Синтетичні мембранні везикули як системи для введення лікарських засобів та спосіб іх одержання

1. Синтетические мембранные везикулы как системы для введения лекарственных средств, включающий, по меньшей мере, один функционально активный слитый вирусный пептид на мембране и фармацевтически активное вещество, о тличающиеся тем, что мембрана везикулы также содержит невирусные фосфолипиды, включающий фосфатидилэтаноламин, и предпочтительно фосфатидилхолин, по меньшей мере один функционально активный гемагглютинин, выбранный из группы, состоящей из тримера или мономера гемагглютинина, гликопептида НА1 и гликопептида НА2 в качестве слитого пептида, бифункциональный поперечносвязывающий агент, предпочтительно производное (З)-сульфосукциними дила и, по меньшей мере, один специфический клеточный маркер, связанный с мембраной предпочтительно посредством указанного поперечносвязывающего агента. 2. Синтетические мембранные везикулы по п. 1 , о т л и ч а ю щ и е с я тем, что они включают функционально активный слитый вирусный пептид на мембране вместе с вирусными фосфолипидами. 3. Синтетические мембранные везикулы п о п . і . о т л и ч а ю щ и е с я тем, что указанный слитый пептид связан с мембраной посредством указанного поперечносвязывающего агента. 4. Синтетические мембранные везикулы по п. 1 , о т л и ч а ю щ и е с я тем, что мембрана везикулы содержит холестерин в концентрации менее 10 вес.%, предпочтительно менее 1 вес.% и/или остаточное количество детергента монододецилового эфира октаэтиленгликоля (ОЭГ) менее 1 вес.% предпочтительно менее 0,25 вес.%. 5. Синтетические мембранные везикулы по п. 1 , о т л и ч а ю щ и е с я тем, что их диаметр менее 100 нм и, предпочтительно, составляет около 80 нм. 6. Синтетические мембранные везикулы п о п . 1 , о т л и ч а ю щ и е с я тем, что специфический клеточный маркер содержит, по меньшей мере одно, предпочтительно моноклональное, антитело. 7. Синтетические мембранные везикулы по п. 1 , о т л и ч а ю щ и е с я тем, что гемагглютинин происходит от, по меньшей мере, одного члена группы, состоящей из вируса гриппа, предпочтительно подтипа A-HINI, рабдовируса, вируса парагриппа и тогавируса. 8. Синтетические мембранные везикулы по п. 1 , о т л и ч а ю щ и е с я тем, ON Os О ' 26610 что вирусный фосфолипид происходит от, по меньшей мере, одного члена группы, состоящей из вируса гриппа, предпочтительно подтипа A-HINI, рабдовируса, вируса парагриппа и тогавируса, в сочетании с от 2 до 100, предпочтительно от 5 до 15-кратным количеством фосфатидилхолина. 9. Синтетические мембранные везикулы по п. 1 , о т л и ч а ю щ и е с я тем, что: - фосфолипид в мембране включает в себя от 70 до 95% по весу фосфатидилхолина и от 5 до 30, предпочтительно от 10 до 2 0 % по весу фосфатидилэтаноламина; - от 5 до 10, предпочтительно от 6 до 8 % по весу, относительно целой мембраны, поперечносвязывающего агента, предпочтительно производного сульфосукцинимидила, и, по меньшей мере, один специфический клеточный маркер, и, необязательно, по меньшей мере, один слитый пептид с мембраной. 10. Синтетические мембранные везикулы по п. 1 , о т л и ч а ю щ и е с я тем, что они используются для приготовления лекарств против СПИДа. 11. Синтетические мембранные везикулы по п. 1 , о т л и ч а ю щ и е с я тем, что они используются для приготовления лекарств против раковых опухолей. 12. Синтетические мембранные везикулы п о п . 1 , ' о т л и ч а ю щ и е с я тем, что они содержат, по меньшей мере, одно из следующих веществ: имидазолкарбоксамид, гидроксимочевина, адрибластин, эндоксан, флорурацид, колхицин. 13. Синтетические мембранные везикулы по п. 1 , о т л и ч а ю щ и е с я тем, что они содержат, по меньшей мере, одно из следующих соединений: сульфат декстрана, димер рибонуклеазы и димер лизоцима. 14. Способ получения синтетических мембранных везикул, включающий разбавление фосфолипида в неионном детергенте, образование везикул при механическом перемешивании и удаление детергента с последующей корректировкой требуемого размера везикулы обработкой ультразвуком, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что очищенный вирус или его поверхностные антигены растворяют в неионном детергенте, предпочтительно в монододециловом эфире октаэтиленгликоля (ОЭГ), который не взаимодействует с геммагтлютинином, вирусные или поверхностные антигены включают в качестве слитого пептида, по меньшей мере, один ге магглютинин, выбранный из группы, состоящей из тримера или мономера гемагглютинина, гликопептида НА1 и ликопептида НА2, после ультрацентрифугирования требуемое фармацевтически активное вещество добавляют в супернатант, который содержит вирусные липиды и, по меньшей мере, один слитый пептид, полученную смесь объединяют с невирусными фосфолипидами, детергент удаляют повторной обработкой раствора микроносителем в форме полистироловых гранул, полученные везикулы подвергают ультразвуковой обработке до получения везикул нужного размера, после чего добавляют бифункциональный псперечносвязывающий агент, чтобы связать его одним из его связывающих участков с мембраной везикул, полученные везикулы обрабатывают раствором, содержащим, по меньшей мере, один специфический клеточный маркер, который связывают с другим связывающим участком поперечносвязывающего агента, или указанное фармацевтически активное вещество растворяют в растворе неионогенного детергента, предпочтительно содержащего монододециловый эфир октаэтиленгликоля (ОЭГ),' который не реагирует с гемагглютинином, полученный раствор объединяют с невирусными фосфолипидами, включающими в себя фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин, и растворяют в нем фосфолипиды, полученный раствор несколько раз обрабатывают микроносителем в форме полистироловых гранул, чтобы удалить детергент, полученные везикулы подвергают ультразвуковой обработке до получения везикул требуемого размера, добавляют бифункциональный поперечносвязывающий агент для связывания одним связывающим участком с мембраной везикул, полученные везикулы обрабатывают раствором, содержащим, по меньшей мере, один слитый пептид и, по меньшей мере, один специфический клеточный маркер, посредством чего, по меньшей мере, один слитый пептид и, по меньшей мере, один специфический клеточный маркер связывают с мембраной посредством другого связывающего участка указанного поперечносвязывающего агента. 15. Способ по п.14, о т л и ч а ю щийся тем, что раствор детергента имеет концентрацию от 10 до 250, предпочтительно от 80 до 120 мкмоль на мл и/или удаляют из раствора посредством трех-, четырехкратной обработки 1-2 г, предпочтительно 1,5 г, микроносителя в форме полистироловых гранул размером 26610 20-50 меш во влажном состоянии на 100 мг детергента. 16. Способ по п.14, о т л и ч а ю щийся тем, что вирусные липиды и слитые пептиды получают, по меньшей мере, от одного вируса, выбранного из группы, состоящей из вируса гриппа, рабдовируса, вируса парагриппа и тогавируса. 17. Способ по л.14, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что указанные специфические клеточные маркеры включают в себя, по меньшей мере, одно, предпочтительно моноклональное, антитело. 18. Способ по п. 14, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что бифункциональный поперечносвязывающий агент, предпочтительно производное (S) сульфосукцинимидила, связано с мембраной в концентрации приблизительно 5-10% от веса всей мембраны. 19. Способ по п.14, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что фармацевтически активное вещество выбирают из группы, состоящей из сульфата декстрана, димера рибонуклеазы, димера лизоцима, имидазолК^рбоксамида, оксимочевины, адрибластита, эндоксана, фтормочевины и колхицина. Изобретение относится к синтетическим мембранным везикулам (липосомам), в частности, к везикулам, на поверхности которых имеются молекулы слитых пептидов и другие специфические для клеток белки. Молекулы слитых пептидов могут присутствовать в формах синтетического или очищенного пептида либо как часть гликопротеиновых выступов на поверхности оболочки вируса, например, гемагглютининов. К числу таких вирусов относится вирус гриппа, парагриппа или вирус комариной лихорадки Семлики. Специфические клеточные белки могут быть представлены антителами класса 1gg, например антителами СД4. При приеме больным того или иного лекарственного средства оно сначала должно поступить из места введения в кровь, поэтому способ введения препарата может иметь существенное влияние на его фармакокинетический профиля в кровяном русле. Так, в случае выбора перорального способа введения, действие лекарственного средства развивается медленно, а его оптимальная концентрация в крови достигается не всегда. Напротив, при внутривенном введении концентрация препарата в крови носит предсказуемый характер и достаточно быстро достигает требуемой величины, хотя такой способ связан с известными неудобствами для больного и болезненными ощущениями. Но даже при непосредственном введении медикаментов в системный кровоток, взаимосвязь между введенной дозой, концентрацией препарата в крови и продолжительностью его действия на орган-мишень носит весьма сложный характер. Значе ния этих параметров определяются сложной системой путей обмена, нередко имеющих конкурентный характер, которые в конечном счете приводят либо к накоплению активных молекул в ткани-мишени, либо к инактивации и экскреции лекарственного средства, К числу таких путей относятся биотрансформация в печени и других органах, выведение через почки или с желчью, связывание препарата с фиксированными или циркулирующими клетками и макромолекулами, пассивное или с помощью других соединений проникновение через мембранные барьеры (Creasy W.A. (1979), Drug Disposition in Humairs, Oxford University Press, New York). В последние годы заметен большой интерес к перспективам регуляции распределения и обмена лекарственных средств в организме по наиболее благоприятному для больного сценарию посредством применения различного рода носителей или систем введения медикаментозных препаратов. Такие системы предназначены для контроля одного или нескольких следующих параметров (Juliano R.R. (1975), Can J.Physial Pharmaco 56, 683890): а) скорости включения препарата в определенную ткань организма, б) распределения и локализации лекарственного средства в организме больного; в) устойчивости и скорости превращения препарата. Важным вкладом в разработку систем направленного введения лекарственных средств явилось конструирование липасом, впервые описанные (Bangkam A.D. 5 10 15 20 25' 30 35 26610 Standish M.M. Watkins T.C. J.Mol.Btol, 1965, 13, 238-252). К настоящему времени в , литературе имеются многочисленные опи . сания достоинств методики введения лекарственных средств в составе липосом. Эти способы можно с известной долей условности подразделить на следующие категории: 1. Липосомы могут проникать через биологические мембраны и способствовать транспорту медицинских препаратов через обычно непроницаемые для последних барьеры. В частности, заключенные в липосомы соединения могут доставляться внутрь клеток. 2. Липосомы могут быть предназначены для взаимодействия с определенными тканями, с целью повышения избирательности действия лекарственных препаратов и снижения их токсического эффекта. 3. Использование липосом позволяет желаемым образом изменять фармакокинетику лекарственных средств, влияя на освобождение, распределение и выведение последних б системном кровотоке. 4. Липосомы могут применяться для предотвращения инактивации химически или метаболически лабильных соединений. Таким образом можно отбирать соединения, перспективные с точки зрения терапевтического применения, поскольку / * инкапсулированные препараты обладают, по крайней мере, при испытаниях in vitro, измененными, по сравнению с исходными, свойствами. К сожалению, первые надежды на революционизирующие последствия нового подхода к химиотерапии полностью не оправдались, как об этом и свидетельствуют результаты экспериментальных исследований (Filds F.t.T. Liposomes From Physical Structure to therapeutic applications Knight (ed), Elsevier (North Holland Biomedical Press, 1981). Более обнадеживающие результаты при использовании липосом в качестве переносчиков лекарственных средств могут быть получены при нагрузке липосом специфическими белками. Для того, чтобы обеспечить более надежную доставку заключенных в липосомы препаратов к нужным органам или тканям, методика нагрузки должна быть направлена на предотвращение задержки липосом в нежелательных местах (таким образом снижается токсичность) и оптимизацию переноса лекарственного средства в определенные типы клеток (для усиления требуемого эффекта). Некоторые исследователи покрывали липосомы оболочкой из агрегированных 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8 иммуноглобулинов для оптимизации их доставки на фагоциты (Ismail, G., Boxer, LA., Bachner, R.L, Pediatr, Res., 1979, 13, 769-773, Finkelstein, M.S., Kuhn, S.H. Schieren, H. Weissmann and Haffstein, S. Liposomes and Immunobiology; (Tom, B.H. and Six., H.R. eds.) 1980, 255-270. Elsevier (North-Holland Publishing Co., Amsterdam). В дальнейшем, методика была усовершенствована Gregoriadis и Neerunjum (1975, Beochem. Biophts. Res. Commun 65, 537-544), которые предложили более эффективный способ нагрузки липосом специфическими для определенного типа клеток антителами (lgG-иммуноглобулинами). Включение липосгм, связанных с иммуноглобулинами к определенным клеточным линиям, возрастало при этом в 3-25 раз. Тем не менее, при практическом применении этого метода выяснилось, что нагруженные таким образом липосомы не сливались с клеточными мембранами, что препятствовало эффективной доставке к клеткам заключенных в липосомах лекарственных препаратов (Leserman, L, Weinstein, I.N., Blumentha L, R, Sharrow. S.O. and Texy. W.D. (1979), J.Immunol, 122, 585-591). Важным шагом на пути улучшения слособов получения систем введения лекарственных средств явилось связывание липосом с вирусными белками. Мембраны липосом, согласно этому способу, подвергают модификации такими белками, как гемагглютинин вируса гриппа (Almeida I.D., Brand С М . , Edurerds O.C., and Heath T.D. Lancet, 1975, 2, 899-901). Эффективность испецифичность взаимодействия вируса с клетками-хозяевами на его ранних стаднях (адсорбция, проникновение в клетки) поддаются регуляции посредством включения соответствующих вирусных белков в мембраны липосомных носителей. Например, включения поверхностных белков вируса Сендай в двуслойную липосому по меньшей мере в 100 раз усиливает включение фрагмента А токсина дифтерии мышиными І-клетками по сравнению с наблюдающимся при использовании липосом, содержащих фрагмент А в отсутствие вирусных белков (Uehida Т., Kim i., Yamaizumi M.t Miyahe, Okado, Y. Cell. Bio». 1979, 80, 10-20). Основным недостатком описанной методики является отсутствие полноценно активных слитых пептидов гемагглютинина вируса гриппа. Вирус гриппа А проникает в клетки-хозяева в процессе слияния с мембраной. После связывания на поверхности клетки вирусные частицы прони 26610 кают в нее и переносятся на эндосомы и лизосомы. Кислая среда этих органелл активирует процесс слияния мембранных компонентов вируса и клетки-хозяина. Преимущество слияния липосомы с клеткой при низких величинах рН состоит в том, что содержимое везикул освобождается после их проникновения в клеточную цитоплазму (рН среды эндосом приближается к 5,2). Открытие слияния гликопротеинов вируса гриппа при низких значениях рН породило множество попыток получить системы доставки лекарственных средств с применением липосом, ассоциированных с гемагглютинином вируса гриппа. Kawasaki К. с соавторами (Blochimica et Biophysica Acta 1983, 733, 286-290) использовали везикулы с гликопротеиновыми гемагглютининами вируса гриппа в системе: желточный фосфатидилхолин (фосфатидилхолин со спиновой меткой) холестерин в молярном соотношении 1,6:0,4-1. При соотношении белка и липидов в препарате 1:44 или 1:105 моль/ моль он содержал везикулы диаметром 100-300 нм при высокой плотности поверхностных выступов. Основные недостатки такого препарата сводились к следующему: 1. Эндоцитоз фагоцитарными клетками угнетен вследствие высокого содержания холестерина и присутствия остаточных количеств детергента. Активность препарата даже по данным Kawasaki с соавторами не превышала 66%, а при оценке новейшими, более совершенными методами составляла спустя 7 мин только 1% (см. ниже пример 10). Это может объясняться тем, что использовавшийся авторами тритон Х-100 частично реагирует с гемагглютинином и полностью не удаляется в процессе диадиза. 2. Для изучения роли мембранных компонентов вируса в реакции слияния следует иметь способы манипулирования этими компонентами. Для этой цели необходимо уметь выделять и формировать белки выступов вирусной оболочки, получая таким образом виросомы в полной мере, способные вступать в реакцию биологического слияния. Тем не менее, несмотря на все усилия Kawasaki и его соавторов, им не удалось получить вирусы гриппа с оболочками, проявляющими такую биологическую активность. 3. Не удалось доказать связывание нагруженных вирусными белками липосом, несущих фармацевтически активные препараты, со специфическими типа клеток. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 10 Большинство других применявшихся методов получения вирусных оболочек с требуемыми свойствами основаны на солюбилизации вирусных мембран детертентами с последующим удалением детергента из надосадочной жидкости после осаждения внутриклеточных вирусных белков и генетического материала. Детергенты с высокой критической концентрацией мицелл, в частности октилглюкозид, можно достаточно полно удалить с помощью диазила. Методика с использованием октилглюкозида описана при работе с вирусом комариной лихорадки Семлики (БКЛ) (Helenius A., Sarvas M. и Simons К. Eur. J.Biochem. 1981, 116, 2735), вирусом везикулярного стоматита (ВЕС) Eidelman О. Schlege! R., Tralka T.S. and Blumenthal R. J.Biol. Chem. 1984, 259, 4622-4628), вирусом гриппа (Huang R.T.C., Wahu K., Klenk H.D. and Rou R. Virology, 1980, 104, 294-302) и вирусом Сендай (Harmsen M.D., Wilschut I., Scherphof G., Hulstaert C. and Hoekstra D. Eur. J.Biochem., 1985, 149, 591-599). Однако ни в одном из этих исследований не были получены вирусные оболочки с желаемыми свойствами. Так, виросомы, полученные из БКЛ, содержали белок и липиды в соотношении, которое отличалось от их соотношения в природной вирусной оболочке, а виросомы из ВВС не обладали способностью к биологическому слиянию. Еще один описанный в литературе метод состоит в отделении поверхностных выростов от оболочки вируса гриппа бромаленом. Получаемый таким образом гемагглютинин связывался с липосомами (Doms. R. Helenius A. and White I.J.Biol. Chem., 1985, 260, (5), 2973-2981). Основным недостатком этого метода является ограниченная биологическая активность таких везикул вследствие расщепления бромеленом. Задача настоящего изобретения состоит в необходимости получения везикул, в которых требуемые лекарственные средства или фармацевтически активные соединения транспортируются на специфические клетки, такие как макрофаги, клетки-хелперы (14), клетки мозга и другие клетки того или иного органа, с которыми везикулы прочно связываются, и проникают внутрь этих клеток в процессе фагоцитоза или эндоцитоза, в результате чего требуемое средство поступает, сразу после эндоцитоза, в цитоплазму нужных клеток. Решение указанной задачи достигается благодаря тому, что в фосфолипидных двухслойных везикулах, вк« . 11 26610 лючающих, по меньшей мере, один функционально активный слитый вирусные пептид на мембране и/или остаточное количество неионогенного детергента и фармацевтически активное вещество, согласно изобретению указанная мембрана везикулы также содержит невирусные фосфолипиды, включающие фосфатидилэтаноламин и предпочтительно фосфатидилхолин, по меньшей мере один функционально активный гемагглютинин, выбранный из группы, состоящей из тримера или мономера гемагглютинина, гликопептида НА1 и гликопептида НА2 в качестве слитого пептида, бифункциональный поперечносвязывающий агент, предпочтительно производное (Б)-сульфосукцинимидила и, по меньшей мере, один специфический клеточный маркер, связанный с мембраной, предпочтительно, посредством указанного поперечносвязывающего агента. Кроме того, фосфолипидные двухслойные везикулы включают функционально активный слитый вирусный пептид на мембране вместе с вирусными фосфолипидами. Мембрана везикулы включает холестерин в концентрации менее 10 вес.% и/ или остаточное количество детергента монододецилового эфира октаэтиленгликоля (ОЭГ) в концентрации менее 1 вес.%. Указанная задача решается также благодаря тому, что указанный слитый пептид связан с мембраной посредством указанного поперечносвязывающего агента. Содержание холестерина может составлять менее 1 % по весу, а содержание детергента менее, чем 0,25% по весу. Кроме того» диаметр фосфолипидных двухслойных везикул менее 100 нм и, предпочтительно, составляет около 80 нм. Специфический клеточный маркер содержит, по меньшей мере одно, предпочтительно моноклональное, антитело. Кроме того, гемагглютинин происходит от, по меньшей мере, одного члена группы, состоящей из вируса гриппа, предпочтительно подтипа A-HINI, рабдовируса, вируса парагриппа и тогавируса. Вирусный фосфолипид происходит от, по меньшей мере, одного члена группы, состоящей из вируса гриппа, предпочтительно подтипа A-HINI, рабдовируса, вируса парагриппа и тога вируса, в сочетании с от 2 до 100, предпочтительно от 5 до 15-кратным количеством фосфатидилхолина. Указанная задача решается также благодаря тому, что фосфолипид в мембране * 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 12 включает в себя от 70 до 9 5 % по весу фосфатидилхолина и от 5 до 30, предпочтительно от 10 до 2 0 % по весу фосфатидилэтаноламина; от 5 до 10, предпочтительно от 6 до 8 % по весу, относительно целой мембраны, поперечносвязывающего агента, предпочтительно производного сульфосукцинимидила, и, по меньшей мере, один специфический клеточный маркер, и, необязательно, по меньшей мере, один слитый пептид связан с мембраной. Кроме того, согласно изобретению, фосфолипидные двухслойные везикулы используют для приготовления лекарства против ВИЧ-инфекции, а также для приготовления лекарств против раковых опухолей. Фосфолипидные двухслойные везикулы содержат, по меньшей мере, одно ид следующих веществ: имидазолкарбоксамид, гидроксимочевина, адрибластин, эндоксан, флорурацил, колхицин. Кроме того, фосфолипидные двухслойные везикулы содержат, по меньшей мере, одно из следующих соединений: сульфат декстрана, димер рибонуклеазы и димер лизоцима. Для получения фосфолипидных двухслойных везикул изобретен способ, включающий разбавление фосфолипида в неионном детергенте, образование везикул при механическом перемешивании и удаление детергента с последующей корректировкой требуемого размера везикулы обработкой ультразвуком. Для решения поставленной задачи, согласно изобретению, очищенный вирус или его поверхностные антигены растворяют в неионном детергенте, предпочтительно в монододециловом эфире эктаэтиленгликоля (ОЭГ), который не взаимодействует с гемагглютинином, вирусные или поверхностные антигены включают в качестве слитого пептида, по меньшей мере, один гемагглютинин, выбранный из группы, состоящей из тримера или мономера гемагглютинина, гликопептида НА1 и гликопептида НА2. После ультрацентрифугирования требуемое фармацевтически активное вещество добавляют в супернатант, который содержит вирусные липиды и, по меньшей мере, один слитый пептид. Полученную смесь объединяют с невирусными фосфолипидами, детергент удаляют повторной обработкой раствора микроносителем в форме полистироловых гранул. Полученные везикулы подвергают ультразвуковой обработке до получения вези 13 26610 кул нужного размера, после чего добавляют бифункциональный поперечносвязывающий агент, чтобы связать его одним из его связывающих участков с мембраной везикул. 5 Полученные везикулы обрабатывают раствором, содержащим, по меньшей мере, один специфический клеточный маркер, который связывают с другим связывающим участком поперечносвязывающе- 10 го агента, или указанное фармацевтически активное вещество растворяют в растворе неионогенного детергента, предпочтительно содержащего монододециловый эфир октаэтиленгликоля (ОЭГ), который 15 не реагирует с гемагглютинином. Полученный раствор объединяют с невирусными фосфолипидами, включающими в себя фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин, и растворяют в 20 нем фосфолипиды. Полученный раствор несколько раз обрабатывают микроносителем в форме полистироловых гранул, чтобы удалить детергент. 25 Полученные везикулы подвергают ультразвуковой обработке до получения вези-, кул требуемого размера, добавляют бифункциональный поперечносвязывающий. агент для связывания одним связываю- 30 щим участком с мембраной везикул. Полученные везикулы обрабатывают раствором, содержащим, по меньшей мере, один слитый пептид и, по меньшей мере, один специфический клеточный мар- 35 кер, посредством чего, по меньшей мере, один слитый пептид и, по меньшей мере, один специфический клеточный маркер связывают с мембраной посредством другого связывающего участка указанного по- 40 перечносвязывающего агента. Кроме того, согласно изобретению, раствор детергента имеет концентрацию от 10 до 250, предпочтительно от 80 до 120 мкмоль на мл и/или детергент удаляют из 45 раствора посредством трех-, четырехкратной обработки 1-2 г, предпочтительно 1,5 г, микроносителя в форме полистироловых гранул размером 20-50 меш во влажном состоянии на 100 мг детергента. 50 Кроме того, согласно изобретению, вирусные липиды и слитые пептиды получают, по меньшей мере, от одного вируса, выбранного из группы, состоящей из вируса гриппа, рабдовируса, вируса па- 55 рагриппа и тогавируса. В заявляемом способе указанные специфические клеточные маркеры включают я себя, по меньшей мере, одно, предпочтительно моноклональное, антитело. 14 Кроме того, бифункциональный поперечносвязывающий агент, предпочтительно производное (S) сульфосукцинимидила, связано с мембраной в концентрации приблизительно 5-10% от веса всей мембраны. Для решения указанной задачи фармацевтически активное вещество выбирают из группы, состоящей из сульфата декстрана, димера рибонуклеаз'ы, димера лизоцима, имидазолкарбоксамида, оксимочевины, адрибластина, эндоксана, фтормочевины и колхицина. В соответствии с этим, изобретение позволяет получать вирососы вирусного гемагглютинина, которые содержат идеально подходящие для эндоцитоза липосомы и специфические клеточные маркеры, обладающие полной биологической активностью, предпочтительно гемагглютининовые вирусные гликопротеины или их производные, а также синтетические слитые пептиды, способные индуцировать быстрое слияние указанных виросом с определенным типом клеток сразу после завершения эндоцитоза. Другой способ реализации изобретения состоит в использовании подходящих агентов, обеспечивающих перекрестную сшивку, которые адсорбируются на специфических липосомах, а смеси со специфическими антителами к рецепторам, для запуска механизма эндоцитоза в клетках данного типа; антитела взаимодействуют со сшивающими агентами таким образом, что полностью сохраняют биологическую активность. Существенным признаком этих везикул является наличие на их поверхности указанных вирусных гликопротеинов или их производных, в полной мере сохраняющих активность, и биологически активных специфических антител, которые обладают способностью прикрепляться к нужным клеткам, подвергаются интернализации в процессе фагоцитоза или эндоцитоза и индуцируют быстрое слияние указанных везикул с внутренними цитоплазматическими мембранами и освобождение содержимого виросом в цитоплазму данных клеток. Благодаря использованию активных слитых пептидов согласно настоящему изобретению, освобождение лекарственных средств происходит сразу после фагоцитоза, что позволяет избежать нежелательного длительного пребывания их в эндоцитосомах, которое может приводить к неспецифической деградации фармацевтических продуктов, присутствующих в вирусных гемагглютининовых вези 15 26610 кулах согласно настоящему изобретению. ' При рН Ъ слитые пептиды вируса гриппа на поверхности везикул активируются посредством такого же механизма, как в случае живого вируса. Содержимое везикул освобождается в цитоплазму, как это имеет место в случае вируса гриппа от выделяемого нуклеопротеина. Термином - "липосома" обозначаются двухслойные фосфолипиды среднего размера, которые получают в процессе контролируемого удаления детергентов. Первоначальный размер везикул, образующихся сразу после удаления детергента зависим от природы как детергента, так и фосфолипида, а в отдельных случаях - от способа и скорости удаледения детергента. Настоящее изобретение относится также к способу получения везикул, в наибольшей степени пригодных для фогоцитоза. Способ включает следующие стадии: 1. Разведение одного или двух фос.фолипидов в неионном детергенте. 2. Формирование везикул в процессе удаления детергента с использованием микроносителей в форме полистироловых гранул (размер во влажном состоянии 2 0 50 меш). 3. Механическое перемешивание во время удаления детергента. 4. Желательный размер возикул ( 5 0 100 нм) достигается ультразвуковой обработкой. Другой способ реализации изобретения сводится к получению везикул, в которых 7 0 - 9 5 % фосфолипидов (по весу) приходится на долю фосфатидилхолина, а 5 - 3 0 % представлено иным фосфолипидом, например, фосфатидилэтаноламином. Содержание холестерина предпочтительно не превышает 1 % . Термин "слитый пептид" относится к гликопротеиновым выростам на поверхности вируса, содержащим слитый пептид. В одном из вариантов, настоящее изобретение относится к полному тримеру гемагглютинина из выростов на поверхности вируса или к одному мономеру или к одному или обоим разлепленным субъединицам (гликолротеидам НА1 и НА2), которые содержат функционально активный слитый пептид. В другом варианте изобретение относится к самому пептиду, выделенному из природного материала или полученному синтетическим путем. Предпочтителен такой способ реализации изобретения, при котором эти поли пептиды, содержащие слитый пептид, 16 § являются гемагглютининами вируса гриппа, особенно гемагглютинином пептида А-Н,^. Понятие "сшивающий агент" приме5 няется для обозначения органической гетерофункциональной молекулы, которая > связывается с поверхностью везикул, полученных согласно настоящему изобретению, и присоединяет полипептиды. Пред10 почтительно, чтобы такая молекула представляла собой органическую бифункциональную молекулу, содержащую карбоксильную группу и тиоловую группу, в частности сульфосукцинимидил-(8)-производ15 ное, например, 8-(р-малеимидо-фенил)-* бутират, Б^ацетат, S-2 (р-азидо-о-нитробензамидо)этил-1,3-дитиопропинат, S-6-(4азидо-2-нитрофениламино)гексаноат, S-(4азидофенилдитио)пропионат, 8-2-(р-азидо20 салициламидо)этил-1,3-дитиопропионат, S2-(биотинамидо)-этил-1,3-дитиопропионат, 8-6-(биотинамидо)гексаноат, 8-3-(4-гидроксифенил)пропионат, 8-(4-йодоацетил)аминобензоат, 8-4(малеимидоме25 тил)циклогексан-1 -карбоксилат, S-2,2,5,5тетраметилпирролин-1 -оксил-НС1. Термин "специфичный для клетки" белок или маркер используется для обозначения белка, способного присоединяться 30 к сшивающему агенту на поверхности везикула и связываться с клеточными рецепторами, что приводит к индукции механизма эндоцитоза. В предпочтительном способе реализации изобретения это по35 нятие относится к специфичным для клеточных рецепторов антителам, особенно к моноклональным антителам. П р и м е р 1. Получение синтетичес40 ких мембранных везикул фосфатидилхолина с полностью функционально активными слитыми пептидами в тримере гемагглютинина из вируса р гриппа, содержащих в качестве антивирусного препа45 рата декстран-сульфат. Фиг.1 иллюстрирует принцип предлагаемой процедуры. Круги обозначают жидкий раствор или суспензию, квадраты твердый осадок или преципитат. 50 В общем виде процедура состоит в следующем. Слитой буферный раствор (ГЕ), содержащий 2700 мг твердого материала и суспензию гемагглютинина (НА), содер55 жащую 46 мг агглютинина и 31,1 мкмоль вирусного фосфолипида (YPL), перемешивают и центрифугируют (UC1). Образующийся осадок разводят в растворе III, содержащем слитой буфер (ГВ) и монодециловый эфир октаэтиленгликоля (СЕд), 17 26610 18 служащего слабым детергентом. После чений их PJ~ в сопоставлении с контрольповторного центрифугирования (UC2) понымиобразцами. Белок определяют с получают надосадочную жидкость IV, содермощью модифицированной методики Лоужащую ГВ, НА, YPL и СЕд и добавляют к ри (Peterson G.L. Anal.Biochem. 1971, 83, ней противовирусный препарат декстран- 5 346-356). сульфат (DS). Конечный раствор обознаРаствор И в количестве 173 мл смечается символом (V). Раствор VI фосфашивают с равным объемом указанного обтидилхолина (ГС) упаривают под вакууъединенного буфера (1). Эту смесь, сомом во вращающейся колбе с округлым держащую вирус гриппа, подвергают центдном для получения тонкого слоя PC на 10 рифугированию при 100 000 х g в течение ЄЄ Внутренней СТеНКе. К ЭТОМУ СЛОЮ ДО: 10 мин до получения осадка. бавляют раствор V и разводят его в раст15,3 мл раствора детергента, содерворе VII, в который трижды последоважащего 54 мг/мл (100 мкмоль/мл) монотельно помещают микроноситель в фордодецилового эфира октаэтиленгликоля ме полистироловых бусин (РВМ) для уда- 15 (СЕд) в описанном слитом буферном растления СЕд. В результате получают растворе добавляют к осадку, содержащему вор VIII, в котором с помощью ультразвувирус гриппа, что дает 18 мкг - 33,3 ковой обработки (US) формируют везикунмоля ОЕд на 1 мкг гемагглютинина. Поллы (VES) требуемого размера. Конечную ное растворение осадка происходит к иссуспензию IX разбавляют раствором NaCI 20 ходу 10 мин. Полученный раствор в течеX, получая суспензию лекарственного ние часа подвергают ультрацентрифугисредства (DR). рованию при 100 000 х д. 3000 мг сухого Слитой буферный раствор I содержит противовирусного препарата декстран7,9 мг NaCI/мл, 4,4 мг/мл дигидрата трисульфата (Liischer М. and GLuck R. Artiviral натрий-цитрата, 2,1 мг/мл 2- 25 Research 14, 39-50) добавляют к оставморфолиноэтанового моногидрата сульфо' шейся надосадочной жидкости IV, которая новой кислоты (MES) и 1,2 мг/мл Nсодержит растворенный тример гемаггоксиэтил-пиперазин-М-2-этан-сулъфоновой — лютинина вируса гриппа, в комбинации с кислоты в Н2О, доводя рН до 7,3 добав* остатком заменимой нейраминидазы и друлением 1 Н NaCH. 30 гими компонентами, получая таким обраВирус гриппа (штамм А(Шанхай) 16/ зом раствор V. 89 (НЗП2)) выращивают в аллантоисе куВ смеси хлороформа и метанола (2:1) риного яйца и дважды подвергают очистразводят фосфатидилхолин (Sigma) до коке ультрацентрифугированием в градиеннечной концентрации 10 мг/мл. 28 мл этого те плотности сахарозы, как описано Skehel 35 раствора VI тщательно упаривают под ваи Schild, T971, (Virology, 44, 396-408). куумом в роторном испарителе, формируя Суспензия очищенного вириона грипна внутренней поверхности круглодоннои па II содержит 266 мкг вирусного гемаггколбы тонкий слой фосфолипидов, содерлютинина в 1 мл и в общей сложности жащий их в количестве 280 мг. 31,1 мкмоль фосфолипидов вируса грип- 40 К фосфолипидному слою в круглопа, определение которых производят, как доннои колбе добавляют раствор V. Посописано ниже. ле встряхивания колбы на протяжении по Вирусные фосфолипиды экстрагируют меньшей мере 15 мин и полного раствопо методу с соавторами (Folch I., Lees M., рения фосфатидилхолина, переносят обand Sloane S.G.H, J.Biol.Chem. 1957, 226, 45 разующийся раствор VII в стеклянный со497-509). Для анализа фосфолипидов нижсуд вместе с 4,8 г микроносителя в форнюю органическую фазу упаривают, а осме полистироловых гранул (РВМ) разметаток либо используют для определения ром 25-50 меш (во влажном состоянии). фосфата (Chen P.S., Toribara T.Y., and Сосуд встряхивают таким образом, Warner H. (1956), Anal. Chem. 1756-1758), 50 чтобы его содержимое перемещалось из либо разводят в небольшом объеме смеодного конца в другой со скоростью два си хлороформа и метанола для послераза в секунду. Спустя час суспензию дующего анализа с помощью тонкослойотсасывают через тонкую пипетку и переной хроматографии на фосфолипиды. Исносят в другой сосуд, содержащий 2,4 г пользуют пластинки из силикагеля (Мерк), 55 полистироловых гранул такого же размекоторые проявляют в системе хлороформра, которые служат микроносителями. Кометанол-уксусная кислота-вода (25:15:4:2, лонку встряхивают на протяжении 30 мин. объемное соотношение). Индивидуальные Процедуру повторяют дважды. По заверфосфолипиды выявляют обработкой йошении ее образовавшийся раствор VIII снидом и идентифицируют на основании знамают с гранул, помещают на водяную 19 26610 баню и подвергают ультразвуковой обработке с помощью аппарата Bransonic, Branson Europe BV (при частоте 50 кГц ± 10%). Продолжительность каждой обработки 10 с, ее повторяют дважды с интервалом 10 с. В результате получают среднего размера везикулы диаметром приблизительно 50-100 им. Конечный раствор IX разбавляют физиологическим раствором NaCI (X) в соотношении 1:100. П р и м е р 2. Препарат синтетических мембранных везикул, содержащий противовирусные антитела, адсорбированные на тримерах гемагглютинина вируса гриппа, и моноклональные антитела СД 4. Везикулы получают, как описано в примере 1, со следующими модификациями: вместо 10 мг фосфатидилхолина используют только 9 мг, в сочетании с 1 мг фосфатидилэтаноламина (кефалина) на 1 мл; указанные соединения разводят в смеси хлороформа с метанолом в соотношении 2:1. После получения гемагглютининовых везикул согласно процедуре, описанной в примере 1, к раствору добавляют 20 мг сульфосукцинимидил-1 -4(Ы-малеимидофенил)-бутирата (СМФБ) в 2 мл воды, который служит сшивающим агентом. Смесь выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре, слегка встряхивая ее, после чего подвергают ультрацентрифугированию при 100 000 х в течение 10 мин для осаждения везикул. К осадку добавляют 8 мл антилейцина ЗА (Becton and Dickinson). Ресуспендированный материал осторожно встряхивают в течение нескольких секунд каждые 5 мин на протяжении часа, при комнатной температуре. На последней стадии полученный материал снова осаждают ультрацентрифугированием при 100 000 х g в течение 10 мин (для удаления несвязанных антител). Осадок ресуспендируют в 1500 мл физиологического раствора NaCI. П р и м е р З . Повторяют процедуру, описанную в примере 2, со следующими модификациями. К раствору IV (см. пример 1) вместо декстран-сульфата добавляют по 1000 мг имидазол-карбоксамида и оксимочевины, которая по данным Вгиппег ти Nagel обладает фармацевтической активностью в отношении меланом (Springer Verlag, 2-е издание, Internistische Krebstherapie, 1979, C.93). После добавления сшивающего агента и продолжения процедуры в соответствии с описанием примера 2, к раствору 20 везикул (VEC) добавляют 1 мг моноклональных антител (либо Р 24, как описано Houghton A.N. et al. 1985, Vol.82, с. 1242, либо 0,5 мг L 55 + 0,5 мг L 72, как 5 описано Jric R.S. et. al., Lancet, 1989, с. 786-787). В результате получают композицию следующего состава, содержащую 1000 доз для введения людям, мг: Гемагглютинин 46 10 Фосфатидилхолин 250 Фосфатидилзтаноламин (кефалин) 30 Сшивающий агент (сульфо-SMPB) 20 15 Моноклональные антитела 1 Имидазол-карбоксамид 1000 Оксимочевина 1000 Поскольку указанные средства до сих пор использовались примерно в пятикрат20 ных количествах, приведенная пропись на самом деле обеспечивает получение лишь 200 доз. П р и м е р 4. Повторяют процедуру, описанную в примере 2, со следующими 25 модификациями. К раствору IV (см. пример 1) вместо декстран-сульфата добавляют по 1000 мг по крайней мере одного из нижеупомянутых соединений: адрипластина, эндокса30 на, фторурацила, (как описано Brunner и Nagel., Internistische Krebstherapie, Springer Verlag, 2-е издание, с.309, 1979) и колхицина (Sigma). После добавления сшивающего агеН35 та и продолжения процедуры в соответствии с описанием примера 2 к раствору везикул (VES) добавляют 1 мг моноклональных антител IDB1, как описано Strelkauskas, A.I., Cancer-lmmunol, 40 Immunother, vol. 28, c.31, 1986). В результате получают композицию следующего состава, содержащую 1000 доз фармацевтического средства для лечения больных с карциномой грудной железы, мг: 45 Гемагглютинин 46 Фосфатидилхолин 250 Фосфатидилэтаноламин 30 Сшивающий агента (сульфо-СМФБ) 20 Щг— Моноклональные антитела^ 1 Адрипластин 1000 Эндоксан 1000 Фторурацил 1000 П р и м е р 5. Повторяют процедуры, 55 описанные в примерах 1 и 2, со следующими модификациями. Вместо тримеров гемагглютинина вируса гриппа используют мономеры, содержащие слитый пептид. Мономер гемагглютинина-2, содержащий слитый пел 21 26610 тид, получают расщеплением S-H мостиков посредством химического восстановления Д4-дитиотректолом (ДЦТ, Sigma) с последующим отделением от пептида гемагглютинина-1 с помощью гелевой хро- 5 матографии на сафадексе д-50 при рН 6. Суспензия очищенного мономера гемагглютинина-2 содержит 180 мкг мономеров, в том числе слитый пептид. П р и м е р 6. Повторяют процедуру, 10 описанную в примере 2, со следующими модификациями. Вместо тримеров гемагглютинина вируса гриппа используют неочищенный слитый пептид. Слитый пептид вируса грип- 15 па, используемый при синтезе мембранных везикул, получают методом химического синтеза. Для этой цели пригодна любая из приведенных на фиг. 2 аминокислотных последовательностей. Для обес- -20 печения слияния концевой фрагмент соответствующей аминокислотной последовательности должен содержать по крайней мере один, предпочтительно три цистеиновых остатка. 25 Раствор с одним из таких синтетических слитых пептидов содержит его в концентрации 4 мкг/мл. Везикулы с одним из вышеуказанных слитых пептидов получают следующим об- 30 разом. Раствор 9 мг фосфатидилходина и 1 мг фосфатидилэтаноламина на 1 мл помещали в смесь хлороформа с метанолом в соотношении 2:1, 28 мл конечного 35 раствора осторожно упаривали в вакуумном роторном испарителе, получая таким образом тонкий слой фосфолипидов на внутренних стенках круглодонной колбы. 3 г декстран-сульфата разводили в 40 15,3 мл раствора детергента, содержащего 100 мкмолей монододецилового эфира октаэтиленгликоля в 1 мл объединенного буферного раствора. Конечный раствор переносили на фосфолипидный слой на 45 стенках круглодонной колбы, последнюю встряхивали на протяжении 15 мин и после полного растворения фосфолипидного слоя раствор переносили в стеклянный сосуд вместе с 4,8 г полистироловых гра- 50 нул, служивших микроносителем, размером 2 5 - 5 0 мин (во влажном состоянии). После этого сосуд встряхивали таким образом, чтобы его содержимое перемешалось из одного конца в другой с час- 55 тотой два раза в секунду. Спустя час суспензию отсасывали тонкой пипеткой и переносили в другой сосуд, содержащий 2,4 г полистироловых гранул вышеуказанного размера. Сосуд встряхивали в течение 22 30 мин. Процедуру повторяли дважды. По завершении ее образовавшийся раствор снимали с гранул, помещали на водяную баню и подвергали ультразвуковой обработке с помощью аппарата Bransonic (Branson Europe B.V.) при частоте 50 кГц ± 10%. Продолжительность каждой обработки составляла 10 с, ее повторяли дважды с интервалом 10 с. В результате получали среднего размера везикулы диаметром приблизительно 50-100 нм. К полученной таким образом суслен-' зии добавляли 2 мл воды, содержащей 20 мг сульфо-СМФБ (Pierce). Смесь выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре, спегка встряхивая, после чего подвергали ее ультрацентрифугированию при 100 000 х g в течение 15 мин для осаждения везикул. 2 мл раствора, содержащего синтетический слитый пептид, добавляли к материалу полученного осадка. Ресуспендированный осадок осторожно встряхивали каждые 5 мин (по нескольку секунд) на протяжении часа при комнатной температуре. На последней стадии суспензию снова центрифугировали при 100 000 х g в течение 10 мин для удаления несвязанного слитого пептида. Осадок ресуспендировали в 200 мл физиологического раствора NaCI. П р и м е р 7. Повторяли процедуру, описанную в примере 6, со следующими модификациями. 2 мл раствора, содержащего 2 мкг синтетического слитого пептида, и 2 мл содержащих 100 мкг антилейцина ЗА, добавляли к присутствовавшим в осадке везикулам. Ресуспендированный материал осторожно встряхивали в течение нескольких секунд каждые 5 мин на протяжении часа при комнатной температуре. Затем суспензию снова подвергали ультрацентрифугированию при 100 000 х g в течение 10 мин для удаления несвязанных слитых и специфичных для клеток пептидов. Полученный осадок снова ресуспендировали в 200 мл физиологического раствора NaCI. П р и м е р е . В соответствии с процедурами, описанными в примерах 1 4, получали везикулы, содержащие слитый пептид или гемагглютинин рабдовирусов, вирусов парагриппа или тогавирусов. а). Рабдовирус бешенства культивировали в человеческих диплоидных клетках. Полученный материал (над осадочную 23 26610 жидкость), содержащую 107 вирусных частиц в 1 мл, подвергали очистке и концентрировали посредством ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Суспензия очищенного вируса бешенства со- 5 держала 210 мкг вирусного гемагглютинина в 1 мл. Ее дальнейшую обработку проводили, как описано в примере 1. б). Вирус парагриппа типа III культивировали в аллактонсе куриного яйца и 10 дважды подвергали очистке посредством ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы, как описано в примере 1. Суспензия очищенного вириона парагриппа содержала 245 мкг гемагглю- 15 тинина вируса парагриппа в 1 мл. Ее дальнейшую обработку проводили, как описано в примере 1. в). Тогавирус краснухи культивировали в человеческих диплоидных клетках и 20 подвергали очистке, как описано в пункте а). Суспензия очищенного вириона краснухи содержала 205 мкг гемагглютинина в 1 мл. Ее дальнейшую обработку производили, как описано в примере 1. 25 П р и м е р 9. Антивирусные средства получали, как описано в примере 1. Мышам линии hu-PBL-SCID на протяжении 1.4 дней вводили димер рибонуклеазы, чередуя его введение с введением на про- 30 тяжении 10 дней только фосфатного буферного раствора (контроль). Вводили также декстран-сульфат или димер рибонуклеазы {полученные, как описано в примере 1 PCT/US 90/00141/ в трех разных 35 дозах, декстран-сульфат в липосомах или димер рибонуклеазы в липосомах. Два последние препарата получали, как описано в примере 1 настоящего изобретения. Введение указанных препаратов 40 производили одновременно с введением ВИЧ 100 ТСЮэд of HfX-1mb. Признаки вирусной инфекции (выделение вируса, определение (СПП) провирусных последовательностей) у мышей линии hu-PBL-SCID 45 проводили спустя 2, 4 и 6 недель после ее начала. Результаты исследования показывают, что в зависимости от характера вводившихся препаратов частота выделения возбудителя у мышей различных групп 50 составляла, %: после введения фосфатного буферного раствора (контроль) 80 после введения 55 димера рибонуклеазы в дозе 0,001 мг/кг 92 после введения димера рибонуклеазы в дозе 0,1 мг/кг , 30 24 при введении димера рибонуклеазы в дозе 1,0 мг/кг 63 после введения декстрансульфата в дозе 10 мг/кг 33 после введения декстрансульфата в дозе 10 мг/кг в липосомах 14 после введения димера рибонуклеазы в липосомах 25 Результаты исследования свидетельствуют о том, что инъекция каждые 12 ч димера рибонуклеазы в дозе 0,1 мг/кг веса тела, декстран-сульфата в дозе 10 мг/кг, липосом, содержащих димер рибонуклеазы, или липосом, содержащих декстран-сульфат, защищают мышей линии hu-PBL-SCID от инфекции вирусом гриппа. Защита была менее эффективной при использовании препарата димера рибонуклеазы в дозе 10 мг/кг, что может быть связано с подавлением иммунной реакции при высокой дозе димера. Его защитное действие в дозе 0,001 мг/кг отсутствовало. В то же время, введение димера рибонуклеазы в составе липосом согласно настоящему изобретению повышало эффективность его защитного действия с 63 до 25%, несмотря на высокую дозу. Ожидается, что подбор оптимальных дозировок этого соединения'позволит еще усилить фармакологическую активность липосомных препаратов. Этот вывод справедлив и для случая исключения из анализа мышей с неудовлетворительно функционирующими имплантатами человеческих ПЛ (PBI) в конце экспериментального периода, хотя из оценки уровня человеческих иммуноглобинов и СПП (PCR) р-глобина следует, что введение липосом, содержащих димер рибонуклеазы или декстран-сульфат, снижает вызываемость человеческих клеток. Исключение из анализа мышей линии hu-PBL-SCID на основании результатов оценки функциональной активности человеческих клеток позволяет дифференцировать непосредственное противовирусное действие липосомных препаратов от их иммуномодуляторной активности. П р и м е р 10. Везикулы, полученные, как описано в примере 1, сравнивали в тесте Llischer и Gluck (Antoviral Research, 1990, 14, 39-50) с рекомбинированными везикулами вируса гриппа, полученными по методу Kawasaki с соавторами. Оценивали характер их слияния с модельными мембранами. 25 26 26610 Фиг.3 иллюстрирует кинетику ингибирования затухания флюоресценции вируса гриппа А, меченного Р18, под воздействием липосом, содержащих ДОФХ/холестерин. Усиление флюоресценции выражали как степень подавления ее затухания в процентах, рассчитанную по методу Luscher & GLlick (см. выше). Начальную скорость слияния выражали через значения тангенсов кривых слияния в нулевой точке, соответствовавшей моменту инициирования этого процесса (пунктирная линия на фиг.З). Кривая 2 характеризует активность слияния везикул, полученных по методике Kawasaki с соавторами. ФИГ.1 26610 С, С С Ь V .G Л Ї \ Г I П N Г, W П і, ІО С С L Г І A G Г I C N G W E G M I Г Л I. Г I С Ч G W С G Ч I І I С N G IV С П Ч I Г > Г С ІА G С L Г СІЛ Ь Г Е ( L Г С L Ct«* G * У~ ' [С С С '-' Г С і0 |Г С С А С F Ч I D G W Y С D O С С U L С|А О D G I W Y G C C C G || А Т Л