Гуманізовані моноклональні антитіла до фактора росту гепатоцитів

1. Гуманізоване mAb, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що має послідовність, позначену HuL2G7 на фіг. 2А.; і зрілу варіабельну область легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, позначену HuL2G7 на фіг. 2В. 2. Гуманізоване mAb, що містить зрілу варіабельну область важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, позначену HuL2G7 на фіг. 2А, за винятком того, що першою амінокислотою варіабельної області важкого ланцюга є Gln; і зрілу варіабельну область легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, позначену HuL2G7 на фіг. 2В. 3. Гуманізоване mAb, що містить зрілі варіабельні області легкого і важкого ланцюгів, що мають амінокислотні послідовності, які щонайменше на 90 % ідентичні амінокислотним послідовностям, позначеним HuL2G7 на фіг. 2А і HuL2G7 на фіг. 2В, відповідно, за умови, що щонайменше три положення вибрані з групи, що складається з Н29, Н30, Н48, Н66, Н67, Н71, Н94, L3 і L60, зайняті амінокислотою, що знаходиться у відповідному положенні антитіла L2G7 миші згідно з нумерацією Kabat. 4. Гуманізоване mAb за п. 3, послідовності варіабельних областей легкого і важкого ланцюгів якого щонайменше на 95 % ідентичні амінокислотним послідовностям, позначеним HuL2G7 на фіг. 2А і HuL2G7 на фіг. 2В. 5. Гуманізоване mAb за п. 3 або 4, в якому всі положення вказаної групи зайняті амінокислотами, що знаходяться у відповідних положеннях антитіла L2G7 миші згідно з нумерацією Kabat. 6. Гуманізоване mAb за п. 5, при тій додатковій умові, що положення Н1 зайняте Glu. 7. Гуманізоване mAb за п. 1, яке належить до ізотипу (IgG1,κ). 8. Гуманізоване mAb за п. 3, яке нейтралізує біологічну активність HGF так само добре, як і L2G7. 9. Застосування mAb, як воно описане в будьякому з попередніх пунктів, для виробництва лікарського засобу. 10. Застосування за п. 9 для лікування злоякісної пухлини. 11. Застосування за п. 9, де злоякісна пухлина являє собою гліобластому. UA (21) a200812789 (22) 28.03.2007 (24) 10.05.2011 (86) PCT/US2007/065385, 28.03.2007 (31) 60/788,243 (32) 01.04.2006 (33) US (46) 10.05.2011, Бюл.№ 9, 2011 р. (72) КІМ КІУНГ ДЗІН, US, ВАН ЛІХУН, US, ПАРК ХАНДЖИЛ, US, ВАСКЕС МАКСІМІЛЬЯНО, US (73) ГЕЛЕКСІ БАЙОТЕК, ЕЛЕЛСІ, US (56) PRESTA L G ET AL: "Humanization of an antivascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders" CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, BALTIMORE, MD., US, vol. 57, no. 20, 15 October 1997 (1997-10-15), pages 4593-4599. KIM ET AL: "Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies" MOLECULES AND CELLS, vol. 20, no. 1, 2005, pages 17-29. BURGESS TERESA ET AL: "FULLY HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO HEPATOCYTE GROWTH FACTOR WITH THERAPEUTIC POTENTIAL AGAINST HEPATOCYTE GROWTH FACTOR/C-MET-DEPENDENT HUMAN TUMORS" CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, BALTIMORE, MD., US, vol. 66, no. 3, 1 February 2006 (2006-02-01), pages 1721-1729. TSURUSHITA N ET AL: "Design of humanized antibodies: From anti-Tac to Zenapax" METHODS : A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY, ACADEMIC PRESS INC., NEW YORK, NY, US, vol. 36, no. 1, 1 May 2005 (2005-05-01), pages 69-83. KASHMIRI S V S ET AL: "SDR grafting-a new approach to antibody humanization" METHODS : A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY, ACADEMIC PRESS INC., NEW YORK, NY, US, vol. 36, no. 1, 1 May 2005 (2005-05-01), pages 25-34, XP004852550 ISSN: 1046-2023 US 2005019327 A; 27.01.05. US 2004208876 A1, 21.10.04. US 5530101 A, 25.06.96. 2 (19) 1 3 Дана заявка є не-попередньою заявкою USSN 60/788243, поданою 1 квітня 2006 року, яка включена як посилання в повному обсязі для будь-яких цілей. Робота, описана в цій заявці, була частково фінансована по Гранту 2R44CA101283-02 Національним Інститутом здоров'я. Уряд США має певні права на даний винахід. Даний винахід стосується головним чином до поєднання технологій моноклональних антитіл (mAb) і рекомбінантних ДНК для розробки нових біологічних препаратів і, більш конкретно, наприклад, для отримання гуманізованих моноклональних антитіл, які зв'язують і нейтралізують фактор росту гепатоцитів. Фактор росту гепатоцитів людини (HGF) являє собою багатофункціональний гетеродимерний поліпептид, що продукується мезенхімними клітинами. Було показано, що HGF стимулює ангіогенез, морфогенез і мотогенез, а також ріст і розподіл різних типів клітин (Bussolino et al., J. Cell. Biol. 119: 629, 1992; Zarnegar and Michalopoulos, J. Cell. Biol. 129:1177, 1995; Matsumoto et al., Ciba. Found. Symp. 212:198, 1997; Birchmeier and Gherardi, Trends Cell. Biol. 8:404, 1998; Xin et al. Am. J. Pathol. 158:1111, 2001). Плейотропні види активності HGF опосередковуються його рецептором, трансмембранною тирозинкіназою, що кодується протоонкогеном cMet. Було показано, що в доповнення до регуляції безлічі нормальних клітинних функцій, HGF і його рецептор c-Met залучені до ініціації, інвазії і метастазування пухлин (Jeffers et al., J. Моl. Med. 74:505, 1996; Comoglio і Trusolino, J. Clin. Invest. 109:857, 2002). HGF/cMet коекспресуються, часто надекспресуються, на різних солідних пухлинах, включаючи пухлини, утворені з тканини легені, товстого кишечнику, прямої кишки, шлунка, нирки, яєчника, шкіри, множинної мієломи і щитовидної залози (Prat et al., Int. J. Cancer 49:323, 1991; Chan et al., Oncogene 2:593, 1988; Weidner et al, Am. J. Respir. Cell. МоІ. Biol. 8:229, 1993; Derksen et al., Blood 99:1405, 2002). HGF діє якості аутокринний (Rong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4731, 1994; Koochekpour et al., Cancer Res. 57:5391, 1997) і паракринний фактор росту (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. МоІ. Biol. 8:229, 1993) і антиапоптотичного регулятора (Gao et al., J. Biol. Chem. 276:47257, 2001) для цих пухлин. HGF являє собою білок масою 102 кДа зі схожістю послідовності і структури з плазміногеном і іншими ферментами згортання крові (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Мої. Biol. 8:229, 1993). HGF людини синтезується як попередник з 728 амінокислот (npenpoHGF), який зазнає внутрішньоклітинного розщеплення до неактивної одноланцюжкової форми (npoHGF) (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Rosen et al., J. Cell. Biol. 127:1783, 1994). При позаклітинній секреції, npoHGF розщеплюється з утворенням біологічно активної зв'язаної дисульфідним зв'язком гетеродимерної молекули, що складається з α-субодиниці і β-субодиниці 94452 4 (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Naldini et al., EMBO J. 11:4825, 1992). α-Субодиниця містить 440 залишків (69 кДа з глікозилуванням), що складаються з N-кінцевого шпилькового домену і чотирьох kringle-доменів. β-Субодиниця містить 234 залишки (34 кДа) і володіє подібним сериновій протеазі доменом, який позбавлений протеолітичної активності. HGF має дві унікальних клітинноспецифічних ділянки зв'язування: високоафінний -10 (Kd=2×10 Μ) дільниця зв'язування для рецепто-9 ра cMet і низкоаффинний (Kd=10 Μ) ділянку зв'язування для гепаринсульфатних протеогліканів (HSPG), які знаходяться на клітинній поверхні і у позаклітинному матриксі (Naldini et al., Oncogene 6:501, 1991; Bardelli et al., J. Biotechnol. 37:109, 1994; Sakata et al., J. Biol. Chem., 272:9457, 1997). Рецептор cMet є членом IV класу сімейства білкових тирозинкіназних рецепторів. Повнорозмірний ген cMet був клонований і ідентифікований як протоонкоген cMet (Cooper et al., Nature 311:29, 1984; Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6379, 1987). NK2 (білок, що охоплює N-кінець і перші два kringle-домена α-субодиниці) є достатнім для зв'язування з cMet і активації каскаду передачі сигналу для рухливості, однак для мітогенної відповіді потрібний повнорозмірний білок (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. МоІ. Biol. 8:229, 1993). HSPG зв'язується з HGF за допомогою взаємодії з Nкінцем HGF. Було описано, що HGF/cMet грають важливу роль в декількох аспектах розвитку злоякісної пухлини, таких як ініціація, інвазія і метастазування пухлини, регуляція апоптозу і ангіогенезу. Було досліджено декілька різних підходів для отримання ефективної молекули-антагоніста: укорочені білки HGF, такі як NK1 (N-кінцевий домен плюс kringle-домен 1; Lokker et al., J. Biol. Chem. 268:17145, 1993), NK2 (N-кінцевий домен плюс kringle-домени 1 і 2; Chan et al., Science 254:1382, 1991) і NK4 (N-кінцевий домен плюс чотири kringleдомени; Kuba et al., Cancer Res. 60:6737, 2000), mAb проти cMet (Dodge, Master's Thesis, San Francisco State University, 1998) і mAb проти HGF (Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001, яка включена в цей документ як посилання). NK1 і NK2 можуть ефективно конкурувати за зв'язування HGF з його рецептором, однак було описано, що вони володіють частковими агоністичними видами активності in vitro (Cioce et al., J. Biol. Chem. 271: 13110, 1996; Schwall et al., J. Cell Biol. 133:709, 1996), а не чисто антагоністичними видами активності, як бажано. Пізнє Kuba et al., Cancer Res. 60:6737, 2000, описали, що NK4 може частково інгібувати первинне зростання і метастазування пухлини LLC легені в моделі на голих мишах (nude) при постійній інфузії NK4. Однак той факт, що NK4 необхідно вводити постійно для досягнення часткового інгібування первинних пухлин, вказує на потенційно короткий час напівжиття молекули NK4 і/або відсутність ефективності. Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001, описали, що введення коктейлю з трьох mAb 5 94452 6 проти HGF, які були вибрані за їх здатністю інгібується з L3 і L60, зайнято амінокислотою, що завати активність HGF відносно поширення in vitro, ймає відповідне положення в легкому ланцюгу було здатне інгібувати зростання пухлин людини в L2G7. моделі ксенотрансплантації на мишах nude. Вони Також передбачені клітинні лінії, що продукупередбачили, що для інгібування видів біологічної ють такі гуманізовані антитіла. В іншому варіанті активності HGF in vivo необхідно три mAb, що розздійснення передбачена фармацевтична композипізнають три різних дільниці зв'язування на HGF: ція, що містить гуманізоване mAb L2G7. У третьодва mAb інгібували зв'язування HGF з cMet, і одне му варіанті здійснення фармацевтичну композицію mAb інгібувало зв'язування HGF з гепарином. вводять пацієнту (як правило, пацієнту-людині) Недавно були описані mAb людини, які окремо для лікування злоякісної пухлини або іншого зазв'язують і нейтралізують HGF і які розроблені з хворювання. використанням технології трансгенних мишей Фіг.1. Амінокислотні послідовності зрілих варі(Burgess et al., WO 2005/017107 A2 і Burgess et al., абельних областей важкого ланцюга (А) і легкого Cancer Res 66:1721, 2006, всі з яких включені в ланцюга (В) L2G7, трансльовані з клонованих цей документ як посилання для будь-яких цілей). кДНК. CDR підкреслені. Використовується система Однак з них щонайменше mAb 2.12.1, яке очевиднумерації Kabat. но було найбільш ефективним в моделях ксенотФіг.2. Показані амінокислотні послідовності рансплантатів пухлин, проте, не інгібувало ангіозрілих варіабельних областей важкого ланцюга (А) генез. Було розроблено mAb миші L2G7, яке і легкого ланцюга (В) HuL2G7, вирівняні з L2G7 і нейтралізувало всі тестовані види біологічної акакцепторними V-областями. CDR підкреслені в тивності HGF, включаючи ангіогенез (патентна послідовностях L2G7, і амінокислоти, заміщені заявка USSN 10/917915, подана 13 серпня 2004 амінокислотами L2G7, підкреслені в послідовносроку, і Kim et al. Clin Cancer Res 12:1292, 2006, всі тях HuL2G7, при цьому початкова амінокислота з яких включені в цей документ як посилання для Н1Е підкреслена подвійною лінією. Використовубудь-яких цілей). ється система нумерації Kabat. Таким чином, існує необхідність в гуманізоваФіг.3. Амінокислотні послідовності повного ному моноклональному антитілі, яке блокує біоловажкого ланцюга (А) і легкого ланцюга (В) HuL2G7. гічну активність HGF in vitro і in vivo. Даний винахід Перші амінокислоти зрілих важкого і легкого ланзадовольняє цю і інші потреби. цюгів (тобто після відщеплення сигнальних посліВ одному варіанті здійснення даний винахід довностей) підкреслені подвійною лінією і познастосується гуманізованого нейтралізуючого mAb чені номером 1; ці амінокислоти також є першими проти фактора росту гепатоцитів людини (HGF). амінокислотами зрілих V-областей. У важкому лаMAb інгібує щонайменше один, і переважно, декінцюгу перші амінокислоти областей СНІ, шарнірлька або всі види біологічної активності HGF, ної області, СН2 і СН3 підкреслені, і в легкому ланвключаючи зв'язування з його рецептором cMet, цюгу перша амінокислота ділянки Ск підкреслена. індукцію поширення клітин, таких як клітки нирки Фіг.4. Конкурентний аналіз зв'язування собаки Madin-Darby, індукцію проліферації епітеліHuL2G7, ChL2G7 і L2G7 з HGF. альних клітин легені норки Mv 1 Lu і/або гепатоциФіг.5. Відносна здатність HuL2G7, ChL2G7 і тів і/або HUVEC, і стимуляцію ангіогенезу. ПереL2G7 блокувати зв'язування HGF з Met. важне гуманізоване mAb проти HGF інгібує, Фіг.6. Відносна здатність HuL2G7 і L2G7 інгібунайбільш переважно, повністю інгібує, зростання вати проліферацію клітин Mv 1 Lu, що індукується ксенотрансплантату пухлини людини в миші. У HGF. переважному варіанті здійснення, гуманізоване Фіг.7. Ефект лікування mAb HuL2G7 або L2G7 mAb являє собою гуманізоване mAb L2G7. В осоабо контролю у вигляді PBS на зростання підшкірбливо переважному варіанті здійснення варіабених ксенотрансплантатів U87 в групах мишей NIH льні області важкого і легкого ланцюгів mAb мають III Beige/Nude. Стрілками вказаний початок ін'єкцій, послідовності, представлені на рядках, позначених і планками погрішностей показані стандартні поHuL2G7 на Фіг.2А і Фіг.2В, відповідно, або послідомилки середнього значення (s.e.m). Символи для вностями, які щонайменше на 90% або більш іденL2G7 і HuL2G7 накладаються, і їх не можна відрізтичні ним. В іншому варіанті здійснення даний винити на фігурі. нахід стосується гуманізованого моноклонального Фіг.8. Ефект чотирьох різних рівнів доз антитіла (mAb), яке зв'язує і нейтралізує фактор HuL2G7 на зростання підшкірних трансплантатів росту гепатоцитів людини (HGF), при цьому гумаU87 в групах мишей NIH III Beige/Nude. Стрілкою нізоване антитіло містить гуманізовані важкий і вказаний початок ін'єкцій, і планками погрішностей легкий ланцюги. Гуманізований важкий ланцюг вказане s.e.m. містить CDR з L2G7 і каркасної дільниці варіабеЦей винахід стосується гуманізованих нейтральної області важкого ланцюга людини, за умови, лізуючих моноклональних антитіл проти HGF, фащо щонайменше одне положення каркасної дільрмацевтичних композицій, що містять їх, і способів ниці варіабельної області важкого ланцюга людиїх застосування для лікування захворювання. ни, вибране з групи, що складається з Н29, Н30, 1. Антитіла Н48, Н66, Н67, Н71, Н94, займає амінокислота, що Антитіла являють собою дуже великі комплекзаймає відповідне положення у важкому ланцюгу сні молекули (молекулярна маса ~150000 або L2G7. Гуманізований легкий ланцюг містить CDR з приблизно 1320 амінокислот) зі складною внутрішL2G7 і каркасна дільниця варіабельної області ньою структурою. Природна молекула антитіла легкого ланцюга людини, за умови, що щонаймемістить дві ідентичних пари поліпептидних ланцюнше одне положення, вибране з групи, що складагів, при цьому кожен з ланцюгів володіє одним 7 94452 8 легким ланцюгом і одним важким ланцюгом; таким вляє інтерес, і еталонного антитіла являє собою чином, фундаментальна структурна одиниця антикількість положень, зайнятих однаковими амінокитіла являє собою тетрамер. Кожний легкий ланцюг слотами в областях як антитіла, що представляє і важкий ланцюг в свою чергу складається з двох інтерес, так і еталонного антитіла, ділене на загаобластей: варіабельної області ("V"), залученої до льну кількість вирівняних положень двох областей, зв'язування антигену-мішені, і константної області без підрахунку розривів, помножене на 100 для ("С"), яка взаємодіє з іншими компонентами імунперетворення в процентну кількість. ної системи. Варіабельні області легкого і важкого Моноклональне антитіло (mAb) являє собою ланцюгів згортаються разом в 3-вимірному просодин молекулярний тип антитіла і, таким чином, не торі з утворенням варіабельної області, яка зв'язує включає в себе поліклональні антитіла, що отриантиген (наприклад, рецептор на поверхні клітимуються шляхом ін'єкції тварині (такому як гризуни). У кожній варіабельній області легкого або ни, кролик або коза) антигену, і витяганням сироважкого ланцюга існує три коротких сегменти (із ватки з організму тварини. Гуманізоване антитіло середньою довжиною 10 амінокислот), які називаявляє собою отримане способами генетичної інються визначальними комплементарність обласженерії (моноклональне) антитіло, в якому CDR з тями ("CDR"). Шість CDR у варіабельному домені мишачого антитіла ("донорного антитіла", яке таантитіла (три з легкого ланцюга і три з важкого кож може являти собою антитіло щура, хом'яка ланцюга) згортаються разом в 3-D-просторі з або іншого схожого виду) пересаджують в людське утворенням істинної антигенів'язувальної ділянки антитіло ("акцепторне антитіло"). Також гуманізоантитіла, яка захоплює антиген-мішень. Положенвані антитіла можна отримувати менш ніж з повня і довжина CDR точно визначені. Див. Kabat, Ε. ними CDR з мишачого антитіла (наприклад, et al, Sequences of Proteins of Immunological Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002). НайчасInterest, U.S. Department of Health and Human тіше в гуманізоване антитіло з донорного антитіла Services, 1983, 1987, які включені в цей документ також переносять першу гіперваріабельну петлю як посилання. Частину варіабельної області, що не НІ важкого ланцюга, що визначається Chothia & знаходиться в CDR, називають каркасною ділянLesk, J. МоІ. Biol. 196:901-917, 1987. Таким чином, кою, яка утворює оточення для CDR. У кожному гуманізоване антитіло являє собою антитіло, що ланцюгу три CDR розділені чотирма ділянками має CDR з донорного антитіла і каркасні ділянки каркасних ділянок в наступному порядку: FR1, варіабельних областей і константні області з антиCDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. тіл людини. Акцепторні каркасні ділянки легкого і Амінокислоти з варіабельних областей зрілого важкого ланцюгів можуть бути з однакових або важкого і легкого ланцюгів імуноглобулінів познарізних антитіл людини, і кожне з них може являти чені Нх і Lx, відповідно, де х являє собою число, собою складову структуру з двох або більш каркащо означає положення амінокислоти відповідно до сних ділянок антитіла людини; або, альтернативсхеми Kabat, представленої в публікації, що цитуно, вони можуть являти собою консенсусну посліється. У Kabat наводиться безліч амінокислотних довність каркасних ділянок людини (наприклад, послідовностей для антитіл кожної підгрупи і вкапідгрупа антитіл людини, як визначено вище у зані амінокислоти, що найчастіше зустрічаються Kabat et al., в публікації, що цитується), тобто посдля кожного положення залишку в цій підгрупі, з лідовність, що має амінокислоту, що найчастіше утворенням консенсусної послідовності. Kabat визустрічається, в групі в кожному положенні. Крім користовує спосіб привласнення номера залишку того, для збереження високої афінності зв'язуванкожній амінокислоті в наведеній послідовності, і ня можна використати щонайменше один з двох цей спосіб привласнення номерів залишків став додаткових структурних елементів. Див., Queen et стандартним в даній галузі. Схема Kabat розпоal., патенти США No. 5530101 і 5585089, кожний з всюджується і на інші, не включені в його перелік, яких включений в цей документ як посилання, в антитіла, шляхом вирівнювання представляючого яких представлені докладні інструкції для консінтерес антитіла з однією з консенсусних послідотруювання гуманізованих антитіл. вностей, вказаних у Kabat, на основі консервативУ першому структурному елементі каркасну них амінокислот. Застосування системи нумерації ділянку варіабельної області важкого ланцюга гуKabat дає можливість легко ідентифікувати аміноманізованого антитіла вибирають так, щоб вона кислоти в еквівалентних положеннях в різних анволоділа високою ідентичністю послідовності (щотитілах. Наприклад, амінокислота в положенні L50 найменше 65%) з каркасною ділянкою варіабельантитіла людини займає положення, еквівалентне ної області важкого ланцюга донорного антитіла, положенню амінокислоти L50 антитіла миші. Більш за допомогою вибору придатним чином акцептортого будь-які дві послідовності антитіл можна одного антитіла серед множини відомих антитіл люнозначно вирівнювати, наприклад для визначення дини. У другому структурному елементі при конспроцентної ідентичності, з використанням системи труюванні гуманізованого антитіла вибрані нумерації Kabat, так що кожна амінокислота в одамінокислоти в каркасній ділянці акцепторного ній послідовності антитіла вирівнюється з амінокиантитіла людини (поза CDR) замінюють відповідслотою іншої послідовності з тим же номером, ними амінокислотами з донорного антитіла, відповказаним у Kabat. Після вирівнювання область відно до вказаних правил. Конкретно, амінокислопредставляючого інтерес антитіла (наприклад, ти, що підлягають заміні в каркасній ділянці, як повної зрілої варіабельної області важкого або правило, вибирають, виходячи з їх здатності взаєлегкого ланцюга) порівнюють з тією ж областю модіяти з CDR. еталонного антитіла, процентна ідентичність посНаприклад, замінені амінокислоти в гуманізолідовностей між областями антитіла, що представаному антитілі можуть бути сусідніми з CDR в 9 94452 10 послідовності донорного антитіла, або вони мона 50%, але переважно, на 75%, більш переважно, жуть знаходитися в межах 4-6 ангстрем від CDR, на 90% або 95% або навіть 99%, і найбільш перепри визначенні в 3-вимірному просторі. важно, приблизно на 100% (по суті повністю) при З іншого боку, оскільки гуманізовані mAb поаналізі способами, описаними в прикладах або винні бути утворені надлюдським донорним mAb, відомими в даній галузі. Як правило, міру інгібугуманізовані mAb, по суті не включають в себе вання вимірюють, коли кількість HGF, що викорислюдських mAb, отриманих шляхом виділення нуктовується, є достатньою тільки для повної стимулеїнових кислот, що кодують варіабельні області, ляції біологічної активності, або становить 0,01, з людини і їх селекції з використанням способів 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 3 або 10 мкг/мл. Переважно, фагового дисплея (див., наприклад, Dower et al., щонайменше 25%, 50%, 75%, 90%, або 95% або WO 91/17271; McCafferty et al, WO 92/001047; по суті повного інгібування будуть досягати, коли Winter, WO 92/20791; і Winter, FEBS Lett. 23:92, молярне співвідношення антитіла і HGF становить 1998) або з використанням трансгенних мишей 0,1х, 0,5х, 1х, 2х, 3х, 5х або 10х. Найбільш пере(див., наприклад, Lonberg et al., WO 93/12227; важно, mAb буде нейтралізовувати не тільки один, Kucherlapati WO 91/10741, і Burgess et al. WO а декілька видів біологічної активності, наведених 2005/027107 A2). вище; для цілей, представлених в цьому докуменЕпітоп mAb являє собою область у відповідті, mAb проти HGF, яке нейтралізувало всі види ному їй антигені, з яким зв'язується mAb. Два анбіологічної активності HGF, буде називатися "повтитіла зв'язуються з одним і тим же або епітопом, ністю нейтралізуючим", і такі mAb є найбільш пещо перекривається, якщо кожне з них повністю реважними. MAb згідно з винаходом переважно інгібує (блокує) зв'язування іншого з антигеном. специфічно зв'язується з HGF, тобто вони не буТаким чином, 1х, 5х, 10х, 20х або 100х надлишок дуть зв'язувати або будуть зв'язувати тільки в знаодного антитіла інгібує зв'язування іншого щонайчно меншій мірі, білки, які схожі з HGF, такі як факменше на 50%, але переважно, на 75%, 90% або тор росту фібробластів (FGF) і фактор росту навіть 99%, при вимірюванні в конкурентному анасудинного ендотелію (VEGF). MAb згідно з виналізі зв'язування (див., наприклад, Junghans et al., ходом, як правило, володіють афінністю зв'язу7 1 Cancer Res. 50:1495, 1990). Альтернативно, два вання (Ка) з HGF щонайменше 10 М" , а переваж8 -1 9 -1 антитіла володіють одним епітопом, якщо всі аміно, 10 Μ або вище і найбільш переважно, 10 М 10 -1 нокислотні мутації в антигені, які знижують або або вище або навіть 10 М або вище. запобігають зв'язуванню одного антитіла, знижуГуманізовані mAb згідно з винаходом включають або запобігають зв'язуванню іншого. Два анють в себе антитіла проти HGF в їх природній теттитіла мають епітопи, що перекриваються, якщо рамерній формі (2 легких ланцюги і 2 важких ланмутації деяких амінокислот, які знижують або зацюги), і вони можуть являти собою будь-який з побігають зв'язуванню антитіла, знижують або завідомих ізотипів IgG, IgA, IgM, IgD i IgE і їх субтипобігають зв'язуванню іншого. пів, тобто IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, і можуть містити 2. Гуманізовані нейтралізуючі антитіла проти легкий ланцюг каппа і лямбда. Також mAb згідно з HGF винаходом включають в себе фрагменти антитіл, Кажуть, що моноклональне антитіло (mAb), такі як Fv, Fab і F(ab')2; біфункціональні гібридні яке зв'язує HGF (тобто mAb проти HGF), нейтраліантитіла (наприклад, Lanzavecchia et al., Eur. J. зує HGF, або є нейтралізуючим, якщо зв'язування Immunol. 17:105, 1987), одноланцюжкові антитіла частково або повністю інгібує один або декілька (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, видів біологічної активності HGF (тобто коли mAb 1988; Bird et al. Science 242:423, 1988); і антитіла із використовують як єдиний засіб). До біологічних зміненими константними областями (див. напривластивостей HGF, які може інгібувати нейтраліклад, патент США No. 5624821). Джерелом CDR в зуюче антитіло, відносяться здатність HGF зв'язуmAb може бути тварина (наприклад, миша, щур, ватися з його рецептором cMet, спричиняти пошихом'як або курка), або його молена отримувати, рення певних клітинних ліній, таких як клітини використовуючи способи генетичної інженерії. mAb нирки собаки Madin-Darby (MDCK); стимулювати щура отримують стандартними способами, добре проліферацію (тобто бути мітогон для) певних вивідомими в даній галузі, включаючи множинну імудів клітин, включаючи гепатоцити, епітеліальні нізацію за допомогою HGF в придатному ад'юванті клітини легені норки Mv 1 Lu і різні пухлинні клітивнутрішньочеревинно, внутрішньовенно або в пони людини; або стимулювати ангіогенез, напридушку лапи, з подальшим витяганням клітин селеклад, при вимірюванні за допомогою стимуляції зінки або лімфатичних вузлів і злиттям з придатпроліферації ендотеліальних клітин судин пуповиною іморталізованою клітинною лінією, і з ни людини (HUVEC) або утворення судин або за подальшою селекцією гібридом, які продукують допомогою індукції кровоносних судин при нанеантитіло, що зв'язується з HGF. сенні на хоріоалантоїсну мембрану курячого ембЦей винахід стосується гуманізованих форм ріона (САМ). Антитіла згідно з винаходом переваmAb L2G7 миші. Послідовності зрілих варіабельжно зв'язуються з HGF людини, тобто з білком, що них областей важкого і легкого ланцюгів mAb L2G7 кодується послідовністю GenBank з реєстраційним миші представлені на Фіг.1А і 1В, відповідно. Таномером D90334. ким чином, гуманізовані форми mAb L2G7 вклюГуманізоване нейтралізуюче mAb згідно з вичають в себе більшість або всі амінокислоти CDR находом в концентрації, наприклад, 0,01, 0,1, 0,5, з цих послідовностей в каркасних ділянках варіа1, 2, 5, 10, 20 або 50 мкг/мл буде інгібувати біолобельної області людини (включаючи каркасні ділягічну функцію HGF (наприклад, стимуляцію пролінки людини з одиничною, складаною або консенферації або розсіювання) приблизно щонайменше сусною послідовністю). Наприклад, деякі 11 94452 12 гуманізовані антитіла включають в себе три інтак99% ідентичні цим послідовностям (при вирівнютних CDR з важкого ланцюга L2G7 і три інтактних ванні відповідно до нумерації Kabat, вище), і/або CDR з легкого ланцюга. Інші гуманізовані антитіла відрізняються від них на невелику кількість (як включають в себе щонайменше один інтактний правило, що включає не більше 5 або 10 амінокиCDR з важкого ланцюга L2G7 і щонайменше один слот) функціонально неістотних замін, делецій інтактний CDR з легкого ланцюга L2G7. Деякі гуі/або вставок. Наприклад, перша амінокислота манізовані антитіла включають в себе щонайменважкого ланцюга може являти собою або Glu, або ше один CDR, в якому джерелом деяких залишків Gin. Заміни, як правило, є консервативними, тобто є відповідний CDR L2G7, і джерелом інших є CDR замінами амінокислот амінокислотами, які є хімічантитіла людини, переважно того ж антитіла люно схожими. З метою класифікації амінокислотних дини, яке є джерелом каркасної ділянки варіабезамін як консервативних або неконсервативних, льної області, що містить CDR. амінокислоти можна групувати таким чином: Група У деяких гуманізованих антитілах згідно з виІ (гідрофобні бічні ланцюги): Met, Ala, Val, Leu, lie; находом щонайменше 1, 3, 5 або всі положення, Група II (нейтральні гідрофільні бічні ланцюги): вибрані з групи Н29, Н30, Н48, Н66, Н67, Н71, Н94, Cys, Ser, Thr; Група III (кислі бічні ланцюги): Asp, L3 і L60, зайняті амінокислотою, представленою у Glu; Група IV (основні бічні ланцюги): Asn, Gin, His, відповідному положенні в нумерації Kabat в антиLys, Arg; Група V (залишки, що впливають на орієтілі L2G7 миші. В акцепторних каркасних ділянках нтацію ланцюга): Gly, Pro; і Група VI (ароматичні варіабельної області людини, що використовуютьбічні ланцюги): Тrр, Туr, Phe. Консервативні заміни ся в прикладах, всі з цих положень зайняті аміноявляють собою заміни, які залучають заміни між кислотними залишками людини, відмінними від амінокислотами в одній і тій же групі. Переважно амінокислоти, представленої у відповідному полоуникають замін, пов'язаних з V-областями на женні в антитілі L2G7 миші. Таким чином, заміФіг.2А і 2В, в положеннях Н29, Н30, Н48, Н66, Н67, щення всіх або більшості положень, вибраних з Н71, Н94, L3 і L60, де амінокислоти з L2G7 миші даної групи, є переважним. Якщо використовують були включені внаслідок взаємодії цих положень з інші каркасні ділянки варіабельної області людини, CDR, як розглянуто в прикладах. Заміни переваждеякі з положень можуть бути зайняті амінокислоно зустрічаються в положеннях каркасної ділянки тами, які є однаковими в каркасній ділянці варіаваріабельної області, але вони також зустрічаютьбельної області людини і антитіла L2G7 миші. Тася і в областях CDR. Якщо область CDR заміщена, ким чином, в таких положеннях заміщення не переважною є заміна амінокислоти миші амінокиспроводять, але його можна провести в інших полотою відповідного положення (нумерація Kabat) в ложеннях, відмінних між каркасною ділянкою варіантитілі людини, переважно в тому ж антитілі люабельної області людини і антитілом L2G7 миші дини, яке є джерелом акцепторних каркасних дівідповідно до правил Queen, US 5530101 і US лянок варіабельних областей. 5585089. Незалежно від вибору каркасної ділянки Як правило, гуманізовані mAb L2G7 належать варіабельної області людини, заміна інших амінодо ізотипу IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4 з легким ланкислот, крім амінокислот, вказаних в наведеній цюгом каппа. mAb IgG1, що має варіабельні облавище групі, також є можливою, як розглянуто нижсті, представлені на Фіг.2А і 2В відповідно, комбіче. Однак, як правило, ні каркасна ділянка варіановані з повною константною областю людини бельної області важкого ланцюга, ні каркасна дігамма-1 і каппа, позначаються HuL2G7. Повні важлянка варіабельної області легкого ланцюга кий і легкий ланцюги HuL2G7 представлені, відпогуманізованого антитіла, не включають більше відно, на Фіг.3А і 3В. Тільки зрілі частини цих посдесяти або дванадцяти замін, що приводить до лідовностей, що починаються в положеннях, залишків, не представлених в акцепторній каркасвказаних номером 1, насправді є частиною ній ділянці варіабельної області людини (включаHuL2G7, оскільки попередні сигнальні пептиди ючи консесусні каркасні ділянки варіабельних обвідщеплюються до або в процесі секреції антитіла. ластей людини і складані каркасні ділянки Варіанти HuL2G7, що зберігають схожі з варіабельних областей людини, як розглянуто HuL2G7 характеристики зв'язування, можна отривище). мувати шляхом мутагенезу з подальшою масовою Будь-які константні області, представлені в гуселекцією з використанням способів фагового диманізованих антитілах згідно з винаходом, є людсплея, розглянутих вище. Варіанти початково відськими або по суті людськими, що мають не більбирають по специфічному зв'язуванню з HGF, неше десяти, і переважно, дві або декілька замін обов'язково конкурентному з HuL2G7 або L2G7 відносно природної константної області людини. миші. Потім варіанти, що володіють такими ж або Деякі заміни є переважними відносно підвищення схожими характеристиками зв'язування, як і навечасу напівжиття антитіла і/або його афінності до дене як приклад антитіло, можна функціонально тестувати. FcRn, як розглянуто нижче. Інші заміни, як правиПереважні mAb L2G7 є нейтралізуючими або ло, консервативні заміни, як розглянуто нижче, повністю нейтралізуючими для HGF, як визначено володіють нейтральним ефектом. вище. Переважно, для деяких, більшості або всіх Ілюстративні гуманізовані форми L2G7 вклюпевних біологічних властивостей HGF (наприклад, чають в себе зрілі варіабельні області важкого і зв'язування з Met, стимуляції проліферації клітин легкого ланцюгів, маючі послідовності, показані на Mv 1 Lu або HUVEC), нейтралізуюча активність Фіг.2А і 2В, відповідно. Інші переважні форми гугуманізованого mAb відрізняється в межах 3 разів, манізованого L2G7 включають в себе зрілі варіабільш переважно, в межах 2 разів або 1,5 разів, і бельні області важкого і легкого ланцюгів, маючі найбільш переважно, не відрізняється (тобто знапослідовності, щонайменше на 90%, 95%, 98% або 13 94452 14 ходиться в межах експериментальної помилки) від У переважному варіанті здійснення даний винейтралізуючої активності самого L2G7. Значить, нахід стосується фармацевтичного складу, що для досягнення тієї ж міри інгібування біологічної містить гуманізовані антитіла, описані в цьому довластивості (наприклад, при вимірюванні за допокументі. Фармацевтичні склади антитіл містять могою ІС50) потрібна не більш ніж 3-кратна, 2mAb в фізіологічно прийнятному носії, необов'язкратна, 1,5-кратна або така ж кількість гуманізоваково з ексципієнтами або стабілізаторами, в формі ного mAb відносно L2G7. Переважно, афінність до ліофілізованих або водних розчинів. Прийнятні HGF гуманізованих mAb також відрізняється в меносії, ексципієнти або стабілізатори є нетоксичнижах З разів, 2 разів або по суті не відрізняється від ми для реципієнтів в дозуванні і концентраціях, що афінності L2G7. Аналогічно, в моделях ксенотранзастосовується, і включають в себе буфери, такі як сплантації на мишах (наприклад, з використанням фосфат, цитрат, або ацетат, при рН, як правило, клітинної лінії гліоми людини, такої як U87), гуманівід 5,0 до 8,0, найчастіше, від 6,0 до 7,0; солі, такі зовані mAb переважно інгібують зростання пухлияк хлорид натрію, хлорид калію і т.д., для забезпени в межах 3 разів, 2 разів або невідмітно від mAb чення ізотонічності; антиоксиданти, консерванти, L2G7 миші. Насправді переважно, щоб доза тільки низькомолекулярні поліпептиди, білки, гідрофільні в 40, 20 або навіть 10 мкг гуманізованого mAb, що полімери, такі як полісорбат 80, амінокислоти, вугвводиться два рази на тиждень, повністю інгібувалеводи, хелатуючі агенти, цукор і інші стандартні ла зростання ксенотрансплантатів пухлини U87. інгредієнти, відомі фахівцям в даній галузі (див. Гуманізовані mAb можна експресувати множиRemington's Pharmaceutical Science 16th edition, ною відомих в даній галузі способів. Наприклад, Osol, A. Ed. 1980). Як правило, mAb представлене спочатку можна синтезувати гени, що кодують їх в концентрації 1-100 мг/мл, наприклад, 10 мг/мл. V-області легкого і важкого ланцюга, з олігонуклеВ іншому переважному варіанті здійснення виотидів, що перекриваються, або за допомогою нахід стосується способу лікування пацієнта з вимутагенезу за допомогою ПЛР раніше отриманого користанням гуманізованого mAb проти HGF, таковаріанту необхідного гена. Внаслідок виродженості го як гуманізоване L2G7, наприклад, HuL2G7, в генетичного коду кожну амінокислотну послідовскладі фармацевтичної композиції. МАЬ, отримане ність антитіла кодує декілька послідовностей ДНК. в складі фармацевтичної композиції, можна ввоВсі послідовності ДНК, що кодують антитіла, опидити пацієнту будь-яким придатним способом, сані в цій заявці, прямо належать до цього винаособливо парентерально шляхом внутрішньовенходу. Однак після отримання гени, що кодують ної інфузії або болюсної ін'єкції, внутрішньом'язово легкий і важкий ланцюги гуманізованого mAb, вбуабо підшкірно. Внутрішньовенну інфузію можна довують спільно з С-областями в експресуючі векпровести протягом 15 хвилин, однак частіше протори (наприклад, комерційно доступні від тягом 30 хвилин, або більше 1, 2 або навіть 3 гоInvitrogen), які забезпечують необхідні регуляторні дин. Також mAb можна ін.'єктувати безпосередньо ділянки, наприклад, промотори, енхансери, ділянв ділянку локалізації захворювання (наприклад, ки поліА і т.д. Застосування промотора-енхансера пухлина), або інкапсулювати в носії, такі як ліпоCMV є переважним. Гени для С-ділянок в цей час соми. Доза, що вводиться, є достатньою для пошироко доступні або їх можна легко клонувати за м'якшення стану, що підлягає лікуванню ("терапедопомогою ПЛР з антитілопродукуючих клітин лювтично ефективна доза") і, ймовірно, буде дини. Гени легкого і важкого ланцюгів можна вбустановити від 0,1 до 5 мг/кг маси тіла, наприклад, довувати спільно в один вектор або їх можна вбу1, 2, 3 або 4 мг/кг, однак вона може складати до 10 довувати в різні вектори. Потім експресуючі мг/кг або навіть 15 або 20 мг/кг. Також можна ввовектори можна трансфікувати з використанням дити фіксовану одиничну дозу, наприклад, 50, 100, різних відомих в даній галузі способів, таких як 200, 500 або 1000 мг, або доза може бути основаліпофекція або електропорація, в різні клітинні лінії на на площі поверхні тіла пацієнта, наприклад, 100 ссавців, такі як СНО або 293, або непродукуючі мг/м . Як правило, для лікування злоякісної пухлимієломи, включаючи Sp2/0 і NSO, і клітини, ексни вводять між 1 і 8 дозами (наприклад, 1,2, 3, 4, 5, пресуючі антитіла, вибрані методом селекції на 6, 7 або 8), однак можна вводити 10, 20 або більвідповідному антибіотику. Див., наприклад, патент ше доз. МАb можна вводити кожний день, два раСША No. 5530101. Великі кількості антитіла можна зи на тиждень, раз на тиждень, раз в два тижні, отримувати шляхом вирощування клітин в комерраз в місяць або з деяким іншим інтервалом, в ційно доступних біореакторах. залежності, наприклад, від часу напівжиття mAb, Після експресії гуманізовані mAb згідно з випротягом 1 тижня, 2 тижнів, 4 тижнів, 8 тижнів, 3-6 находом можна очищати відповідно до стандартмісяців або більше. Також можливі повторні курси них в даній галузі способів, таких як мікрофільтралікування, як у разі тривалого введення. ція, ультрафільтрація, афінна хроматографія з Захворювання, особливо чутливі до терапії білком А або G, гель-фільтрація, аніонообмінна гуманізованими mAb проти HGF згідно з винахохроматографія, катіонообмінна хроматографія дом, наприклад, HuL2G7, включають в себе соліді/або інші форми афінної хроматографії на основі ні пухлини, для яких, як вважають, потрібний ангіоорганічних барвників і ін. По суті чисті антитіла з генез, або які асоційовані з підвищеними рівнями гомогенністю щонайменше приблизно 90 або 95% HGF, наприклад, рак яєчника, рак молочної залоє переважними, і антитіла з гомогенністю 98% або зи, рак легені (дрібноклітинний або недрібноклі99% або більше є найбільш переважними для фатинний), рак товстого кишечнику, рак передміхурормацевтичного застосування. вої залози, рак підшлункової залози, рак шлунка, 3. Терапевтичні способи рак печінки, пухлини голови і шиї, меланому і саркоми дітей або дорослих і пухлини мозку. Дійсно, 15 94452 16 способи згідно з винаходом, особливо системне вання (наприклад, шляхом стандартної хіміотеравведення гуманізованого L2G7 mAb, є особливо пії), що включає mAb проти HGF може підвищити застосовними для лікування пухлин мозку, вклюпоказник повної відповіді, показник часткової відчаючи менінгіоми; гліоми, включаючи епендимоми, повіді або показник об'єктивної відповіді (повний + олігодендрогліоми, і всі типи астроцитом (низькочастковий) пацієнтів з вказаними пухлинами (надиференційовану, анапластичну і мультиформну приклад, яєчника, молочної залози, легені, підшгліобластому, або просту гліобластому); медулоблункової залози, головного мозку і товстого кишеластоми, гангліогліоми, шваноми, хондроми; і пухчнику, особливо у випадку рецидивуючих або лини головного мозку, головним чином дитячі, рефрактерних) щонайменше на 30% або 40%, включаючи ембріональні нейроектодермальні пухпереважно, на 50%, 60% і до 70% або навіть до лини. Як первинні пухлини головного мозку (тобто 100% в порівнянні з тим же лікуванням (напривиникаючі в головному мозку), так і вторинні або клад, методами хіміотерапії), але без mAb проти метастатичні пухлини мозку можна лікувати споHGF. Для пухлин мозку, таких як гліобластоми, собами згідно з винаходом. Інші захворювання, лікування гуманізованим mAb проти HGF, окремо придатні для лікування способами згідно з винаабо в поєднанні з іншими засобами, переважно ходом, являють собою захворювання, асоційовані забезпечує частковий, повний або об'єктивний з небажаним ангіогенезом, такі як діабетична репоказник відповіді щонайменше в 5% або 10%, тинопатія, пов'язана зі старінням дегенерація жовбільш переважно, в 20% або 25% або 30%, і найтої плями, ревматоїдний артрит і псоріаз. більш переважно, в 40%, 50% або більше. В особливо переважному варіанті здійснення Головним чином при клінічному випробуванні гуманізоване mAb проти HGF, наприклад, HuL2G7, (наприклад, випробуванні II фази, ІІ/ІІІ фази або III вводять спільно (тобто до, в процесі або після) з фази), вищезазначені підвищення середньої виіншою терапією злоякісної пухлини. Наприклад, живаності без прогресування і/або показника відmAb можна вводити спільно з будь-яким одним повіді у пацієнтів, яких лікували стандартною теабо декількома хіміотерапевтичними лікарськими рапією плюс гуманізоване mAb проти hHGF, засобами, відомими фахівцям в галузі онкології, наприклад, HuL2G7, відносно контрольної групи наприклад, алкілуючими засобами, такими як карпацієнтів, яким проводили стандартну терапію мустин, хлорамбуцил, цисплатин, карбоплатин, окремо (або плюс плацебо), є статистично значуоксиплатин, прокарбазин і циклофосфамід; антищими, наприклад, при рівні р=0,05 або 0,01 або метаболітами, такими як фторурацил, флоксуринавіть 0,001. Показники повної і часткової відповідин, флударабін, гемцитабін, метотрексат і гідрокдей визначають за допомогою об'єктивних критерісисечовина; природними продуктами, включаючи їв, що звичайно використовуються в клінічних виалкалоїди рослин і антибіотиками, такими як блепробуваннях при злоякісній пухлині, наприклад, оміцин, доксорубіцин, даунорубіцин, ідарубіцин, приведених або схвалених Національним Інституетопозид, мітоміцин, мітоксантрон, вінбластин, том Раку і/або ФДА. вінкристин, і таксол (паклітаксел) або схожі сполу4. Інші способи ки, такі як Taxotere®; засобами, схваленими конкГуманізовані mAb проти HGF згідно з винахоретно для пухлин головного мозку, включаючи дом також знаходять застосування в діагностичтемозоломід і Gliadel®, облатки, що містять кармуних, прогностичних і лабораторних способах. їх стин; і іншими лікарськими засобами, що включаможна застосовувати для визначення рівня HGF в ють іринотекан і Gleevec® і всі схвалені і експерипухлині або в кровотоці пацієнта з пухлиною і, таментальні протипухлинні засоби, перераховані в ким чином, для проходження і регулювання лікуWO 2005/017107 А2 (яка включена в цей документ вання пухлини. Наприклад, пухлина, асоційована з як посилання). Інші засоби, з якими можна вводити високими рівнями HGF, може бути особливо чутгуманізоване mAb проти HGF, включають в себе ливою до лікування гуманізованим mAb проти біологічні препарати, такі як моноклональні антитіHGF. У конкретних варіантах здійснення mAb мола, включаючи HerceptinTM проти антигену HER2, жна застосовувати в методі ELISA або радіоімунAvastinTM проти VEGF або антитіла до рецептора ного аналізу для визначення рівня HGF, наприEGF, а також низькомолекулярні антиангіогенні клад, в зразку біоптату пухлини або в сироватці лікарські засоби або антагоністи рецептора EGF. або супернатанті середовища секретуючих HGF Крім того, гуманізоване mAb проти HGF можна клітин в клітинній культурі. Для різних способів застосовувати спільно з променевою терапією або аналізу mAb проти HGF можна мітити флуоресцехірургічною операцією. нтними молекулами, міченими спиновою міткою Лікування (наприклад, стандартна хіміотерамолекулами, ферментами або радіоізотопами і пія), що включає гуманізоване антитіло mAb проти можна надавати у вигляді набору з всіма необхідHGF, наприклад, HuL2G7, може підвищувати сеними реагентам для проведення аналізу HGF. В редню виживаність без прогресування або загальінших способах застосування mAb проти HGF зану виживаність пацієнтів з цими пухлинами (настосовують для очищення HGF, наприклад, за приклад, яєчника, молочної залози, легені, допомогою афінної хроматографії. підшлункової залози, головного мозку і товстого Приклади кишечнику, особливо у випадку рецидивуючих або 1. Конструювання гуманізованого антитіла рефрактерних) щонайменше на 30% або 40%, L2G7 переважно, на 50%, 60% і до 70% або навіть до Отримання mAb проти HGF миші, L2G7, яке 100% або більше, в порівнянні з тим же лікуванням нейтралізувало всі види біологічної активності (наприклад, хіміотерапевтичним), але без mAb HGF, що тестуються, вже описане (Kim et al., US проти HGF. Додатково або альтернативно, ліку20050019327 подана 13 серпня, 2004, і Kim et al. 17 94452 18 Clin Cancer Res 12:1292, 2006). Першою стадією спочатку концептуально пересаджували в акцепгуманізації L2G7 було клонування його генів легкоторні каркасні ділянки. У положеннях каркасних го і важкого ланцюгів, яке проводили по суті відподілянок, де комп'ютерна модель передбачала знавідно до способу Co et al., J. Immunol. 148:1149, чний контакт з CDR, які можуть бути необхідні для 6 1992. Коротко, РНК отримували з 10 гібридомних підтримки конформації CDR, амінокислоти з миклітин L2G7 (IgG2a,к) з використанням набору шачого антитіла замінювали початковими амінокиRNeasy Mini Kit (Qiagen), з подальшим синтезом слотами каркасної ділянки людини. Для гуманізопершого ланцюга кДНК з випадковими праймераваного mAb L2G7, що позначається HuL2G7, це ми з використанням набору з Stratagene і доданпроводили в залишках 29, 30 (в гіперваріабельній ням dG-хвостів за допомогою термінальної дезопетлі Н1 Chothia), 48, 66, 67, 71 і 94 важкого ланксинуклеотидилтрансферази (Promega). V-області цюга і в залишках 3 і 60 легкого ланцюга, з викориважкого і легкого ланцюгів, відповідно, ампліфікустанням нумерації Kabat. Крім того, 1 амінокислоту вали з кДНК з допомогою праймера, що випалюважкого ланцюга замінювали на Ε (Glu), оскільки ється з dG-хвостом, і праймера, що випалюється з ця амінокислота з меншою імовірністю, ніж Q (GІn), утворює похідне в білку антитіла. ПослідовN-кінцевою областю С2а, для важкого ланцюга і ності V-області важкого і легкого ланцюгів HuL2G7, праймера, що випалюється з N-кінцевою областю вирівняні відносно відповідних ділянок L2G7 і акСк, для легкого ланцюга, з використанням полімецепторних V-областей, показані на Фіг.2А і 2В, де рази з високою точністю AccuPrime Pfx (Invitrogen). CDR і заміщені амінокислоти виділені кольором. Смуги відповідного розміру очищали з гелю з реаТакож цей винахід стосується варіантів гуманікційних сумішей ПЛР і секвенували або клонували, зованих mAb L2G7, зрілі варіабельні області важа потім секвенували, з використанням способами кого і легкого ланцюгів яких відрізняються від посдидезокси-термінації за допомогою автоматизовалідовностей HuL2G7 на невелику кількість ного секвенатора. Для важкого ланцюга була ви(наприклад, як правило, не більше 1, 2, 3, 5 або явлена одинична послідовність кДНК, яка показана 10) замін, делецій або вставок, як правило, в карпісля трансляції на Фіг.1А. Було виявлено дві різкасній ділянці, але можливо, і в CDR. Зокрема, них, мабуть, неаберантних послідовності кДНК тільки частину описаних вище замін можна провелегкого ланцюга послідовності, однак секвенувасти в акцепторних каркасних ділянках, або можна ние амінокислот N-кінця виділеного легкого ланпровести додаткову заміну(и), наприклад, амінокицюга L2G7 виявило тільки один з цих ланцюгів, слоту 69F VH L2G7 можна замінювати акцептортрансльована амінокислотна послідовність якого ною амінокислотою 69М. З іншого боку, амінокиспоказана на Фіг.1В. лота 1E VH може являти собою Q. Дійсно, багато Для експресії химерної форми L2G7 і пізнього які із залишків каркасної ділянки, що не контактугуманізованого mAb експресуючі вектори, схожі з ють з CDR в HuL2G7, можуть включати заміни векторами pVk і pVgl, описаними у Co et al., J. амінокислот з відповідних положень L2G7 або інImmunol. 148:1149, 1992, які містять гени Ск і C1 ших мишачих або людських антитіл, і також заміну людини, конструювали з комерційно доступних допускають навіть багато які потенційні контактуювекторів і фрагментів ДНК. Однак вектор легкого чі з CDR залишки або навіть амінокислоти в CDR. ланцюга мав селективний маркер hyg замість gpt, і Найчастіше, заміни, що проводяться в послівектор важкого ланцюга мав селективний маркер довностях варіантів гуманізованого L2G7, є консеnео замість Dhfr. Клоновані гени VL і VH субклонурвативними відносно амінокислот, що замінюютьвали в придатні ділянки цих векторів, з отриманся HuL2G7. Переважно, заміни в HuL2G7 (як ням експресуючих плазмід для генів важкого і легконсервативні, так і неконсервативні) не володіють кого ланцюгів химерного mAb L2G7 (chL2G7). MAb істотним ефектом на афінність зв'язування або chL2G7 було отримано, і було показано, що воно ефективність гуманізованого mAb, тобто його здазв'язується з HGF, також як і L2G7, показуючи, що тність нейтралізовувати види біологічної активносбули клоновані правильні легкий і важкий ланцюги. ті HGF (наприклад, ефективність в деяких або всіх Для конструювання гуманізованого mAb L2G7 з аналізів, описаних в цьому документі, варіанту в основному слідували способам Queen et al., пагуманізованого mAb L2G7 є по суті такою ж, тобто тенти США No. 5530101 і 5585089. Базу даних Нав межах експериментальної помилки, як і ефектиціонального центра біотехнологічної інформації вність HuL2G7). Переважно зрілі послідовності V(NCBI) послідовностей антитіл людини сканували, області важкого і легкого ланцюга варіанту щоі послідовність VН AAC18323 і послідовність Vк найменше на 90%, більш переважно, щонайменше BAC01726 людини були, відповідно, вибрані як на 95%, і найбільш переважно, щонайменше на акцепторні послідовності для послідовностей VН і 98% ідентичні відповідним зрілим V-областям легVL L2G7, оскільки вони володіють особливо високого і важкого ланцюга HuL2G7. Альтернативно, кою гомологією каркасної ділянки (тобто ідентичніінші варіабельні області антитіла людини з висостю послідовностей) з ними. Комп'ютерну програкою ідентичністю послідовностей варіабельним му, Deep View Swiss-Pdb Viewer, доступну у областям L2G7 також придатні для надання каркавсесвітній мережі (http://www.expasy.org/spdbv/), сної ділянки гуманізованого антитіла, особливо Vвикористали для конструювання молекулярної областей каппа підгрупи І людини і V-областей моделі варіабельного домену L2G7, який викорисважкого ланцюга підгрупи І людини або консенсустали для визначення положення амінокислот в них послідовностей цих підгруп. каркасній ділянці L2G7, які розташовані досить Ілюстративне mAb HuL2G7, описане в приклаблизько до CDR, щоб потенційно взаємодіяти з дах нижче, має константні області к і 1 людини, і, ними. Для конструювання варіабельних областей таким чином, являє собою IgG1: повні послідовноважкого і легкого ланцюгів L2G7, CDR з mAb L2G7 19 94452 20 сті генів важкого і легкого ланцюга HuL2G7, вклюпри кімнатній температурі (RT); потім суміш додачаючи сигнальні пептиди, показані на Фіг.3А і вали до клітин. Після інкубації протягом 48 год. Фіг.3В. (Безумовно, сигнальні пептиди відщеплютрансфіковані клітини культивували в присутності ються і не є частиною HuL2G7.) Однак зрозуміло, 1 мг/мл G418 для селекції клітин, експресуючих що mAb IgG1 інших алотипів (IgG1,к) охоплюються nео, а потім розподіляли в 96-ямкових планшетах позначенням HuL2G7. Гуманізовані mAb інших для культивування тканин (100 мкл/ямка). Приблиізотипів (наприклад, IgG2, IgG3 і IgG4) можна зно через 2 тижні, коли в ямках, що містять життєотримувати комбінуванням варіабельних областей здатні клітини, відбувалося утворення моношару, HuL2G7 з відповідними константними областями супернатанти культур з цих ямок тестували віднолюдини. Заміни можна виготовляти в константних сно наявності і кількості HuL2G7 за допомогою областях HuL2G7 для зниження або підвищення ELISA. Трансфіковані клітини можуть секретувати ефекторної функції, такої як опосередкована комнеоднакову кількість (дисбаланс) легкого і важкого плементом цитотоксичність або ADCC (див., наланцюгів, таким чином, щоб пересвідчитися, що приклад, Winter et al., патент США No. 5624821; визначається тільки повний HuL2G7, в ELISA виTso et al., патент США No. 5834597; і Lazar et al., користовується козяче антитіло проти Fc людини, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), або для як засіб для захоплення, і біотинільоване антитіло продовження часу напівжиття у людини (див., напроти каппа людини, як реагент для детекції. МАb приклад, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, chL2G7 експресували схожим чином. Клони клітин, 2004). Конкретно, але не обмежуючись цим, експресуючих відносно високі рівні ChL2G7 і HuL2G7, що володіє мутаціями в константній обHuL2G7, відповідно, розмножували і вирощували в ласті IgG на GІn в положенні 250 і/або на Leu в середовищі FS. Антитіло очищали з культуральних положенні 428, являють собою варіанти здійсненсупернатантів з використанням афінної хроматогня даного винаходу. рафії з білком А і аналізували на предмет чистоти Після конструювання mAb HuL2G7, тобто пісза допомогою SDS-PAGE. ля вибору амінокислотних послідовностей його V2. Властивості HuL2G7 областей легкого і важкого ланцюга (Фіг.2 і Фіг.3), Для порівняння афінності зв'язування HuL2G7 загальноприйнятими способами вибирали посліз афінністю зв'язування ChL2G7 і L2G7, проводили довності ДНК, що кодують V-області (включаючи експеримент по конкурентному зв'язуванню. На сигнальні пептиди) за допомогою генетичного комікропланшет для титрування наносили 50 ду; послідовності починалися з CTCGAGACCACC мкл/ямка 2 мкг/мл козячих антитіл проти IgG-Fc перед ініціюючим кодоном ATG для забезпечення людини (GahlgG-Fc) в PBS протягом ночі при 4°С і ділянки рестрикції для клонування і сигналу ініціаблокували за допомогою 2% BSA протягом 1 год. ції трансляції Козака. Ці гени синтезували комерпри RT. Після промивання планшет інкубували з ційно в Genscript Corp. (Piscataway, NJ). Альтерна50 мкл/ямка mAb ChL2G7 (2 мкг/ямка) протягом 1 тивно для синтезу гена кожної V-області можна год. при RT, з подальшим промиванням 50 використати спосіб Co et al., J. Immunol. 148:1149, мкл/ямка IgG людини (10 мкг/мл) протягом 1 год. 1992. Коротко, синтезують дві пари олігонуклеотидля зниження фону. Після промивання ямки дів, що перекриваються на альтернативних ланпланшета інкубували окремо протягом 1 год. з 50 цюгах (пристрій для синтезу ДНК Applied мкл/ямка різних концентрацій очищених HuL2G7, Biosystems), які все разом охоплюють цілий ген. ChL2G7 або L2G7 як конкурент спільно з 50 Олігонуклеотиди мають довжину від 110 до 140 мкл/ямка HGF-Flag (1 мкг/мл). Після промивання основ з перекриттям 15 основ. Дволанцюжкові планшети інкубували з 50 мкл/ямка mAb проти фрагменти ДНК синтезують з використанням поліFlag HRP-M2 (Invitrogen), і пов'язані HRP-протимерази Кленова з 5'-пари олігонуклеотидів і окреFlag М2 виявляли за допомогою додавання субмо з 3'-пари. 5'-Фрагмент ДНК відщеплюють за страту тетраметилбензидину. На Фіг.4 показано, допомогою ферментів рестрикції, що розщеплющо HuL2G7, ChL2G7 і L2G7 по суті добре конкурують на 5'-кінці і в центрі гена V-області. 3'вали з L2G7, пов'язаним з планшетом для зв'язуФрагмент ДНК відщеплюють за допомогою фервання з розчинним HGF-Flag, що вказує на те, що ментів рестрикції, що розрізають в центрі і на 3'ці три mAb володіють дуже схожою афінністю. кінці гена V-області. Кожний відщеплений фрагКлючовою біологічною активністю HGF є здатмент вбудовують в придатний вектор для клонуність зв'язуватися з його рецептором cMet, так що вання і трансформують в Е.соІі, і ДНК з множини порівнювали здатність mAb HuL2G7, ChL2G7 і ізолятів секвенують для виявлення фрагментів, які L2G7 інгібувати зв'язування HGF з Met. Met викомають повністю правильні послідовності. Потім ристовували в формі Met-Fc і HGF використовувадля кожного гена проводять лігування 3 шляхами ли в формі HGF-Flag, який отримували, як описано для вставки правильних 5' і 3'-фрагментів у відпо(патентна заявка USSN 10/917915, подана 13 сервідний експресуючий вектор з утворенням цілого пня 2004 року, і Kim et al. Clin Cancer Res 12:1292, гена, послідовність якого перевіряють. 2006). Мікропланшет для титрування покривали 50 Для отримання mAb HuL2G7 епітеліальні клімкл/ямка 2 мкг/мл кожного з двох mAb проти Met тини нирки людини 293-F (Invitrogen) культивували (Galaxy Biotech) в PBS протягом ночі при 4°С (альв середовищі для експресії Freestyle 293 (середотернативно можна використати 2 мкг/мл GahlgGвище FS; Invitrogen) і ресуспендували в середоFc) і блокували 2% BSA протягом 1 год. при RT. 6 вищі FS в кількості 10 клітин/2 мл/макроямку. ДНК Після промивання планшетів в кожну ямку додаекспресуючих векторів легкого і важкого ланцюгів вали 50 мкл/ямка Met-Fc (1 мкг/мл) протягом 1 год. HuL2G7 (1 мкг кожні) інкубували з 3 мкл Fugene 6 при RT, а потім промивали 50 мкл/ямка IgG люди(Roche) в 100 мкл середовища FS протягом 30 хв. ни (10 мкг/мл) протягом 1 год. для зниження фону. 21 94452 22 Після промивання планшетів в кожну ямку додали на групи (n=6 на групу) і ін'єктували 40 мкг вали 50 мкл/ямка HGF-Flag (0,5 мкг/мл), попередHuL2G7, L2G7 або контрольного PBS внутрішньоньо інкубованого з різними концентраціями mAb, черевинно два рази на тиждень в об'ємі 0,1 мл протягом 1 год. Після промивання планшети інкуPBS. Об'єми пухлини визначали кожний тиждень бували з 50 мкл/ямка mAb проти Flag HRP-M2 за допомогою вимірювання двох показників (дов(Invitrogen), і HRP-npoTH-Flag М2, що зв'язався, жини, а, і ширини, b) і обчислення об'єму як 2 виявляли за допомогою додавання субстрату, як V=аb /2. На Фіг.7 показано, що в цьому аналізі описано вище. На Фіг.5 показано, що HuL2G7, HuL2G7 і L2G7 інгібували зростання пухлини неChL2G7 і L2G7 блокували зв'язування HGF з Met відмітно. Для подальшого визначення здатності однаково добре, так що ці mAb володіють дуже HuL2G7 інгібувати зростання ксенотрансплантатів схожою активністю в цьому аналізі. пухлин використали чотири різних дози mAb, 40 Іншою важливою біологічною активністю HGF мкг, 20 мкг, 10 мкг і 5 мкг, в схожих експериментах. є здатність стимулювати проліферацію певних На Фіг.8 показано, що навіть значно низька доза в клітин, включаючи епітеліальні клітини легені нор10 мкг два рази на тиждень була здатна повністю ки Mv 1 Lu. Для порівняння здатності HuL2G7 і інгібувати зростання пухлини, в той час як навіть L2G7 нейтралізовувати цю активність HGF, клітини більш низька доза в 5 мкг забезпечувала хороше, 4 Mv 1 Lu (2×10 клітини/100 мкл/ямка), вирощені в але неповне інгібування. Аналогічно, при системDMEM, що містить 10% FCS, ресуспендували в ному введенні HuL2G7 ефективно інгібує зростанбезсироватковому DMEM і стимулювали 100 ня внутрішньочерепних ксенотрансплантатів U87. мкл/ямка HGF (40 нг/мл) плюс трансформуючий Незважаючи на те, що даний винахід описаний фактор росту -β1 (1 нг/мл, R&D Systems) для знина основі переважних в цей час варіантів здійсження фону і різні концентрації HuL2G7, L2G7 або нення, потрібно розуміти, що різні модифікації мостороннє контрольне антитіло людини. Рівень жна провести в рамках об'єму даного винаходу. проліферації клітин визначали шляхом додавання Всі цитовані публікації, патенти і патентні заяWST-1 (Roche Applied Science) протягом 14 годин. вки включені в цей документ як посилання в повНа Фіг.6 показано, що HuL2G7 і L2G7 володіють ному об'ємі для будь-яких цілей таким же чином, рівною інгібіторною активністю в цьому аналізі. як якби кожна окрема публікація, патент і патентна Загалом, HuL2G7 був щонайменше настільки ж заявка були конкретно і індивідуально вказані як активний, як і L2G7, у всіх аналізах, що використовключені як посилання в повному об'ємі для будьвуються, і, таким чином, воно є повністю нейтраліяких цілей. зуючим: в процесі гуманізації не сталося зниження Гібридома L2G7 була депонована 29 квітня активності L2G7. 2003 року в Американській колекції типових куль3. Здатність HuL2G7 інгібувати зростання пухтур, P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, під номелини in vivo ром АТСС РТА-5162, згідно з Будапештським доВже було показано, що mAb L2G7 здатне повговором. Цей депонований зразок буде ністю інгібувати зростання ксенотрансплантатів зберігатися в уповноваженому банку депозитарії і гліоми U87 в моделях на мишах nude (патентна буде замінений у разі мутації, нежиттєздатності заявка USSN 10/917915, подана 13 серпня 2004 або руйнування протягом щонайменше п'яти років року, і Kim et al. Clin Cancer Res 12:1292, 2006). після отримання депозитарієм останнього запиту Для підтвердження того, що HuL2G7 також володіє на видачу зразка протягом щонайменше тридцяти цією здатністю, використали той же експерименроків після дати депонування, або протягом законтальний спосіб. Коротко, самицям мишей NIH III ної тривалості пов'язаного патенту, в залежності Xid/Beige/Nude у віці 4-6 тижнів (Charles River від того, який з цих періодів буде довшим. Всі об7 Laboratories) підшкірно ін'єктували 10 клітин в 0,1 меження в доступі суспільства до цих клітинних мл PBS в ділянку спини. Коли розмір пухлини доліній будуть остаточно усунені після видачі патен3 сягав ~50 мм , мишей випадковим чином розділяту на основі заявки. 23 94452 24 25 94452 26 27 94452 28 29 Комп’ютерна верстка А. Рябко 94452 Підписне 30 Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601