Спосіб оцінки фази захворювання легень та перебігу бронхолегеневого процесу у дітей

Реферат: Винахід належить до галузі медицини, зокрема педіатрії та патоморфології і може бути використаний для удосконалення діагностики та терапії бронхолегеневих захворювань у дітей. У заявленому способі використані такі маркери дослідження: а) субпопуляційний склад бронхіального епітелію; б) функціональна активність тканинних макрофагів; в) рівень експресії матриксної металопротеїнази (ММР); г) маркери проліферації; д) апоптозний каскад в клітинах епітелію оболонки бронхів дітей дають можливість діагностики хронізації бронхолегеневого процесу на ранніх етапах. UA 101103 C2 (12) UA 101103 C2 UA 101103 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі медицини, зокрема педіатрії та патоморфології і може бути використаний для удосконалення діагностики та терапії бронхолегеневих захворювань у дітей. Запальні захворювання дихальних шляхів продовжують займати значну питому вагу, тому особливого значення набула проблема діагностики, лікування та вторинної профілактики рецидивуючих бронхітів та бронхіальної астми у дітей, оскільки ці патології у подальшому визначають формування хронічних бронхолегеневих захворювань як у дітей, так і у дорослих. Неодноразово перенесені респіраторні захворювання формують велику групу так званих неспецифічних захворювань органів дихання. Поряд з пневмонією, в цю групу входять рецидивуючий та хронічний бронхіт (ХБ), бронхіальна астма (БА). Під впливом респіраторних захворювань, часто маніфестують клінічні прояви вроджених аномалій трахеобронхіального дерева та аномалій розвитку легень, циліарної дискінезії, деяких системних та спадкових захворювань. Головними клінічними симптомами неспецифічних захворювань органів дихання є кашель, хрипи в легенях, а у частини дітей - відходження мокротиння. Подібна симптоматика вкладається в клінічну картину бронхіту. Повторювання бронхітів, важкість перебігу, наявність обструктивного синдрому часто передбачає складності в проведенні диференційної діагностики рецидивуючого бронхіту, хронічного бронхіту, рецидивуючого бронхіту з обструктивного синдромом та бронхіальної астми. Рецидивуючий бронхіт (РБ) є захворюванням, яке спостерігається у дитини не менш 3-4 разів за рік протягом двох років, при тривалості кашлю не менш двох тижнів та відсутності клінічно вираженої обструкції бронхів в період загострення. До теперішнього часу дуже важко передбачити перехід рецидивуючого бронхіту у хронічний, враховуючи тільки частоту епізодів захворювання бронхітом. Кожен бронхіт супроводжується розвитком бронхіальної обструкції, ступінь якої коливається від доклінічних проявів до яскравої клінічної картини. В механізмі обструкції приймає участь набряк слизової оболонки, значна гіперсекреція та зміна в'язко-еластичних властивостей мокротиння. У дітей перших років життя, як правило, виявляється на фоні вірусної інфекції не менш 2-3 епізодів обструкції. Як при кожному тривалому запальному процесі, виникаючі при бронхіальній астмі морфологічні зміни характеризуються різноманітними порушеннями бронхіального дерева. Морфологічні зміни структур, які з'являються, характерні для розвитку хронічного запалення будь-якого, а не тільки алергічного ґенезу. Спостереження в динаміці, аналіз клініко-лабораторних показників в більшості випадків не є достатнім для виділення нозологічної форми неспецифічних захворювань органів дихання у дітей та потребує використання допоміжних методів (Антипкін Ю. Г., Арабська Л. П., Смірнова О. А. та співав. /Сучасні підходи до діагностики, профілактики рецидивуючих і хронічних бронхітів у дітей // Методичний посібник, К., 2003.-121 с. та Журавлев А. В. / Цитологическая диагностика при хронических воспалительных заболеваниях легких // Проблемы пульмонологии. - Вып. 8.-1990.-С. 219-223). Питання поглибленого вивчення стану слизової оболонки бронхів та факторів місцевого захисту є досить актуальним. Проведення цитоморфологічних та імуноцитохімічних досліджень допомагає ідентифікувати глибину запального процесу, тобто, оцінити ступінь його активності, відображає неспецифічну резистентність легень до дії мікробних і вірусних агентів. Крім того, ці методи дозволяють охарактеризувати стан локального клітинного захисту і зробити висновок про необхідність антибактеріальної терапії та її ефективність / Бронхиты у детей // Российский педиатрический журнал-2000.-№ 5.-С. 58-59). При не чітко вираженій клінічній симптоматиці цитологічне дослідження може слугувати важливим додатковим методом у діагностиці хронічних бронхолегеневих захворювань. В останні роки цитологічні дослідження поповнилися важливими для діагностики імуноцитохімічними методами, які набувають широкого застосування у світі. Особливе місце серед них займають методи, направлені на виявлення рецепторів апоптозу та проліферації. (Артамонов Р. Г. / Бронхиты у детей. // Российский педиатрический журнал.-2000.-№ 5.-С. 58-59 та Бондаренко Г. І. / Програмована смерть, апоптоз і некроз: загальні риси і відмінності (огляд літератури) // Перинатологія і педіатрія.-2001. - № 2. - С. 45-47). Паралельно з клінічною картиною для оцінки перебігу бронхолегеневого процесу у дітей використовують відомі способи діагностики: Відомий пат. 2165084 RU "Спосіб прогнозування гострих бронхолегеневих захворювань у дітей" (Шовкун В. А., Вилков Г. А., Уситнова Н. Н.): в якому при дослідженні сироватки крові у дітей з гострою бронхолегеневою патологією визначаються параметри перекисного окислення ліпідів, калікреїнкіонінової та імунної системи. При величині швидкого спалаху більше 100 мм і латентного періоду менше 70 с, а також рівні прекалікреїну більше 400 мКе, калікреїну вище 40 мКе, циркулюючих імунних комплексів більше 100 од. Прогнозують несприятливий варіант перебігу хвороби. 1 UA 101103 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Недоліком даного способу є те, що він є ефективним тільки при гострій патології бронхів, а також цей спосіб не дає можливості визначити особливості регенераторних змін слизової оболонки бронхів. А також відомий спосіб - пат. 64620А, Україна, спосіб діагностики бронхолегеневої патології у дітей (Майданник В. Г., Свойкіна С. Ю., Брюзгіна Т. С.) який включає визначення жирнокислотного спектру еритроцитів крові, а саме вмісту ессенціальних жирних кислот арахідонової, ейкозапентаєнової, ейкозатриєнової, і суму поліненасичених жирних кислот та розрахунок співвідношення сумарного вмісту полієнових жирних кислот і арахідонової кислоти І при значенні цього співвідношення 0,3 і менше діагностують гострий запальний процес, а при значенні більше 0,3 - хронічний процес. Недоліком даного способу є те, що оцінка гострого та хронічного процесу проводиться побічно і не дає можливості оцінити дійсний стан слизової оболонки бронхів. Найбільш близьким за технічною суттю є "Спосіб диференціальної діагностики бронхітів у дітей" (Андрущук А. О. Мелліна Т. В. / пат. 70579А, України), в якому автори досліджують мокротиння і за наявності в ньому поодиноких волокон фібрину і метаплазованих клітин та відсутність (чи поодиноких) альвеолярних клітин та еозинофілів в цитограмі, діагностують гострий простий бронхіт; за наявності в помірній чи значній кількості альвеолярних клітин, фібрину, метаплазованих клітин та за відсутності еозинофілів діагностують рецидивуючий бронхіт, а за наявності в помірній та значній кількості альвеолярних клітин, фібрину, метаплазованих клітин та еозинофілів - гострий обструктивний бронхіт. Даний спосіб є інформативним, але при цьому для дослідження отримується мокротиння не тільки з нижніх відділів бронхів, а з усього бронхіального дерева, пройшовши через ротоглотку. В основу запропонованого способу оцінки фази захворювання легень та перебігу бронхолегеневого процесу у дітей покладена задача дослідження молекулярних процесів з визначенням маркерів проліферативної активності клітин епітелію бронхів, про- і антиапоптичних факторів (активація процесів апоптозу і зниження його регуляторних процесів), маркерів регенеративної здатності епітелію бронхіального дерева, зниження якої свідчить про розвиток патогенетичних механізмів пневмосклерозу, про більш виразну проліферативну активність клітин епітелію бронхів у дітей з РБ і ХБ, ніж при БА; про патологічну регенерацію епітелію з підвищенням експресії антигенів до макрофагів в епітелії з хронізацією бронхолегеневого процесу; про ультраструктурні ушкодження клітин епітелію бронхів (ядро, цитоплазматичні органели) при РБ і ХБ з появою детриту та колагену в мокротинні при БА, яке свідчить про те, що характер змін регенераторних процесів в епітелії бронхів залежить від клінічних проявів захворювання, фази захворювання, перебігу бронхолегеневого процесу. Поставлена задача способу оцінки фази захворювання легень та перебігу бронхолегеневого процесу у дітей вирішується шляхом бронхоскопії, згідно винаходу, додатково у мазках лаважної рідини і браш-біопсіях досліджуються показники: а) субпопуляційний склад бронхіального епітелію - при переважанні у субпопуляційному складі бронхіального епітелію базального епітелію та зниженні кількості війчастих клітин з одночасним збільшенням їх дистрофії діагностується глибоке ураження слизової оболонки бронхів; зменшення кількості війчастого епітелію з одночасним збільшенням їх дистрофії (структурно-функціональна перебудова клітин респіраторного тракту), збільшення келихоподібних клітин у мазках вказує на часткову десквамацію епітелію, зростання продукції муцинів, порушення цілісності бронхіального прошарку слизової оболонки бронхів, структурнофункціональну перебудову війчастих клітин слизової оболонки респіраторного тракту за рахунок запалення гостроту процесу, наявність обструкції; б) функціональна активність тканинних макрофагів (антигени до макрофагів CD-169) - при підвищенні експресії антигенів до макрофагів в епітелії (2 бали і вище) діагностується зміна регуляції захисного характеру активації макрофагів на ушкоджуючий, патологічна регенерація епітелію з хронізацією бронхолегеневого процесу; в) рівень експресії матриксної металопротеїнази (ММР) - при підвищенні експресії антигенів до макрофагів з одночасним підвищенням експресії матриксної металопротеїнази (2 бали і більше) з переважанням у мембранних структурах клітин діагностуються зміни регенерації слизової оболонки бронхіального дерева та формування хронічного процесу - фіброзносклеротичних змін у структурі бронхів; г) маркери проліферації - характер експресії ядерного антигену проліферативної активності клітин (PCNA): при наявності ультраструктурних ушкоджень клітин епітелію (виразні дистрофічні зміни цитоплазми клітин з нерівномірним розподілом хроматину в ядрах без деструкції мембрани клітини. 2 UA 101103 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 д) апоптозний каскад в клітинах епітелію оболонки бронхів дітей - експресія рецепторів апоптозу CD-95 Apo-1/Fas та його регулятор антиапоптозний протеїн всl-2 - підвищення експресії антигену антиапоптотичного протешу всl-2 до 1,5-1,7 балів вказує на порушення регуляторних механізмів апоптозу і хронізацію бронхолегеневого процесу та підвищення експресії рецепторів СД-95 Apo-1/Fas (2 бали і вище) з переважанням у мембранних структурах клітин епітелію і лейкоцитів свідчать про високу апоптотичну активність клітин епітелію слизової оболонки бронхів, характерну для хронічного процесу (РБ, ХБ), при величині показника до 1,5 бали у поєднанні з появою опасистих клітин у мазках (є маркерами ризику формування хронічного процесу та гіперреактивності бронхів, оскільки, вони є критичними ефекторними клітинами алергічних реакцій і приймають участь у ремодулюванні бронхіальної стінки) діагностується бронхіальна астма. Причинно-наслідковий зв'язок полягає у наступному: патогенез формування хронічного процесу у бронхолегеневій системі пов'язаний з розвитком фіброзно-склеротичних змін у слизовій оболонці бронхів. Значну роль у формуванні цього процесу відіграють макрофаги, активація яких призводить до комплексу структурно-функціональних змін, направлених на підвищення захисних властивостей клітин. Від активності та функціональності макрофагів залежить характер протікання процесу: недостатня стимуляція ланцюгів імунітету може викликати хронізацію процесу з наступним залученням в ушкодження інших органів, в зоні яких запальна реакція має місце. Одна із основних функцій макрофагів - елімінація клітинного детриту та апоптичних клітин. При порушенні механізмів регуляції захисний характер активації макрофагів змінюється на ушкоджуючий. Ушкоджуючий ефект проявляється при надлишковій або пролонгованій активації макрофагів і проявляється дією на оточуючі клітини високоактивних продуктів секреції макрофагів, які мають цитотоксичний ефект та пов'язані з індукцією апоптозу клітин-мішеней, крім того, підвищується активність лізосомних ферментів, що проявляється підсиленням фагоцитарної активності макрофагів. Макрофаги можуть порушувати свою скевенджерну (виведення клітинного детриту та апоптозних клітин) функцію. Однією з причин дослідження являється порушення взаємодії з позаклітинним стромальним фактором, а взаємодія стромального фактору з макрофагами призводить до порушення рецепторної функції макрофагів (скевенджерні рецептори - тип А). Враховуючи цю функцію (скевенджерну) макрофагів, важливими є оцінка матриксної (стромальної) маталопротеїнази, яка приймає участь в деградації клітинного матриксу та міграції клітин. Матриксні металопротеїнази (ММР) активуються паралельно на прозапальному фоні разом з IL-1 та TNF і залучені в деградації клітинного материксу та міграцію ендотеліальних клітин. Запалення, яке індукується IL-1, супроводжується підсиленою експресією та активністю ММР, тобто підсилена експресія ММР асоційована з хронічним запальним процесом. Клітини запальної інфільтрації, а саме нейтрофіли та лімфоцити, кількісно переважають при хронізації процесу. У розвитку алергічного запалення бронхів при БА приймають участь опасисті клітини, еозинофіли, альвеолярні макрофаги і лімфоцити. Клітини, які приймають участь у запаленні і знаходяться в дихальних шляхах виробляють медіатори, котрі безпосередньо діють на бронхіальну мускулатуру, судини, взаємодіють з іншими клітинами, активуючи їх. Опасисті клітини є критичними ефекторними клітинами алергічних реакцій і приймають участь в ремодулюванні бронхіальної стінки, формування фіброзної тканини в легенях. Поява опасистих клітин в мазках дітей з БА може розглядатися як маркер ризику формування хронізації запального процесу гіперактивності бронхів. Відомо, що підтримка сталості клітинного складу в тканинах та органах забезпечується складним динамічним урівноваженням між процесами проліферації, диференціювання та відмирання клітин шляхом апоптозу. Апоптоз або програмована клітинна смерть - це фізіологічний процес, який регулює кількість клітин в багатоклітинному організмі, процеси апоптозу в усіх клітинах організму людини, регулюються подвійно, що відображається різною експресією про- та антиапоптотичних антигенів на клітинних мембранах. Відомо, що швидкість росту клітин обумовлена балансом проліферативної активності та апоптозу. У зв'язку з цим нами було вивчено особливості процесів проліферації та апоптозу в клітинах епітелію слизової оболонки бронхів дітей з хронічними бронхітами та бронхіальною астмою. Апоптоз - складний каскадний процес, який може здійснюватися різними шляхами. В запуску програми апоптозу важливу роль відіграють розташовані на клітинній мембрані специфічні рецептори Fas (APO-1/CD95), утворені комплексом трансмембранних протеїнів, які 3 UA 101103 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 входять до складу суперродини цитокінів. Fas (APO-1/CD95) - рецептори є важливим сигнальним шляхом запуску апоптозу різними фізіологічними та патологічними факторами. В основі імуноцитохімічної оцінки проліферативної активності лежить використання антитіл Кі-67 та PCNA. Антиген PCNA приймає участь у механізмах, які пов'язані не тільки з проліферацією клітин, наприклад, в репарації ДНК, яка може здійснюватися і в фазі спокою. Проліферативно-клітинноядерний антиген (PCNA) - довгоживучий білок, який є маркером проліферації та регенерації. PCNA може виявлятися в клітинах, які уже закінчили проліферацію і може слугувати маркером ефективності лікувального процесу. Запропонований спосіб вирішується наступним чином: бронхоскопія виконується вранці натщесерце під час якої проводиться забір лаважної рідини та браш-біопсія слизової оболонки бронхів. Робляться мазки лаважної рідини та відбитки від слизової оболонки бронхів підраховувались клітини бронхіального епітелію, в тому числі клітини війкового епітелію в стані дистрофії. При проведенні дослідження використовуються різні методи: 1. Загальноцитологічні - забарвлення за Романовським-Гімзе; 2. Морфометричні: а) підрахунок клітин з дистрофічними змінами (жирова та гідропічна дистрофії) у перерахунку на 500 клітин; б) підрахунок клітин, які характеризують інфільтрацію (нейтрофілів, лімфоцитів, еозинофілів та мактрофагів) у перерахунку на 500 клітин. 3. Імуноцитохімічні методи (дослідження проводиться в клітинах епітелію бронхів, клітинах запальної інфільтрації - нейтрофілах, лімфоцитах, еозинофілах): а) непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення антигенів до макрофагів; б) непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення експресії матричної металопротеїнази. в) непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення експресії ядерного антигену проліферативної активності клітин. Протокол забарвлення наступний: проводиться фіксація мазків після заморозки (-20 °C) в ЗФА (забуферний формалін-ацетон), блокування ендогенною пероксидазою або 3 % розчином пероксиду водню, обробка предметного скла водою, блокування неспецифічних протеїнових сполук двома краплями 1 % BSA (бичачий сироватковий антиген), промивка в PBS-буфері (фосфатний буфер, рН-7,4), нанесення первинних антитіл до антигену макрофагів (фірма DAKO, Данія) на одну годину. Далі промивають в PBS-буфері і наносять вторинні антитіла, промивають в PBS-буфері, наносять дві краплі комплексу стрептавідин-пероксидази та інкубують протягом 30 хв, промивають і наносять АЕС (аміноетілкарбазол-хромоген-розчин) інкубують від 5 до 20 хв, до появи забарвлення. Оцінка результатів імуноцитохімічної реакції здійснюється за допомогою методів, прийнятих в імуногістохімії, з визначенням ступеню експресії (в балах): 0 балів - немає видимого забарвлення; 1 бал - слабке забарвлення: 2 бали - помірне забарвлення; 3 бали - виразне забарвлення; 4 бали - дуже виразне забарвлення. Аналіз імуноцитохімічних досліджень експресії антигенів до макрофагів та експресії матричної маталопротеїнази проводиться в клітинах багатошарового плоского епітелію і клітинах запальної інфільтрації (нейтрофілах, лімфоцитах, еозинофілах). г) непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення рецептора CD-95 Apo-1/Fas. Дана методика визначає ступінь експресії CD-95 антигена апоптозу Аро-1 або Fas антигену з молекулярною масою 45 кД, трансмембранна молекула типа І, відносить до суперсімейства рецепторів фактора некрозу, пухлин (TNF), визначає сигнали, що індукують апоптоз. Протокол забарвлення: фіксація мазків після заморозки (-20 °C) в ЗФА (забуферний формалін-ацетон), блокування ендогенного пероксидазою або 3 % розчином пероксиду водню, обробка предметного скла водою, блокування неспецифічних протеїнових сполук двома краплями 1 % BSA (бичачий сироватковий антиген), промивка в PBS-буфері (фосфатний буфер, рН-7,4), нанесення первинних антитіл до антигену CD-95 Apo-1/Fas (фірма DAKO, Данія) на одну годину. Промивка в PBS-буфері і нанесення вторинних антитіл. Промивка в PBSбуфері, нанесення двох крапель комплексу стрептавідин-пероксидази та інкубацію протягом 30 хв, промивка і нанесення АЕС (аміноетілкарбазол-хромоген-розчину) - інкубація від 5 до 20 хв, до появи забарвлення; д) непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення антиапоптотичного протеїну вс12. Дана методика визначає ступінь експресії антиапоптотичного протешу вс1-2. 4 UA 101103 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Протокол забарвлення: фіксація мазків після заморозки (-20 °C) в ЗФА (забуферний формалін-ацетон), блокування ендогенного пероксидазою або 3 % розчином пероксиду водню, обробка предметного скла водою, блокування неспецифічних протеїнових сполук двома краплями 1 % BSA (бичачий сироватковий антиген), промивка в PBS-буфері (фосфатний буфер, рН-7,4), нанесення первинних антитіл до антигену CD-95 Apo-1/Fas (фірма DAKO, Данія) на одну годину. Промивка в PBS-буфері і наносять вторинні антитіла. Промивка в PBS-буфері, нанесення двох крапель комплексу стрептавідин-пероксидази та інкубацію протягом 30 хв, промивка і нанесення АЕС (аміноетілкарбазол-хромоген-розчину) - інкубація від 5 до 20 хв, до появи забарвлення; Дослідження препаратів в прохідному світлі проводиться на дослідницькому мікроскопі "Olimpus BH-2" (Японія). При переважанні у субпопуляційному складі бронхіального епітелію базального епітелію та зниженні кількості війкових клітин з їх дистрофією (структурно-функціональна перебудова клітин респіраторного тракту) діагностується глибоке ураження слизової оболонки бронхів. При підвищенні експресії антигенів до макрофагів з одночасним підвищенням експресії матриксної металопротеїнази (2 бали і більше) з переважанням у мембранних структурах клітин діагностуються зміни регенерації слизової оболонки бронхіального дерева та формування хронічного процесу - фіброзно-склеротичних змін у структурі бронхів. При нечітко вираженій клінічній симптоматиці цитоморфологічне, імуноцитохімічне дослідження може слугувати важливим додатковим методом у діагностиці хронізації бронхолегеневого процесу, критерієм чого може бути виявлення підвищення експресії антигенів до макрофагів та експресії матриксної металопротеїнази в епітелії бронхів, що призводить до патологічної регенерації епітелію з подальшою хронізацією запального процесу з розвитком фіброзно-склеротичних змін в структурі бронхів. Даним критерієм може бути використаний для оптимізації лікування даної когорти хворих дітей. Спосіб діагностики демонструється наступними прикладами: Приклад 1. Дівчинка В., 11 років, історія хвороби № 632. Клінічний діагноз: Хронічний бронхіт, обструктивний синдром, фаза загострення. Двобічний катарально-гнійний ендобронхіт. Ковзаюча грижа стравоходу. Рефлюкс-езофагіт. Дуоденогастральний рефлюкс. Дискінезія жовчовивідних шляхів за гіпотонічним типом. Поступила у відділення захворювань органів дихання із скаргами на сильний кашель з помірною кількістю слизово-гнійного мокротиння, яке дуже тяжко відкашлювалось. Лабораторне обстеження. 12 Загальний аналіз крові: еритроцити - 4,3 × 10 /л, гемоглобін - 113 г/л, лейкоцити - 5,7 × 9 10 /л, швидкість осідання еритроцитів - 8 мм/год. Формула білої крові без особливостей. Загальний аналіз сечі без особливостей. Біохімічний аналіз крові в межах вікової норми. Імунологічний аналіз крові: IgG-12,8 г/л, IgA-1,12 г/л, IgM-0,45 г/л. Мазок з носової порожнини на віруси: аденовірусний антиген (+++), респіраторно6 синцитіальний (+++). Мазок з ротової порожнини на флору: Streptococcus pneumoniae-10 , 5 чутливий до канаміцину, гентаміцину, цефазоліну; Staphylococcus aureus-10 , чутливий до оксациліну, канаміцину, гентаміцину. Спірограма - вентиляційна недостатність 1-2 ступеня за рестриктивно-обструктивним типом. ЕКГ - помірні обмінні зміни міокарду. ФГДС: Ковзаюча грижа стравохідного отвору. Рефлюкс-езофагіт. Дуоденогастральний рефлюкс. УЗД черевної порожнини: Жовчний міхур збільшений, деформований, є перегиб в ділянці шийки. Інші органи в межах вікової норми. Рентгенографія органів грудної клітки: Легеневий малюнок підсилений з обох боків та дещо деформований. Корені легень інфільтровані, є незначні структурні порушення. Кардіодіафрагмальні синуси закриті спайками. Межі серця без особливостей. Висновок: Хронічний запальний процес в стадії загострення. Фібробронхоскопія: Двобічний, переважно правобічний катарально-гнійний ендобронхіт, дистонія мембранозної частини трахеї. Цитологія (браш-біопсія). Цитоморфологічне дослідження слизового прошарку бронхів в (%). Бронхіальний епітелій (% на 100 клітин): базальний - 2; війчастий - 80; келихоподібний - 18. Клітинний склад слизової бронхів (% на 100 клітин): епітелій - 74; нейтрофіли - 12; лімфоцити - 8; еозинофіли - 1; базофіли - 0; макрофаги - 5; опасисті клітини - 0. 5 UA 101103 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Цитоморфологічні характеристики війчастого епітелію (% на 100 клітин): нормальні клітини 12; проліферуючі - 62; дистрофічно змінені - 82. Ступінь дистрофії бронхіального епітелію: 3. Індекс дистрофії: 88 %. Цитологія лаважної рідини. Дистрофія клітин бронхіального епітелію (% на 100 клітин): жирова – 68 %; гідропічна - 24 %. Запальна інфільтрація: виразна (4 бали). Клітинний склад слизової бронхів (% на 100 клітин): епітелій - 56; нейтрофіли - 14; лімфоцити - 5; еозинофіли - 1; базофіли - 0; макрофаги - 24. Бронхіальний епітелій (% на 100 клітин): війчастий - 100. Антигени до макрофагів CD-169: 3 бали. Експресія ММР: 3 бали. На Фіг. 1. Браш-біопсія слизової оболонки бронхів дівчинки В., 11 років, з хронічним бронхітом до лікування. Шар клітин війчастого епітелію, поодинокі нейтрофіли. Ок.10, об.40. Фіг. 2. Мазок лаважної рідини з бронхів дівчинки В., 11 років, з хронічним бронхітом до лікування, клітини війчастого та базального епітелію, альвеолярні макрофаги на фоні нейтрофілів, лімфоцитів. Ок.10, об.40. Фіг. 3. Браш-біопсія слизової оболонки бронхів дівчинки В., 11 років з хронічним бронхітом до лікування. Ступінь експресії (3 бали) ядерного антигену проліферативної активності клітин (PCNA) в ядрах клітин війчастого епітелію. Непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення експресії антигену PCNA (імуноцитохімічне дослідження). Мікрофотографія. Об.40, ок.10. Фіг. 4. Браш-біопсія слизової оболонки бронхів дівчинки В., 11 років з хронічним бронхітом після лікування. Ступінь експресії (2 бали) ядерного антигену проліферативної активності клітин (PCNA) в ядрах клітин війчастого епітелію. Непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення експресії антигену PCNA (імуноцитохімічне дослідження). Мікрофотографія. Об.40, ок.10. Фіг. 5, 6. Ультраструктурне дослідження Індукованого мокротиння дівчинки В., 11 років з хронічним бронхітом. Дистрофічні зміни в цитоплазмі клітин бронхіального епітелію, багатоядерність макрофагальних альвеолоцитів, нерівномірний розподіл хроматину в ядрах. Ок.10, об.40. Резюме: у 10-річної дитини, яка перенесла до 2 років затяжну двобічну пневмонію, а потім і хірургічне втручання з приводу вади серця, сформувалась схильність до запального процесу, що в майбутньому проявлялось повторними бронхітами та запаленнями легень. Цьому також сприяли наявність рефлюксної хвороби та ковзаючої грижі стравоходу. Скрупульозно проведене клініко-параклінічне обстеження, в тому числі і бронхологічне та фіброгастродуоденоскопічне, які раніше не проводились дитині, дозволили встановити, з урахуванням сучасних поглядів, діагноз хронічного бронхіту з обструктивним синдромом у фазі загострення. Ендоскопічно - двобічний катарально-гнійний ендобронхіт. А також супутні захворювання, які провокують подальше прогресування хвороби: ковзаючу грижу стравоходу та рефлюксну хворобу. Приклад 2. Дівчинка О., 10 років, історія хвороби № 654. Клінічний діагноз: Двобічна пневмонія нижніх відділів обох легень, затяжний перебіг. Двобічний, більше справа, катаральний ендобронхіт. Дистонія нижньої третини трахеї та правого головного бронха 2 ступеня. Двобічний катарально-гнійний ендобронхіт. Рецидивуючий бронхіт. Дискінезія жовчовивідних шляхів за гіпотонічним типом. Поступила у відділення захворювань органів дихання на 7 добу зі скаргами на сильний малопродуктивний кашель, підвищення температури до 37,5 °C, слабкість. Лабораторне обстеження. 12 Загальний аналіз крові: еритроцити - 4,5 × 10 /л, гемоглобін - 131 г/л, лейкоцити - 6,5 × 9 10 /л, швидкість осідання еритроцитів - 9 мм/год. Формула білої крові без особливостей. Загальний аналіз сечі без особливостей. Біохімічний аналіз крові в межах вікової норми. Імунологічний аналіз крові: IgG-8,8 г/л, IgA-0,72 г/л, IgM-0,87 г/л. Мазок з носової порожнини на віруси: аденовірусний антиген (++). Мазок з ротової 4 порожнини на флору: Streptococcus epidermicus-10 , чутливий до канаміцину, гентаміцину, 5 цефазоліну; Staphylococcus aureus-10 , чутливий до оксациліну, канаміцину, гентаміцину. Спірограма - варіант норми. ЕКГ - синусова аритмія, помірні обмінні зміни міокарду. 6 UA 101103 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 УЗД черевної порожнини: Жовчний міхур збільшений, деформований, є перегин в ділянці шийки, стінки потовщені. Інші органи в межах вікової норми. Рентгенографія органів грудної клітки: Інфільтрація коренів легень, посилення та інфільтрація легеневого малюнка в нижніх відділах правої легені та язичкових сегментах лівої легені. Межі серця без особливостей. Фібробронхоскопія: Двобічний, більше справа, катаральний ендобронхіт. Дистонія нижньої третини трахеї та правого головного бронха 2 ступеня. Цитологія (браш-біопсія). Цитоморфологічне дослідження слизового прошарку бронхів в (%), бронхіальний епітелій (% на 100 клітин): базальний - 0; війчастий - 82; келихоподібний - 18. Клітинний склад слизової бронхів (% на 100 клітин): епітелій - 83; нейтрофіли - 6; лімфоцити - 9; еозинофіли - 0; базофіли - 0; макрофаги - 2; опасисті клітини - 0. Цитоморфологічні характеристики війчастого епітелію (% на 100 клітин): нормальні клітини 24; проліферуючі - 0; дистрофічно змінені - 76. Ступінь дистрофії бронхіального епітелію: 3. Індекс дистрофії: 76 %. Цитологія лаважної рідини. Дистрофія клітин бронхіального епітелію (% на 100 клітин): жирова - 84 %; гідропічна - 21 %. Запальна інфільтрація: помірна (3 бали). Клітинний склад слизової бронхів (% на 100 клітин): епітелій - 42; нейтрофіли - 21; лімфоцити - 4; еозинофіли - 1; базофіли - 0; макрофаги - 32. Бронхіальний епітелій (% на 100 клітин): базальний - 0; війчастий - 79; келихоподібний - 21. Антигени до макрофагів CD-169: 2 бали. Експресія ММР: 3 бали. На Фіг. 7. Мазок лаважної рідини з бронхів дівчинки О., 10 років з рецидивуючим бронхітом до лікування. Шар клітин війчастого епітелію, нейтрофільно-лімфоцитарна інфільтрація. Ок.10, об.40. Фіг. 8. Браш-біопсія слизової оболонки бронхів дівчинки О., 10 років з рецидивуючим бронхітом до лікування. Шар клітин війчастого епітелію з жировою дистрофією цитоплазми. Ок.10, об.90. Фіг. 9. Браш-біопсія слизової оболонки бронхів дівчинки О., 10 років з рецидивуючим бронхітом до лікування. Експресія антигенів до макрофагів в цитоплазмі війчастого епітелію бронхів (2 бали). Ок.10, об.20. Фіг. 10. Браш-біопсія слизової оболонки бронхів дівчинки О., 10 років з рецидивуючим бронхітом після лікування. Шар клітин келихоподібного епітелію. Ок.10, об.40. Фіг. 11, 12. Ультраструктурне дослідження, напівтонкі зрізи індукованого мокротиння дівчинки О., 10 років з рецидивуючим бронхітом. Дистрофічні зміни в цитоплазмі клітин бронхіального епітелію, багатоядерність макрофагальних альвеолоцитів, нерівномірний розподіл хроматину в ядрах. Ок.10, об.40. Резюме: дане спостереження може свідчити про те, що у дівчинки, яка неодноразово перенесла у ранньому віці значну кількість гострих бронхітів, а також їх ускладнення - гостру пневмонію, в формуванні рецидивуючого бронхіту важливу роль відіграли часті ГРВІ з наступною їх трансформацією. Це суттєво знижувало захисні механізми організму, що, в свою чергу, призводило до наступного захворювання, тобто виникло "хибне" коло. Приклад 3. Дівчинка Н., 12 років, № історії хвороби 272. Клінічний діагноз: Бронхіальна астма персистуюча атопічна, важка форма, міжприступний період, контрольована. Алергічний риніт, період загострення. Харчова та побутова алергія. Поступила у відділення захворювань органів дихання із скаргами на сильний малопродуктивний кашель, слабкість, експіраторну задишку. Лабораторне обстеження. 12 Загальний аналіз крові: еритроцити - 4,9 × 10 /л, гемоглобін - 149 г/л, лейкоцити - 4,5 × 9 10 /л, швидкість осідання еритроцитів - 10 мм/год. Формула білої крові без особливостей. Загальний аналіз сечі, біохімічний аналіз крові без особливостей. Імунологічний аналіз крові: IgG-9,2 г/л, IgA-1,49 г/л, IgM-1,95 г/л. Виявлена наявність підвищеного рівня еозинофілів в носовому слизу та рівень алергенспецифічних IgE в сироватці крові. Мазок з носової порожнини на віруси: аденовірусний антиген (+). Мазок з ротової порожнини 4 на флору: Streptococcus agalacticae-10 , чутливий до канаміцину, гентаміцину, цефазоліну; 5 Staphylococcus aureus-10 , чутливий до оксациліну, канаміцину, гентаміцину. Спірограма - вентиляційна недостатність обструктивного характеру, середнього ступеню важкості. 7 UA 101103 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ЕКГ - в межах вікової норми. УЗД черевної порожнини: Ехогенність паренхіми підшлункової залози підвищена нерівномірно, збільшення хвоста підшлункової залози. Інші органи в межах вікової норми. Рентгенографія органів грудної клітки: Дифузне посилення легеневого малюнка. Посилення та неструктурність коренів легень. Синуси вільні. Межі серця без особливостей. Цитологія (індуковане мокротиння). Цитоморфологічне дослідження слизового прошарку бронхів в (%), бронхіальний епітелій (% на 100 клітин): базальний - 8; війчастий - 66; келихоподібний - 26. Клітинний склад слизової бронхів (% на 100 клітин): епітелій - 38; нейтрофіли - 21; лімфоцити - 4; еозинофіли - 11; базофіли - 2; макрофаги - 24; опасисті клітини - 0. Цитоморфологічні характеристики війчастого епітелію (% на 100 клітин): нормальні клітини 18; проліферуючі - 0; дистрофічно змінені - 88. Ступінь дистрофії бронхіального епітелію: 3. Індекс дистрофії: 82 %. Антигени до макрофагів CD-169: 3 бали. Експресія ММР: 3 бали. На Фіг. 13. Мазок лаважної рідини з бронхів дівчинки Н., 12 років з бронхіальною астмою до лікування, альвеолярні макрофаги на фоні поодиноких нейтрофілів та виразної еозинофільної інфільтрації, зерна розпаду еозинофілів. Ок.10, об.90. Фіг. 14. Мазок лаважної рідини з бронхів дівчинки Н., 12 років з бронхіальною астмою після лікування, альвеолярні макрофаги на фоні поодиноких нейтрофілів та еозинофілів. Ок.10, об.90 Фіг. 15. Браш-біопсія слизової оболонки бронхів дівчинки Н., 12 років з БА до лікування. Експресія проапоптотичного протеїну Вах в цитоплазмі еозинофілів та нейтрофілів (2 бали). Ок.10, об.40. Фіг.16. Браш-біопсія "слизової оболонки бронхів дівчинки Н., 12 років з БА після лікування. Експресія антиапоптотичного протеїну всl-2 в мембранних структурах клітин епітелію бронхів (2 бали). Ок.10, об.40. Фіг.17, 18. Ультраструктурне дослідження, напівтонкі зрізи індукованого мокротиння дівчинки Н., 12 років з бронхіальною астмою. Виразні деструктивні зміни клітин бронхіального епітелію, наявність клітинного детриту, фібрину, волокнистих структур та поодиноких альвеолярних макрофагів. Ок.10, об.40. Резюме: у даної дитини мала місце поєднана дія декількох несприятливих факторів. Дівчинка має обтяжену алергічними захворюваннями спадковість, вдома мала місце експозиція побутовими алергенами, наявність харчової алергії, а потім і алергічного риніту. Діагноз був поставлений із запізненням, лікувалась нерегулярно. Після призначення комплексної терапії стан дитини покращився і залишається стабільним. Таким чином, на основі поглибленого вивчення механізмів ушкодження слизової оболонки бронхів дітей з хронічними запальними захворюваннями дихальних шляхів, встановлено порушення регенераторних процесів в епітелії бронхів в залежності від клінічних проявів захворювання, а саме більш виражена проліферативна активність - клітин епітелію бронхів дітей з хронічними та рецидивуючими бронхітами у порівнянні з бронхіальною астмою, що необхідно враховувати при лікуванні дітей з хронічними запальними захворюваннями органів дихання. Процеси регенерації епітелію проходять на тлі достовірно виразних змін про- і антиапоптотичних факторів (Аро-1/Fas, вс1-2), що свідчить про взаємозв'язок цих факторів та глибину ушкодження епітеліальних структур бронхів і важливі для лікувального процесу. В динаміці лікування проліферативна активність клітин достовірно знижується у дітей з хронічними бронхітами. У дітей з бронхіальною астмою проліферативна активність клітин в динаміці лікування достовірно не змінюється. Отже, використані вище дані свідчать про застосування запропонованого способу з найбільшою серед існуючих способів об'єктивністю, що може використовуватися для клінічного обстеження хворих з бронхолегеневою патологією з метою уточнення фази захворювання для оптимізації терапії, постановки діагнозу хронічної патології на ранній стадії хронізації процесу для ефективності проведення терапії з попередженням ранньої інвалідизації пацієнта. 55 8 UA 101103 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 Спосіб оцінки фази захворювання легень та перебігу бронхолегеневого процесу у дітей шляхом бронхоскопії, який відрізняється тим, що додатково у мазках лаважної рідини і браш-біопсіях досліджують показники: а) субпопуляційний склад бронхіального епітелію - при переважанні базального епітелію та зниженні кількості війчастих клітин з одночасним збільшенням їх дистрофії, збільшенні келихоподібних клітин - це часткова десквамація епітелію, зростання продукції муцинів, порушення цілісності бронхіального прошарку слизової бронхів, структурно-функціональна перебудова війчастих клітин слизової респіраторного тракту за рахунок запалення, гострота процесу, наявність обструкції; б) функціональна активність тканинних макрофагів - при підвищенні експресії антигенів до макрофагів в епітелії (2 бали і вище) діагностують зміну регуляції захисного характеру активації макрофагів на ушкоджуючий, патологічну регенерацію епітелію з хронізацією бронхолегеневого процесу; в) рівень експресії матриксної металопротеїнази (ММР) - підвищення експресії антигенів до макрофагів з одночасним підвищенням експресії ММР (1,5 бали і більше) з переважанням у мембранних структурах клітин - це зміни регенерації слизової оболонки та формування хронічного процесу; г) характер експресії ядерного антигену проліферативної активності клітин (PCNA): при ультраструктурних ушкодженнях клітин епітелію без деструкції мембрани клітини - це РБ, ХБ; при деструкції клітинної мембрани, розпаді клітини із зростанням клітинного детриту та колагену - БА; д) апоптозний каскад - підвищення експресії антигену всl-2 до 1,5-1,7 балів - це порушення регуляторних механізмів апоптозу, підвищення експресії рецепторів СД-95 Аро-1/Fas (2 бали і вище) з переважанням у мембранних структурах клітин епітелію і лейкоцитів - висока апоптотична активність клітин епітелію, характерна для хронічного процесу (РБ, ХБ), при показнику до 1,5 балів з появою опасистих клітин-маркерів ризику формування хронічного процесу та гіперреактивності бронхів - діагностують бронхіальну астму. 9 UA 101103 C2 10 UA 101103 C2 11 UA 101103 C2 12 UA 101103 C2 13 UA 101103 C2 Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 14