Спосіб лікування та запобігання хворобливому стану пацієнта, фармацевтична композиція
Формула / Реферат
1. Способ лечения или предотвращения болезненного состояния у пациента с применением эффективного количества фактора роста кератиноцитов (ФРК), входящего в состав фармацевтической композиции, путем стимулирования пролиферации или дифференцировки эпителиальных клеток, выбранных из группы, содержащей гепатоциты, пневмоциты типа II, муцин-продуцирующие бокаловидные клетки и другие эпителиальные клетки и их предшественники, содержащиеся в печени, легких и желудочно-кишечном тракте.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что болезненное состояние выбрано из группы: кожная патология, патологические состояния желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей, цирроз печени, острая печеночная недостаточность, токсический инсульт печени.
3. Способ по любому из пп. 1, 2, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция содержит неводный носитель.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что неводным носителем является коллаген, гиалуроновая кислота или карбоксиметилцеллюлоза.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что ФРК является природным ФРК, синтезированным химическим путем ФРК или рекомбинантным ФРК.
6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что рекомбинантный ФРК содержит аминокислотную последовательность природного ФРК.
7. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что ФРК содержит следующую аминокислотную последовательность:
или ее аналоги, варианты или химеры.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что рекомбинантный ФРК производится в бактериальных клетках, предпочтительно E. соli.
9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что его осуществляют in vivo.
10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что ФРК вводится путем инъекции, орально, местно, интраназально или введением через легкие.
11. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество ФРК для лечения или предотвращения болезненного состояния у пациента путем стимулирования пролиферации или дифференцировки эпителиальных клеток, выбранных из группы, содержащей гепатоциты, пневмоциты типа II, муцин-продуцирующие бокаловидные клетки и другие эпителиальные клетки и их предшественники, содержащиеся в печени, легких и желудочно-кишечном тракте.
12. Фармацевтическая композиция по п. 11, отличающаяся тем, что болезненное состояние выбрано из группы: кожная патология, патологические состояния желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей, цирроз печени, острая печеночная недостаточность, токсический инсульт печени.
13. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 11, 12, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый носитель является неводным носителем.
14. Фармацевтическая композиция по п. 13, отличающаяся тем, что неводным носителем является коллаген, гиалуроновая кислота или карбоксиметилцеллюлоза.
15. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 11-14, отличающаяся тем, что ФРК является природным ФРК, синтезированным химическим путем ФРК или рекомбинантным ФРК.
16. Фармацевтическая композиция по п. 15, отличающаяся тем, что рекомбинантный ФРК содержит аминокислотную последовательность природного ФРК.
17. Фармацевтическая композиция по п. 15, отличающаяся тем, что ФРК содержит следующую аминокислотную последовательность
или ее аналоги, варианты или химеры.
18. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 11-17, отличающаяся тем, что рекомбинантный ФРК производится в бактериальных клетках, предпочтительно E. соli.
19. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 11-18, отличающаяся тем, что ее используют in vivo.
20. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 11-19, отличающаяся тем, что она вводится путем инъекции, орально, местно, интраназально или введением через легкие.
Текст
1 Способ лечения или предотвращения болезненного состояния у пациента с применением эффективного количества фактора роста кератиноцитов (ФРК), входящего в состав фармацевтической композиции, путем стимулирования пролиферации или дифференцировки эпителиальных клеток, выбранных из группы, содержащей гепатоциты, пневмоциты типа II, муцинпродуцирующие бокаловидные клетки и другие эпителиальные клетки и их предшественники, содержащиеся в печени, легких и желудочнокишечном тракте 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что болезненное состояние выбрано из группы кожная патология, патологические состояния желудочнокишечного тракта и дыхательных путей, цирроз печени, острая печеночная недостаточность, токсический инсульт печени 3 Способ по любому из пп 1, 2, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция содержит неводный носитель 4 Способ по п 3, отличающийся тем, что неводным носителем является коллаген, гиалуроновая кислота или карбоксиметилцеллюлоза 5 Способ по любому из пп 1-4, отличающийся тем, что ФРК является природным ФРК, синтезированным химическим путем ФРК или рекомбинантным ФРК 6 Способ по любому из пп 1-5, отличающийся тем, что рекомбинантный ФРК содержит аминокислотную последовательность природного ФРК 7 Способ по любому из пп 1-5, отличающийся тем, что ФРК содержит следующую аминокислот ную последовательность ШєІ KGF-dsd TATGTCCAATGAC^TCACTCCAGAGCAAATCKCTACAAATGTG^ACTGTTCCAGCCCTGA ACACGTTACTGTACTCAGGXCTCGTTTACCGATCTTTACACTTGACAAGGTCGGGnCT M C N D M T P E Q H A T N V H C S S P E G CC ACAC^CAAGAAGTTA?GATTACA?GGAAGGAGGGGATATAAGAraSAGAAG ЧСТСТГ CG CTCTu7CTTC~TCA~ TACT AATGfАССТТССГССССТАТАТТСТСАСТСТТСГОАСAA R J T R S V D Y K E G G D I R V R R L F Kpnl ] синтетическая ДНК CTGTCGAACACAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGA GACAGCTTGTGTCACCATGGACGCATASCTGrrTGCGCCGTrrCAGTTCCCGTGGGI-rCT R T Q W Y L K I D K G К V К G T Q GATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTXTCGrTGCAAT CTACTTTTTGTTI^rGirATAATACCTTTAGGCJVTGACAACC^iCAACCATAGCAACGTra M К N N Y N 1 M E I R T V A V G I V A I EcoRI CAAAGGTGTTGAATCTGAAITCTArCiraCAATGAACMGGAAGGAAAACTCTATGCAAA GTTTCCACAACTTAGACTTAAGATAC^ACSTTACTTGTrCCTTCCTTrrGAGATACGrrT К G V 2 S E Y L A M N K E G K L Y A K CTTTCTTACGTTACrrCTAACATTGAAGlTrCTTGATTAAGACCrnTGG'rAATG'rTGTG K E C » E I > C H F K E L I L E N u Y t 3 T О ATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATCTTTGT^KrCTTAAATCAAAA TATACGTAGTCGATH'ACCTGTGT^riGCCTCCCC'rTrACAAACAACGGAATTrAGrrrr Y A S A K W T H H G G E H F V A L K Q K GGGGATTCCTGTAAGAKAAAAAAAACCAAGnAAGAACAAAAAACAGCCCACTTTCTTCC ССССТААШАСАТТСТССТГГТГІТК^ТІСТТТГТТСТТІТГТОТСИСТОАААОААОС G I P V R G K K T K K E Q K T A K F L P TATGGC AATAACTT AAT AG или ее аналоги, варианты или химеры 8 Способ по любому из пп 1-7, отличающийся тем, что рекомбинантный ФРК производится в бактериальных клетках, предпочтительно Е coh 9 Способ по любому из пп 1-8, отличающийся тем, что его осуществляют in vivo 10 Способ по любому из пп 1-9, отличающийся тем, что ФРК вводится путем инъекции, орально, местно, интраназально или введением через легкие 11 Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество ФРК для лечения или предотвращения болезненного состояния у пациента путем стимулирования пролиферации или дифференцировки эпителиальных клеток, выбранных (О о (О 46706 из группы, содержащей гепатоциты, пневмоциты типа II, муцин-продуцирующие бокаловидные клетки и другие эпителиальные клетки и их предшественники, содержащиеся в печени, легких и желудочно-кишечном тракте 12 Фармацевтическая композиция по п 11, отличающаяся тем, что болезненное состояние выбрано из группы кожная патология, патологические состояния желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей, цирроз печени, острая печеночная недостаточность, токсический инсульт печени 13 Фармацевтическая композиция по любому из пп 11, 12, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый носитель является неводным носителем 14 Фармацевтическая композиция по п 13, отличающаяся тем, что неводным носителем является коллаген, гиалуроновая кислота или карбоксиметил целлюлоза 15 Фармацевтическая композиция по любому из пп 11-14, отличающаяся тем, что ФРК является природным ФРК, синтезированным химическим путем ФРК или рекомбинантным ФРК 16 Фармацевтическая композиция по п 15, отличающаяся тем, что рекомбинантный ФРК содержит аминокислотную последовательность природного ФРК 17 Фармацевтическая композиция по п 15, отличающаяся тем, что ФРК содержит следующую аминокислотную последовательность Ndel KGF-dsd TATGTGCAATCACATGA C^CC? ACAGGTrACTGTACTGAGG: M C K D M T P E :AAATOGCTACAAATGTGAACKrrrCCAGCCCTGA 3TITACCQATGTrTACACTTGACAAG3TCGGGACT Q M A T H V N C S S P E ЧрїіІ E T 0 W синтетическая ДНК L R I D K R G K V K G T Q GATGAAAi^CAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTCTT^TGTTGGTATCGTTGCAAT CTACTrrTTCTTGATGTTATAATACCTTrAGGCATGACAACGACAACCATAGCAACGTTA M K K K V i M I K E I R T V A V G I V A I CAAAGGTGrTQAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAA GTTrCCACAACrrAGACTTAAGATAGAACGTTACTTGTTCCTTCCrrrrGAGATACGrrT K G V E S E F Y L A M N K E G K L Y A K GAAAGAATGCAATGAAGATTGT AACTTCAAAG ^ACTAATTCreGAAAACCATTACAACAC K E C H E D C N F K E L I L E I J H Y N T ATATCCATCAGCTAAA^^ACACACAACGGAGGGGAAATGTrTGTTGCCTTAAATCAAAA TATACGTAGTCGArrrACCTCTGTGTTGCCTCCCCnTACAAACAACGGAATTrAGTTTT Y A S A X W T B N G G E M F V A L N Q K CCCCTAAGGACArrCTCCTTTTTITTGCrrCTrTCTTGTTrrrTGTCGGGTGAAAGAAGG G I P V R G K K T K K E Q X T A H F L P TATGGCAATAACTTAATAG f A I За-НІ или ее аналоги, варианты или химеры 18 Фармацевтическая композиция по любому из пп 11-17, отличающаяся тем, что рекомбинантный ФРК производится в бактериальных клетках, предпочтительно Е coli 19 Фармацевтическая композиция по любому из пп 11-18, отличающаяся тем, что ее используют in vivo 20 Фармацевтическая композиция по любому из пп 11-19, отличающаяся тем, что она вводится путем инъекции, орально, местно, интраназально или введением через легкие GCGACACACAAGAAGTTATGXTTACnTGSAAGaAGGGGATATAAGAGTGAGAAGACTCTT CGCTGTGTGTTCTTCAXTACTAATCTACCTTCCTCCCCTATATTCTCACTCTTCTGACAA Е Н Т R S D Y H E G G D I R V R R L Настоящее изобретение относится к применению фактора роста кератиноцитов (ФРК) для стимулирования пролиферации, роста и дифференцировки клеток, отличных от кератиноцитов, а также предусматривает введение ФРК пациентам, для которых указанные биологические эффекты могут быть полезны при регенерации поврежденных или больных клеток и тканей Достижения биотехнологии в последние годы привели к разработке и терапевтическому применению новых рекомбинантных полипептидов, включая эритропоэтин и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, что принесло реальную пользу многим больным Был открыт ряд и других полипептидов, обладающих биологическими эффектами in vitro Однако для выяснения потенциальных терапевтических применений таких факторов необходимо установить, какие клетки являются мишенями их действия и определить биологические эффекты данных факторов in vivo ФРК - известный митоген, первоначально идентифицированный как специфический ростовой фактор эпителиальных клеток, в частности, кератиноцитов Rubin et al , Proc Natl Acad Sci USA 86 802-806 (1989), Finch et al , Science, 245 752755 (1989), Marchese et al ,J Cell, Phys 144 326332(1990) Экспрессия мРНК ФРК была обнаружена в нескольких линиях стромальных фибробластов, полученных из эмбриональных, неонатальных и тканей взрослого человека Эта РНК была выделена из нормальной взрослой почки и желудочно-кишечного тракта Подобная РНК не была обнаружена в глиальных клетках, легких, мозге, или же различных клеточных линиях эпителиальной природы, таких как чешуе клеточные карциномы, эпителиальные клетки молочной железы, иммортализованные клетки эпителия бронхов, иммортализованные кератиноциты ,а также в культурах первичных кератиноцитов (Finch et al , Science, см выше) Однако ФРК митогенно активен в отношении клеток перевиваемой мышиной линии BALB/MK Weismann and Aaronson, Cell, 32 599 (1983), см также PNAS и Science выше Это наблюдение свидетельствует в пользу паракринного действия ФРК в коже, с образованием ФРК в дермисе (но не в эпидермисе) и влияния 46706 ФРК на кератиноциты ляцию Кроме того, экспрессией генов филагрина и Буллозный эпидермолиз (болезнь Гольдшейкератинов было показано влияние ФРК на дифдера) представляет собой нарушение прикреплеференцировку и созревание кератиноцитов См ния эпидермиса к подлежащей дерме, что проявJ Cell Phys выше ляется в образовании открытых болезненных Большинство упомянутых работ по исследоволдырей Ускоренная реэпителизация таких пованию биологической активности ФРК было вывреждений, достигаемая применением ФРК, приполнено с использованием рекомбинантного ФРК, вела бы к снижению риска инфицирования, снидоступность которого позволила значительно жению болезненности и меньшей частоте расширить изучение данного фактора В опублиперевязок кованной заявке РСТ (WO) 90/08711 описана очиВ ходе химиотерапии неоплазий у большого стка ФРК из кондиционированной среды линии числа больных наблюдается облысение как реклеток эмбриональных фибробластов человека, зультат такой терапии В настоящее время нет частичная аминокислотная последовательность терапевтических средств, которые предотвращали выделенного полипептида, клонирование гена и бы гибель клеток волосяных фолликулов, привоего экспрессия в бактериальных клетках (Е coh) дящую к временной потере волос ФРК может для получения рекомбинантного, биологически служить таким терапевтическим средством активного ФРК Облысение у мужчин широко распространено и практически не поддается лечению ПрогрессиПоскольку роль ФРК как стимулирующего рующая утрата волос у мужчин и женщин являетагента для кератиноцитов in vitro была точно устася серьезной косм етологи чес кой проблемой Это новлена, предстояло изучить, на какие другие тинарушение могло бы излечиваться системным или пы клеток ФРК может воздействовать как ростоже местным применением ФРК при абсорбции вой фактор и охарактеризовать эти возможные препарата кожей головы или путем распыляющих воздействия in vivo инъекций в кожу головы при помощи воздушного Для понимания возможной роли ФРК как тепистолета или других подобных методов введерапевтического препарата подобная информация ния была особенно необходима Вкратце, настоящее изобретение основано на Язвы желудка, хотя и поддающиеся лечению обнаружении стимулирующего воздействия ФРК Н2-антагонистами, широко распространены и часна эпителиальные клетки, отличные от кератиното возобновляются снова и снова Их заживление цитов В частности, в настоящее время установпроисходит через образование рубца на слизилено, что in vivo ФРК индуцирует пролиферацию и стой оболочке Возможность ускоренной регенедифференцировку в таких нормальных экстраэмрации железистой слизистой оболочки благодаря бриональных структурах, как себоциты (клетки применению ФРК стала бы значительным усосальных желез) и клетки волосяного фолликула, вершенствованием терапии язв желудка гепатоциты и клетки слизистого дыхательного Как и язвы желудка, язвы двенадцатиперстной эпителия (пневмоциты типа II) Имеются также кишки поддаются лечению, однако разработка серьезные указания на то, что ФРК стимулирует терапевтического агента для более полной и бопролиферацию и рост клеток слизистой оболочки лее быстрой регенерации слизистой оболочки пищеварительного тракта, таких как муцин - обрадвенадцатиперстной кишки явилась бы значизующие бокаловидные клетки железистой части тельным достижением Безусловно, терапевтичежелудка и тонкого кишечника, клетки крипт прямой ский агент для регенеративного заживления таких кишки и другие эпителиальные клетки пищевариязв и снижения частоты их рецидивов был бы тельного тракта весьма полезен ФРК обладает таким потенциалом Данные наблюдения, послужившие основой настоящего изобретения, могут иметь существенВоспалительные заболевания кишечника, таное значение для коррекции нарушений, связанкие как болезнь Крона (затрагивающая в основном ных с повреждением или недостаточностью укатонкий кишечник) и язвенный колит (поражающий занных типов клеток Далее описаны заболевания в основном толстый кишечник) - это хронические и медицинские показания, по которым может быть заболевания невыясненной этиологии, приводяприменен ФРК согласно настоящему изобретещие к разрушению слизистой оболочки, воспалению нию, образованию рубцов и спаек при заживлении Частота этих заболеваний довольно высока Стимуляция пролиферации и дифференциСуществующая на сегодня терапия в основном ровки таких экстраэмбриональных структур, как направлена на сдерживание воспаления Такие волосяные фолликулы, потовые железы и сальтерапевтические средства как ФРК, стимулируюные железы, являются чрезвычайно важными для щие восстановление слизистой оболочки и приворегенерации эпидермиса и дермы у пациентов с дящие к более быстрому заживлению, могут окаожогами и другими повреждениями кожи различзаться чрезвычайно полезными при лечении ной глубины В настоящее время поверхностные подобных заболеваний повреждения заживляются путем образования шрамов с выходом на поверхность кератиноцитов, Основным ограничением для различных схем полная регенерация кожи все еще невозможна химио- и радиотерапии является токсичность соРепопуляции волосяных фолликулов, потовых ответствующих терапевтических факторов для желез и сальных желез на всю толщину дефектов клеток пищеварительного тракта Предварителькожи, включая ожоги, все еще не происходит Исное введение ФРК может иметь протективный пользование ФРК делает возможной эту репопуэффект в отношении слизистой оболочки тонкого 8 46706 кишечника, что позволит увеличить дозы химио- и цитопротективного по отношению к гепатоцитам радиотерапии с уменьшением нежелательных Таким образом, настоящее изобретение попобочных эффектов священо терапевтическому (а в отдельных случаВоздействие ФРК приводит к значительному ях и профилактическому) применению ФРК при увеличению образования слизи в пищеварительуказанных болезненных состояниях, а также фарном тракте Эта особенность может иметь сущемакологическим препаратам, содержащим ФРК в ственное значение для защиты слизистой оболочтерапевтических дозах ки от повреждающих веществ, попадающих в Краткое описание фигур пищеварительный тракт, или же препятствовать На Фиг 1 представлена нуклеотидная послераспространению повреждений в случае воспалидовательность синтетического олигонуклеотида, тельных процессов в кишечнике использованного для получения рекомбинантного ФРК, который в свою очередь был использован в Поражения гиалиновых мембран у недоноописанных ниже экспериментах in vivo шенных младенцев приводят к отсутствию поверхностного образования пневмоцитов типа II в На Фиг 2 представлено модельное поврежделегких, что в свою очередь ведет к разрушению ние уха кролика на неполную толщину дермы, альвеол Хотя кортикостероиды могут в значизатрагивающее хрящ и которое позволяет количетельной степени ускорять созревание пневмоциственно оценить рост новой ткани тов у плода, начиная с двадцати восьминедельноНа ФигЗ отражена реэпителизация обрабого возраста, подобной терапии для эмбрионов танных ФРК и контрольных модельных повреждеболее раннего возраста не разработано, что приний, описанных на Фиг 2 Слева показана общая водит к значительной смертности Такой терапевплощадь регенерирующего эпителия после обратический агент как ФРК, индуцирующий пролифеботки ФРК, а справа - процент реэпителизации рацию и дифференцировку пневмоцитов типа II, ран значительно облегчил бы лечение подобных заНа Фиг 4 показана пролиферация базальных и болеваний супрабазальных кератиноцитов на краях раны на пятый день после обработки ФРК с использованиОтравление дымом через дыхательные пути ем той же модельной системы является серьезной причиной смертности в первую неделю ведения после ожоговых больных, что На Фиг 5 приведен гистологический анализ обусловлено некрозом бронхиолярного эпителия обработанных бромдезоксиуридином (Brdll) волои альвеол Такой ростовой фактор как ФРК, спосяных фолликулов в контрольных и обработанных собный индуцировать пролиферацию и диффеФРК ранах Видна пролиферация клеток ренцировку указанных структур, может внести суНа Фиг 6 представлена окраска красным масщественный прогресс в лечение отравлений ляным красителем сальных желез в контрольных такого рода и обработанных ФРК ранах При эмфиземе легких наблюдается прогресНа Фиг 7 и 8 показано микрососочковое разсирующая утрата альвеол ФРК может стимулирорастание эпителиальных клеток перегородок альвать рост новых альвеол и защищать оставшиеся, веол в легких здоровых крыс, интратрахеально что безусловно имеет терапевтическое значение обработанных ФРК В настоящее время эффективная терапия эмфиНа Фиг 9 и 10 показан кубоидальный рост эпизем не разработана телиальных клеток в альвеолах больших сегментов легких после интратрахеального введения Цирроз печени, развившийся как следствие ФРК тем же здоровым крысам вирусного гепатита или хронического употребления алкоголя, имеет высокую частоту и является На Фиг 11 и 12 видно, что гиперпластические серьезной причиной смертности Пролиферация и эпителиальные клетки, выстилающие перегородки дифференцировка гепатоцитов, индуцированная альвеол, у крыс, обработанных ФРК, содержат ФРК, может улучшить работу печени и затормопластинчатые включения различного размера и зить или предотвратить развитие цирроза формы Острая печеночная недостаточность, развиНа Фиг 13 А показано гиперпластическое возвающаяся на конечной стадии цирроза, представдействие ФРК на бронхиальный эпителий после ляет угрозу для жизни Препарат, который подобинтратрахеального введения здоровым крысам но ФРК, способен индуцировать пролиферацию На Фиг 13 В показан бронхиальный эпителий оставшихся гепатоцитов, будет оказывать теракрыс контрольной (по отношению к представленпевтический эффект в случае острой печеночной ным на Фиг 13А) группы недостаточности, единственным методом лечения На Фиг 14 представлены результаты теста которой на сегодня является пересадка печени защиты от РНКазы РНК рецептора ФРК в легких взрослой крысы Острый вирусный гепатит часто имеет субклиническое и непродолжительное течение Однако, На Фиг 15 показано увеличение веса органов у небольшой части больных острое поражение пищеварительного тракта и печени в зависимости печени может наблюдаться в течение нескольких от дозы применяемого в течение четырех дней недель Цитопротективный агент, подобный ФРК, ФРК способен предотвратить гепатоцеллюлярную деНа Фиг 16 показано увеличение синтеза белка герацию в печени крыс, обработанных ФРК в течение четырех дней Печеночные отравления, вызванные ацетаминофеном, галотаном, четыреххлористым углероФиг 17 демонстрирует увеличение пролифедом и другими ядами, могут быть облегчены прирации гепатоцитов в печени животных, получавменением ростового фактора (ФРК), ших ФРК от одного до семи дней Уровень проли 46706 10 ферации определяли путем мечения Brdll (А) или Для определения специфических типов эпиподсчетом митозов (В) телиальных клеток, на которые ФРК оказывает значительный биологический эффект, обусловлиНа Фиг 18 и 19 показано восстановление масвающий возможное терапевтическое применение, сы печени после обработки ФРК у крыс, перенесбыли предприняты широкие исследования на жиших частичную гепатоэктомию вотных с введением ФРК in vivo и тщательным На Фиг 20 показано увеличение уровня сывоанализом полученных результатов Рекомбинантроточной глутаматоксалоацетат трансаминазы ный ФРК, использованный в каждом из приведен(СГОТ) в сыворотке отравленных четыреххлориных ниже примеров, получали следующим обрастым углеродом крыс Увеличение наступило в зом результате обработки ФРК На Фиг 21 показано увеличение длины желуРекомбинантный ген ФРК был синтезирован дочных желез и количества слизи, образуемой в полимеразной цепной реакцией на основе РНК железистом желудке крыс, получавших ФРК от фибробластов крайней плоти человека (AG1523) и одного до семи дней полученная ДНК был встроена в вектор экспрессии pCFM1156 между сайтами рестрикции Ndel и На Фиг 22 показано увеличение длины дуодеBamHI Плазмида рСРМ1156 может быть полученальных крипт и количества слизи, образуемой в на из плазмиды pCFM836, описанной в патенте тонком кишечнике крыс, получавших ФРК от одноСША №4,710,473, путем удаления двух эндогенго до семи дней ных сайтов рестрикции Ndel с заполнением концов На Фиг 23 показано увеличение доли гиперпри помощи Т4-полимеразы, последующим легипластических крипт в толстом кишечнике крыс, рованием по тупым концам и замещением неполучавших ФРК от одного до семи дней большого фрагмента ДНК между уникальными На Фиг 24 показано увеличение глубины крипт сайтами рестрикции Clal и Kpnl следующим олигов толстом кишечнике крыс, получавших ФРК от нуклеотидным дуплексом, состоящим из последоодного до семи дней вательности № 1 и последовательности № 2 Описание специфических применений ФРК Clal Kpnl 5'CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC3' 1 З TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5 і Плазмида pCFM1156KGF была затем введена в клетки FM5 при помощи стандартной процедуры электротрансформации (прибор BioRad Gene Pulser) Для снижения внутренней инициации трансляции последовательность ДНК в гене ФРК между сайтами рестрикции Kpnl и EcoRI была заменена синтетическим олигонуклеотидом, сконструированным таким образом, чтобы снизить возможность использования внутреннего сайта связывания рибосом (Фиг 1 ) После лигирования и трансформации клеток FM5 был отобран клон, содержащий плазм иду pCFM1156KGF-dsd Правильность последовательности нуклеотидов гена ФРК в данной плазмиде была подтверждена секвенированием Клетки затем культивировали при 30°С в 10-литровых ферментерах в стандартной ростовой среде, что позволяло клеткам достичь экспоненциальной фазы роста в условиях дефицита глюкозы, предотвращающего накопление токсичных побочных продуктов При средне - экспоненциальной плотности клеток температуру кратковременно поднимали до 42°С, чтобы индуцировать транскрипцию гена ФРК, а затем поддерживали на уровне 37°С на протяжении всего оставшегося времени ферментации Клеточную массу собирали и хранили в замороженном состоянии Биологически активный ФРК очищали из механически лизированных бактерий стандартными хроматографическими методами, используя тот факт, что белок имеет очень высокую изоэлектрическую точку (колонки с S-сефарозой Fast Flow фирмы Pharmacia) и размер (Superdex 75 Pharmacia) Очищенный рекомбинантный ФРК проверяли на наличие эндотоксинов и на биологическую активность в митогенном тесте как описано Rubin с соавт (см PNAS, выше) Пример 1 ФРК- стимулируемые пролиферация и диф ференцировка экстра эмбриональных структур на модели заживления ран in vivo В настоящем Примере была использована раневая модель с повреждением уха кролика на неполную толщину дермы Модель кожной язвы на ухе кролика, описанная Mustoe et al , (J Clm Invest, 87 694-703, 1991), была модифицирована с образованием раны через хрящ до дермиса с обратной стороны уха с помощью 6 мм трепана В результате заживление раны происходило распространением эпителиальных элементов под хрящом, сжатие раны в процессе заживления было невелико, что давало возможность точно оценить размеры вновь образуемых тканей (см Фиг 2) В качестве терапевтического агента для заживления ран был использован рекомбинантный ФРК, полученный описанным выше способом Материалы и методы ФРК или, в контроле, растворитель (фосфатный буферный раствор) наносились однократно в день операции и раны (площадью 0,25см кв) закрывали специальным защитным покрытием Tegadeim (ЗМ Company, St Paul, MN) Перед забоем каждому животному внутривенно вводили Brdll (Aldnch Chemical Company, Milwaukee, Wl) в количестве 50 мг на килограмм веса тела Введение Brdll давало возможность количественно оценить степень пролиферации базальных кератиноцитов и кинетику миграции базальных клеток по направлению к сосочковому слою и роговому слою После забоя из каждой раны было приготовлено два образца, один образец замораживали в "среде оптимального охлаждения" (COO, Miles Inc , Elkhardt, IN), второй образце фиксировали в среде Ommfix (Al-Con, Genetics Inc , Melville, NY), a затем подвергали обработке согласно стандартным гистологическим методам Срезы толщиной 3 мкм, приготовленные из 11 46706 12 каждой раны, окрашивали Masson Tnchrome, масные срезы толщиной 7 мкм высушивали на воздуляным красным, а также иммуногистохимически хе и фиксировали в цинк-формалине в течение 10 минут Затем препараты погружали в 0,3% Измерение реэпителизации (вес/объем) раствор масляного красного (Sigma Измерения полного просвета раны и эпителиChemical Co , St Louis,МО), затем в 60%-ный изоального просвета для каждой раны производили с пропанол на 30 минут при комнатной температуре, помощью калиброванного стационарного микрообесцвечивали в 60%-ном изопропаноле и окраметра Процент реэпителизации для каждой раны шивали гематоксилином Лернера Определяли рассчитывали, деля разницу в площади между размер сальных желез и число клеток в железе полным просветом и эпителиальным просветом на площадь полного просвета Данные для двух Результаты и обсуждение срезов каждой раны усредняли Отклонения в изПри обработке ран ФРК в дозах 4-40мкг/см кв мерениях эпителиального просвета и в проценте наблюдалась ускоренная реэпителизация и увереэпителизации анализировали по распределеличение толщины эпителия На пятый день после нию Стьюдента обработки в ранах отмечена усиленная в сравнении с контролем реэпителизация (76,7% против Для каждой использованной дозы ФРК рас52,5%, 1 мкг ФРК) К пятому и седьмому дню после считывали площадь вновь образованного эпитеобработки плотность эпителия увеличивалась в лия в опыте и в контроле Результаты этих экспезависимости от дозы ФРК и при дозе 10 мкг на риментов были обработаны по методам Даннетта рану площадь эпителия в два раза превышала и ANOVA (вероятностные тесты) таковую в контроле (ФигЗ) Гистологический анаИзмерение пролиферации и дифференцировлиз дает основания считать, что регенерация эпики эпителиальных клеток телия происходит в основном за счет распростраПарафиновые срезы тканей толщиной Змкм нения в дерме экстра эмбриональных элементов, окрашивали антителами против Brdll (Dako Corp а именно сальных желез, потовых желез и волоCarpmtena.CA), авидинбиотиновым комплексом сяных фолликулов (Vector Laboratories Inc , Burlmgame, CA) и диаминобензидином (ДАВ, Sigma Chemical Co , St Louis, Анализ пролиферации базальных кератиноциМО) Срезы обрабатывали 0,1% раствором протов и миграции базальных клеток показал увелитеазы, а затем 2н HCI Эндогенную пероксидазу чение числа пролиферирующих базальных кераподавляли обработкой 3%-ной перекисью водоротиноцитов по краям раны уже на первый день да после обработки ФРК (Фиг 4) Ко второму дню после обработки ФРК возросшее число пролифериСрезы обрабатывали 10%-ным раствором рующих кератиноцитов в супрабазальном слое нормальной лошадиной сыворотки в фосфатном указывает на сокращение времени перехода пробуферном растворе, а затем инкубировали с антилиферирующих клеток в сторону сосочкового BrdU антителами в разведении 1 400 в 1%-ном слоя К пятому дню после обработки пролиферабычьем сывороточном альбумине После отмывация клеток в базальном слое уменьшается, что ния срезы инкубировали 20 минут в коньюгироуказывает на само ограничивающееся ускорение ванном с пероксидазой авидин-биотиновом комвосстановления эпителия и дифференцировки плексе в разведении 1 100 в 1%-ном бычьем (Фиг 4) сывороточном альбумине Затем срезы обрабатывали ДАВ (10мг ДАВ, 20мл фосфатного буферКератиноциты претерпевают нормальное соного раствора, 20мкл 30% перекиси водорода) в зревание по мере их миграции вверх и образоватечение 10 минут ния рогового слоя Неожиданно была обнаружена усиленная пролиферация себоцитов и волосяных Фоновую окраску срезов проводили гематокфолликулов В ранах, обработанных ФРК, по силином сравнению с контрольными и волосяные фоллиГистологический анализ волосяных фолликукулы, и сальные железы были многочисленней и лов, обработанных BrdU крупнее (Фиг 3 и 6, соответственно) После включения BrdU и ІНС-окрашивания определяли общее число фолликулов в раневом Анализ гистологических препаратов, окрашенложе и данные обрабатывали по компаративному ных масляным красным для дифференциального тесту Kruskall-Walhs Дальнейший анализ включал выявления сальных желез, показал значительно определение для каждой группы животных коливозросшее число таких желез и увеличение их чества ран (в процентах), в которых были фоллиразмеров, что указывает на усиленную пролифекулы с десятью или более пролиферирующими рацию и дифференцировку себоцитов в зрелые клетками (Chi-square тест) Кроме того, для всех салопродуцирующие клетки В обработанных ФРК фолликулов, имеющих более пяти пролифериранах отмечено также дозо-зависимое увеличение рующих клеток, определяли число клеток, полочисла пролиферирующих клеток в волосяных жительных по окраске на BrdU фолликулах Ранее на раневой модели уха кролика были проверены эпидермальныи фактор роста Окрашивание сальных желез масляным крас(EGF) и основной фактор роста ным фибробластов(Г-СГ-)(и Clm Invest ,87 694-704,1991 Для идентификации себоцитов и сальных жеи Pierce et al ,Amer J Pathol 140 1375-1388, 1992) лез была применена окраска масляным красным, Хотя известно, что оба эти фактора стимулируют нейтральным красителем, специфичным для нейреэпителизацию, ни EGF, ни основной FGF не тральных липидов Окрашивание проводили на влияют на пролиферацию и дифференцировку замороженных срезах по методу, описанному таких экстра эмбриональных структур, как сальF L Carson Histotechnology A Self-lnstuctional Text, ные железы и волосяные фолликулы СпособASCP Press, Chicago (1990) Вкратце, заморожен 13 46706 ность ФРК стимулировать пролиферацию и последующую дифференцировку в коже эпителиальных клеток различных типов вместе с тем фактом, что он был первоначально выделен из фибробластов, дают основания считать ФРК мощным паракринным стимулятором регенеративных процессов в коже Пример 2 ФРК- стимулирование пролиферация и дифференцировка пневмоцитовтипа II in vivo Настоящие эксперименты были проведены с целью оценки воздействия ФРК на эпителиальные клетки респираторного тракта здоровых крыс Материалы и методы Самцам крыс Lewis весом 200-250г однократно интратрахеально вводили различные дозы ФРК, разведенного в физиологическом растворе или фосфатном буферном растворе согласно протоколу, описанному Ulich et al , Amer J Pathol , 138 1485-1496, 1991 ФРК вводили в дозах 0,1, 1,0, 5,0 и 10,0 мг/кг веса Контрольные крысы получали интратрахеальные инъекции растворителя Через шесть часов, один, два, три, четыре, пять и шесть дней после введения ФРК животных забивали, через интратрахеальный катетер легкие заполняли фиксатором Буэна, сагиттальные срезы легких заключали в парафин и гистологические препараты окрашивали гематоксилин - эозином Результаты и обсуждение ФРК в дозе 0,1 мг/кг не вызывает гистологически различимой гиперплазии эпителиальных клеток альвеол ФРК в дозе 1,0мг/кг вызывает незначительное, но различимое увеличение числа альвеолярных эпителиальных клеток Значительная гиперплазия этих клеток отмечена при дозах ФРК, равных 5,0 и 10,0мг/кг ФРК не вызывал гистологически различимой гиперплазии эпителиальных клеток на сроках 6 и 24 часа после интратрахеального введения На второй день после введения ФРК в легких крыс отмечены островковые микрососочковые разрастания эпителиальных клеток перегородок альвеол (Фиг 7, 8) На третий день в больших сегментах легких в выстилке целых альвеол отмечен низко-кубический и кубический рост альвеолярных эпителиальных клеток При этом некоторые области легких сохраняют нормальную гистологическую картину Гистологическая картина гиперпластического альвеолярного эпителия у крысы на третий день после введения ФРК практически совпадает с картиной реактивной гиперплазии пневмоцитов типа II в легких человека На четвертый и пятый день после интратрахеального введения ФРК количество гиперпластического альвеолярного эпителия в легких крыс заметно снижается На шестой день легкие контрольных и ФРК-обработанных крыс были неразличимы Легкие ФРК-обработанных крыс подвергли ультраструктурному анализу на третий день после интратрахеального введения ФРК Гиперпластические альвеолярные эпителиальные клетки, выстилающие перегородки альвеол, неизменно содержали одно или более пластинчатое включение различных форм и размеров (Фиг 11,12) На третий день после введения ФРК бронхиальный эпителий у крыс был также гиперпластичен, но эта 14 гиперплазия была не столь явной, как в случае альвеолярных эпителиальных клеток Проявлениями бронхиальной гиперплазии считают псевдорасслоение (псевдостратификацию) эпителиальной выстилки малых дистальных бронхов, которые в норме выстланы однослойным эпителием, пучковый или сосочковый рост бронхиального эпителия, а также увеличение числа митозов в бронхиальном эпителии (Фиг 13А, 13В) Введенный интратрахеально ФРК вызывает резкую гиперплазию альвеолярных эпителиальных клеток Наличие пластинчатых цитоплазматических включений в этих клетках подтверждает предположение о том, что эти клетки являются пневмоцитами типа II Эти пластинчатые включения немногочисленны и не окрашиваются осмием, в отличие от подобных включений, описанных в некоторых случаях экспериментальной гиперплазии пневмоцитов типа II у крыс Они гораздо больше напоминают пластинчатые включения, встречающиеся в клетках легких нормальных крыс Кроме гиперплазии альвеолярного эпителия ФРК вызывает гиперплазию бронхиального эпителия Возможно, что гиперпластический альвеолярный эпителий представляет собой прорастание бронхиального эпителия из терминальных бронхиол в альвеолярную паренхиму Однако, более вероятно, что ФРК действует прямо на пневмоциты типа II, о чем свидетельствует многофокусный микрососочковый характер роста пневмоцитов в перегородках альвеол на второй день после введения ФРК Такой рост предшествует образованию непрерывной выстилки альвеол кубическими клетками на третий день после введения ФРК Кроме того, пневмоциты типа II считают митотически активными клетками эпителия альвеол и именно эти клетки должны отвечать пролиферацией на такой эндогенный медиатор роста альвеолярных клеток, каким является ФРК Наконец, идентификация пластинчатых включений в гиперпластических клетках дает основания считать что эти клетки не только дифференцируются в пневмоциты типа II, но и происходят из этих пневмоцитов Стимулирующий эффект ФРК на пневмоциты типа II подтверждается еще и данными о том, что количество мРНК рецептора ФРК на эквивалентное количество общей РНК в легких в два-три раза выше по сравнению с другими органами молодых взрослых крыс В этих опытах количество мРНК рецептора ФРК определял и модифицированным методом защиты от РНКазы Ambion (RPAII, №1410) "Антисмысловая" -РНК, использованная в этих экспериментах, имела следующую последовательность (SEQ ID No 3) 5GAAUACGAAUUCCUUGCUGUUUGGGCAGGACAGUGA GCCAGGCAGACUGGUUGGCCUGCCCUAUAUAAUUGG AGACCUUACAUAUAUAUUCCCCAGCAUCCAUCUCCG UCACAUUGAACAGAGCCAGCACUUCUGCAUUGGAGC UAUUUAUCCCCGAGUGGAUC 3 "Антисмысловая" проба была приготовлена с помощью набора Riboprobe Gemini II фирмы Promega (#2020) на матрице линеаризованной ДНК, кодирующей соответствующую последовательность, описанную выше Проба РНК была выделена из содержащего мочевину полиакриламидного геля путем вырезания полосы соответст 15 46706 16 вующего размера и элюции РНК в растворе Ambiражали в граммах по отношению к 100 граммам on F веса тела (процент к весу тела) Образцы тканей помещали в 10%-ный забуференный формалин "Смысловая" РНК, кодирующая последовадля последующего гистологического исследовательность, комплиментарную "антисмысловой" ния пробе, имеет следующую структуру (SEQ Ю N0 4) Срезы печени окрашивали гематоксилином и эозином (Г и Э) За час до умерщвления крысам 5GGGAGACMGCUUGCAUGCCUGCAGGUCGACUCUAG интраперитонеально вводили 50мг/кг Brdll Для AGGAUCCACUCGGGGAUAAAUAGCUCCAAUGCAGAA визуального выявления Brdll, включившегося в GUGCUGGCUCUGUUCAAUGUGACGGAGAUGGAUGCU GGGGAAUAUAUAUGUAAGGUCUCCAAUUAUAUAGGG ДНК реплицирующихся клеток, использовали имCAGGCCAACCAGUCUGCCUGGCUCACUGUCCUGCCCA муногистохимический метод, основанный на исAACAGCAAGG 3 пользовании антител к Brdll "Смысловой" стандарт РНК приготавливали Индекс мечения (ИМ) печени определяли с немеченым (без радиоактивной метки) с испольпомощью калиброванной окулярной сетки Для зованием набора Riboprobe Gemini II, Promega каждого животного подсчитывали и усредняли (#2020) и очищали на колонке G50 Sephadex Quick десять полей зрения Определяли общее число spin ядер и число меченых ядер на единицу площади Для стандартизации подсчета все поля зрения на Согласно стандартному протоколу Ambion препаратах выбирали таким образом, чтобы они (RPA II #1410), 50 мкг тотальной РНК инкубироваприлегали к портальной триаде ли с 100000 с р т пробы сначала при 95°С четыре минуты, затем от двенадцати до восемнадцати Все данные анализировали по распределению часов при 45°С РНКаза (в разведении 1 500 в Стьюдента или тесту ANOVA для множественных растворе Ambion R) была добавлена к гибридизагрупп сравнения ционной смеси на сорок минут при 37°С, а затем Результаты и обсуждение был добавлен инактивирующий и осаждающий Для определения эффективной дозы ФРК исагент (раствор Dx) пользовали методику дозо-зависимого ответа ФРК инъецировали ежедневно в течение четырех Фрагменты РНК, защищенные от РНКазы, дней и забирали органы Вес печени, выраженный разделяли по размеру электрофорезом в полиакв процентах к весу тела, значительно отличался риламидном геле с мочевиной, а затем весь гель от контрольного только при самой высокой ежеэкспонировали с пленкой Phosphonmager Количедневной дозе ФРК (5 мг/кг) при сравнении метоственную оценку содержания РНК в полосах продом ANOVA (Фиг 15) Примечательно, что содерводили при помощи прибора Phosphonmager жание сывороточных белков, холестерина и фирмы Molecular Dynamics Результаты представтриглицеридов, синтезируемых печенью, было лен на Фиг 14 значительно выше по сравнению с контрольным Идентификация ФРК как ростового фактора при дозах ФРК 1,0 и 5,0 мг/кг (Фиг 16) пневмоцитов типа II открывает возможности терапевтического применения ФРК, который подобно Исследовали животных, которым ежедневно в кортикостероидам может быть использован для течение одного, четырех или семи дней вводили стимулирования созревания легких эмбриона ФРК в дозе 5 мг/кг Как показали исследования Другое возможное клиническое применение ФРК органов, печень была значительно увеличена в состоит в стимулировании бронхоальвеолярной размерах по состоянию на седьмой день эксперирегенерации после повреждения легких у взросмента Вес печени у получавших ФРК крыс был лых Пролиферативное действие ФРК на пневмосущественно увеличен во всех исследуемых врециты типа II дает основания предполагать его менных точках (седьмой день, ФРК 4,08 +- 0,08%, важную роль в регуляции синтеза и секреции сликонтроль 3,49 +- 0,06%, р=0,0003) Подсчет Brdllзи положительных ядер показал трех-четырех кратное превышение их числа у ФРК-обработанных Пример 3 крыс по сравнению с контрольными через день ФРК - стимулирование пролиферация и дифпосле введения ФРК (Фиг 17) Митотический инференцировка гепатоцитов декс, выраженный как число митозов в поле зреОценивали эффекты систематического введения при большом увеличении микроскопа, был ния ФРК на эпителиальные ткани печени взроссущественно выше по сравнению с контролем на лых крыс первый день после введения ФРК, что согласуется Материалы и методы с подсчетом BrdU-положительныхядер Самцы крыс получали воду и пищу ad libitum Всем животным ежедневно интраперитонеально Приведенные результаты указывают на сильвводили ФРК или фосфатный буферный раствор в ное митогенное и дифференцировочное воздейтечение одного, четырех или семи дней Во всех ствие ФРК на печень Быстрое увеличение веса экспериментах из каждой группы анализировали печени на первый день после введения ФРК в по крайней мере пять животных сочетании с увеличенным митотическим индексом и доли BrdU-положительных клеток указывают на Всех животных умерщвляли с помощью С02, быстрое и мощное воздействие ФРК на эту пресразу же после гибели забирали кровь путем серимущественно эпителиальную ткань Хотя митодечной пункции для получения сыворотки, кототическое воздействие ФРК быстро спадает, вес рую хранили замороженной до использования печени, выраженный в процентах к весу тела, Сыворотку анализировали обычным методом на продолжает возрастать в ходе экспериментов содержание химических веществ и электролитов Возрастание веса первоначально обусловлено Печень взвешивали слепым способом и вес вы 18 17 46706 увеличением числа клеток, гистологически разлиСС14 у каждой крысы брали пробу крови и опречимым уже через день после введения ФРК Это деляли уровень сывороточной глутаматже увеличение веса сохраняется на четвертый и оксалоацетаттрансаминазы (СГОТ) седьмой дни эксперимента Поскольку при регеРезультаты и обсуждение нерации масса печени может увеличиваться боКак видно из Фиг 20, подкожное введение ФРК лее чем в два раза менее чем за две недели, не после перорального введения удивительно, что столь существенные различия СС14 значительно увеличивает в сыворотке обнаруживаются уже через день после введения содержание фермента СГОТ, являющегося индиФРК катором повреждения печени Эффект особенно выражен при дозе 2 мг/кг на первый день после Повышенный уровень альбумина не связан с введения ФРК каким-либо болезненным состоянием за исключением дегидратации По-видимому, ФРК индуцируПример 6 ет повышение уровня альбумина (и других белков) ФРК- стимулирование пролиферация и дифв сыворотке за счет увеличения числа функциоференцировка эпителиальных клеток слизистой нирующих гепатоцитов Индуцируемое ФРК усиоболочки кишечника ление синтеза белков может иметь исключительВ данном примере оценивается биологиченое значение для пациентов с терминальными ское воздействие ФРК на эпителиальные клетки стадиями заболеваний печени, в частности циррослизистой оболочки кишечника здоровых крыс зом Материалы и методы Пример 4 Самцы крыс получали воду и пищу ad libitum Животным вводили ФРК или фосфатный буферФРК- стимулированные пролиферация и восный раствор (контроль) интраперитонеально в становление клеток печени in vivo после частичтечение одного, четырех или семи дней Анализиной гепатэктомии ровали не менее пяти животных в каждой группе В настоящих экспериментах в качестве подВсех крыс умерщвляли при помощи С02 Главные опытных животных были использованы самцы органы взвешивали слепым методом и их вес выкрыс Spraque-Dawley весом 300-340 г ражали в граммах на 100 граммов веса тела (проМатериалы и методы цент к весу тела) Пищеварительный тракт раздеКаждой из крыс удаляли до двух третей печеляли на нежелезистый желудок, железистый ни по методике Higgms и Anderson, Archives of Paжелудок, тонкий кишечник и толстый кишечник thology, Volume 12, page 186 (1931) Начиная с Образцы тканей помещали в 10%-ный забуфевосьми часов после операции и затем ежедневно ренный формалин для последующего стандартнокрысам подкожно вводили фосфатный буферный го гистологического исследования раствор (контроль) или ФРК в дозе 1 мг/кг Контрольных и ФРК-обработанных крыс взвешивали и Срезы всех отобранных органов окрашивали забивали на четвертый, седьмой, десятый и чегематоксилином и эозином (Г и Э) За час до забоя тырнадцатый день после операции Удаляли и крысам интраперитонеально вводили 50 мг/кг взвешивали остатки печени Brdll Для визуализации включения Brdll в ДНК реплицирующихся клеток был использован иммуРезультаты и обсуждение ногистохимический метод с антителами к Brdll Установлено, что обработка ФРК крыс, переОтдельные ткани были окрашены перийодатнесших частичную гепатэктомию, приводит к знаШиффом (PAS), альциановым голубым при рН 2,5 чительному ускорению восстановления массы и Мессон-трихромом печени, как в абсолютных, так и в относительных величинах, как показано, соответственно, на Для измерения толщины слизистой желудка и Фиг 18 и 19 У обработанных ФРК крыс масса пеглубины ее прокрашивания PAS использовали чени возвращалась к исходному значению в течекалиброванный окуляр Аналогично определяли ние семи дней Напротив, в контрольной группе ни длину ворсинок и глубину кишечных крипт в двеабсолютная, ни относительная масса печени не надцатиперстной кишке и глубину крипт ободочвосстанавливались полностью даже к четырнаной кишки Чтобы оценить количественные измедцатому дню после гепатэктомии нения в образовании бокаловидных клеток подсчитывали PAS-положительные бокаловидные Пример 5 клетки на 100 мкм длины дуоденальной ворсинки, Положительное воздействие ФРК при химиченачиная с основания Для всех отделов пищеваском отравлении печени рительного тракта измерения проводили только Самцы крыс Spraque-Dawley весом 300-340 г на тех железах или ворсинках, которые были пербыли использованы для оценки терапевтического пендикулярны подстилающим мышцам Результавоздействия ФРК на печень при введении химичеты выражали в микронах или, в случае бокалоского токсина видных клеток тонкого кишечника, средним Введение числом на единицу площади Кроме того, для Группам из двенадцати самцов крыс Spraqueободочной кишки определяли число обычных и Dawley перорально вводили четырех-хлористый гиперпластических (бифурцированных и трифуруглерод (СС14) в растительном масле в дозах 1 цированных) крипт на единицу длины кишки мг/кг и 2 мг/кг Каждая группа была разделена на две подгруппы по шесть крыс в каждой Через три Для каждого животного проводили от пяти до часа после введения СС14 и затем ежедневно десяти повторных измерений и результаты усредкрысам соответствующей подгруппы вводили няли Все данные обрабатывали по распределефосфатный буферный раствор или ФРК в дозе 1 нию Стьюдента или тесту ANOVA для множестмг/кг/день Через 24, 72 и 144 часа после введения венных групп сравнения (Statview II, Abacus 20 19 46706 Concepts, Berkeley CA) К седьмому дню обработки слизистая оболочка ободочной кишки образовывала морщинистые Результаты и обсуждение складки, которые значительно увеличивали обДля определения эффективной дозы ФРК щую площадь поверхности Признаки гиперплазии первоначально были поставлены эксперименты (бифурцированные и трифурцированные крипты по типу "доза-ответ" ФРК вводили ежедневно в ободочной кишки) имели место во всех группах течение четырех дней, и органы опытных животживотных, включая контрольных, но они были боных забирали для обследования Выраженный лее выраженными и многочисленными в тех групответ на введение ФРК наблюдался в отношении пах, которые получали ФРК в течение коротких железистого желудка, тонкого кишечника и обовременных интервалов (один и четыре дня), придочной кишки (Фиг 15) чем число гиперпластических крипт уменьшалось Животных обследовали после одного, четыс увеличением сроков обработки (Фиг 23) Соотрех и семи дней ежедневных введений ФРК в дозе ветственно, глубина крипт ободочной кишки воз5 мг/кг Согласно данным патологоанатомического растала с увеличением сроков обработки (Фиг 24) обследования, на четвертый и седьмой дни введения ФРК нежелезистый желудок был значиОкраска препаратов PAS и альциановым готельно утолщен с образованием складок слизилубым показала возрастание числа продуцируюстой оболочки щих слизь бокаловидных клеток в ободочной кишке после обработки ФРК Кроме того, у всех На четвертый и седьмой дни обработки ФРК, обработанных ФРК животных к седьмому дню отно не на первый день, нежелезистый желудок, мечали возрастание числа окрашиваемых альжелезистый желудок, двенадцатиперстная кишка циановым голубым бокаловидных клеток на люи ободочная кишка имели значительное увеличеминальной поверхности кишки Обработка ние по весу по сравнению с контролем На седьживотных ФРК уже к четвертому дню приводила к мой день железистый желудок весил 0 65 +- 0,01г заметному увеличению числа PAS-положительных у животных, клеток в верхних трех четвертях крипт ободочной обработанных ФРК, и 0,48 +- 0,02г у контролькишки ных (р= 0,0001) На четвертый и седьмой дни обработки ФРК Приведенные результаты показывают, что нежелезистый желудок значительно превышал по ФРК обладает сильным мито генным и диффевесу контрольный Гистологически у ФРКренцировочным действием на эпителиальные обработанных животных чешуйчатый эпителий ткани желудочно-кишечного тракта Из опытов по нежелезистого желудка был слегка (на четвертый включению Brdll очевидно, что ФРК инициирует день) или значительно (на седьмой день) гиперпролиферацию слизистых клеток в слизистой пластирован В кардии характер эпителия резко оболочке желудка В железистом желудке эти менялся от чешуйчатого эпителия пищевода до клетки являются клетками-предшественниками пролиферирующего эпителия обработанного ФРК По мере деления они мигрируют наверх, по нанежелезистого желудка После одного дня обраправлению к просвету желудка, и образуют поботки ФРК слизистая оболочка железистого жеверхностные клетки, или же перемещаются вниз и лудка выглядела гистологически нормальной На образуют клетки, формирующие железы желудка четвертый и седьмой дни гистологически выявля(Toner et al , 1989, in Gastrointestinal and Esophagлось возросшее число бокаловидных клеток, разeal Pathology, Churchill Livingstone, New York, NY, личимых по обширной прозрачной цитоплазме У at pages 13-28) Кроме того, ФРК ускоряет селекживотных, получавших ФРК в течение четырех и тивную дифференцировку слизистых клеток жесеми дней, отмечено умеренное увеличение толлудка в клетки, которые мигрируют наверх и стащины слизистой оболочки (Фиг 21) На седьмой новятся бокаловидными клетками На четвертый и день слой слизистых клеток оказывается расшиседьмой дни обработки общая толщина слизистой ренным и смещенным к поверхности серозной оболочки желудка значительно увеличивается оболочки Окраска PAS на четвертый и седьмой Аналогичные эффекты отмечаются также для тондни выявляет значительное возрастание числа кого и толстого кишечника PAS-положительных (муцин продуцирующих) боСтимулируя клетки-предшественники, ФРК ускаловидных клеток Окрашивание срезов Brdll коряет клеточное деление и приводит к удлинетакже подтверждает, что указанные клетки обранию крипт Кроме того, ФРК индуцирует диффезуют пролиферирующий клеточный слой в желеренцировку делящихся клеток крипт, что приводит зистом желудке Кроме того, число делящихся к увеличению образования слизи и возрастанию клеток возрастает при обработке ФРК Толщина числа бокаловидных клеток в ворсинках и криптах PAS-положительного слоя на люминальной поПри том, что указаны отдельные применения верхности слизистой оболочки желудка на четверданного изобретения и оно раскрыто в конкретных тый и седьмой дни обработки ФРК также значипримерах, следует понимать, что приведенное тельно увеличивается (Фиг 21) описание не является исчерпывающим Так, например, любая из форм ФРК, обладающая усиВо все временные точки тонкий кишечник осленными биологическими свойствами природного тавался в основном нормальным Окраска PAS ФРК, может быть использована для решения певыявляла возросшее число бокаловидныхклеток, речисленных в данной заявке задач Эти формы продуцирующих слизь Эти было особенно заметмогут включать очищенный природный ФРК, синно на четвертый и седьмой дни (Фиг 22) Длина тезированный химическим путем ФРК, рекомбиворсинок оставалась одинаковой, а глубина крипт нантный ФРК, полученный в системах экспрессии, была значительно больше на первый и седьмой отличных от описанной в данной заявке, а также дни (Фиг 22) 21 46706 22 СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ аналоги, варианты, химеры и т п , основанные на природной аминокислотной последовательности (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ Все эти формы должны применяться на практике с (]} ЗАЯВИТЕЛЬ Amgen lac учетом настоящего изобретения (їх) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Терапевтические применения Опытному исследователю очевидно, что разфактора роста кератиноцитов личные системы "вектор-хозяин" могут быть ис ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 4 пользованы для экспрессии белок-кодирующей Ovj АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ (A) АДРЕСАТ Amgenlnc последовательности ФРК Эти системы могут не (B) УЯКЦА Antgen Center 1840 Detiavilland Drive ограничиваться клетками млекопитающих, инфи(C) ГОРОД Thousand Gate цированными вирусами (например, вирусом оспоCD) ШТАТ California вакцины, аденовирусами и т д ) , клетками насеко(E) СТРАНА USA мых, инфицированными вирусами, в частности, (F) ПОЧТОВЫЙ КОД 91320 1789 бакуловирусами), дрожжами, содержащими дрож(v) ФОРМА ДЛЯ РАБОТЫ С КОМПЬЮТЕРОМ жевые векторы, а также бактериями, отличными (A) НОСИТЕЛЬ ИНФОРМАЦИИ Дискета, 3 5яюйма от Е coli, трансформированными фаговыми, плазDS 20 МЬ мидными или космидными ДНК Элементы, кон(B) КОМПЬЮТЕР IBM совместимый (C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА. MS-DOS тролирующие экспрессию, в этих векторах могут (D) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ Microsoft Word отличаться по силе и специфичности В зависимоVersion 5 la сти от использованной системы "хозяин-вектор" (vi) ТЕКУЩИЕ ДАННЫЕ ПО ЗАЯВКЕ могут быть применены те или иные транскрипци(A) НОМЕР ЗАЯВКИ онные и трансляционные элементы (B) ДАТА ПОДАЧИ 26-03-1993 Будучи выделен, очищен и проверен на активность с использованием описанных в данной заявке или других методов, белковый продукт экспрессии кДНК ФРК может быть включен в состав различных фармакологических композиций Как правило, такие композиции включаютудобный, обычно химически определенный носитель или растворитель для терапевтического агента (ФРК) и, в зависимости от способа применения, другие компоненты Композиции могут включать водный растворитель или же могут быть твердофазными, в которых ФРК включен в состав неводных носителей, таких как коллагены, гиалуроновая кислота и различные полимеры Состав такой композиции может быть подобран в соответствии с методом введения, включая инъекции, пероральное введение, наружное и назальное введение, а также введение в легкие Как понятно опытному специалисту, дозировка ФРК будет меняться в зависимости от заболевания и метода введения, но эффективными могут оказаться дозы в интервале от 0,01мг до 500мг на килограмм веса тела В зависимости от заболевания и состояния пациента ФРК может применяться однократно или многократно ФРК может быть использован в сочетании с другими препаратами, например цитокинами и ростовыми факторами, и с другими фармакологическими препаратами, применяемыми для лечения заболеваний кожи, легких, печени и пищеварительного тракта (C) КЛАССИФИКАЦИЯ (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ S£Q ID NO I (і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВ AT ЕЛ ЬНОСТИ (A) ДЛИНА 55 пар основании (B) ТИП нуклеиновая кислота СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ (1) ОБІДАЙ ИНФОРМАЦИЯ (0 ЗАЯВИТЕЛЬ Aragei! lac (и) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Терапевтические применения фактора рпетэ кнртганоцитоа (ш) ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 4 (iv) АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ (A) АДРЕСАТ Amgonlnc (B) УЛИЦА Amgen Center 1840 DehaviUand Diive (C) ГОРОД, Thousand Qata
ДивитисяДодаткова інформація
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/12, C12P 21/02, A61P 17/02, C07K 14/50, A61K 38/22, A61P 1/04, A61P 1/16, C12N 15/09, A61P 11/00, C12N 5/06, A61K 8/99, A61Q 5/00, A61P 17/14, A61K 8/00
Мітки: пацієнта, композиція, запобігання, фармацевтична, стану, лікування, спосіб, хворобливому
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/15-46706-sposib-likuvannya-ta-zapobigannya-khvoroblivomu-stanu-paciehnta-farmacevtichna-kompoziciya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб лікування та запобігання хворобливому стану пацієнта, фармацевтична композиція</a>
Попередній патент: Електростанція з комбінованим циклом та спосіб виробництва енергії на ній
Випадковий патент: Механізм відтяжки полотна круглов'язальної машини