Штам гібридомних тваринних клітин mus musculus l., що культивуються та продукують моноклональні антитіла, специфічні до d-димера фібрину людини

Винахід належить до області біотехнології, а саме, до клонування гібридомних клітин - продуцентів моноклональних антитіл (мон AT), спрямованих до D—димера фібрину. Він може бути використаний для визначення у плазмі крові людини D-димера, продукту деградації стабілізованого фактором ХIIIа фібрину під дією плазміну у разі генералізованих предтромботичних, тромботичних та інших станів, що пов'язані із формуванням та лізисом фібрину. У кров'яному руслі є дві антагоністичні системи: полімеризації фібрину і фібринолізу. Перша - пов'язана з утворенням тромбів і закупоркою ушкоджених судин, друга - з руйнуванням цих тромбів. У нормі ці дві системи знаходяться в рівновазі. За порушення рівноваги спостерігається або аномальне тромбоутворення, або, навпаки, кровоточивість. Під час активації системи зсідання крові утворюється фермент тромбін, що перетворює фібриноген, який циркулює у кров'яному руслі, на фібрин, здатний до спонтанної полімеризації. Внаслідок цього утворюється тривимірний згусток фібрину, що є каркасом для включення клітин крові за утворення тромбу. З моменту формування протофібрил фібрину активується фібринолітична система крові. Плазміноген, що циркулює в крові, перетворюється в плазмін, який руйнує стабілізований фактором ХIIIа фібрин до кінцевих продуктів, зокрема до D-димера. Концентрація D-димера у крові суттєво зростає при різних захворюваннях як, наприклад, при інфарктах міокарда, емболії легенів, дисемінованому внутрішньосудинному зсіданні крові, при хірургічних втручаннях тощо. Таким чином, D-димер є молекулярним маркером стану рівноваги між системою зсідання крові та фібринолізу. Відомо декілька гібридом, описаних у науковій та патентній літературі, що продукують мон AT до Dдимера фібрину, які використовують для визначення прошитих продуктів деградації фібрину [1,2,3,]. Мон AT до D-димера фібрину, одержані J. Amiral (Stago, Франція), D. Collen (Catholic University of Leuven, Бельгія) та P. Bundesen (Австралія) були досліджені P. Gafrhey на здатність їх взаємодіяти з D-димером, виділеним різними авторами. Показано, що досліджувані мон AT не однаково реагують із використаними антигенами. Очевидно, що епітопи у цих антитіл різні і до того ж, ймовірно, експоновані на D-димері по-різному за його імобілізації та в розчині [4]. Тому немає однозначності у визначенні концентрацій утвореного продукту, а питання щодо удосконалення і стандартизації тест-систем для визначення продуктів деградації фібрину на основі мон AT ще й досі залишається невирішеним. Задача винаходу - одержання штаму гібридомних клітин Mas musculus L. -продуцентів мон AT, що специфічно реагують з D-димером, D-фрагментом фібрину людини, але не зв'язують фібриноген та фібрин, і які можна використати для розробки бісайтового імунохімічного аналізу D-димера у плазмі крові людини. Як прототип, що найбільш близький за імунологічною характеристикою до запропонованого, взято штам гібридомних клітин, одержаний P.G. Bundesen та D.B. Rylatt [3]. Мон AT DD-3B6/22 реагують з D-димером, прошитим фібрином, продуктами деградації фібрину, але не з мономерним фібрином, фібриногеном і продуктами його деградації. Епітоп їх, що міститься на D-димері прошитого фібрину, утворений N-кінцевими (або розташованими поблизу) амінокислотними залишками γ- та (X-поліпептидних ланцюгів D-димера [5]. Ці антитіла, адсорбовані на кульках латексу, було використано для визначення прошитих продуктів деградації фібрину у плазмі крові людини. Чутливість методу - 200нг/мл плазми. Перевага нового штаму гібридомних клітин Ш-ЗЬ у тому, що він продукує мон AT з високою константою зв'язування 1,43·10-10Μ D-димера і вони не реагують ні з фібриногеном, ні з фібрином. Епітоп їх розміщений, на відміну від мон AT прототипу, в N-кінцевій частині β-ланцюга D-димера (Ββ134-190, вірогідно Ββΐ55-160). Ці характеристики дозволяють використовувати мон AT III-3b для визначення D-димера в плазмі крові за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА) в концентрації 15нг/мл. Штам одержують наступним чином. Мишей лінії Balb/c імунізують введенням у порожнину черева 1 ООмкг очищеного препарату D-димера у вигляді емульсії з повним ад'ювантом Фрейнда (1 : 1). D-димер очищають за методом, описаним у статті [6]. Повторні імунізації проводять тією самою кількістю антигену в неповному ад'юванті Фрейнда. Мишам із достатнім титром антитіл у сироватці крові вводять антиген у забуференому фізіологічному розчині - 0,01 Μ Κфосфатний буфер, рН 7,4, з 0,14 Μ NaCl (ЗФР) за три дні до гібридизації [7,8]. У мишей у стерильних умовах беруть селезінку і виділяють клітини, які промивають розчином Хенкса. 1-10 клітин селезінки гібридизують з 510 клітин мієломи миші X63-Ag 8.6.5.3, додаючи до осаду суміші клітин Імл 50%-го поліетиленгліколю з молекулярною масою 3000 протягом 1 хв. Після злиття клітини промивають розчином Хенкса і розсівають у чотири 24-лункові планшети (по Імл на лунку). Для культивування і селекції гібридів використовують поживне середовище RPMI-1640, що містить 10% ембріональної телячої сироватки, 10-4 Μ гіпоксантин, 4·10-7Μ аміноптерин і 1,6-10-5 Μ тимидин. Відбір в окремих лунках гібридомних клітин, що секретують антитіла потрібної специфічності, здійснюють за допомогою твердофазного ІФА (тІФА): в лунки полістиролового планшету, заздалегідь покриті антигенами в концентрації 10мкг/мл ( для D-димера та D-фрагмента у 0,02 Μ бікарбонатному буфері з рН 9,5, для фібриногену в 0,2 Μ ацетатному буфері з рН 8,5, а для фібрину ще з 2,0 Μ сечовини), вносять культуральну рідину, на якій ростуть гібридомні клітини, і інкубують 1год при 37°С. Промивають планшет проточною водою шість разів, видаляють воду струшуванням, заповнюють лунки ЗФР з 0,05%-м твін-20 (ТФБ), через три хвилини струшують, старанно видаляють залишки вологи і вносять в лунки кон'югат пероксидази із кролячими антитілами до IgG миші в розведенні 1 : 1000. Після інкубації при 37°С протягом 1год планшети промивають, лунки заповнюють субстратною сумішшю 0,03% Н2О2 і 0,4 мг/мл орто-фенілендіаміну в 0,05 Μ Κ-фосфатному буфері з рН 6,0. Реакцію зупиняють додаванням до розчину 50 мкл 2 Μ H2SO4. Оптичну густину визначають при довжині хвилі 492 нм на автоматичному спектрофотометрі MR-580 («Dynatech», США). Гібридоми, що продукують монАТ клонують чотири рази методом кінцевих розведень, висіваючи по одній клітині в лунку, що містить 5-104 неімунних клітин селезінки миші. Після клонування частка клітин, що синтезує антитіла заданої специфічності, становить 100%. Продукція антитіл зберігається, як мінімум, протягом 20 пасажей. Штам позначається IIІ-3b і має наступні характеристики. 1. Культуральні властивості. Для вирощування штаму використовують культуральні флакони з поживним серодовищем Ігла в модифікації Дульбекко або RPMI-1640, що містить 10% ембріональної телячої сироватки, 2 мМ глутамін, імМ піруват натрію, 0,05 мМ 2-меркаптоетанол, 50мкг/мл гентаміцину, 20 мМ HEPES. Посівна доза 50 - 100 тис.клітин/мл. Через 3-4 дні клітини підраховують і пересівають. Вирощують клітини при 37°С. У разі використання у поживному середовищі 20 мМ HEPES необов'язково створювати 5% концентрацію СО2 в атмосфері. Характер росту - стаціонарна суспензія. 2. Характеристика корисного продукту. Мон AT ІII-3b належать до IgGl, легкі ланцюги К-типу. Специфічність: D-димер фібрину людини. Антигенна детермінанта (епітоп), що розпізнається антитілами, розташована в Ββ-ланцюгу, на ділянці Ββ155-160. Константа дисоціації мон AT: 1,43· 10-10 з D-димером, а з Dфрагментом на порядок нижча. Мон AT з фібрин(оген)ом не реагують. 3. Продуктивність штаму. Концентрація антитіл у культуральній рідині за 3 - 4 дні культивування досягає 35-50 мкг/мл. 4. Контамінації. При довготривалому спостереженні бактерії, гриби і мікоплазм не виявили. 5. Кріоконсервування. Для зберігання клітини штаму ІИ-ЗЬ ресуспендують у суміші, що складається з 10% диметилсульфоксиду і 90% ембріональної телячої сироватки, в концентрації 5-106 клітин/мл. Суспензію розливають у пластикові ампули, поміщають у контейнери із спіненого полістиролу з товщиною стінок 1см, переносять у заморожувач (-70°С) на 18год. Потім клітини переносять у рідкий азот на довге зберігання. Розморожують клітини при + 37°С у водяній бані. Життєздатність клітин оцінюють шляхом фарбування їх трипановим синім. Звичайно вона становить близько 50%. Приклад 1. Моноклональні антитіла виділяють афінною хроматографією із культурального середовища, на якому протягом 3-4 днів росли гібридомні клітини штаму ІII-3b. Культуральну рідину пропускають через колонку із протеїн-G сефарозою («Pharmacia», Швеція), яку урівноважують 0,1 Μ К-фосфатним буфером, рН 7,2. Зв'язані антитіла знімають 0,1 Μ гліцин-НСІ буфером з рН 3, нейтралізують 1 Μ Κ2ΗΡΟ4, концентрують і діалізують проти ЗФР за допомогою ультрафільтрації. Концентрацію антитіл визначають на спектрофотометрі. Вважають, що оптична густина 1,4 відповідає концентрації IgG 1мг/мл за λ 280 нм. Мон А Т ІII-3b використовують для визначення концентрації D-димера у плазмі крові людини за допомогою ІФА. У 96-лункові полістиролові планшети з підвищеною адсорбційною здатністю ( фірма «NUNC», Данія) вносять по 110мкл розчину мон Ат у ЗФР з концентрацією 10 мкг/мл і інкубують при 4°С протягом 18год. Потім лунки заповнюють ТФБ і витримують 30 хвилин при кімнатній температурі, промивають проточною водою з-під крана шість разів та один раз. ТФБ. До адсорбованих на полістиролі мон AT додають 100мкл розчину, що містить зразок D-димера (наприклад розведену в 10 разів плазму крові людини). Розведення плазми готують в ТФБ з додаванням сухого обезжиреного молока і цитрату натрію з кінцевою концентрацією 5% і 0,38%, відповідно. В контрольних лунках D-димер відсутній. Інкубують 1год при 37°С. Промивають протчною водою, ТФБ і додають у кожну лунку біотинильовані антитіла до D-димера II-4d, які, на відміну від Ш-ЗЬ, розпізнають іншу ділянку на молекулі, інкубують 1год при 37°С, промивають планшет, як описано вище, і заповнюють кожну лунку коньюгатом стрептавідину з пероксидазою хрону («Pharmacia», Швеція), знову інкубують та промивають планшет, як і в попередні рази. В кожну лунку планшета вносять субстратну суміш (склад якої описано вище). Оптичну густину визначають при λ 492нм за допомогою автоматичного мікроспектрофотометра. Концентрацію D-димера обчислюють, використовуючи калібрувальну криву, котру будують за результатами паралельного експерименту, в якому використовують відомі концентрації D-димера. Чутливість визначення D-димера становить 15нг/мл плазми, розведеної у десять разів. Таким чином, одержані моноклональні антитіла можуть бути використані для кількісного визначення Dдимера у плазмі крові людини. СПИСОК ПОСИЛАНЬ 1. Hart R., Bate I., Dinh D., Elms M, Bundesen P., Hillyard C, et.al. The detection of D-dimer in plasma by enzyme immunoassay: improved discrimination is obtained with a more specific signal antibody // Blood Coagul. Fibrinolysjs. - 1994. - 5(2), - P. 227 - 232. 2. Shibata Т., Magari Y., Mizunaga S., Okabe E., Sumie Α., Ishii Т., et.al. Significance of urinary fibrin/fibrinogen degradation product (AB3) D-dimer measured by highly sensitive ELISA method with a new monoclonal antibody (DD E72) in various renal diseases // Nippon Jinzo Gakkai Shi. - 1994. - 36 (7), - P. 805 - 812. 3. Пат. 4,758,524 США, МКИ4 G01N 33/53 C12N 15/00. Monoklonal antibodies with specificity for crosslinked fibrin derivatives and assay for said derivatives / P. G. Bundesen, D. B. Ryllatt. - Опубл. 19.07.88. 4. Gaffhey P. J., Edgell Т., Creichton-Kempsford L. J., Wheeler S. and Tarelli E. Fibrin degradation product assays: analysis of standardization issues and target antigens in plasma // British j. of Haematology. - 1995. - 90, - P. 187 - 194. 5. Wylie F. G., Walsh T. P., Partial identifcation of the epitope on D-dimer for monoklonal antibody, DD-3B6/22. // Blood Coagul. Fibrinolisis. - 1997. Mar; 8(2): 87 - 96. 6. Lugovskoy E. V., Kolesnikova I. K, Gritsenko P. G, Zolotareva Ε. Ν., GeffheyP., Nieuwenhuizen W., Komisarenko S. V., A neoantigenic determinant in the D-dimer fragment of fibrin // Trombosis research. - 2002. - 107, 3 - 4, - P. 151-156. 7. Kohler G., Milstein С Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity //Nature. 1975. - 256, - P. 495 - 497. 8. Lerner Ε. Α., How to make a hybridoma // Yale j. Biol. and med. - 1981. - 54, - P. 387 -402.