрини, CXCR4 (крім антитіла за даним винаходом, тобто орієнтоване на інший епітоп), CXCR7 або CXCR2. Біспецифічні або біфункціональні антитіла є другим поколінням моноклональних антитіл, у яких дві різні варіабельні ділянки об'єднані в одну молекулу (Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis, rev. 18:411-419). Як у діагностичній, так і в терапевтичній областях була продемонстрована їхня корисність за рахунок їх здатності залучати нові ефекторні функції або впливати на деякі молекули на поверхні пухлинних клітин; такі антитіла можуть бути отримані за допомогою хімічних способів (Glennie MJ et al., 1987, J. Immunol. 139, 2367–2375; Repp R. et al., 1995, J. Hemat., 377-382) або соматичних способів (Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et al., 1986, Method Enzymol., 121:210-228), а також, краще, за допомогою методик генної інженерії, які уможливлюють гетеродимеризацію і тим самим полегшують очищення шуканого антитіла (Merchand et al., 1998, Nature Biotech., 16:677-681). Ці біспецифічні антитіла можуть бути побудовані як цілий IgG, біспецифічний Fab'2, Fab'ПЕГ, діатело або біспецифічний scFv, а також як чотиривалентне біспецифічне антитіло, у якому присутні два сайти зв'язування для кожного цільового антигену (Park et al., 2000, Mol. Immunol., 37(18):1123-30), або як їх фрагменти. На додаток до економічних переваг, враховуючи, що продукція і введення біспецифічного антитіла дешевше, ніж продукція двох специфічних антитіл, застосування таких біспецифічних антитіл має перевагу в плані зниження токсичності лікування. Дійсно, застосування біспецифічного антитіла дозволяє зменшити загальну кількість циркулюючих антитіл і, отже, можливу токсичність. У кращому втіленні винаходу біспецифічне антитіло є двовалентним або чотиривалентним антитілом. Нарешті, даний винахід стосується описаного вище антитіла або його похідних сполук чи функціональних фрагментів для застосування їх як лікарського засобу. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, що містить як активний інгредієнт сполуку, що включає антитіло за винаходом або одну з його похідних сполук чи функціональних фрагментів. Краще, зазначене антитіло доставляється ексципієнтом та/або фармацевтично прийнятним носієм. Винахід також стосується композиції, яка характеризується тим, що вона як комбінований продукт для одночасного, роздільного або розширеного застосування містить крім того протипухлинне антитіло, відмінне від антитіла, спрямованого проти CXCR4. Відповідно до ще одного втілення, даний винахід також стосується описаної вище фармацевтичної композиції, яка містить щонайменше другу протипухлинну сполуку, вибрану поміж сполук, здатних специфічно інгібувати тирозинкіназну активність рецепторів, таких як IGFIR, EGFR, HER2/neu, cMET, VEGFR або VEGF, або будь-яких інших протипухлинних сполук, відомих фахівцям у даній області. У другому кращому аспекті винаходу зазначена друга сполука може бути вибрана поміж антиEGFR, антиIGF-IR, антиHER2/neu, антиcMET, VEGFR, VEGF і т.д., виділених, або їх функціональних фрагментів чи похідних сполук, здатних інгібувати проліферативну, та/або антиапоптотичну, та/або ангіогенну, та/або індукційну активність метастатичної дисемінації, яку підтримують зазначені рецептори. Також придатними для згадування є антиCD20-антитіла, такі як ритуксимаб, ібритумомаб або тоситумомаб; антиCD33-антитіла, такі як гемтузумаб або лінтузумаб; антиCD22-антитіла, такі як епратузумаб; антиCD52-антитіла, такі як алемтузумаб; антиEpCAM-антитіла, такі як едреколомаб, Ch 17-1A або IGN-101; антитіла антиCTP21 або 16, такі як Xactin; антиДНК-Ag131 антитіла, такі як I-Cotara TNT-1; антиMUC1-антитіла, такі як пемтумомаб або R1150; антиMUC18-антитіла, такі як ABX-MA1; антиGD3-антитіла, такі як мітумомаб; антиECA-антитіла, такі як Ceavac або лабетузумаб; антиCA125-антитіла, такі як OvaRex; антиHLA-DR-антитіла, такі 111 як аполізумаб; антиCTLA4-антитіла, такі як MDX-010; антиPSMA-антитіла, такі як MDX-070, In 90 177 і Y-J591, Lu J591, J591-DM1; анти-Льюїс Y-антитіла (антитіла до антигену Y Льюїса), такі як IGN311; антиангіогенні антитіла, такі як AS1405 і 90YmuBC1; антиTrail-R1-антитіла, такі як МКА TRAIL R1 або МКА TRAIL R2. Інше втілення, що доповнює винахід, складається з композиції, описаної вище, яка як комбінований або кон'югований продукт для одночасного, роздільного або розширеного застосування містить, крім іншого, цитотоксичний/цитостатичний агент. 22 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Під "одночасним застосуванням" розуміється введення обох сполук композиції в єдиній фармацевтичній формі. Під "роздільним застосуванням" розуміється введення в один і той самий час обох сполук композиції в різних фармацевтичних формах. Під "розширеним застосуванням" розуміється послідовне введення обох сполук композиції, кожна в окремій фармацевтичній формі. У цілому, композиція відповідно до винаходу значно підвищує ефективність лікування раку. Іншими словами, терапевтичний ефект антитіла за винаходом несподівано підсилюється при введенні цитотоксичного агента. Інша важлива подальша перевага, отримана за допомогою композиції за винаходом, стосується можливості використання більш низьких ефективних доз активного інгредієнта, що дозволяє уникнути або зменшити ризик виникнення побічних ефектів, зокрема впливу цитотоксичного агента. Крім того, ця композиція дозволяє швидше досягати очікуваного терапевтичного ефекту. Під "терапевтичним протираковим агентом" або "цитотоксичним агентом" розуміється речовина, яка при введенні її пацієнту лікує або запобігає розвитку раку у пацієнта. Необмежувальні приклади таких агентів включають "алкілувальні" агенти, антиметаболіти, протипухлинні антибіотики, мітотичні інгібітори, інгібітори функціонування хроматину, антиангіогенні агенти, антиестрогени, антиандрогени або імуномодулятори. Такими агентами є, наприклад, агенти, згадані у виданні VIDAL на сторінці, присвяченій сполукам, застосовуваним в онкології та гематології, у колонці "Цитотоксичні речовини"; цитотоксичні сполукм, цитовані застосовно до даного документа, приводяться тут як кращі цитотоксичні агенти. Під "алкілувальним агентом" розуміється будь-яка речовина, що може ковалентно зв'язувати або алкілувати будь-яку молекулу, краще, нуклеїнову кислоту (наприклад, ДНК) у клітині. Приклади таких алкілувальних агентів включають азотні аналоги гірчичного газу, такі як мехлоретамін, хлорамбуцил, мелфалан, хлоргідрат, піпоброман, преднімустин, гідрофосфат натрію або естрамустин; оксазафосфорини, такі як циклофосфамід, алтретамін, трофосфамід, сульфофосфамід або іфосфамід; азиридини або етиленіміни, такі як тіотепа, триетиленамін або алтретамін; нітрозосечовини, такі як кармустин, стрептозоцин, фотемустин або ломустин; алкілсульфонати, такі як бусульфан, треосульфан або імпросульфан; триазени, такі як дакарбазин; або платинові комплекси, такі як цисплатин, оксаліплатин або карбоплатин. Під "антиметаболітом" розуміється речовина, яка блокує ріст та/або клітинний метаболізм, втручаючись у певні види активності, як правило, у синтез ДНК. Приклади антиметаболітів включають метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, 5-фтородезоксиуридин, капецитабін, цитарабін, флударабін, цитозинарабінозид, 6-меркаптопурин (6-MP), 6-тіогуанін (6-TG), хлородезоксиаденозин, 5-азацитидин, гемцитабін, кладрибін, дезоксикоформіцин і пентостатин. Під "протипухлинним антибіотиком" розуміється сполука, яка може запобігати або інгібувати синтез ДНК, РНК та/або білків. Приклади таких протипухлинних антибіотиків включають доксорубіцин, даунорубіцин, ідарубіцин, валрубіцин, мітоксантрон, дактиноміцин, мітраміцин, плікаміцин, мітоміцин C, блеоміцин і прокарбазин. "Мітотичні інгібітори" запобігають нормальному розвитку клітинного циклу і мітозу. Як правило, інгібітори мікротрубочок, або "таксоїди", такі як паклітаксел і доцетаксел, здатні інгібувати мітоз. Алкалоїди барвінка, такі як вінбластин, вінкристин, віндезин і вінорелбин, також здатні інгібувати мітоз. До "інгібіторів хроматину" або "інгібіторів топоізомерази" належать речовини, які інгібують нормальне функціонування білків, що моделюють хроматин, таких як топоізомерази I і II. Приклади таких інгібіторів включають, для топоізомерази I, камптотецин та його похідні, такі як іринотекан або топотекан, і, для топоізомерази II, етопозид, фосфат етопозиду і теніпозид. Під "антиангіогенним агентом" розуміється будь-який лікарський препарат, сполука, речовина або агент, який інгібує ріст кровоносних судин. Приклади антиангіогенних агентів включають, без обмеження ними, разоксин, марімастат, батимастат, приномастат, таномастат, іломастат, CGS-27023A, галофугінон, COL-3, неовастат, BMS-275291, талідомід, CDC 501, DMXAA, L-651582, скваламін, ендостатин, SU5416, SU6668, інтерферон-альфа, EMD121974, інтерлейкін-12, IM862, ангіостатин і вітаксин. Під "антиестрогеном" або "антагоністом естрогену" розуміється будь-яка речовина, яка зменшує, протидіє або інгібує дію естрогену. Прикладами таких агентів є тамоксифен, тореміфен, ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен, анастрозол, летрозол і екземестан. Під "антиандрогеном" або "антагоністом андрогену" розуміється будь-яка речовина, яка зменшує, протидіє або інгібує дію андрогену. Приклади антиандрогенів включають флутамід, нілутамід, бікалютамід, спіроналоктон, ацетат ципротерону, фінастерид і цимітидин. 23 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Імуномодулятори є речовинами, які стимулюють імунну систему. Приклади імуномодуляторів включають інтерферон, інтерлейкіни, такі як алдеслейкін, ОСТ-43, денілейкін дифтитокс і інтерлейкін-2, фактори некрозу пухлини, такі як тазонермін, або інші типи імуномодуляторів, такі яклентінан, сизофіран, рохінімекс, підотимод, пегадемаза, тимопентин, полі(I:C) (співполімер поліінозинової і поліцитидилової кислот) або левамізол у комбінації з 5фторурацилом. За більш докладною інформацією фахівець у даній області може звернутися до посібника, виданого під редакцією French Association of Therapeutic Chemistry Teachers і озаглавленого "Therapeutic chemistry, vol. 6, Antitumor drugs and perspectives in the treatment of cancer, TEC and DOC edition, 2003" (французькою мовою). В окремому кращому втіленні зазначена композиція за винаходом як комбінований продукт характеризується тим, що зазначений цитотоксичний агент хімічно зв'язаний із зазначеним антитілом для одночасного застосування. В окремому кращому втіленні зазначена композиція характеризується тим, що зазначений цитотоксичний/цитостатичний агент вибраний поміж інгібіторів або стабілізаторів веретена ділення, краще, вінорелбіну та/або вінфлуніну та/або вінкристину. Для полегшення зв'язування зазначеного цитотоксичного агента і антитіла відповідно до винаходу можливе введення між двома сполуками, які повинні бути зв'язані, молекулроздільників, наприклад, полі(алкілен)гліколю, поліетиленгліколю або амінокислот; або, в іншому втіленні, використання активних похідних зазначених цитотоксичних агентів, у які були введені функціональні структури, здатні взаємодіяти із зазначеним антитілом. Ці методики зв'язування добре відомі фахівцям у даній області і не будуть більш докладно розглядатися в даному описі. Інші інгібітори EGFR включають, без обмеження ними, моноклональні антитіла C225 і антиEGFR 22 (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA) або сполуки ZD-1834, ZD-1838 і ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), флуномід (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183, 805 (Warner Lambert Parke Davis), CL387, 785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GMBH/Roche), Naamidine A (Bristolboard Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co), VRCTC-310 (Ventech Research), гібридний токсин EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Center Cancer), WHI-P97 (Parker Hughes Center Cancer), GW-282974 (Glaxo), KT8391 (Kyowa Hakko) або "вакцину EGFR" (York Medical/Centro of Immunologia Molecular). Інший аспект винаходу стосується композиції, яка характеризується тим, що щонайменше одне із зазначених антитіл або одна з їх похідних сполук чи функціональних фрагментів комбіноване або кон'юговане із клітинним токсином та/або радіоізотопом. Краще, зазначений токсин або зазначений радіоізотоп здатний запобігати росту або проліферації пухлинної клітини, зокрема, повністю інактивуючи зазначену пухлинну клітину. Також краще, зазначений токсин є ентеробактеріальним токсином, зокрема, екзотоксином А Pseudomonas. Радіоізотопи, краще, кон'юговані з терапевтичними антитілами, є радіоізотопами, які 131 90 199 100 67 випромінюють гамма-промені, і краще йодом , ітрієм , золотом , палладієм , міддю , 217 211 вісмутом і сурмою . Радіоізотопи, які випромінюють альфа- і бета-промені, також можуть бути використані в терапії. Під "токсином або радіоізотопом, комбінованим щонайменше з одним антитілом за винаходом або його функціональним фрагментом" розуміють будь-який засіб, що дозволяє зазначеному токсину або зазначеному радіоізотопу зв'язуватися щонайменше з одним антитілом, особливо шляхом ковалентного зв'язування двох сполук, з або без введення з'єднувальної молекули. Приклади агентів, що дозволяють зв'язувати хімічно (ковалентно), електростатично або нековалентно усі або частину елементів кон'югата, включають, зокрема, бензохінон, карбодіімід і ще краще EDC (1-етил-3-[3-диметиламінопропіл]карбодііміду гідрохлорид), дималеімід, дитіобіснітробензойну кислоту (DTNB), сукцинімідил-S-ацетилтіоацетат (SATA), зв'язуючі агенти з однією чи декількома групами, з однією чи більш ніж однією фенілазидною групою, які вступають в реакцію під дією ультрафіолетових (УФ) променів, найкраще, N-[-4(азидосаліциламіно)бутил]-3'-(2'-піридилдитіо)пропіонамід (APDP), N-сукцинимидил-3-(2пиридилдитіо)пропіонат (SPDP) і 6-гідразинонікотинамід (HYNIC). Інша форма зв'язування, зокрема, для радіоізотопів, може полягати у використанні біфункціональних іонних хелатуючих агентів. 24 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклади таких хелатуючих агентів включають хелатуючі агенти, отримані з EDTA (етилендіамінтетраоцтової кислоти) або DTPA (діетилентриамінпентаоцтової кислоти), які були розроблені для зв'язування металів, зокрема радіоактивних металів, з імуноглобулінами. Таким чином, DTPA та її похідні можуть бути замінені різними групами у вуглецевому ланцюзі з метою підвищення стабільності і жорсткості комплексу ліганд-метал (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); патент США 4831175). Наприклад, DTPA (діетилентриамінпентаоцтова кислота) та її похідні, які протягом тривалого часу широко використовуються в медицині і біології або у своїй вільній формі, або в комплексі з іоном металу, має чудову здатність формувати стабільні хелати з іонами металу, які можуть бути зв'язані з білками, що представляють терапевтичний або діагностичний інтерес, такими як антитіла, для одержання радіоімунокон'югатів для терапії раку (Meases et al., 1984; Gansow et al. 1990). Також краще зазначене щонайменше одне антитіло за винаходом, що формує зазначений кон'югат, вибирають з його функціональних фрагментів, особливо фрагментів з видаленим Fcкомпонентом, таких як scFv-фрагменти. Даний винахід також включає застосування композиції для виготовлення лікарського засобу, застосовуваного для профілактики або лікування раку. Даний винахід також стосується застосування антитіла або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, краще, гуманізованого, та/або композиції відповідно до винаходу для виготовлення лікарського засобу, призначеного для інгібування росту пухлинних клітин. Загалом, даний винахід також стосується застосування антитіла або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, краще, гуманізованого, та/або композиції для виготовлення лікарського засобу для профілактики або лікування раку. Кращі раки, при яких можна проводити профілактику та/або лікування, включають рак передміхурової залози, остеосаркому, рак легені, рак молочної залози, рак ендометрія, рак товстої кишки, множинну мієлому, рак яєчників, рак підшлункової залози або будь-який інший рак. Винахід також стосується застосування антитіла, його похідної сполуки чи функціонального фрагмента та/або композиції, описаної вище, для виготовлення лікарського препарату для модуляції CXCR4-активності у клітині. Інший аспект даного винаходу стосується застосування антитіла відповідно до опису у способі діагностики, краще, in vitro, захворювань, пов'язаних з рівнем експресії CXCR4. Краще зазначеними захворюваннями, пов'язаними з білком CXCR4, у зазначеному діагностичному способі будуть раки. Таким чином, антитіла за винаходом або їх похідні сполуки чи функціональні фрагменти можуть бути використані в способі виявлення та/або кількісної оцінки білка CXCR4 у біологічному зразку in vitro, зокрема, для діагностики захворювань, пов'язаних з аномальною експресією цього білка, таких як рак, де зазначений спосіб включає такі етапи: а) введення біологічного зразка в контакт із антитілом відповідно до винаходу або його похідною сполукою чи функціональним фрагментом; б) демонстрація можливо сформованого комплексу антиген-антитіло. Таким чином, даний винахід також включає набори або прилади для реалізації описаного способу, що містять такі елементи: а) поліклональне або моноклональне антитіло за винаходом; б) можливо, реагенти для готування середовища, сприятливого для імунологічних реакцій; в) можливо, реагенти, які виявляють комплекси антиген-антитіла, отримані в імунологічній реакції. У цілому, даний винахід стосується застосування антитіла або його похідної сполуки чи функціонального фрагмента, які містять важкий ланцюг з наступними трьома CDR-CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, відповідно, з послідовностями SEQ ID №№ 4, 5 і 6, і легкий ланцюг з наступними трьома CDR-CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, відповідно, з послідовностями SEQ ID №№ 7, 8, 9, для діагностики in vitro онкогенного розладу, пов'язаного з експресією CXCR4, або для визначення in vitro прогнозу розвитку онкогенного розладу, пов'язаного з експресією CXCR4. У цьому аспекті, даний винахід стосується, зокрема, застосування важкого ланцюга гуманізованого антитіла, та/або легкого ланцюга гуманізованого антитіла, та/або гуманізованого антитіла, або їх похідної сполуки чи функціонального фрагмента відповідно до винаходу для діагностики in vitro онкогенного розладу, пов'язаного з експресією CXCR4, або для визначення in vitro прогнозу розвитку онкогенного розладу, пов'язаного з експресією CXCR4. В іншому аспекті даний винахід стосується процесу виявлення in vitro присутності та/або локалізації пухлини, що експресує CXCR4, у суб'єкта, де зазначений спосіб включає етапи: (а) 25 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контактування зразка від суб'єкта з антитілом або його похідною сполукою чи функціональним фрагментом, що містять наступні три CDR важкого ланцюга - CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, відповідно, з послідовностями SEQ ID №№ 4, 5 і 6, і наступні три CDR легкого ланцюга CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, відповідно, з послідовностями SEQ ID №№ 7, 8, 9, і (б) виявлення зв'язування зазначеного антитіла зі зразком. Зокрема, даний винахід спрямований на процес виявлення in vitro присутності та/або локалізації пухлини, що експресує CXCR4, у суб'єкта, де зазначений спосіб включає такі етапи: (а) контактування зразка від суб'єкта з важким ланцюгом гуманізованого антитіла, та/або легким ланцюгом гуманізованого антитіла, та/або гуманізованим антитілом, або їх похідною сполукою чи функціональним фрагментом відповідно до винаходу, і (б) виявлення зв'язування зазначеного антитіла зі зразком. Як необмежувальний приклад, таке виявлення може бути здійснене за допомогою FACS або будь-якої іншої методики, відомої фахівцю в даній області. В іншому аспекті даний винахід спрямований на процес визначення in vitro рівня експресії CXCR4 в пухлині, що експресує CXCR4, у суб'єкта, де зазначений спосіб включає етапи (а') контактування зразка від суб'єкта з антитілом або його похідною сполукою чи функціональним фрагментом, що містять важкий ланцюг з наступними трьома CDR-CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, відповідно, з послідовностями SEQ ID №№ 4, 5 і 6, і легкий ланцюг з наступними трьома CDRCDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, відповідно, з послідовностями SEQ ID №№ 7, 8, 9, і (б') виявлення зв'язування зазначеного антитіла зі зразком. Зокрема, даний винахід спрямований на процес визначення in vitro рівня експресії CXCR4 в пухлині, що експресує CXCR4, у суб'єкта, де зазначений спосіб включає такі етапи: (а') контактування зразка від суб'єкта з важким ланцюгом гуманізованого антитіла, та/або легким ланцюгом гуманізованого антитіла, та/або гуманізованим антитілом, або його похідною сполукою, або функціональним фрагментом відповідно до винаходу; і (б') кількісна оцінка рівня зв'язування антитіла з CXCR4 у зазначеному зразку. У кращому втіленні рівень експресії CXCR4 виміряється за допомогою імуногістохімії (IHC). В іншому аспекті даний винахід стосується процесу діагностики in vitro пухлини, що експресує CXCR4, або визначення in vitro прогнозу розвитку пухлини, що експресує CXCR4, де зазначений спосіб включає етапи: (i) визначення рівня експресії CXCR4 відповідно до даного винаходу, зокрема, із залученням гуманізованих антитіл за даним винаходом, і (ii) порівняння рівня експресії етапу (i) з референсним рівнем експресії CXCR4 у нормальній тканині. В іншому аспекті даний винахід стосується процесу визначення in vitro CXCR4-статусу пухлини у суб'єкта, де зазначений процес включає етапи: (1) визначення рівня експресії CXCR4 відповідно до даного винаходу, зокрема, із залученням гуманізованих антитіл за даним винаходом, (2) підрахунку рівня експресії CXCR4 у зазначеній пухлині, і (3) порівняння зазначеного підрахунку з результатом, отриманим для контрольного зразка. В іншому аспекті даний винахід стосується процесу визначення того, чи піддається онкогенний розлад лікуванню анти-CXCR4-антитілом або його фрагментом чи похідним, де зазначений процес включає такі етапи: (а) визначення in vitro CXCR4-статусу пухлини суб'єкта відповідно до винаходу; і (б) якщо CXCR4-статус позитивний, визначення того, чи піддається цей онкогенний розлад лікуванню анти-CXCR4-антитілом або його фрагментом чи похідним. В іншому аспекті даний винахід стосується процесу скринінгу та/або ідентифікації молекул CXCR4-антагоністичних протипухлинних агентів, який включає такі етапи: а) вибір клітин, експресуючих CXCR4, б) інкубація зазначених клітин з антитілом або його похідною сполукою чи функціональним фрагментом, які містять важкий ланцюг з наступними трьома CDR-CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, відповідно, з послідовностями SEQ ID №№ 4, 5 і 6, і легкий ланцюг з наступними трьома CDRCDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, відповідно, з послідовностями SEQ ID №№ 7, 8, 9, і в) оцінка аналізованих молекул на предмет потенційного інгібування ними зв'язування антитіла або одного з його функціональних фрагментів чи похідних з CXCR4, і г) вибір молекул, здатних до зазначеного інгібування. У цьому аспекті даний винахід стосується процесу скринінгу та/або ідентифікації молекул CXCR4-антагоністичних протипухлинних агентів, який включає такі етапи: а) вибір клітин, експресуючих CXCR4, б) інкубація зазначених клітин з важким ланцюгом гуманізованого антитіла, та/або легким ланцюгом гуманізованого антитіла, та/або гуманізованим антитілом, або його похідною сполукою, або функціональним фрагментом відповідно до винаходу, і в) оцінка аналізованих молекул на предмет потенційного інгібування ними зв'язування 26 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла або одного з його функціональних фрагментів чи похідних з CXCR4, і г) вибір молекул, здатних до зазначеного інгібування. В іншому аспекті даний винахід стосується набору, який містить щонайменше антитіло або його похідну сполуку чи функціональний фрагмент, які містять важкий ланцюг з наступними трьома CDR-CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, відповідно, з послідовностями SEQ ID №№ 4, 5 і 6; і легкий ланцюг з наступними трьома CDR-CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, відповідно, з послідовностями SEQ ID №№ 7, 8, 9, при цьому зазначене антитіло краще є міченим. У цьому аспекті даний винахід стосується, зокрема, набору, що містить щонайменше важкий ланцюг гуманізованого антитіла, та/або легкий ланцюг гуманізованого антитіла, та/або гуманізоване антитіло, або його похідну сполуку, або функціональний фрагмент відповідно до винаходу, при цьому зазначене антитіло краще є міченим. В іншому аспекті даний винахід стосується набору відповідно до даного винаходу для визначення in vitro CXCR4-статусу пухлини, при цьому зазначений набір також включає: i) реагент, використовуваний для виявлення ступеня зв'язування зазначеного анти-CXCR4антитіла і CXCR4, і ii) позитивні і негативні контрольні зразки, використовувані для підрахунку рівня експресії CXCR4. Краще, антитіла або їх функціональні фрагменти можуть бути іммобілізовані на субстраті, зокрема, на білковому чипі. Один з таких білкових чипів є об'єктом винаходу. Краще, білкові чипи можуть бути використані в наборах або приладах, необхідних для виявлення та/або кількісної оцінки білка CXCR4 у біологічному зразку. Потрібно відзначити, що термін "біологічний зразок", використовуваний у даному документі, стосується зразка, узятого у живого організму (зокрема, крові, тканини, органа або іншого зразка, узятого в ссавця, зокрема, людини), або будь-якого зразка, який може містити один такий білок CXCR4 (такого як зразок клітин, трансформованих при необхідності). Зазначене антитіло або його функціональний фрагмент може перебувати у формі імунокон'югата або міченого антитіла для одержання сигналу, який можна виявити та/або кількісно оцінити. Мічені антитіла за винаходом або його функціональні фрагменти включають, наприклад, кон'югати антитіл (імунокон'югати), які можуть бути комбіновані, наприклад, з ферментами, такими як пероксидаза, лужна фосфатаза, α-d-галактозидаза, глюкозооксидаза, глюкозоамілаза, карбоангідраза, ацетилхолінестераза, лізоцим, малатдегідрогеназа або глюкозо-6-фосфат-дегідрогеназа, або з молекулами, такими як біотин, дигоксигенін або 5бромдезоксиуридин. Флуоресцентні мітки також можуть бути комбіновані з антитілами за винаходом або їх функціональними фрагментами, особливо включаючи флуоресцеїн та його похідні, флуорохром, родамін та його похідні, зелений флуоресцентний білок (GFP), дансил, умбеліферон і т.д. У таких кон'югатах антитіла за винаходом або їх функціональні фрагменти можуть бути отримані за допомогою способів, відомих фахівцям у даній області. Вони можуть бути зв'язані з ферментами або флуоресцентними мітками безпосередньо; за допомогою роздільної групи або з'єднувальної групи, такої як поліальдегід, глутаральдегід, етилендіамінтетраоцтова кислота (EDTA) або діетиленглікольтриамінпентаоцтова кислота (DPTA); або в присутності зв'язуючих агентів, таких як згадані вище для терапевтичних кон'югатів. Кон'югати, що несуть флуоресцеїнові мітки, можуть бути отримані шляхом реакції з ізотіоціанатом. Інші кон'югати можуть також включати хемілюмінесцентні мітки, такі як люмінол і діоксетан, 123 біолюмінесцентні мітки, такі як люцифераза і люциферин, або радіоактивні мітки, такі як йод , 125 126 133 77 99m 111 113m 67 68 95 97 йод , йод , йод , бром , технецій , індій , індій , галій , галій , рутеній , рутеній , 103 105 107 203 99m 101 105 47 121m рутеній , рутеній , меркурій , меркурій , реній , реній , реній , скандій , телурій , 122m 125m 165 167 168 18 199 131 телурій , телурій , тулій , тулій , тулій , фтор , ітрій і йод . Способи, відомі фахівцю в даній області, що існують для зв'язування радіоізотопів з антитілами або безпосередньо, або через хелатуючий агент, такий як згадані вище EDTA або DTPA, можуть 125 бути використані для діагностичних радіоізотопів. Також можна згадати мітку з [I ]Na за допомогою хлораміну Т [Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495], або також з 99m технецієм відповідно до опису Crockford et al. (патент США 4424200), або через DTPA, як описано у Hnatowich (патент США 4479930). Також розкрите застосування антитіла за винаходом як біомаркера. Способи можуть бути використані для виявлення і діагностики різних гіперпроліферативних онкогенних порушень, пов'язаних з експресією CXCR4, прикладами яких, без обмеження, є рак молочної залози, рак яєчників, рак передміхурової залози, рак підшлункової залози, рак шкіри, рак стравоходу, рак легені, рак голови і шиї, рак сечового міхура, колоректальний рак, остеосаркоми, 27 UA 106529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нейробластома, гострий лімфобластний лейкоз, гострий мієлобластний лейкоз, хронічний мієлоїдний лейкоз, хронічний лімфолейкоз, множинна мієлома, лімфоми, рак нирки, гліобластома, рак щитовидної залози, рабдоміосаркома або будь-який інший рак, пов'язаний з експресією CXCR4. Як має бути відомо фахівцю в даній області, рівень експресії антитіла, пов'язаний з певним розладом, буде варіювати залежно від характеру та/або тяжкості вже існуючого стану. Введення антитіл за даним винаходом будь-яким зі звичайних шляхів, відомих фахівцям у даній області (наприклад, місцево, парентерально, внутрішньом'язово і т.д.) буде надзвичайно корисним способом виявлення диспластичних клітин у зразку, а також дозволить лікареві контролювати терапевтичний режим пацієнта, який проходить лікування від гіперпроліферативного розладу, пов'язаного з або опосередкованого експресією CXCR4. В іншому втіленні винахід стосується фармацевтичної композиції для візуалізації in vivo онкогенного розладу, пов'язаного з експресією CXCR4, яка містить зазначене вище моноклональне антитіло або його фрагмент, який є міченим і який зв'язує CXCR4 in vivo, та фармацевтично прийнятний носій. Антитіло за винаходом або його функціональний фрагмент чи похідне знайдуть застосування в різних медичних або наукових цілях, включаючи виявлення, діагностику і визначення стадії різних патологій, пов'язаних з експресією CXCR4. Визначення стадії має потенційне прогностичне значення і забезпечує критерії для розробки оптимальної терапії [Simpson et al. J. Clin. Oncology 18:2059 (2000)]. Як правило, визначення патологічної стадії, наприклад, раку молочної залози, є кращим, ніж визначення клінічної стадії, тому що дає більш точний прогноз. Проте, визначення клінічної стадії було б кращим, якби воно було таким саме точним, як визначення патологічної стадії, оскільки воно не залежить від інвазивной процедури одержання тканин для патологічної оцінки. При використанні придатних міток або інших відповідних виявлюваних біомолекул або хімічних речовин, антитіло за винаходом є особливо корисним для діагностичних і прогностичних застосувань in vitro і in vivo. Мітки для застосування в імунологічних аналізах, відомі фахівцям в даній області, включають ферменти, радіоізотопи, а також флуоресцентні, люмінесцентні і хромогенні речовини, у тому числі забарвлені частинки, такі як колоїдне золото, або латексні кульки. Придатні імунологічні аналізи включають імуноферментний аналіз (ELISA). Фахівцям у даній області добре відомі різні типи міток і способи кон'югації міток з антитілами за винаходом, такі як викладені нижче. Використовуваний у даному документі термін "онкогенний розлад, пов'язаний з експресією CXCR4" включає захворювання та інші розлади, при яких була показана присутність високих рівнів і аномально низьких рівнів CXCR4 (відхилення) у суб'єкта, що страждає від розладу, який, як було показано, або гадано є відповідальним за патофізіологію розладу, або є чинником, який сприяє погіршенню захворювання. Альтернативно, такі розлади можуть бути підтверджені, наприклад, підвищенням рівнів CXCR4 на поверхні клітин в уражених клітинах або тканинах пацієнта, що страждає від розладу. Підвищення рівнів CXCR4 може бути виявлене, наприклад, за допомогою антитіла 515H7 або hz515H7 за винаходом. Більше того, воно стосується клітин, які демонструють відносно автономний ріст, так що вони виявляють фенотип аберантного росту, який характеризується значною втратою контролю клітинної проліферації. Альтернативно, клітини можуть експресувати нормальні рівні CXCR4, але відзначатися аномальною проліферацією. У деяких втіленнях термін "підвищена експресія", який уживається по відношенню до CXCR4, стосується рівнів білка або експресії гена, які демонструють статистично значуще збільшення експресії (за даними експресії РНК або експресії білка) у порівнянні з контролем. Зокрема, мається на увазі застосування антитіла або його функціонального фрагмента чи похідного відповідно до винаходу, як описано, для діагностики in vitro онкогенного розладу, пов'язаного з експресією CXCR4, або для визначення in vitro прогнозу розвитку онкогенного розладу, пов'язаного з експресією CXCR4, наприклад, раку, пов'язаного з експресією CXCR4. Інший широкий аспект відповідно до винаходу стосується способу діагностики патологічного гіперпроліферативного онкогенного захворювання або схильності суб'єкта до патологічного стану, пов'язаного з експресією CXCR4, який включає визначення наявності або відсутності CXCR4-несучих клітин у зразку і діагностику патологічного стану або схильності до патологічного стану на основі наявності або відсутності зазначених CXCR4-несучих клітин. Діагностичні застосування антитіла за винаходом включають первинні пухлини, ракові метастази, ракові стовбурові клітини. Антитіло може бути присутнім у вигляді імунокон'югата або міченого антитіла, щоб одержати сигнал, який можна виявити та/або кількісно оцінити. 28