Суміш полісахаридів на основі гепарину, спосіб її одержання та фармацевтична композиція

1. Суміш сульфатованих полісахаридів, які мають загальну структуру полісахаридів, що входять до складу гепарину, і мають такі характеристики: - середня молекулярна маса в діапазоні від 1500 до 3000 Дальтон - активність анти-Ха в діапазоні від 100 до 150 МО/мг, - активність анти-IIа в діапазоні від 0 до 10 МО/мг і - відношення активність анти-Ха/активність антиIIа більше ніж 10, - полісахариди, що входять до складу суміші, містять від 2 до 26 сахаридних ланок і містять на одному з їхніх кінців ланку 2-О-сульфату 4,5ненасиченої глюкуронової кислоти в формі солі лужного або лужноземельного металу. 2. Суміш за п. 1, яка відрізняються тим, що активність анти-Ха знаходиться в діапазоні від 125 до 150 МО/мг. 3. Суміш за п. 1 або п. 2, яка відрізняється тим, що активність анти-Ха знаходиться в діапазоні від 140 до 150 МО/мг і середня молекулярна маса знаходиться в діапазоні від 2000 до 3000 Дальтон. 4. Суміш за будь-яким з пп. 1-3, яка відрізняється тим, що полісахариди представлені в формі солі натрію, калію, кальцію або магнію. 5. Суміш за будь-яким з пп. 1-4, яка відрізняється тим, що має активність анти-Па в діапазоні від 0 до 5 МО/мг. 2 (11) 1 3 74836 4 го бензилового ефіру гепарину має ступінь етерифікації в інтервалі від 50 до 100 %. R4 R2 N 15. Спосіб за будь-яким з пп. 7-14, який відрізняється тим, що перетворення четвертинної амонієR1 N P N R5 вої солі складного бензилового ефіру гепарину на 6 N R натрієву сіль здійснюється обробкою реакційного середовища спиртовим розчином ацетату натрію. 7 R , 16. Спосіб за будь-яким з пп. 7-15, який відрізня1 7 де радикали R -R є однаковими або різними і явється тим, що омилення здійснюється за допомоляють собою алкільні радикали, що містять від 1 гою гідроксиду лужного металу. до 6 атомів вуглецю в нерозгалуженому або в роз17. Спосіб за будь-яким з пп. 7-16, який відрізнягалуженому ланцюзі. ється тим, що очищення здійснюється за допомо13. Спосіб за будь-яким з пп. 7-12, який відрізнягою пероксиду водню. ється тим, що молярне відношення сильна органі18. Суміш за будь-яким з пп. 1-6, що використовучна основа з рКа більшим ніж 20 або імідазолат ється як лікарський засіб. натрію/четвертинна амонієва сіль складного бен19. Суміш за будь-яким з пп. 1-6, що використовузилового ефіру гепарину знаходиться в інтервалі ється як антитромботичний лікарський засіб. від 0,2 до 5. 20. Фармацевтична композиція, що містить як дію14. Спосіб за будь-яким з пп. 7-13, який відрізняче начало суміш за будь-яким з пп. 1-6. ється тим, що четвертинна амонієва сіль складно R3 Даний винахід стосується сумішей полісахаридів на основі гепарину, способу їх одержання і фармацевтичних композицій, що їх містять. Гепарин являє собою суміш сульфатованих мукополісахаридів тваринного походження, використовувану, зокрема, через її антикоагуляційні й антитромботичні властивості. Проте гепарин має недоліки, що обмежують умови його застосування. Зокрема, його значна антикоагуляційна активність (активність анти-ІІа) може викликати кровотечі. Були запропоновані (ЕР40144) низькомолекулярні гепарини, отримані лужною деполімеризацією складних ефірів гепарину; проте дані продукти ще мають значну активність анти-ІІа. Винахід стосується сумішей полісахаридів на основі гепарину, що мають активність, більш вибіркову щодо активованого чинника X (чинник Ха) й активованого чинника II (чинник llа), ніж у гепарину. Більш конкретно, предметом даного винаходу є суміші сульфатованих полісахаридів, які мають звичайну структуру полісахаридів, що входять до складу гепарину й мають такі характеристики: - вони мають середню молекулярну масу в діапазоні від 1500 до 3000Дальтон, активність антиХа в діапазоні від 100 до 150МЕ/мг, активність анти-ІІа в діапазоні від 0 до 10МЕ/мг і відношення активність анти-Ха/ активність анти-llа більше 10, - полісахариди, що входять до складу сумішей, містять від 2 до 26 сахаридних ланок і мають на одному з їхніх кінців ланку 2-О-сульфату 4,5ненасиченої глюкуронової кислоти, в формі солі лужного або лужноземельного металу. В якості солей лужного або лужноземельного металу кращими є солі натрію, калію, кальцію і магнію. Середню молекулярну масу визначають методом рідинної хроматографії при високому тиску з використанням двох послідовно з'єднаних колонок, наприклад колонок, що поставляються під назвою TSK G3000 XL і TSK G2000 XL. Детекцію здійснюють рефрактометрично. Використовуваний елюент являє собою нітрат літію, і витрата складає 0,6мл/хв. Систему калібрують по стандартах, отриманих хроматографічним фракціонуванням еноксапарину (AVENTIS) на поліакриламідагарозному гелі (IBF). Згадане одержання здійснюють відповідно до методики, описаної в статті Barrowcliffe et coll., Thromb. Res., 12, 27-36 (197778) або в статті D.A.Lane et coll., Thromb. Res., 12, 257-271 (1977-78). Результати обчислюють із використанням програмного забезпечення GPC6 (Perkin Elmer). Активність анти-Ха вимірюють амідолітичним методом на хромогенному субстраті, описаному в статті Teien et coll., Thromb. Res., 10, 399-410 (1977), з використанням як еталону першого міжнародного еталону низькомолекулярних гепаринів. Активність анти-llа вимірюють технікою, описаною Andersen L.O. et coll., Thromb.Res., 15, 531541 (1979), з використанням як еталону першого міжнародного еталону низькомолекулярних гепаринів. Переважно, суміші, як-от описані вище, мають активність анти-Ха в інтервалі від 125 до 150МЕ/мг. Зокрема, суміші, як-от описані вище, мають активність анти-Ха в інтервалі від 140 до 150МЕ/мг і середню молекулярну масу в діапазоні від 2000 до 3000 Дальтон. Переважно, суміші відповідно до винаходу мають активність анти-llа від 0 до 5МЕ/мг. Ще більш переважно, суміші мають відношення активність анти-Ха/активність анти-llа більше 25. Суміші олігосахаридів відповідно до винаходу можуть бути отримані деполімеризацією четвертинної амонієвої солі складного бензилового ефіру гепарину в органічному середовищі за допомогою сильної органічної основи з рКа>20 або імідазолату натрію, перетворенням деполімеризованої чет 5 74836 6 вертинної амонієвої солі складного бензилового ної амонієвої солі складного бензилового ефіру ефіру гепарину на натрієву сіль, омиленням склагепарину на натрієву сіль звичайно здійснюють дного ефіру й, у разі потреби, очищенням. обробкою реакційного середовища спиртовим роЧетвертинна амонієва сіль складного бензизчином ацетату натрію, переважно 10%-ним розлового ефіру гепарину являє собою, переважно, чином ацетату натрію в метанолі (маса/об'єм) при сіль бензетонію, цетилпіридинію або цетилтриметемпературі в інтервалі від 15 до 25°С. Масовий тиламонію. еквівалент ацетату, що додається, переважно, Зазвичай деполімеризацію здійснюють у севтричі більший від маси четвертинної амонієвої редовищі інертного органічного розчинника, як-от солі складного бензилового ефіру гепарину, що хлоровмісний розчинник (наприклад, дихлормевводиться в реакцію деполімеризації. тан), тетрагідрофуран, анізол, при температурі від Омилення звичайно здійснюють за допомо-20°С до 40°С. гою гідроксиду лужного металу, як-от гідроксид У якості сильної органічної основи з рКа більнатрію, гідроксид калію, гідроксид літію, у водному ше 20 можна використовувати 1,5,7середовищі при температурі в інтервалі від 0 до триазабіцикло[4.4.0]дец-5-ен, 2-трет-бутиліміно-220°С, переважно від 0 до 10°С. Звичайно викорисдіетиламіно-1,3-диметилпергідро-1,3,2товують від 1 до 5 молярних еквівалентів гідрокдіазафосфорин, основи сімейства гуанідину й фосиду лужного металу. Переважно, омилення здійссфазенів. нюють за наявності 2-3 молярних еквівалентів Основи сімейства гуанідинів являють собою, гідроксиду лужного металу. переважно, основи формули: Кінцевий продукт, у разі потреби, може бути очищений будь-яким відомим способом очищення деполімеризованих гепаринів, зокрема способом, описаним у європейському патенті ЕР0037319. Переважно очищають за допомогою пероксиду водню у водному середовищі при температурі від 10 до 50°С. Переважно, зазначену операцію здійснюють в інтервалі від 20 до 40°С. Четвертинна амонієва сіль складного бензи1 2 3 4 де R означає водень або алкіл, R , R , R і лового ефіру гепарину може бути отримана відпо5 R , однакові або різні, означають алкільний радивідно до такої реакційної схеми: кал. а) перетворення гепарину в формі натрієвої Більш конкретно, R1 означає водень і R2, R3, солі за допомогою бензетонійхлориду з одержан4 5 R і R являють собою метильні радикали. ням гепаринату бензетонію, Сильні органічні основи, що належать до сіб) етерифікація бензетонієвої солі, отриманої мейства фосфазенів, визначені, наприклад, відпоперед цим, за допомогою бензилхлориду й обробвідно до R.Schwesinger et coll., Angew. Chem. Int. ка спиртовим розчином ацетату натрію з одержанEd. Engl., 26, 1167-1169 (1987), R.Schwesinger et ням натрієвої солі складного бензилового ефіру coll., Angew. Chem., 105, 1420 (1993). гепарину, Серед основ сімейства фосфазенів викорисв) перетворення натрієвої солі складного бентовують, переважно, основи формули: зилового ефіру гепарину на четвертинну амонієву сіль, переважно на сіль бензетонію, цетилпіридинію або цетилтриметиламонію. Реакцію стадії а) здійснюють у водному середовищі дією бензетонійхлориду, взятого з надлишком, на гепарин у формі натрієвої солі при температурі, близькій до температури в інтервалі від 15 до 25°С. Переважно, молярне відношення бензетонійхлорид/гепарин у формі натрієвої солі знаходиться в інтервалі від 2 до 3 і, більш конкретно, у якій радикали R1-R7 є однаковими або різдорівнює 2,5. ними і являють собою алкільні радикали. Використовуваний вихідний гепарин у формі В попередніх формулах алкільні радикали мінатрієвої солі являє собою, переважно, свинячий стять від 1 до 6 атомів вуглецю в нерозгалуженому гепарин. Вихідний гепарин може бути попередньо або в розгалуженому ланцюзі. очищений з метою зменшення відсоткового вмісту Переважно, молярне відношення сильна орв ньому дерматансульфату відповідно до способу, ганічна основа з рКа більше 20 або імідазолат наописаного у французькому патенті FR 2663639. трію/четвертинна амонієва сіль складного бензиЕтерифікацію стадії б) здійснюють, переважлового ефіру гепарину знаходиться в інтервалі від но, в середовищі хлоровмісного органічного роз0,2 до 5 і, переважно, від 1 до 4. чинника (наприклад, хлороформ, метиленхлорид) Більш конкретно, ступінь етерифікації четверпри температурі в інтервалі від 25 до 45°С і, перетинної амонієвої солі складного бензилового ефіру важно, в інтервалі від 30 до 40°С. Складний ефір у гепарину знаходиться в інтервалі від 50 до 100% і, формі натрієвої солі виділяють потім осадженням переважно, в інтервалі від 70 до 90%. Даний сту10%-ним, маса/об'єм, розчином ацетату натрію в пінь етерифікації відповідає молярному відсотку спирті, як-от метанол. Звичайно використовують етерифікації уронових кислот гепарину. від 1 до 1,2 об'єму спирту на один об'єм реакційноПеретворення деполімеризованої четвертинго середовища. Кількість бензилхлориду й час 7 74836 8 реакції підібрані для одержання ступеня етерифіють 7,6г складного бензилового ефіру гепарину в кації в інтервалі від 50 до 100% і, переважно, від формі натрієвої солі, ступінь етерифікації якого 70 до 90%. Переважно, використовують від 0,5 до дорівнює 77%. 1,5 масових частин бензилхлориду на 1 масову Складний бензиловий ефір гепарину (бензечастину бензетонієвої солі гепарину. Також, перетонієва сіль) важно, час реакції знаходиться в інтервалі від 10 У колбу Ерленмейєра А об'ємом 2л вводять до 35 годин. 36г (0,0549моль) складного бензилового ефіру Перетворення однієї солі на іншу на стадії в) гепарину (натрієва сіль) і 540мл дистильованої здійснюють за допомогою хлориду четвертинного води. Після гомогенізації при температурі близько амонію і, переважно, за допомогою бензетонійх20°С одержують блідо-жовтий розчин. При перелориду, цетилпіридинійхлориду або цетилтримемішуванні на магнітній мішалці в колбі Ерленмейєтиламонійхлориду, у водному середовищі при тера В об'ємом 1л готують розчин 64,45г мпературі в інтервалі від 10 до 25°С. Переважно, (0,1438моль) хлориду бензетонію в 450мл води. молярне відношення хлорид четвертинного амоРозчин з колби Ерленмейєра В приблизно за 35 нію/натрієва сіль складного бензилового ефіру хвилин при перемішуванні доливають до розчину, гепарину знаходиться в інтервалі від 2 до 3. що знаходиться в колбі Ерленмейєра А. СпостеріСуміші відповідно до винаходу в формі натрігають утворення рясного білого осаду. Колбу Ерєвої солі можуть бути перетворені на іншу сіль ленмейєра В обполіскують 200мл дистильованої лужного або лужноземельного металу. В разі потводи і промивну воду вводять у колбу Ерленмейєреби, від однієї солі до іншої переходять, викорисра А. Перемішування припиняють і суспензію затовуючи спосіб, описаний в американському пателишають осідати протягом 12 годин. Прозору часнті US 4168377. тину супернатанту відбирають і видаляють. До Суміші відповідно до винаходу нетоксичні й, осілого осаду (зовнішній вигляд кашки) додають таким чином, можуть бути використані як лікарські 560мл води і перемішують протягом 20 хвилин. засоби. Дають осаду повторно осісти приблизно протягом Суміші за даним винаходом можуть бути ви30 хвилин. Супернатант відбирають і видаляють користані як антитромботичні препарати. Зокрема, (560мл). З осілим осадом двічі повторюють описаїх використовують для профілактики венозних ну операцію промивання приблизно 560мл диститромбозів, ускладнень, пов'язаних з артеріальним льованої води. При останній операції промивання тромбозом, зокрема, у випадку інфаркту міокарда. залишають осад у суспензії і фільтрують через їх також використовують при профілактиці й лікуфільтр з пористого скла №3. Осад потім промиваванні проліферації гладких м'язових клітин, ангіоють 4 рази 200мл дистильованої води. Вологу білу генезу, а також як нейропротектори атеросклерозу тверду речовину віджимають і потім сушать при й артеріосклерозу. зниженому тиску (2,7кПа) при температурі, близьДаний винахід стосується також фармацевтикій до 60°С. Після 12 годин сушіння одержують чних композицій, що містять у якості діючого нача87,5г бензетонієвої солі складного бензилового ла суміш полісахаридів відповідно до винаходу, в ефіру гепарину. Отриманий вихід складає 94,9%. разі потреби, в поєднанні з одним або декількома Приклад 1 Деполімеризація й перетворення інертними ексципієнтами. на натрієву сіль Фармацевтичні композиції являють собою, В колбу Ерленмейєра А об'ємом 50мл увонаприклад, розчини, придатні для підшкірного або дять 28мл дихлорметану. При перемішуванні повівнутрішньовенного ін'єктування. Так само їх викольно вводять 4г (0,00238моль) складного бензиристовують для введення легеневим шляхом (інлового ефіру гепарину (ступінь етерифікації: 77%, галяція). бензетонієва сіль), отриманого як описано в прикДозування може варіюватися залежно від віладі А. Після повного розчинення додають 1,32г ку, ваги і стану здоров'я пацієнта. Для дорослого (0,00948моль) 1,5,7-триазабіцикло[4.4.0]дец-5-ену. вона звичайно складає від 20 до 100мг на день Перемішують при температурі, близькій до 20°С, внутрішньом'язово або підшкірно. протягом 3 годин 30 хвилин. Протягом цього часу Наступні приклади ілюструють винахід. при 4°С у колбі Ерленмейєра В готують розчин 12г Приклад А ацетату натрію в 120мл метанолу. При перемішуОдержання бензетонієвої солі складного бенванні на магнітній мішалці реакційну суміш, що зилового ефіру гепарину знаходиться в колбі Ерленмейєра А, доливають до Гепаринат бензетонію метанольного розчину ацетату натрію. З'являється До розчину 10г гепарину в формі натрієвої квазіпрозорий драглистий жовтий осад. Перемішусолі в 100мл води при температурі, близькій до вання припиняють і дають суспензії осісти протя20°С, додають розчин 25г хлориду бензетонію в гом однієї години. Прозору частину супернатанту 125мл води. Продукт фільтрують, промивають відбирають і видаляють (62мл). До осілого осаду водою і сушать. (зовнішній вигляд жовтої кашки) додають 50мл Складний бензиловий ефір гепарину (натрієметанолу й перемішують протягом 20 хвилин. Дава сіль) ють осаду повторно осісти приблизно протягом 30 До розчину 20г гепаринату бензетонію у 80мл хвилин. Супернатант відбирають і видаляють метиленхлориду додають 16мл бензилхлориду. (49мл). До осілого осаду додають 50мл метанолу Розчин нагрівають при температурі 30°С протягом й перемішують протягом 20 хвилин. Потім осад у 12 годин. Тоді додають 108мл 10%-ного розчину формі суспензії фільтрують через фільтр із порисацетату натрію в метанолі, фільтрують, промиватого скла №4. Отриманий золотаво-жовтий осад ють метанолом і сушать. У такий спосіб одержупотім двічі промивають 25мл метанолу. Вологу 9 74836 10 тверду речовину віджимають і потім сушать при сушіння одержують 0,51г очищеної суміші полісазниженому тиску (2,7кПа) при температурі, близьхаридів (натрієва сіль). Отриманий вихід складає кій до 60°С. Після 12 годин сушіння отримують 77,2%. 1,21г деполімеризованого гепарину (складний беХарактеристики отриманої суміші такі: нзиловий ефір, натрієва сіль). Отриманий вихід - середня молекулярна маса: 1600 Дальтон; складає 77,2%. - активність анти-Ха: 94 МЕ/мг; Омилення - активність анти-ІІа: