Суміш олігосахаридів, які є похідними гепарину, спосіб її одержання і фармацевтична композиція, яка їх містить
Формула / Реферат
1. Суміш олігосахаридів, що мають загальну структуру конститутивних полісахаридів гепарину і мають наступні характеристики:
- середня молекулярна маса від 1800 до 2400 Да,
- активність анти-Ха, від 190 М.од./мг до 450 М.од./мг,
- активність анти-ІІа становить менше 0,2 М.од./мг;
причому конститутивні олігосахариди цих сумішей:
- містять 2-16 сахаридних ланок,
- мають ланку 2-О-сульфат-4,5-ненасиченої уронової кислоти на одному з їх кінців,
- і містять гексасахарид наступної формули:
в формі солі лужного або лужноземельного металу.
2. Суміш олігосахаридів за п. 1, яка відрізняється тим, що солями лужного або лужноземельного металу є солі натрію, калію, кальцію і магнію.
3. Суміш олігосахаридів за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що вона містить 20-100 %, зокрема 30-60 %, гексасахаридної фракції.
4. Суміш олігосахаридів за п. 3, яка відрізняється тим, що гексасахаридна фракція містить 20-70 %, зокрема 25-50 %, гексасахариду , який описаний в п. 1.
5. Суміш олігосахаридів за будь-яким з пп. 1-4, яка відрізняється тим, що вона має середню молекулярну масу 1900-2200, зокрема 1950-2150 Да.
6. Суміш олігосахаридів за будь-яким з пп. 1-5, яка відрізняється тим, що вона має активність анти-Ха, яка дорівнює 190-410 М.од./мг, зокрема, яка дорівнює 200-300 М.од./мг, і активність анти-ІІа менше 0,2 М.од./мг.
7. Суміш олігосахаридів за будь-яким з пп. 1-6, яка відрізняється тим, що вона має наступні характеристики:
- середню молекулярну масу 1950-2150 Да,
- активність анти-Ха, яка дорівнює 190-410 М.од./мг і активність анти-ІІа менше 0,2 М.од./мг,
- включає 30-60 % гексасахаридної фракції, яка містить 25-55 % фракції .
8. Спосіб одержання суміші олігосахаридів за будь-яким з пп. 1-7, який відрізняється тим, що гепарин дуже низької молекулярної маси, що має активність анти-Ха вище 140 М.од./мг, активність анти-IIa нижче 5 М.од./мг і середню молекулярну масу 2000-3000 Да, піддають наступним хімічним реакціям:
a) перетворенню однієї солі в іншу при дії хлориду бензетонію для одержання гепаринату бензетонію,
b) етерифікації одержаного гепаринату бензетонію під дією бензилхлориду і обробці для одержання солі натрію складного бензилового ефіру гепарину дуже низької молекулярної маси,
c) перетворенню солі одержаного складного бензилового ефіру і одержанню солі четвертинного амонію,
d) деполімеризації за допомогою сильної органічної основи з рkа, переважно, вище 20 з одержанням деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси,
e) перетворенню солі четвертинного амонію деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси в сіль натрію,
f) омиленню складноефірних залишків і, можливо, очищенню.
9. Спосіб одержання за п. 8, який відрізняється тим, що молярне співвідношення сильна основа/складний ефір, що використовують на стадії деполімеризації d), становить 0,2-5, переважно 0,6-2.
10. Спосіб одержання за п. 8 або 9, який відрізняється тим, що стадію деполімеризації d) здійснюють з використанням похідного фосфазену як основи.
11. Спосіб одержання за будь-яким з пп. 8-10, який відрізняється тим, що стадію деполімеризації d) здійснюють при вмісті води нижче 0,3 %, якщо використовують 1 молярний еквівалент фосфазенової основи по відношенню до солі бензетонію складного бензилового ефіру НТВТМ.
12. Спосіб одержання за будь-яким з пп. 8-11, який відрізняється тим, що основи, які належать до сімейства фосфазенів, що використовують на стадії деполімеризації d), мають, переважно, формулу:
,
в якій радикали R1-R7, однакові або різні, означають алкільні лінійні, розгалужені або циклічні радикали, що містять 1-6 атомів вуглецю, при цьому R3 і R4 можуть, при бажанні, утворювати з групою -N-P-N-, з якою вони зв'язані, 6-членний гетероцикл.
13. Спосіб одержання за будь-яким з пп. 8-12, який відрізняється тим, що основа, яка належить до сімейства фосфазенів, що використовують на стадії деполімеризації, являє собою 2-трет.бутиліміно-2-діетиламіно-1,3-диметилпергідро-1,3,2-діазафосфорин.
14. Спосіб одержання за п. 8, який відрізняється тим, що ступінь етерифікації солі четвертинного амонію складного бензилового ефіру гепарину на стадії b) становить 40-100 %, переважно 70-90 %.
15. Спосіб одержання за п. 8, який відрізняється тим, що перетворення солі четвертинного амонію складного ефіру гепарину дуже низької молекулярної маси, одержаного на стадії b) способу за п. 8, в сіль натрію здійснюють шляхом обробки реакційного середовища спиртовим розчином ацетату натрію, переважно 10% розчином ацетату натрію в метанолі (маса/об'єм), при температурі 15-25 °С.
16. Спосіб одержання за п. 15, який відрізняється тим, що масовий еквівалент ацетату натрію, що вводять на стадії етерифікації b), складає трикратну кількість маси солі четвертинного амонію складного бензилового ефіру гепарину, що вводять в реакцію деполімеризації.
17. Спосіб за п. 8 одержання суміші олігосахаридів, який відрізняється тим, що сіль четвертинного амонію складного бензилового ефіру гепарину дуже низької молекулярної маси, одержаного на стадії с), переважно, являє собою сіль бензетонію, цетилпіридинію або цетилтриметиламонію.
18. Спосіб одержання за п. 8, який відрізняється тим, що омилення на стадії f) здійснюють за допомогою гідроксиду лужного металу, такого як гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид літію, у водному середовищі при температурі 0-20 °С, переважно 0-10 °С.
19. Спосіб одержання за п. 18, який відрізняється тим, що використовують 1-5 молярних еквівалентів гідроксиду лужного металу, більш конкретно 1-2 молярних еквіваленти гідроксиду лужного металу.
20. Спосіб за будь-яким з пп. 8-19 одержання суміші олігосахаридів, описаних в будь-якому з пп. 1-5, що мають підвищену селективністю відносно фактора Ха сумішей олігосахаридів, який відрізняється тим, що додатково здійснюють видалення дисахаридних і тетрасахаридних фракцій шляхом хроматографії, зокрема, на колонках, наповнених гелем агар-поліакриламідного типу.
21. Спосіб одержання суміші олігосахаридів, вказаних в будь-якому з пп. 1-7, який відрізняється тим, що гепарин низької молекулярної маси або гепарин дуже низької молекулярної маси (1500-3000 Да), що мають активність анти-Ха 100-140 М.од./мг, піддають наступним хімічним реакціям:
a) перетворенню однієї солі в іншу при дії хлориду бензетонію для одержання гепаринату бензетонію,
b) етерифікації одержаного гепаринату бензетонію під дією бензилхлориду і обробці для одержання солі натрію складного бензилового ефіру гепарину дуже низької молекулярної маси,
c) перетворенню солі одержаного складного бензилового ефіру і одержанню солі четвертинного амонію,
d) деполімеризації за допомогою сильної органічної основи з рkа, переважно вище 20, з одержанням деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси,
e) перетворенню солі четвертинного амонію деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси в сіль натрію,
f) омиленню складноефірних залишків і, можливо, очищенню.
22. Спосіб одержання суміші олігосахаридів, вказаних в будь-якому з пп. 1-7, який відрізняється тим, що гепарин дуже низької молекулярної маси (1500-4000 Да), що має активність анти-Ха 100-140 М.од./мг, піддають наступним хімічним реакціям:
a) перетворенню однієї солі в іншу при дії хлориду бензетонію для одержання гепаринату бензетонію,
b) етерифікації одержаного гепаринату бензетонію під дією бензилхлориду і обробці для одержання солі натрію складного бензилового ефіру гепарину дуже низької молекулярної маси,
c) перетворенню солі одержаного складного бензилового ефіру і одержанню солі четвертинного амонію,
d) деполімеризації за допомогою сильної органічної основи з рkа, переважно вище 20, з одержанням деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси,
e) перетворенню солі четвертинного амонію деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси в сіль натрію,
f) омиленню складноефірних залишків і, можливо, очищенню.
23. Спосіб одержання за п. 21, який відрізняється тим, що гепарин низької молекулярної маси вибирають з Еноксапарину, Фраксипарину, Фрагміну, Інохепу (або Логіпарину), Норміфло, Емболексу (або Сандопарину), Флюксуму (або Мінідальтону), Кліварину і Хібору.
24. Суміш олігосахаридів, вказана в будь-якому з пп. 1-7, як лікарський засіб.
25. Суміш олігосахаридів, вказана в будь-якому з пп. 1-7, як лікарський засіб, що має антитромботичну активність.
26. Суміш олігосахаридів за п. 24 або 25 для лікування або профілактики венозних або артеріальних тромбозів, глибокого венозного тромбозу, емболії легень, нестабільної стенокардії, інфаркту міокарда, ішемічної хвороби серця, оклюзивних захворювань периферичних артерій і миготливої аритмії, проліферації клітин гладкої мускулатури, атеросклерозу і артеріосклерозу, лікування і профілактики раку шляхом модулювання ангіогенезу і факторів росту, а також для лікування і профілактики порушень діабетичного походження, таких як діабетичні ретинопатії і нефропатії.
27. Фармацевтична композиція, яка містить щонайменше один лікарський засіб, описаний в п. 24, і один або декілька фармацевтично інертних ексципієнтів або носіїв, або добавок.
28. Фармацевтична композиція за п. 27, яка відрізняється тим, що вона являє собою розчин для ін’єкцій, що вводиться підшкірним шляхом або внутрішньовенно.
29. Фармацевтична композиція за п. 27, яка відрізняється тим, що вона являє собою склад для інгаляції, призначений для введення через легені.
30. Фармацевтична композиція за п. 27, яка відрізняється тим, що вона являє собою склад, призначений для перорального введення.
Текст
1. Суміш олігосахаридів, що мають загальну структуру конститутивних полісахаридів гепарину і мають наступні характеристики: - середня молекулярна маса від 1800 до 2400 Да, - активність анти-Ха, від 190 М.од./мг до 450 М.од./мг, - активність анти-ІІа становить менше 0,2 М.од./мг; причому конститутивні олігосахариди цих сумішей: - містять 2-16 сахаридних ланок, - мають ланку 2-О-сульфат-4,5-ненасиченої уронової кислоти на одному з їх кінців, - і містять гексасахарид наступної формули: Na O OH O OH O NH IIa O OH O OH O Na O O OSO3Na O NH O O S O Na O O OH O C2 O O O O O O S O Na O OH (13) O O O OH NH O O S O Na IIs Is в формі солі лужного або лужноземельного металу. 2. Суміш олігосахаридів за п. 1, яка відрізняється тим, що солями лужного або лужноземельного металу є солі натрію, калію, кальцію і магнію. 3. Суміш олігосахаридів за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що вона містить 20-100 %, зокрема 30-60 %, гексасахаридної фракції. 4. Суміш олігосахаридів за п. 3, яка відрізняється тим, що гексасахаридна фракція містить 20-70 %, IIa -IIs - Is , зокрема 25-50 %, гексасахариду який описаний в п. 1. 5. Суміш олігосахаридів за будь-яким з пп. 1-4, яка відрізняється тим, що вона має середню молекулярну масу 1900-2200, зокрема 1950-2150 Да. 6. Суміш олігосахаридів за будь-яким з пп. 1-5, яка відрізняється тим, що вона має активність антиХа, яка дорівнює 190-410 М.од./мг, зокрема, яка дорівнює 200-300 М.од./мг, і активність анти-ІІа менше 0,2 М.од./мг. 7. Суміш олігосахаридів за будь-яким з пп. 1-6, яка відрізняється тим, що вона має наступні характеристики: - середню молекулярну масу 1950-2150 Да, - активність анти-Ха, яка дорівнює 190-410 М.од./мг і активність анти-ІІа менше 0,2 М.од./мг, 89356 O OH Na (11) O O Na O S O UA O Na O S O (19) Na O O S O 3 - включає 30-60 % гексасахаридної фракції, яка IIa -IIs - Is . містить 25-55 % фракції 8. Спосіб одержання суміші олігосахаридів за будь-яким з пп. 1-7, який відрізняється тим, що гепарин дуже низької молекулярної маси, що має активність анти-Ха вище 140 М.од./мг, активність анти-IIa нижче 5 М.од./мг і середню молекулярну масу 2000-3000 Да, піддають наступним хімічним реакціям: a) перетворенню однієї солі в іншу при дії хлориду бензетонію для одержання гепаринату бензетонію, b) етерифікації одержаного гепаринату бензетонію під дією бензилхлориду і обробці для одержання солі натрію складного бензилового ефіру гепарину дуже низької молекулярної маси, c) перетворенню солі одержаного складного бензилового ефіру і одержанню солі четвертинного амонію, d) деполімеризації за допомогою сильної органічної основи з рkа, переважно, вище 20 з одержанням деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси, e) перетворенню солі четвертинного амонію деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси в сіль натрію, f) омиленню складноефірних залишків і, можливо, очищенню. 9. Спосіб одержання за п. 8, який відрізняється тим, що молярне співвідношення сильна основа/складний ефір, що використовують на стадії деполімеризації d), становить 0,2-5, переважно 0,6-2. 10. Спосіб одержання за п. 8 або 9, який відрізняється тим, що стадію деполімеризації d) здійснюють з використанням похідного фосфазену як основи. 11. Спосіб одержання за будь-яким з пп. 8-10, який відрізняється тим, що стадію деполімеризації d) здійснюють при вмісті води нижче 0,3 %, якщо використовують 1 молярний еквівалент фосфазенової основи по відношенню до солі бензетонію складного бензилового ефіру НТВТМ. 12. Спосіб одержання за будь-яким з пп. 8-11, який відрізняється тим, що основи, які належать до сімейства фосфазенів, що використовують на стадії деполімеризації d), мають, переважно, формулу: R3 R4 R2 N R5 R1 N P N N R6 R7 , в якій радикали R1-R7, однакові або різні, означають алкільні лінійні, розгалужені або циклічні радикали, що містять 1-6 атомів вуглецю, при цьому R3 і R4 можуть, при бажанні, утворювати з групою -NP-N-, з якою вони зв'язані, 6-членний гетероцикл. 13. Спосіб одержання за будь-яким з пп. 8-12, який відрізняється тим, що основа, яка належить до сімейства фосфазенів, що використовують на стадії деполімеризації, являє собою 2 89356 4 трет.бутиліміно-2-діетиламіно-1,3-диметилпергідро-1,3,2-діазафосфорин. 14. Спосіб одержання за п. 8, який відрізняється тим, що ступінь етерифікації солі четвертинного амонію складного бензилового ефіру гепарину на стадії b) становить 40-100 %, переважно 70-90 %. 15. Спосіб одержання за п. 8, який відрізняється тим, що перетворення солі четвертинного амонію складного ефіру гепарину дуже низької молекулярної маси, одержаного на стадії b) способу за п. 8, в сіль натрію здійснюють шляхом обробки реакційного середовища спиртовим розчином ацетату натрію, переважно 10 % розчином ацетату натрію в метанолі (маса/об'єм), при температурі 15-25 °С. 16. Спосіб одержання за п. 15, який відрізняється тим, що масовий еквівалент ацетату натрію, що вводять на стадії етерифікації b), складає трикратну кількість маси солі четвертинного амонію складного бензилового ефіру гепарину, що вводять в реакцію деполімеризації. 17. Спосіб за п. 8 одержання суміші олігосахаридів, який відрізняється тим, що сіль четвертинного амонію складного бензилового ефіру гепарину дуже низької молекулярної маси, одержаного на стадії с), переважно, являє собою сіль бензетонію, цетилпіридинію або цетилтриметиламонію. 18. Спосіб одержання за п. 8, який відрізняється тим, що омилення на стадії f) здійснюють за допомогою гідроксиду лужного металу, такого як гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид літію, у водному середовищі при температурі 0-20 °С, переважно 0-10 °С. 19. Спосіб одержання за п. 18, який відрізняється тим, що використовують 1-5 молярних еквівалентів гідроксиду лужного металу, більш конкретно 12 молярних еквіваленти гідроксиду лужного металу. 20. Спосіб за будь-яким з пп. 8-19 одержання суміші олігосахаридів, описаних в будь-якому з пп. 15, що мають підвищену селективністю відносно фактора Ха сумішей олігосахаридів, який відрізняється тим, що додатково здійснюють видалення дисахаридних і тетрасахаридних фракцій шляхом хроматографії, зокрема, на колонках, наповнених гелем агар-поліакриламідного типу. 21. Спосіб одержання суміші олігосахаридів, вказаних в будь-якому з пп. 1-7, який відрізняється тим, що гепарин низької молекулярної маси або гепарин дуже низької молекулярної маси (15003000 Да), що мають активність анти-Ха 100-140 М.од./мг, піддають наступним хімічним реакціям: a) перетворенню однієї солі в іншу при дії хлориду бензетонію для одержання гепаринату бензетонію, b) етерифікації одержаного гепаринату бензетонію під дією бензилхлориду і обробці для одержання солі натрію складного бензилового ефіру гепарину дуже низької молекулярної маси, c) перетворенню солі одержаного складного бензилового ефіру і одержанню солі четвертинного амонію, d) деполімеризації за допомогою сильної органічної основи з рkа, переважно вище 20, з одержанням деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси, 5 89356 6 e) перетворенню солі четвертинного амонію деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси в сіль натрію, f) омиленню складноефірних залишків і, можливо, очищенню. 22. Спосіб одержання суміші олігосахаридів, вказаних в будь-якому з пп. 1-7, який відрізняється тим, що гепарин дуже низької молекулярної маси (1500-4000 Да), що має активність анти-Ха 100-140 М.од./мг, піддають наступним хімічним реакціям: a) перетворенню однієї солі в іншу при дії хлориду бензетонію для одержання гепаринату бензетонію, b) етерифікації одержаного гепаринату бензетонію під дією бензилхлориду і обробці для одержання солі натрію складного бензилового ефіру гепарину дуже низької молекулярної маси, c) перетворенню солі одержаного складного бензилового ефіру і одержанню солі четвертинного амонію, d) деполімеризації за допомогою сильної органічної основи з рkа, переважно вище 20, з одержанням деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси, e) перетворенню солі четвертинного амонію деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси в сіль натрію, f) омиленню складноефірних залишків і, можливо, очищенню. 23. Спосіб одержання за п. 21, який відрізняється тим, що гепарин низької молекулярної маси вибирають з Еноксапарину, Фраксипарину, Фрагміну, Інохепу (або Логіпарину), Норміфло, Емболексу (або Сандопарину), Флюксуму (або Мінідальтону), Кліварину і Хібору. 24. Суміш олігосахаридів, вказана в будь-якому з пп. 1-7, як лікарський засіб. 25. Суміш олігосахаридів, вказана в будь-якому з пп. 1-7, як лікарський засіб, що має антитромботичну активність. 26. Суміш олігосахаридів за п. 24 або 25 для лікування або профілактики венозних або артеріальних тромбозів, глибокого венозного тромбозу, емболії легень, нестабільної стенокардії, інфаркту міокарда, ішемічної хвороби серця, оклюзивних захворювань периферичних артерій і миготливої аритмії, проліферації клітин гладкої мускулатури, атеросклерозу і артеріосклерозу, лікування і профілактики раку шляхом модулювання ангіогенезу і факторів росту, а також для лікування і профілактики порушень діабетичного походження, таких як діабетичні ретинопатії і нефропатії. 27. Фармацевтична композиція, яка містить щонайменше один лікарський засіб, описаний в п. 24, і один або декілька фармацевтично інертних ексципієнтів або носіїв, або добавок. 28. Фармацевтична композиція за п. 27, яка відрізняється тим, що вона являє собою розчин для ін’єкцій, що вводиться підшкірним шляхом або внутрішньовенно. 29. Фармацевтична композиція за п. 27, яка відрізняється тим, що вона являє собою склад для інгаляції, призначений для введення через легені. 30. Фармацевтична композиція за п. 27, яка відрізняється тим, що вона являє собою склад, призначений для перорального введення. Даний винахід стосується сумішей олігосахаридів, які є похідними гепарину, що мають середню молекулярну масу від 1800 до 2400 Дальтон, відмінних високою активністю анти-Ха (аХа) і відсутністю активності анти-IIа (alIa), способу їх отримання і до фармацевтичних композицій, що їх містять. Гепарин являє собою суміш сульфатвмісних мукополісахаридів тваринного походження і використовується, зокрема, завдяки своїм антикоагулюючим і антитромботичним властивостям. Однак гепарин має недоліки, які обмежують умови його застосування. Зокрема, його висока антикоагулююча активність (alIa) може бути причиною кровотеч. (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol.5 sup.3 (1999)). Низькомолекулярні гепарини, отримані, зокрема, лужною деполімеризацією складного ефіру гепарину і що випускаються в цей час під найменуванням Еноксапарин, також мають високу активність alIa. У більш пізніх публікаціях рівня техніки описані гепарини з дуже низькою молекулярною масою. Наприклад, в патенті США 6384021 описані продукти, що мають активність анти-Ха в інтервалі від 100 до 120М.од./мг і активність анти-IIа в інтервалі від 2 до 8М.од./мг. У міжнародних заявках W002/08295 і W02004/033503 описані продукти, що мають активність анти-Ха, яка дорівнює, зокрема, 100-190М.од./мг при активності анти-IIа нижче за 5М.од./мг. Однак, жоден з вказаних гепаринів з дуже низькою молекулярною масою фактично не володіє активністю анти-Ха вищою за 190М.од./мг і нульовою або практично нульовою активністю анти-IIа. (UI - міжнародна одиниця). Під практично нульовою активністю анти-IIа (або іншими словами, що практично не володіють активністю анти-IIа) розуміють активність нижчу за 0,2М.од./мг. Винахід стосується сумішей олігосахаридів, які мають дуже високу селективну активність відносно активованого фактора X (фактора Ха) і при цьому що не володіє або практично що не володіє активністю анти-IIа. Таким чином, винахід стосується сумішей олігосахаридів, що мають загальну формулу конститутивних полісахаридів гепарину і що володіють наступними характеристиками: - вони мають середню молекулярну масу від 1800 до 2400 Дальтон, активність анти-Ха, яка дорівнює 190-450М.од./мг і не мають, або практично не мають активності анти-IIа; 7 89356 8 - при цьому конститутивні олігосахариди сумішей: - містять 2-16 сахаридних ланок, - мають ланку 2-О-сульфат-4,5-ненасиченої уронової кислоти на одному з її кінців, - і містять гексасахарид наступної формули: в формі солі лужного або лужноземельного металу. Гексасахарид ΔIIa-IIs-Is, що міститься в суміші олігосахаридів, яка описується в даному винаході, є послідовністю, що володіє сильною спорідненістю з АТІII і активністю, що характеризується аХа вище за 740М.од./мг. Як сіль лужного або лужноземельного металу переважні солі натрію, калію, кальцію і магнію. Середню молекулярну масу визначають методом рідинної хроматографії під високим тиском з використанням двох послідовно встановлених колонок, наприклад, колонок, що випускаються в продаж під найменуваннями TSK G3000 XL і TSK G2000 XL. Визначення проводять методом рефрактометрії. Елюентом, що використовується, є нітрат літію і елюційна витрата становить 0,6мл/хв. Систему відкалібровують за допомогою стандартів, отриманих шляхом фракціонування Еноксапарину методом хроматографії на агарполіакриламідному гелі (IBF). Цей метод отримання здійснюють відповідно до методики, описаної Barrowcliffe et al, Thromb.Res., 12, 27-36 (1977-78) або D.A.Lane et al, Tromb.Res., 12, 257-271 (197778). Результати обробляють за допомогою програмного забезпечення GPC6 (Perkin Elmer). Активність анти-Ха вимірюють амідолітичним методом на хромогенному субстраті згідно з принципом, описаним Tein et al, Thromb.Res., 10, 399-410 (1977). Кількісний аналіз був здійснений методом, описаним в монографії по низькомолекулярних гепаринах діючої фармацевтичної фармакопеї, за винятком відновлювального буфера: альбумін в буфері Tris-NaCl з рН 7,4 був замінений на поліетиленгліколь 6000 (ПЕГ 6000). Вимірювання активності анти-Ха здійснювалося відносно стандартного гепарину дуже низької молекулярної маси (НТВРМ) з концентрацією 140180 U/мг (на суху вагу). Активність стандартного НТВРМ вимірювалася по відношенню до міжнародного стандартного еталону низькомолекулярного гепарину. Цей стандартний НТВРМ був отриманий відповідно до відомостей, які є в міжнародних заявках на патент W002/08295, зокрема в заявці WO 2004/033503. Активність стандартного НТВРМ вимірювалася по відношенню до міжнародного стандартного еталону низькомолекулярного гепарину. Активність анти-IIа вимірювалася амідолітичним методом на хромогенному субстраті згідно з методом, описаним в монографії по низькомолекулярних гепаринах діючої фармацевтичної фармакопеї. Вимірювання активності alia здійснювалося по відношенню до стандартному гепарину дуже низької молекулярної маси (НТВРМ) з виміряною активністю 2,1М.од./мг. Активність стандартного НТВРМ вимірювалася по відношенню до міжнародного стандартного еталону низькомолекулярного гепарину. Згідно з переважним варіантом суміш олігосахаридів згідно з винаходом містить 20-100% гексасахаридної фракції. Зокрема, ця суміш містить 3060% гексасахаридної фракції. Крім того, суміші згідно з винаходом містять 20-70% гексасахариду ΔIIa-IIs-Is в гексасахаридній фракції суміші олігосахаридів. Зокрема, ця фракція ΔIIa-IIs-Is в гексасахаридній фракції становить 25-50%. Процентний вміст гексасахаридної фракції може бути визначений методом аналізу з допомогою рідинної хроматографії при високому тиску на колонках TSK G3000 XL і TSK G2000 XL або методом препаративного розділення гексасахаридної фракції. У цьому випадку хроматографію проводять на колонках, заповнених гелем агар-поліамідного типу. Суміш елююють розчином бікарбонату натрію. Переважно, розчин бікарбонату натрію являє собою розчин з концентрацією від 0,1мол/л до 1мол/л. Більш переважно, розділення здійснюють з концентрацією 1мол/л. Вимірювання здійснюють шляхом спектрометрії в УФ області (254нм). Після фракціонування гексасахаридну фракцію, розчинену в бікарбонаті натрію, нейтралізують крижаною оцтовою кислотою. Розчин потім концентрують під зниженим тиском так, щоб концентрацію ацетату натрію була вищою за 30% мас. Гексасахаридну фракцію осаджують доданням 3-5 об'ємів метанолу. Гексасахаридну фракцію відділяють шляхом фільтрації через фритоване скло n°3. 9 Отриману суміш гексасахаридів аналізують високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ) і визначають вміст гексасахариду ΔІІа-IIs-Is. Гексасахарид ΔІІа-IIs-Is можна виділити шляхом препаративної ВЕРХ або афінною хроматографією на колонці з антитромбін III-сефарозою згідно з методами, відомими фахівцеві (m.Hook / I.Bjork, J.Hopvvood and U.Lindahl, F.E.B.S letters, vol.656(1) (1976)). Переважно, суміші згідно з винаходом мають середню молекулярну масу від 1900 до 2200 Дальтон і, зокрема, від 1950 до 2150 Дальтон. Згідно з переважним варіантом суміш олігосахаридів згідно з винаходом характеризується тим, що вона володіє активністю анти-Ха, яка дорівнює 190-410М.од./мг і активністю анти-Іа, яка дорівнює нулю або практично дорівнює нулю. Більш конкретно, активність анти-Ха складає величину від 200 до 300М.од. Таким чином, більш конкретно, винахід стосується сумішей, що мають наступні характеристики: - середня молекулярна маса складає від 1950 до 2150 Дальтон, - активність анти-Ха дорівнює 190-410М.од./мг і активність анти-IIа дорівнює нулю або практично дорівнює нулю; - вони включають 30-60% фракції гексасахаридів, які містять 25-55% фракції Δlla-IIs-Is. Активність сумішей олігосахаридів згідно з винаходом зумовлена особливим способом отримання, описаним нижче. Фахівцеві добре відомо, що фізико-хімічні характеристики полісахаридних сумішей, а також активність, витікаюча з цих характеристик, пов'язана зі способом їх отримання (J.Med.Chem. 33(6) 1639-2093 (1990)). Суміші олігосахаридів згідно з винаходом отримують деполімеризацією четвертинної солі амонію складного бензилового ефіру гепарину дуже низької молекулярної маси (НТВРМ) в орга 89356 10 нічному середовищі, причому цей гепарин (НТВРМ) отриманий в свою чергу згідно з відомостями, розкритим в заявках на патент WO 02/08295 і WO 2004/033503. Загалом, мова йде про повторну деполімеризацію гепарину дуже низької молекулярної маси, який сам був отриманий специфічним чином шляхом деполімеризації етерифікованого гепарину в присутності сильної основи, переважно, в дихлорметані, і при вмісті води менше за 3%. НТРВМ, що використовуються в даному винаході як сировинний продукт, були отримані, зокрема, згідно з способами, розкритими в заявках на патент WO 02/08295 і WO 2004/033503. НТРВМ, що використовуються в даному винаході як вихідний продукт, володіють, зокрема, активністю аХа вищою 140М.од./мг, активністю alia нижчою 5М.од./мг і мають середню молекулярну масу від 2000 до 3000 Дальтон. Вимірювання активності аХа здійснювалося відносно стандартного НТВРМ з виміряною активністю 158М.од./мг. Активність стандартного НТВРМ вимірювалася відносно міжнародного стандартного еталону низькомолекулярного гепарину. Вихідні НТВРМ, отримані згідно з способом, який описаний вище, повторно деполімеризують за допомогою сильної органічної основи з рkа, переважно, вище 20 (з властивостями, переважно, близькими властивостям сімейства фосфазенів, описаних, наприклад, R.Schwesinger et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 1167-1169 (1987) або R.Schwesinger et al, Angew. Chem. 105, 1420 (1993)). Потім перетворюють четвертинну амонієву сіль складного бензилового ефіру деполімеризованого НТВРМ в сіль натрію, омилюють залишкові складноефірні функції і, можливо, очищають отриманий продукт. Наступна схема реакцій ілюструє даний винахід: 11 Винахід стосується таким чином способу отримання сумішей олігосахаридів, таких, які описані вище, який відрізняється тим, що гепарин дуже низької молекулярної маси, що має активність аХа вищу за 140М.од./мг, активність alla нижчу за 5М.од./мг і середню молекулярну масу 2000-3000 Дальтон, піддають наступним хімічним реакціям: a) перетворенню однієї солі в іншу при дії хлориду бензетонію для отримання гепаринату бензетонію, b) етерифікації отриманого гепаринату бензетонію під дією бензилхлориду і обробці спиртовим розчином ацетату натрію для отримання солі натрію складного бензилового ефіру гепарину дуже низької молекулярної маси, c) перетворенню солі отриманого складного бензилового ефіру і отриманню солі четвертинного амонію, переважно, солі бензетонію, солі цетилпіридинію або солі цетилтриметиламонію, d) деполімеризації за допомогою сильної органічної основи з рkа, переважно, вище за 20 для отримання деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси, e) перетворенню солі четвертинного амонію деполімеризованого гепарину дуже низької молекулярної маси в сіль натрію, f) омиленню залишкових складноефірних функцій і, можливо, очищенню. У даному винаході використовують, в більш конкретному випадку, високоселективну фосфазенову основу на стадії деполімеризації (стадія d), яка збагачує, несподіваним чином, суміш олігосахаридів послідовностями, що мають спорідненість з АТIII. Переважно, мольне співвідношення сильна основа/складний ефір становить 0,2-5, більш конкретно, 0,6-2. Для досягнення оптимальної селективності і максимального збереження послідовностей, що має спорідненість з АТIII, переважно працюють при вмісті води нижче за 0,3%, якщо використовують 1 мольний еквівалент фосфазенової основи по відношенню до солі бензетонію складного бензилового ефіру НТВТМ. Основи, що стосуються сімейства фосфазенів, переважно, являють собою основи формули: 89356 12 в якій радикали R1-R7, однакові або різні, означають алкільні лінійні, розгалужені або циклічні радикали, що містять 1-6 атомів вуглецю, при цьому R3 і R4 можуть, при бажанні, утворювати з групою -N-P-N-, з якою вони зв'язані, 6-ти членний гетероцикл. Зокрема, винахід стосується способу, описаного вище, який відрізняється тим, що основа, яка використовується на стадії деполімеризації d) являє собою 2-трет.бутиліміно-2-діетиламіно1,3-диметилпергідро-1,3,2-діаза-фосфорин (по офіційній номенклатурі: 1,3,2-діазафосфорин-2амін-2-[(1,1-диметилетил)іміно]-N,N-діетил-1,2,2,2, 3,5,6-октагідро-1,3-диметил). Реакцію на стадії а) перетворення однієї солі в іншу, переважно здійснюють шляхом впливу надлишку хлориду бензетонію на сіль натрію НТВРМ при температурі близько 15-25°С. Переважно, молярне співвідношення сіль/гепарин, сіль натрію, складає від 2,5 до 3,5. Етерификацію на стадії b) здійснюють, переважно, в середовищі хлорвмісного органічного розчинника (такого як хлороформ або дихлорметан) при температурі від 25 до 45°С, переважно, від 30 до 40°С. Складний ефір в формі солі натрію потім виділяють осадженням за допомогою 10% (по масі) розчину ацетату натрію в спирті, такому як метанол. Звичайно використовують 1-1,2 об'єми спирту на об'єм реакційного середовища. Кількість бензилхлориду і тривалість реакції вибирають такими, щоб досягнути ступеню етерифікації 40100%, переважно, 70-90%. Переважно, використовують 0,5-1,5 мас. частин бензилхлориду на 1 мас. частину солі бензетонію гепарину. Виходячи з того ж, тривалість реакції переважно, становить 10-35 годин. Отже, в способі згідно з винаходом досягають ступеню етерифікації солі четвертинного амонію складного бензилового ефіру гепарину, що дорівнює 40-100%, переважно, 70-90%. Перетворення солі четвертинного амонію складного бензилового ефіру деполімеризованого 13 гепарину в натрієву сіль здійснюють, як правило, обробкою реакційного середовища спиртовим розчином ацетату натрію, переважно, 10%-им розчином ацетату натрію в метанолі (маса/об'єм) при температурі від 15 до 25°С. Масовий еквівалент ацетату, що вводиться, переважно складає трикратну кількість маси солі четвертинного амонію складного бензилового ефіру гепарину, що вводиться надалі в реакцію деполімеризації. Сіллю четвертинного амонію отриманого складного бензилового ефіру НТВРМ є, переважно, сіль бензетонію, сіль цетилпіридинію або цетилметиламонію. Перетворення однієї солі в іншу на стадії с) здійснюють за допомогою хлориду четвертинного амонію, переважно, хлориду бензетонію, хлориду цетилпіридинію або хлориду цетилтриметиламонію, у водному середовищі при температурі від 10 до 25°С. Переважно, мольне співвідношення хлорид четвертинного амонію/сіль натрію складного бензилового ефіру гепарину складає від 2,5 до 3,5. Омилення здійснюють, як правило, за допомогою гідроксиду лужного металу, такого як гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид літію, у водному середовищі при температурі від 0 до 20°С, переважно, від 0 до 10°С. Звичайно використовують 15 мольних еквіваленти гідроксиду лужного металу. Переважно, омилення здійснюють в присутності 12 мольних еквіваленти гідроксиду лужного металу. Кінцевий продукт можливо, при необхідності, очищений будь-яким відомим методом очищення деполімеризованих гепаринів (наприклад, ЕР 0037319В1). Переважно, очищають за допомогою перекису водню у водному середовищі при температурі 10-50°С. Переважно, цю операцію здійснюють при температурі 20-40°С. Згідно з винаходом суміші в формі солі натрію можуть бути перетворені в суміші іншої солі лужного металу або лужноземельного металу. Перехід від однієї солі до іншої можливий при використанні методу, описаного в патенті Франції 7313580. Даний винахід дозволяє, зокрема, значно збільшити вміст гексасахариду ΔIIа-IIs-Is. Якщо повторно деполімеризують низькомолекулярний гепарин способом, яким він отриманий, то добре відомо фахівцеві, що активність анти Ха отриманого продукту значно знижується і доходить до нуля. У випадку, коли використовують способи, що дозволяють отримати Еноксапарин, Фраксипарин, Фрагмін, Іннохеп (або Логипарин), Норміфло, Емболекс (або Сандопарин), Флюксум (або Мінідальтон), Кліварин і Хибор, то можна спостерігати це явище, якщо повторно деполімеризують ці НВРМ способом їх отримання. Наслідком цього є низька селективність цих способів відносно збереження областей АТIII. У даному винаході, якщо використовують як вихідний продукт НТВРМ, отриманий способом фосфазенової деполімеризації, то спостерігається якраз зворотне явище. Активність аХа суміші олігосахаридів збільшується і навіть перевищує активність гепарину, який був вихідним при отриманні НТВРМ. Таке явище можливо є наслідком значної селективності фосфазенових основ відносно збе 89356 14 реження послідовностей, що мають спорідненість з АТIII. Ця особливість способу спостерігається також при аналізі середньої молекулярної маси сумішей отриманих олігосахаридів. Наприклад, якщо деполімеризують НТВРМ зі середньою молекулярною масою 2400 Дальтон, то отримують суміш олігосахаридів зі середньою молекулярною масою 2000 Да. Висновок робиться такий, що послідовності, які мають спорідненість з АТIII (гексасахариди і октасахариди), не зазнають впливу фосфазенової основи, але який приводить до деструкції і елімінування інших послідовностей, і, отже, до середньої молекулярної маси, яка наближається до середньої молекулярної маси компонента, що не піддається деполімеризації, тобто гексасахариду ΔIIaIIs-Is (1834г/мол). Потрібно підкреслити, що на стадії деполімеризації гепарину фосфазеновою основою середня молекулярна маса змінюється від 15000 Да до 2400 Да. Альтернативою способу згідно з винаходом, що дозволяє збільшити активність і селективність відносно фактора Ха, є спосіб, що використовує низькомолекулярні гепарини загалом. Наприклад, ними можуть бути, зокрема, Еноксапарин, Фраксипарин, Фрагмін, Іннохеп (або Логипарин), Норміфло, Емболекс (або Сандопарин), Флюксум (або Мінідальтон), Кліварин і Хибор. Мова може також йти про деякі гепарини з дуже низькою молекулярною масою, такі, як описані в документах US 6384021 (2000-4000 Да) або WO 02/08295 (15003000 Да), що володіють активністю анти-Ха нижчою за 140М.од./мг (зокрема, від 100 до 140М.од./мг). Вказана особливість способу виражена в досягненні величин активності анти-Ха, несподіваних при середній молекулярній масі сумішей олігосахаридів (190М.од./мг
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюHeparin-derived oligosaccharide mixtures, preparation thereof and pharmaceutical compositions containing said mixtures
Автори англійськоюLaux Volker, Mourier Pierre, Viskov Christian
Назва патенту російськоюСмесь олигосахаридов, которые являются производными гепаринина, способ ее получения и фармацевтическая композиция, которая их содержит
Автори російськоюЛаукс Фолькер, Мурье Пьер, Висков Кристиан
МПК / Мітки
МПК: C08B 37/10
Мітки: суміш, гепарину, містить, одержання, олігосахаридів, похідними, яка, спосіб, фармацевтична, композиція
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/15-89356-sumish-oligosakharidiv-yaki-eh-pokhidnimi-geparinu-sposib-oderzhannya-i-farmacevtichna-kompoziciya-yaka-kh-mistit.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Суміш олігосахаридів, які є похідними гепарину, спосіб її одержання і фармацевтична композиція, яка їх містить</a>
Попередній патент: Спосіб визначення відносної концентрації метгемоглобіну в артеріальній крові
Наступний патент: Об’єднання підтвердження прийому та керування швидкістю передачі
Випадковий патент: Ультразвуковий активатор