Лазерно-доплерівський пристрій для оцінки токсичності та біологічної активності хімічних речовин

Лазерно-доплерівський пристрій для оцінки токсичності та біологічної активності ХІМІЧНИХ речовин з виконанням методу оптичного гомодинування, що містить джерела лазерного випромінювання і живлення, схему формування лазерного випромінювання, вимірювальну камеру, яка виготовлена з прозорого пластику, що має термостатичний кожух, з'єднаний з термостатом, фотоприймач з діафрагмою Обскура, попередній підсилювач, аналого-цифровий перетворювач, інтерфейс, електронну обчислювальну машину з блоком вводу-виводу, який відрізняється тим, що схема формування лазерного випромінювання складена з двопроменевої призми, яка розщеплює лазерне світло на два промені, і з діафрагми, яка встановлена з боку дна, а фотоприймач - з боку вільної поверхні вимірювальної камери, при цьому як вимірювальну камеру використовують пластиковий одноразовий планшет для культивування клітин, який з'єднаний з блоком керування положенням вимірювальної камери, яка обладнана дозатором біологічного тест-об'єкта і дозатором рідини, які з'єднані з культиватором біологічного тест-об'єкта і блоком підготовки і розбавлення рідини з ХІМІЧНИМИ добавками, два промені лазерного випромінювання перетинаються в центрі вимірювальної камери із заданим кутом, а опорний промінь формують від розсіяного світлового відблиску із зовнішнього боку дна вимірювальної камери, окрім того, до блока керування положенням вимірювальної камери приєднаний механізм приводу, а між джерелом лазерного випромінювання і схемою формування лазерного випромінювання встановлена система дзеркал, при цьому схема формування лазерного випромінювання і система дзеркал сполучені з блоком юстирування, інтерфейс виконаний як універсальний з допоміжними та іншими каналами зв'язку для інших вимірювальних систем контролю, електронна обчислювальна машина забезпечена спеціалізованим програмним забезпеченням, блок вводу-виводу обладнаний каналами обміну та зв'язку комплексу із стандартними комп'ютерними мережними системами, а термостат з'єднаний з електронною системою термостабілізацм Винахід відноситься до біологи, медицини та екологи, зокрема, до медико-бюлопчного приладобудування, до вимірювальних систем контролю якості води за узагальненими показниками токсичності, що оцінюються методами бютестування, саме до пристроїв для вимірювання внутрішніх енерговитрат рухомих мікробіологічних об'єктів на їх рух у в'язкому середовищі, і може бути використаний в системах бюмоніторингу, екотоксикологп і бютестування для оцінки токсичності природних і стічних вод, скринінгу біологічної активності пре система [1], що складається з лазерного джерела світла, блока віброметра, оптичної лави, блока розчеплення лазерного променя світла, приймача світла, аналізатора сигналів і блока виводу інформації Діапазон вимірювань швидкості руху об'єкту від 10 6м/с до 3 м/с Цей пристрій маємо розглядати як вимірювальну систему бютестування, до складу якої входять біологічний рухливий тест-об'єкт, що розміщується у вимірювальній камері, яка обладнана вторинними датчиками (приймача лазерного світла) реєстрації функціональних показників ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ - рухливості тест-об'єкта, виходи цих дат паратів і ХІМІЧНИХ речовин Відома лазерно-допплерівська віброметрична О 00 ю 45481 чиків з єднано з підсилювачем і перетворювачем електричних сигналів Останні, в свою чергу, з'єднано з блоком відображення інформації, яка далі передається користувачу Функціонально вони сполучені таким чином, щоб забезпечити дослід після дозованого запровадження зразка водяного середовища у вимірювальну камеру, до якої подається з культиватора біологічний тест-об'єкт, і де здійснюється інкубація його з водою, що досліджується, певний інтервал часу Після завершення інкубації роблять послідовний вимір показника руху біологічного тест-об'єкта для оцінки його стану у вимірювальній камері, а потім тим же вимірювачем оцінюється стан біологічного тест-об'єкта в камері контролю Про ефект токсичності досліджуваного водяного середовища судять по ЗМІНІ величини відношення виміряного показника руху в ДОСЛІДІ та контролі При перевищенні відгуку реакції біологічного тест-об'єкта деякого порогу, що встановлюється в попередніх дослідах, з одержанням калібрувальних графіків відгуку для конкретного біологічного тест-об'єкта досліджуваної хімічної речовини, з'являється можливість зробити оцінку ТОКСИЧНОСТІ Недоліком такої системи є те, що за й допомогою неможливо контролювати число нерухомих клітин, а також вимірювати величину внутрішніх енерговитрат на рух клітин в популяції, неможливо провести оцінку параметричної чутливості біологічного тест-об'єкта в реальному масштабі часу, що знижує відтворюємість одержуваних результатів оцінки його функціонального показника руху, трудоємкість проведення аналізів і низька точність оцінки токсичності, що пов'язано з необхідністю одержання калібрувальних графіків для конкретних ХІМІЧНИХ речовин і стічних вод, що найчастіше мають невизначений склад, значна динамічна помилка, яка пов'язана з ефектами метаболізму і наявністю добових бюритмів параметрів руху - ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ біологічних тест-об'єктів У цьому зв'язку відомий пристрій - лазернодопплерівський анемометр [2], в якому використовується така оптика лазерна головка, оптична лава, розподільник променя, лінзи, фільтр, фотодетектор При цьому два промені, один із яких використовується як опорний, спрямовані в місце з об'єктами, що рухаються Місце перетинання променів формує обсяг зони розсіювання (виміру) Швидкість потоку або часток визначається по розрахунковій формулі Сигнал від ФЕП посилюється за допомогою підсилювача і формується у вигляді числового коду й опрацьовується в процесорі допплерівського сигналу, вихід якого сполучений із цифровим вольтметром Діапазон , що вимірюється, швидкості потоку Змм/с 300м/с За лазерну головку використовується гелій-неоновий лазер потужністю 5мВт із когерентною довжиною променя не менше 20см і низьким фактором шуму Точність виміру 1% повного відхилення використаного діапазону вимірів Діапазони допплерівської частоти 2,25 15кГц, 8 50кГц, 22,5 150кГц, 8 500кГц, 0,225 1,5МГц, 0,8 5МГц, 2,25 15МГц Цей пристрій також можливо використати для дослідження токсичності та біологічної активності ХІМІЧНИХ речовин при бютестуванні, однак треба вказати на таке До хиб даного пристрою варто віднести високі вимоги до метрологічних характеристик лазерної головки, зокрема, до когерентності, стабільності, інтенсивності і шумів генерації випромінювання, складність юстировки оптичного тракту, бо для гетеродинування сигналу потрібна висока точність і спеціальна стабільність опорного променя лазерного світла, неможливість одержання інформації про всі параметри руху клітин (швидкості, числа клітин, що рухаються, енерговитрат на їх рух), тому що в даному випадку вимірюється тільки середня швидкість руху часток, неможливість виміру мікрооб'єктів, що повільно рухаються Відзначаємо, що рухливі рослинні клітини, найпростіші, спермії тварин і людини мають характерні швидкості руху в діапазоні 1 10мкм/с З огляду на те, що вимоги до точності виміру швидкостей і рухливості таких об'єктів, що у біологічних дослідженнях складають порядку ± 1мкм/с, то очевидно, що використання в задачах, бютестування лазерного анемометра типу 55L у цьому випадку неможливе Найбільше близьким до пристрою, що заявляється, є пристрій для вимірювання в реальному масштабі параметрів руху рухомих клітин [3], який містить в собі такі основні вузли і блоки Промінь лазерного світла від джерела, який з'єднано з блоком живлення, формується оптичною схемою (діафрагмою і лінзою) і фокусується у центрі вимірювальної камери з суспензією клітин, що досліджуються Джерело світла, вимірювальна камера і фотоприймач встановлені на оптичній лаві За джерело світла може бути використано гелій-неоновий або інший лазер , потужність випромінювання якого не повинна викликати зміни стану біологічного об'єкти, що досліджується, за термін виміру Розсіяне світло і опорний промінь детектуються фотоприймачем, якого встановлено під кутом до осі променя лазерного світла Фотоприймач має джерело живлення, а вихід його з'єднано зі входом попереднього підсилювача, який з'єднано з одним входом корелятора, другий вхід якого з'єднано з таймером Вихід корелятора з'єднано з мікро-ЕОМ При цьому керування роботою корелятора здійснюється комп'ютером по спеціальному каналу Одержані результати виводяться на друк Когерентний опорний промінь на лазерній частоті створюється незміщеним світлом бліці в від передньої стінки вимірювальної камери Бліки формуються рисками, що їх нанесено на передню стінку камери Режим оптичного гетеродинування реалізований шляхом змішування на фотокатоді фотоприймача розсіяного світла від об'єкту, що рухається, і опорного променя Це дозволяє отримати кореляційну функцію з аналізу флуктуацій фотоструму числовим методом Цифрові дані про форму кореляційної функції надходять в мікро-ЕОМ і обробляються за методом найменших квадратів з одержанням даних про 45481 формованого штрихами на передній СТІНЦІ камери середню швидкість руху клітин в популяції і про Відстань між штрихами не більша діаметра провідносну КІЛЬКІСТЬ рухомих клітин Обчислення меню світла, що подається на камеру, зокрема величини питомих енерговитрат популяції на рух дорівнює 200мкм, при цьому сітку завдають вертиклітин здійснюють за формулою кально вздовж осі симетрії камери Для форму-2 вання зображення використаний принцип камери Е= v-p-G(O) Обскури за допомогою діафрагми У цьому випадВимірювальна камера має термостатичний ку забезпечується максимальна глибина різкості кожух При цьому, в кожусі є вікна для введення при мінімальних вимогах до точності постановки променя лазерного світла і виводу розсіяного світоптичної частини спектрометра, положенню кювела і світла від бліків, а також вікно для оптичної ти зі зразком і катода ФЕП пастки Термостатичний кожух має зв'язок з термостатом Детекторна частина допплерівського кореляційного спектрометра встановлена на поворотноШтрихи на передній СТІНЦІ вимірювальної каму плечі гоніометра Г-5, а термостатичного кожуха мери наносять у вигляді сітки, а перед фотоприйз кюветою для зразка - у центрі нерухомого столимачем встановлена діафрагма, що представляє ка гоніометра На іншому плечі гоніометра зібрана собою камеру Обскура формуюча промінь світла частина і джерело світКут установки фотоприймача вибирають у мела Монтаж здійснений на мікрометричних столижах від 0 до 45° у залежності від розмірів досліках, що мають горизонтальну і вертикальну ступені джуваних рухливих клітин свободи Точність установки кута розсіювання Конкретна технічна реалізація пристрою ±0,5 Обмеження на світлозахист від зовнішнього Пристрій лазерно-допплерівський на базі стазасвічування, ЗОВНІШНІХ ВПЛИВІВ типу "хитавиця" ндартних приладів може бути здійснений в такий мінімальні, що забезпечує широке використання спосіб За джерело монохроматичного когерентноданого пристрою в польових умовах го випромінювання узятий гелій-неоновий лазер ЛГН-105 із довжиною хвилі 632,8нм і потужністю Електронна частина пристрою 2,0мВт Пучок лазерного світла формується оптиУ якості попереднього підсилювача викорисчною схемою, що складається з лінз із фокусною товується низькочастотний вимірювальний підсивідстанню 100мм і діафрагми з діаметром, d = лювач У4-28 із смугою пропускання частот від 2 до 0,5мм, що об'єднані в одному корпусі Діаметр сві100000 Гц Коефіцієнт підсилення установлюється тлового променя, сфокусованого в центрі вимірювід 10 до ЮОдб східчасте через Юдб Вхідний опір вальної камери складає біля 120мкм Камера явприладу - 1МОм, вхідна ємність на частоті 200кГц ляє собою кювету з оптичною довжиною 1мм і не більш 40пф Посилений сигнал надходить на МІСТКІСТЮ 0,8мл Така конфігурація кювети обрана вхід 100-канального цифрового корелятора Х6-4, для можливості роботи з достатньо великими (до що працює в реальному масштабі часу при термі10млн кл/мл ) концентраціями клітин у суспензії нах затримки від ЮОмкс до 1с, що дозволяє допри відсутності ефекту перерозсіювання Малий сліджувати кореляційні характеристики сигналів у обсяг камери дозволяє проводити дослідження з діапазоні частот 0,5 25000Гц 3 огляду на те, що мінімальною КІЛЬКІСТЮ клітинної суспензії частотний діапазон допплерівського зсуву на рух(200 ЗООмкл) Кювета зі зразком має термостатиливих клітинах достатньо перекриває діапазон чний кожух, що виготовлений з почорненої МІДІ і одержуваних у дослідах частот, ця вимірювальна має вікно для оптичної пастки Для підтримки засхема дозволяє в широкому діапазоні вимірювати даної температури використаний рідинний ультрашвидкості від 0 до 500мкм/с Час виміру для побутермостат, в якому тепловим носієм є воднодови кореляційної функції вибирається ВІДПОВІДНО гліцеринова суміш Останнє обумовлено більшою до умови конкретного експерименту і може змінюв порівнянні з дистильованою водою в'язкістю, ЩО ватися від 27 до 217 у , де f - термін затримки кодозволяє уникнути вібрації зразка під час проверелятора дення виміру Температуру в кюветній камері моЦифрова інформація про форму кореляційної жна підтримувати в діапазоні від 0 до 60° С із точфункції з тактовою частотою ЮкГц подається ченістю не нижче ± 0,1 °С рез порт мікро-ЕОМ, за якої використано "Електроніку МСО401", в оперативну пам'ять На інфорРозсіяне на клітинах, що рухаються, світло ремаційному виході корелятора є три типи сигналів єструється за допомогою фотоелектронного при"строб" початок функції, сигнал типу "меандр", що множувача ФЭУ-79 Область спектральної чутлисупроводжує видачу інформації і 8-розрядний цивості ФЕП 300 830нм Рівномірний дільник фровий сигнал про значення кореляційної функції напруги і ФЕП розміщені у світлонепроникному в конкретному каналі Тому для зчитування інфоркожусі, за який використана фотометрична насадмації з корелятора задіяно два вхідних порти Река до люмінесцентного мікроскопа ФМЭЛ-А зі зняально ЕОМ здійснює також і керування роботою тою лінзою, що розсіює У кожусі є барабан ревокорелятора, для чого на роз'їм "дистанційне керульверного типу з вмонтованими діафрагмами 0 1, вання" через вхідної порт подаються сигнали "ски0 5, 1 5мм, що служать для побудови зображення дання", "обнуління ЛІЧИЛЬНИКІВ" І "пуск", що запусна фотокатоді кає набір кореляційної функції Напруга живлення на ФЕП подається від високовольтного, стабілізованого випрямляча типу ТВ2 Нестабільність вихідної напруги в діапазоні 50 1500В не нижче 0 2% На ФЕП подається напруга негативної полярності, анод заземлений Опорний промінь одержують від відблиску, До хиб даного пристрою - прототипу маємо віднести недостатня компактність і деяка складність обслуговування вимірювального комплексу ускладнює реалізацію переносного, а тим більше порта 45481 8 лює лазерне світло на два променя, і діафрагми, тивного, варіантів пристроїв для оцінки токсичності які встановлені з боку дна, а фотоприймач - з боку та біологічної активності ХІМІЧНИХ речовин, вільної поверхні вимірювальної камери, при цьому для пристрою характерні більші динамічні поза вимірювальну камеру використовується пластигрішності виміру внутрішніх енерговитрат мікроорковий одноразовий планшет для культивування ганізмів й сперматозоїдів на їхній рух, що зв'язане клітин, з'єднаний з блоком керування положенням з тривалістю проведення аналізів і оцінювання вимірювальної камери, що облаштована дозатопараметрів руху (від 4-х до 15 хвилин), ром біологічного тест-об'єкту і дозатором рідини, алгоритм обробки сигналів базується на побуякі з'єднані з культиватором біологічного тестдові кореляційної функції фотоструму і підгонки об'єкту і блоком підготовки і розбавлення рідини з експериментальних даних під теоретичну функцію, ХІМІЧНИМИ добавками, при чому два промені лазещо /тягне за собою відповідну систематичну помирного випромінювання перетинаються в центрі лку кінцевого результату зі збільшенням її привимірювальної камери під заданим кутом, а опорнаймні в 3 5 раз, ний промінь формується від розсіяного світового у ВІДОМІЙ вимірювальній системі бютестування відблиску із зовнішнього боку дна вимірювальної неможливо організувати синхронний контроль фукамери, окрім того, блок керування положенням нкціонального стану біологічного тест-об'єкта в вимірювальної камери має механізм приводу, а контролі і у ДОСЛІДІ з метою одержання відносного між джерелом лазерного випромінювання і схемою розміру параметру реакції біологічного тестформування лазерного випромінювання встановоб'єкта на токсичний вплив лено систему дзеркал, при цьому схему формувелика тривалість проведення досліджень, вання лазерного випромінювання і систему дзертому що при ОЦІНЦІ функціонального стану біологікал пов'язано з блоком юстировки, інтерфейс чного тест-об'єкта необхідне використання калібвиконано як універсальний з допоміжними та інрувальних графіків шими каналами зв'язку для інших вимірювальних існує значна динамічна помилка в ОЦІНЦІ функсистем контролю, а електронна обчислювальна ціонального стану біологічного тест-об'єкта в умомашина має спеціалізоване програмне забезпевах дії ВІДПОВІДНИХ чинників, тому що не враховучення, і блок вводу - виводу має канали обміну та ється показник параметричної чутливості і ефект, зв'язку комплексу із стандартними комп'ютерними пов'язаний зі схованими і явними бюритмами, що мережами системами, крім того термостат з'єднавизначають його ЖИТТЄДІЯЛЬНІСТЬ у реальному мано з електронною системою термостабілізацм сштабі часу складність реалізації високоточної вимірюваТе, що в запропонованому винаході викорисльної системи з результатами, що відтворюються, тані вищевказані ознаки, дозволяє досягти вирітому що технічні засоби, що входять до складу шення поставлених задач - підвищення точності відомої вимірювальної лазерно-допплерівської вимірювання внутрішніх енерговитрат мікроорганісистеми бютестування, повинні володіти «жорстзмів й сперматозоїдів (за рахунок зниження динакими» метрологічними характеристиками В осномічної помилки і скорочення терміну вимірювання ву винаходу поставлена задача удосконалити при збереженні статистичної вибірки), тому що пристрій розглянутий пристрій має оригінальну схему побудови оптичної частини пристрою, а процесор реаіз забезпеченням підвищення точності виміру лізований для виконання запропонованого унікавнутрішніх енерговитрат мікроорганізмів й спермального алгоритму обробки сигналу фотоприймача тозоїдів (за рахунок зниження динамічної помилки Алгоритм роботи процесора побудований на просі скорочення часу виміру при зберіганні статистичтих операторах, що забезпечує можливість ствоної вибірки), рення портативних аналізаторів якості водяного зниження динамічних помилок і підвищення середовища відтворюємості аналізу в короткострокових дослідженнях бютестування з використанням диференте, що у вимірювальному комплексі викорисціального й алгоритмічного методів підвищення тано диференціального й алгоритмічного методів точності вимірів функціонального стану рухливих підвищення точності вимірів характеристик біолобіологічних тест-об'єктів в реальному масштабі гічних тест-об'єктів забезпечує реалізацію експресчасу без використання калібрувальних графіків контролю токсичності водяного середовища методами бютестування Поставлена задача може буПоставлена задача вирішується за рахунок тоти вирішена і технічно реалізована, го, що лазерно-допплерівський пристрій для оцінки токсичності та біологічної активності ХІМІЧНИХ рекрім того, розглянутий лазерно-допплерівський човин з виконанням методу оптичного гомодинупристрій для оцінки токсичності та біологічної аквання, що містить джерела лазерного випромінютивності ХІМІЧНИХ речовин можливо реалізувати з вання і живлення, схему формування лазерного використанням як аналогового, так і цифрового випромінювання, вимірювальну камеру, яка вигопринципу обробки електричних сигналів, тобто, товлена з прозорого пластику, що також має тердля нього характерні простота, технологічність і мостаті чий кожух, з'єднаний з термостатом, фотогнучкість побудови приймач з діафрагмою Обскура, попередній З огляду на принципову важливість даної підсилювач, аналого-цифровий перетворювач, ознаки і неочевидність вищевказаного твердженінтерфейс, електронну обчислювальну машину з ня, а також використання алгоритму вимірів харакблоком вводу-виводу теристик біологічних тест-об'єктів, що забезпечує реалізацію єкс-прес-контролю токсичності водяноВ якому при цьому, ВІДПОВІДНО до винаходу, го середовища методами бютестування, роздивисхема формування лазерного випромінювання мося більш докладно обгрунтування даної ознаки складається з двопроменевої призми, яка розщеп 45481 10 Суть запропонованого винаходу і методологікореляційної функції розсіяного світла відбуваєтьчний аспект ся протягом 0 82 с Вибір величини статистики вибірок, які опрацьовуються, при побудові кореляВеличиною, що безпосередньо вимірюється в ційній функції визначається характеристиками докореляційному експерименті є не сам спектр розсліджуваного процесу, при цьому мінімальна КІЛЬсіяного досліджуваною системою світла, а спектр КІСТЬ вибірок обмежується власними шумами (або кореляційна функція) флуктуацій фотоструму біологічних систем на виході приладу, що фотореєструє Цей спектр являє собою результат биття гармонік електромаТермін між двома послідовними вимірами загнітних полів між собою і зосереджений у низькодається КІЛЬКІСТЮ "порожніх" циклів у програмі "Кечастотній області, тобто там, де можливо проворування" плюс час, що витрачається на передачу дити аналіз сучасними радіотехнічними засобами даних по каналах обміну Шпаруватість скануванВже на цьому рівні, як то на рівні класифікації гарня може змінюватися в межах від Юмс до терміну монік електромагнітних полів, що реєструються часу, що обумовлюється лише параметрами дофотодетектором, виникають два варіанти вимірів сліджуваного процесу Слід зазначити, що термін обміну хоча й обмежує шпаруватість між виміраа) на фотодетектор потрапляє лише світло, ми , але не впливає на точність проведеного анащо розсіяне досліджуваною системою У цьому лізу Завдяки застосуванню цифрового корелятора варіанті реалізується гомогенний метод виміру, досягається 100%-ва ефективність використання б) разом із розсіяним на фотодетектор потрафотоструму під час побудови кореляційної функпляє і частина не розсіяного (опорного) випроміції нювання Цей варіант одержав назву гетеродинування Після набору масиву кореляційної функції провадять відновлення інформації про параметри На основі аналізу відомих літературних даних руху клітин у популяції можна зробити загальні висновки з цього питання 1 Ідеальне в теоретичному плані гетеродинуДля суспензії, що складає з рухливих і нерування дозволяє за інших рівних умов і однаковому хомих клітин, кореляційна функція складається з часі аналізу одержати в два рази більшу статистишвидко- і компонентів, що повільно спадають, [4], чну точність, ніж ідеальне гомодинування типовий вид якої, отриманий у наших експериментах, поданий на фіг 1 2 Математична обробка результатів вимірів при гетеродинування простіше, оскільки вона звиУ загальному вигляді кореляційну функцію для чайно полягає в розкладанні спектра або корелятакої системи можна уявити як ційної функції на адитивні внески різноманітного Gi(x) = pG mot (x) + (1-p)G im (x) з походження Ця процедура полегшується, якщо Де вимірюється сама кореляційна функція, а не и квадрат Те ж можна сказати і для спектрального ^motW . швидкоспадаюча компонента від руаналізу, коли вимірюється сам спектр, а не його хливих клітин, автозгортка Р - частина рухливих клітин (активність), 3 Технічна реалізація гомодинування істотно простіше відпадає необхідність ретельної юстиЦт(.х.) . спадаюча повільно складова від неровки і віброзахисту оптичної частини установки рухомих КЛІТИН 4 У гомогенному режимі легше використовуУ принципі КЛІТИНИ з нульовою ШВИДКІСТЮ не вати техніку рахування фотонів із усіма перевагадають допплерівського зсуву частоти і не можуть ми, що випливають із цілком цифрової обробки бути детектовані, але в умовах реального експесигналу рименту вони завжди підпадають під вплив рухлиОтже, гетеродинування в два рази точніше, вих сусідів і тому мають деяку швидкість, що і дає проте гомодинування набагато простіше в експевнесок у сумарну кореляційну функцію При термірименті нах затримки ЮОмкс повільноспадаюча компонеРозглянемо програмне забезпечення обробки нта від малорухомих клітин добре описується конелектричного сигналу фотоприймача в лазерностантою, оскільки чисельні оцінки, приведені у допплерівському спектрометрі, ВІДПОВІДНО до провищевказаній роботі, дають ВІДМІННІСТЬ ВІД констатотипу [3] нти менше 1 % Алгоритм підпрограми "Керування" для одерЧастина, що повільно спадає, має вигляд Ложання інформації про рух клітин по флуктуаціям ренцевої кривої, напів-ширина котрої обернено розсіяного світла представляється в такій ПОСЛІДОпропорційна векторові розсіювання і середній ВНОСТІ операцій швидкості руху клітин Одинична кореляційна функція займає в па1 G м'яті Мікро-ЕОМ 100 байтів Обмін інформацією mot(x) = ^ між корелятором і комп'ютером організований на 1 + 1 qvx тактовій частоті ЮкГц Обсяг оперативного пристрою, що запам'ятовує, дозволяє записати 16 Кбайт інформації, що відповідає 160 послідовним Де вимірам, що може бути перенесена на гнучкі магq - модуль вектора розсіювання, нітні носи v Термін побудови одиничної кореляційної фун- середня швидкість руху клітин, т кції визначається часом затримки між двома по- експериментальний термін затримки слідовними вибірками і КІЛЬКІСТЮ цих вибірок При Отримані експериментальні результати підгастатистиці 2 1 3 сигналів і f, рівнім ЮОмкс, побудова няються під теоретичну форму автокореляційної 11 45481 функції розсіяного світла за методом найменших костях їхнього руху квадратів шляхом варіювання v і Р У результаті цього відокремлюється інформація про середню швидкість руху клітин і відносної КІЛЬКОСТІ рухливих клітин у данний момент часу Розмір внутрішніх енерговитрат на рух клітин у популяції обчисляють за формулою Е= v-p-G)0) i 5 Таким чином, в розглянутому пристрої - прототипі реалізована автоматизація знімання й опрацювання інформації про швидкість, рухливості й енерговитратах на рух клітин у популяції з вилученням суб'єктивізму оцінки Реальний час знімання й опрацювання інформації складається в межах 0,5 1 хвилин При дослідженні руху мікроорганізмів й сперматозоїдів у задачах бютестування і ОЦІНЦІ ТОКСИЧНОСТІ та якості сперми важливою характеристикою процесу є показник відносних внутрішніх енерговитрат клітини (а також усієї популяції) на переміщення в в'язкому середовищі Як було показано нами раніше, цей показник пропорційний квадрату середньої миттєвої швидкості, помноженому на коефіцієнт, що пов'язаний із властивостями середовища і формою клітини Для одержання значень середньої швидкості руху міководоростей, сперматозоїдів та ш звичайно застосовуються кінематографічний або фотографічний методи, а останнім часом - метод лазерної спектроскопії Засіб виміру швидкості руху шляхом побудови спектра розсіяного лазерного випромінювання має високу точність і об'єктивність, але достатньо працезатратний у плані опрацювання експериментальної інформації Проте, як буде показано нижче, існують можливості безпосереднього виділення інформації про внутрішні енерговитрати клітини і популяції в цілому на рух за величиною фотоструму детектора розсіяного лазерного випромінювання, що має допплерівський зсув по частоті При цьому відпадає необхідність побудови автокореляційної функції і и подальшого цифрового опрацювання методом підгонки експериментальних даних до теоретичної функції, що істотно впливає на систематичну помилку вимірів Запишемо вираз для кореляційної функції фотоструму (кореляційної функції амплітуди розсіяного лазерного світла, що у випадку гетеродинної схеми виміру збігається з кореляційною функцією фотоструму) [4] у вигляді G(x) = J Можна показати, що при і т G(x)= J q= 4TI X sin smqvx -p(v)dv = 1 qvx ТОЧЦІ 6 х = 0 Дійсно, G'(x)T q2 7 тому 2 -2 7 q v p(v)d v = - — 7 тобто, друга похідна кореляційної функції пропорційна квадрату миттєвої швидкості руху сперматозоїдів Якщо ж використовувати ненормуєму кореляційну функцію, що дорівнює [4] = Gнорм (x)-G(0) 'ненорм G(0)= \ / при цьому \ / - пропорційно, як показано в наших експериментах, КІЛЬКОСТІ сперматозоїдів або рухливих мікроорганізмів у зоні розсіювання лазерного випромінювання Таким чином, де Е - потужність внутрішніх енерговитрат z сперматозоїдів, що пропорційна E~v -N і відби ває енерговитрати мікроорганізмів на подолання сил в'язкого тертя середовища Зв'яжемо тепер G"(T) із фотострумом детектора розсіяного лазерного випромінювання 9 + т 9 + x)dt G(x)= hm тТ де l(t) - інтенсивність фотоструму У цьому випадку маємо 9 + т G"(x)= hm - Jl(t)-I"(t+x)dt Інтегруючи цей вираз вроздріб, одержимо п 'ненорм О (х)= h m | Т +Т Jl'(t)-I' І -Т 12 З огляду нате, що перший доданок тут прямує до нуля, одержуємо вираз smqvTf '(v)dv qvx модуль © х тому що smqvx qvx п р и Х ^ 0 Ось чому для визначення квадрата швидкості потрібно взяти другу похідну від ^ ( т ) за часом у Де q 12 вектора розсіювання ,© - кут розсіювання лазерного світла сперматозоїдами, ^ - довжина хвилі падаючого лазерного випромінювання), т -термін затримки при побудові кореляційної функції, P(v) - розподіл клітин сперматозоїдів по швид 'ненорм 2 .0 Т 13 Ч ''ненорм Таким чином, огляду на формулу (7) маємо »0 ) 2 \~Е / ,14 Отже, пов'язане з природою реєстрації фотоприймачем лазерного випромінювання середнє значення квадрата похідною фотоструму детекто 13 45481 14 pa розсіяного лазерного випромінювання пропорчерез аналогово-цифровий перетворювач із часційне внутрішнім енерговитратам мікроорганізмів, тотою знімання, наприклад 5кГц, заносяться в ОЗУ зокрема сперматозоїдів, на рух у в'язкому середокомп'ютера Для реалізації описаного вище алговищі Коефіцієнт пропорційності у формулі (14) ритму достатньо було б проводити виміри фотоствизначити не важко руму з частотою 1 кГц, щоб одержати інформацію в дискретному виді Але завдяки підвищеній частоті З огляду на, що для кореляційної функції невдасться одержати середнє арифметичне високоточечних об'єктів, що рухаються .маємо відомий частотних шумів фотодетектора Для цього застовираз [5] совується засіб цифрової фільтрації за методом 1 ковзного середнього, тобто у обчислювальному 2 1 + (2,75q-27i) алгоритмі використовується сигнал, автоматично 1 5 усереднений по п'ятьох точках У цьому випадку Одержуємо заключна формула одержання похідною фотост2 2 2 g"(x)^ o =-2-(2,75q-27i) v руму має вигляд 16 або 2 j=k+5 2 v 9 ненорм = -2-(2,75q-27i)^-N 1 у тому що під енерговитратами ми розуміємо E = vz-N тобто = -2-(2,75q-27i)2E 18 Звідси остаточно отримуємо E= 1 2-(2,75q-27i)' f _ dl dt u І j=k-1 2 І." 2 ] і At ! 1 9 Вираз енерговитрат у вигляді (19) уже збігається з тим виразом, що досліджувався нами раніше Практичну реалізацію розглянутого алгоритму виміру енерговитрат на рух мікроорганізмів у в'язкому середовищі з використанням лазернодопплерівського спектрометра можна здійснити на персональному комп'ютері будь-якого класу Для цього сигнал фотодетектора розсіяного на мікрооб'єкті , що рухається, лазерного випромінювання j=k j=k-6 5-10"J ,20 Таким чином, вимірювальний комплекс (лазерно-допплерівський пристрій для оцінки токсичності та біологічної активності ХІМІЧНИХ речовин), з аналізованим алгоритмом опрацювання сигналів детектора фотоприймача методом гетеродинування, має достатньо високу точність виміру (що природно) параметрів внутрішніх енерговитрат на рух мікроорганізмів й сперматозоїдів, швидкодію, експлуатаційну гнучкість, простоту технічного виконання (аналоговий або цифровий варіанти), тому що в оптичній схемі використаний принцип одержання биття електромагнітного випромінювання в оптичному діапазоні, що припускає вимір флуктуації фотоструму, а процесор практично і технічно реалізований винятково простими операторами послідовної дії, якто Таблиця 1 Структура процесора № оператора 1 2 3 4 5 Функція оператора Фільтрація сигналу Усереднення в мікротерміновому діапазоні Диференцювання середнього сигналу фотоструму Зведення в квадрат Інтегрування за час проведення експерименту На фіг 1 подані порівняння дослідної кореляційної функції (1) раз-сіяного сперміями світла G(T ) і підгінної функції (2) при [ = 0,825 і V = 3 162 9мкм/с, на фіг 2 подана структурна схема лазерно-доплерівського пристрою для оцінки токсичності та біологічної активності ХІМІЧНИХ речовин з застосуванням методу оптичного гомодинування, на фіг 3 наведена функціональна схема електронної системи термо-стабілізацм в зоні вимірювання, на фіг 4 наведена функціональна схема роботи лазерно-доплерівського пристрою для оцінки токсичності та біологічної активності ХІМІЧНИХ речовин, на фіг 5 подана загальна схема технології контролю і оцінки токсичності та біологічної активності ХІМІЧНИХ речовин, на фіг 6 блок-схема алгоритму токсикологічного аналізу методом лазерно Технічна реалізація Широкополосний фільтр RC - ланцюг Диференціальний підсилювач Квадратичний підсилювач Суматор або ж RC - ланцюг доплерівської спектроскопії і оцінки токсичності стічних вод і ХІМІЧНИХ речовин, що розчинені у воді Приклад реалізації запропонованого винаходу На фіг 2 представлена структурна схема лазерно-допплерівського пристрою для оцінки токсичності та біологічної активності ХІМІЧНИХ речовин з виконанням методу оптичного гомодинування, що містить джерела лазерного випромінювання 1 і живлення 2, схему формування лазерного випромінювання 3, вимірювальну камеру 4, яка виготовлена з прозорого пластика, що також має термостатичний кожух 5, з'єднаний з термостатом 6, фотоприймач 7 з діафрагмою Обскура 8, попередній підсилювач 9, аналого-цифровий перетворювач 10, інтерфейс 11, електронну обчислювальну машину 12 з блоком вводу-виводу 13 15 45481 16 В пристрм, який розглядається, згідно з винаДовжина хвилі 632,8нм ходом, схема формування лазерного випромінюПотужність 2 5мВт вання 3 складається з двопроменевої призми 14, Когерентність 20 50см яка розщеплює лазерне світло на два променя, і Товщина пучка променя 1 2мм діафрагми 15, які встановлені з боку дна, а фотоСтабільність (вихід на приймач 7 - з боку вільної поверхні вимірювальної стабільний режим) 1 2% камери 4 При цьому за вимірювальну камеру 4 живлення 2 лазера (наприклад, блок живлення використовується пластиковий одноразовий лазеру 3 976121), що забезпечує живлення лазера планшет для культивування клітин, з'єднаний з високовольтним струмом Основні параметри виблоком керування положенням 16 вимірювальної значаються технічними характеристиками викорикамери 4, що облаштована дозатором біологічного стовуємого лазера і повинні забезпечувати гарантест-об'єкта 17 і дозатором рідини 18, які з'єднані з товану стабільність та мінімальні шумові культиватором біологічного тест-об'єкта і блоком характеристики в діапазоні досліджуємих частот підготовки і розбавлення рідини з ХІМІЧНИМИ доба0 ЮОкГц вками 20 При чому два промені лазерного випросхему формування лазерного випромінювання мінювання перетинаються в центрі вимірювальної З, що забезпечує одержання двох променів, що камери 4 під заданим кутом, а опорний промінь перетинаються в точці простору на відстані формується від розсіяного світового відблиску із 10 20см від поверхні оптичного блоку при мінімазовнішнього боку дна вимірювальної камери 4 льному куті розходження пучка променів (не більОкрім того, блок керування положенням 16 виміше як 1°) рювальної камери 4 має механізм приводу 21, а Два промені лазерного випромінювання переміж джерелом лазерного випромінювання 1 і схетинаються в центрі вимірювальної камери 4 із замою формування лазерного випромінювання З даним кутом який визначається з урахуванням встановлено систему дзеркал 22 При цьому схему розмірів рухомих біологічних тест-об'єктів і завдаформування лазерного випромінювання 3 і систеється у межах 10 22°, му дзеркал 22 пов'язано з блоком юстировки 23 вимірювальну камеру 4, що забезпечує проведення досліду рухомих мікробіологічних об'єктів Інтерфейс 11 виконано як універсальний з дозасобом лазерного сканування, і виготовлена з поміжними та іншими каналами зв'язку для інших прозорого пластику Оптична довжина камери вимірювальних систем контролю, а електронна обчислювальна машина 12 має спеціалізоване 1 2мм При цьому за вимірювальну камеру 4 мопрограмне забезпечення 24, та блок вводу - вивожливо використовувати пластиковий одноразовий ду 13 має канали обміну та зв'язку комплексу із планшет для культивування клітин Це дозволяє стандартними комп'ютерними мереживими систепроводити досліди одночасно в широкому діапамами Крім того термостат 6 з'єднано з електрозоні концентрацій ХІМІЧНИХ речовин в реальному нною системою термостабілізацм 25 Основні техмасштабі часу при 5 10 повторах досліду, нічні характеристики термостатичний кожух 5, що формує термостатичну зону вимірювання з забезпеченням необЖивлення вимірюючого комплексу забезпечухідного температурного режиму для досліджуємої ється від силової електромережі з промисловими популяції і вільне проходження розсіяного лазерхарактеристиками 220В, 50Гц для дослідноного світла на фотореєструючі пристрої (фотоконструкторського зразка і передбачає можливість приймач 7), автономного живлення (12В) в подальших модифікаціях комплексу, в портативних варіантах термостатом 6, що забезпечує термостатування термостатуючого кожуха 5 в діапазоні темМінімальні шумові характеристики лазерного ператур 15 25° С При цьому термостат повинен променя і фотопідсилювача, усунуто вібрацію в мати велику теплоємність, що має забезпечувати діапазоні частото ЮОкГц високий рівень стабільності температури в умовах Автоматична регуляція температури в діапакороткочасового імпульсного нагріву вимірювальзоні +10 +50°С і термостатування з точністю ної камери (температурний імпульс 10 20°С, час±1°С тота цих імпульсів - 5 10 за хвилину), Швидкість ЗМІНИ температури вимірювальної камери 1град/сек фотоприймач 7, що забезпечує реєстрацію, оптичне гомодинування розсіяного лазерного світЗабеспечено реєстрацію, гомодинування розла на своїй активній площі і перетворення його сіянного лазерного світла потужністю 10 7 Вт і його інтенсивності в електричний струм Його встановфлуктуацію не менше 0,3 постійної складової сиглено з боку вільної поверхні вимірювальної каменалу, в частотному діапазоні 0 ЮОкГц під кутом ри 4, В експериментальних, дослідно18° до опорного променя конструкторських моделях повинен забезпечувати Обчислення дискретного аналога автокореляреєстрацію оптичного сигналу з розрахованою ційної функції вхідного сигналу виконується (теоретичною) потужністю 10е-7 10е-5Вт і його В лазерно-допплерівському пристрою для оціфлуктуацію не менше 0 3 від постійної складової нки токсичності та біологічної активності ХІМІЧНИХ сигналу, в частотному діапазоні 0 ЮОкГц Це речовин з виконанням методу оптичного гомодиможе бути зроблено на основі фотодюду ФД-25к з нування застосовано однолінзовою фокусуючою системою джерело лазерного випромінювання 1 - гелійнеоновий (He-Ne), що забезпечує освітлення доСередня відстань від зони сліджуваного середовища з біологічним тествимірювання 100мм об'єктом монохроматичним, когерентним та стабіДіаметр активної поверхні льним світлом фокусуючої лінзи 2 10мм 17 45481 18 Кут розсіювання 14 18° блок вводу - виводу 13, що забезпечує введення і виведення цифрової інформації як в однодіафрагма Обскура 8, що забезпечує велику канальному, так і в багатоканальному режимах в глибину різкості точкового джерела світла від асинхронному або синхронному вводі - виводі інцентру вимірювальної камери і зміщених джерел формації, бліків розсіяного світла за мінімальних засвіток бокових стінок камери Діаметр діафрагми Обскудвопроменеву призму 14, що забезпечує розра 0,8 0,3мм, щеплення лазерного світла на два ідентичних променя зі збереженням монохроматичності і копопередній підсилювач 9, що забезпечує елекгерентності первинного світла Призма виконана з тричне узгодження із фотоприймачем підсилення кварцового скла з полірованими поверхнями не фотоструму, для подальшої передачі одержаного нижче третього класу, сигналу на аналого-цифровім перетворювачі 10 модулів обробки сигналів діафрагму 15, що забезпечує одномодового вузького пучка світла, яка встановлена з боку дна Основні характеристики попереднього підсивимірювальної камери 4 Діаметр діафрагми лювача 9 визначаються параметрами фотоприй2 5мм, товщина діафрагми 0,5 1мм, отвір полімача 7 і вхідними характеристиками аналогорований за другим класом, щоб звести до мінімуму цифрових перетворювачів 10, ефект розсіювання, аналого-цифровий перетворювач 10, що забезпечує аналого-цифрове перетворення та різблок керування положенням 16 вимірювальної номанітну програмову спектральну обробку сигнакамери 4, що забезпечує належну просторову орілів в реальному масштабі часу єнтацію вимірювальної камери відносно оптичної Осі лазерного променій Точність такої координаДоцільно використовувати спеціалізовані протної орієнтації - 0,1 0,5мм Тривалість зміни помислові електронні модулі технологічно та функціложення за командою не більше 1с Керування онально сумісні з програмно-апаратними технолокомандами здійснюється комп'ютером, гіями фірми National Instruments Зразком таких модулів є аналого-цифрові системи обробки сигдозатор біологічного тест-об'єкту 17, що заналів L1250, які функціонують на базі RISCбезпечує подачу суспензії біологічного тест-об'єкту процесорів і дозволяють програмне керувати рев вимірювальну камеру 4 в ретельно завданій КІжимами виміру, збору, спектральної обробки сигЛЬКОСТІ Дозатора використано автоматичного з налів паралельно по декількам каналам об'ємом дози 0,01 0,05мл, Основні мінімальні технічні вимоги для спектдозатор рідини 18, що забезпечує подачу зраральної обробки вхідного сигналу по одному казка рідини, що досліджується, заданої концентраналу ції до вимірювальної камери 4 Цей дозатор виконаний ідентично попередньому Тут можливі два Номінальний рівень вхідного варіанти виконання перший - з використанням сигналу ± 5В одного дозатора, до якого послідовно підключаДіапазон робочих частот ються ємності з ХІМІЧНИМ реагентом від найменших вхідного сигналу 0 100 кГц концентрацій до найбільших, (КІЛЬКІСТЬ таких ємНомінальна частота дискреностей -12 15), другий вариант- з використанням тизації аналогового сигналу 500мкс 12 15 дозаторів, в яких міститься конкретно заЧисло розрядів дискретизавдана концентрація За такі дозатори можуть слуції 8 жити одноразові шприци-дозатори, Термін обчислюваної автокореляційної функції 8 16 мс культиватор біологічного тест-об'єкта 19, що забезпечує культивування біологічного рухомого КІЛЬКІСТЬ дискретних каналів тест-об'єкта в стандартизованих лабораторних автокореляційної функції 10 32 умовах в КІЛЬКОСТІ, що достатня для провадження інтерфейс 11, що забезпечує підключення різтоксикологічних досліджень Ця достатність визнаноманітних джерел сигналів, для одержання дочається необхідністю забезпечення безперервної поміжної інформації і включення її в систему збору роботи протягом 7 діб За цей термін в дослідах для подальшої обробки аналізується 12600 проб з біологічним об'єктом (15 Його виконано як універсальний пристрій з допроб за годину 5-кратноі повторності = поміжними та іншими каналами зв'язку для інших 75проб/годину = 1800проб/добу = вимірювальних систем контролю і джерел інформації 12600пробл-иждень), Використання стандартних модулів для побублок підготовки і розбавлення рідини з ХІМІЧдови аналого-цифрового перетворювача 10 і обНИМИ добавками 20, що забезпечує приготування робки сигналів в комплексі, дозволить в перспекпроб завданої концентрації з урахуванням розчинтиві уніфікувати програмне забезпечення для ності у воді ХІМІЧНИХ речовин, створення інформаційно-аналітичних банків даних опорний промінь, що формується від розсіянона базі систем збору інформації про стан навкого світового відблиску із зовнішнього боку дна вилишнього середовища, мірювальної камери 4 і забезпечує режим оптичного гомодинування Ця ознака дозволяє суттєво електронну обчислювальну машину 12, що заспростити оптичну схему комплексу, знизити метбезпечує обробку інформації в реальному масшрологічні вимоги до оптичного тракту і збільшить табі часу, керування вимірювальним комплексом, надійність і достовірність результатів, що одержуперетворення результатів в вигляді, що необхідються Інтенсивність опорного променя повинна ний споживачеві, зберігання і формування банку бути щонайменше в 100 разів більшою за оптичданих Для цього необхідно використовувати маний сигнал (розсіяне лазерне світло) від рухомих шину IBM PC/AT п'ятого покоління, 19 45481 20 біологічних об'єктів, ному режимі, в режимі генерації переривань і по каналах DMA механізм приводу 21, що забезпечує орієнтацію вимірювальної камери в кроковому режимі для DLL - бібліотека (Dynamic Link Library) є набоорганізації автоматичного вимірювання в кожній ром функцій, що доступні для будь-якої програми в комірці в реальному масштабі часу Тривалість середовищі Windows Програма може викликати дослідження одного планшета для одержання дофункцію з DLL, просто вказавши при виклику ім'я зових залежностей за 5-кратноі повторності ДОСЛІDLL та ім'я функції, і и порядковий номер Причому ДІВ складає 5 15 хвилин, на етапі трансляції головної програми DLL не бере участі, тобто зв'язування програми DLL відбувасистема дзеркал 22, що забезпечує прямуванється на етапі виконання Великою перевагою DLL ня лазерного променя на лінзу з поворотом цього є те, що для них визначено стандартний спосіб променя на 90°, що дозволяє суттєво зменшити передачі параметрів, що не залежний від конкретгабарити пристрою, спростити юстировку, ного транслятора функції бібліотеки можуть бути блок юстировки 23, що забезпечує оптичну однаково легко використані в програмах на юстировку системи для збільшення чутливості і Borland С 3 1, Microson Visual С, Вог-land Delphi, ефекивності вимірювального тракту Цей блок виBorland Pascal 7 Ота те, що відповідає необхідносконано у вигляді двох незалежних предметних ті жорсткої орієнтації комплексу на конкретну пластоликів з можливістю двохкоординатної орієнтації ту АЦП, а для переходу на іншу - потрібно лише за допомогою мікрогвинтів ручного регулювання з замінити відповідну бібліотеку Вказане програмне точністю 1мкм, забезпечення було протестовало в складі комплеелектронна обчислювальна машина 12 має ксу Воно дозволило збільшити число частотних спеціалізоване програмне забезпечення 24 і при каналів, що реєструються одночасно, з 16 до 255, цьому для ефективної роботи комплексу було роззбільшити потужність комплексу (розраховується роблено програмне забезпечення низького рівня, 20 кореляційних функцій на хвилину), що дає змокотре підтримує роботу плати АЦП для вводу гу швидко набирати необхідні статистичні дані, що виводу аналогових сигналів в багатозадачних важливо при практичному бютестуванні оболонках Windows 3 1 та 32-розрядних Windows 32s/95/NT в захищеному режимі, без переходу в блок вводу - виводу 13, що забезпечує комуніреальний режим [6] кацію ЕОМ через канали обміну та зв'язку комплексу із стандартними комп'ютерними мережевими Програмне забезпечення 24 складається з бісистемами, бліотек DLL, віртуального драйвера VXD, драйвера Ldrvsys для підтримки роботи в Windows NT електронна система термостабілізацм 25 за4 0 та утиліти конфигурування бібліотеки безпечує підтримку стабільної температури в зоні LCDSsetup exe вимірювання, обмін інформацією з ЕОМ LCDS AD DLL - бібліотека, що реалізує функції Електричні параметри визначаються технічЮ для плат L1250 та L300 в середовищі 16 ВІТ ними характеристиками нагрівних охолоджуючих елементів термостатичної зони вимірювання LCDS 32 DLL - бібліотека, що реалізує функції Ю для плат L1250 та L300 в середовищі 32 ВІТ Точність регулювання температури ± 1 С VLCDSD- драйвер для роботи з DMA та IRQ в Функціональна схема електронної системи WIN95 термостабілізацм в зоні вимірювання наведена на фіг 3, де зазначено LCDS_32 PAS - UNIT для роботи в проекті на DELPHI 3 0 з використанням LCDS 32 DLL 25 - електронна система термостабілізацм, Утиліта конфігурування бібліотеки LCDSsetup 26 - терморезистор на кюветному тримачі, використовується для настройки DLL на потрібний 27 - контролер терморегулювання, підтип плати (з процесором чи без), для завдання 28 аналого-цифровий перетворювач задіяної платою базової адреси та переривання К1113ПВ1, IRQ Lsetup дозволяє також задійснити режим ав29 - статичне ОЗУ НМ6264Р, томатичної загрузки BIOS для плати з сигнальним 30 - шина даних (формувач КР1533АП6), процесором Хоча установку всіх параметрів мож31 - мікропроцесор КР1816ВЕ1, ливо виконати за допомогою наявних в бібліотеці 32 - формувач адреси, функцій, більш зручним є їх завдання в Lsetup - в 33 - регістр даних, момент запуску програми плата і бібліотека вже 34 цифро-аналоговий перетворювач будуть коректно настроєні, і оператор може одразу К573РФ5, викликати будь-які функції DLL 35 - операційний підсилювач К140УД8Б Основною частиною пакету є DLL6i6nioTeKa 36 - керований блок живлення, LCDS AD DLL, вона є бібліотекою функцій, котра 37 - батареї елементів Пельтьє ТЭБ-6, може бути використана в більшості існуючих сис38 - штерфейсний кабель, тем програмування в середовищі Windows Бібліо39 - комп'ютер IBM PC/AT (електронну обчистека містить закінчений набір функцій для роботи з лювальну машину 12) Даний контролер термореконтролером переривань IBM PC і з контролером гулювання дозволяє програмне керувати темпера"Прямого Доступу до Пам'яти" (DMA) Бібліотека турою вимірювальної камери в діапазоні містить функції , що дозволяють реалізувати вве+10 +5°С і зміною температури в вимірювальній дення-виведення аналогової та цифрової інфоркамері зі швидкістю 1 град/с Таким чином, як кемації в асинхронному режимі, вводити та виводити рування апаратним комплексом, так і обробка дааналогову інформацію як у одноканальному, так і в них може бути здійснена з терміналу керуючого багатоканальному режимах з довільною синхронікомп'ютеру зацією вводу, вводити і виводити дані в програмНа фіг 4 наведена функціональна схема ро 21 45481 22 боти лазерно-допплерівського пристрою, для оцінного стану біологічного тест-об'єкту в умовах дії ки токсичності та біологічної активності ХІМІЧНИХ ВІДПОВІДНИХ факторів, що визначають його ЖИТТЄречовин, де зазначено ДІЯЛЬНІСТЬ в реальному масштабі часу, без використання побудови калібрувальних графіків, необ40 - приготування культивованого тест-об'єкту, хідно організувати процедуру 4-х тактового на 41 - приготування зразка хімічної речовини одному зразку біологічного тест-об'єкту два такти 42-Титрування, змішування і інкубація, - диференціального виміру плюс два такти дифе43 - стадія прийняття рішення, ренціального виміру за умови аддитивної добавки 44 - експертна оцінка і система рішення, (температурний стрибок на 10°С) показника функ45 - вибір об'єкту з урахуванням нормативної ціонального стану (параметру руху), що вимірюбази, ється 46 - нормативна база, 47 - тест-об'єкт в умовах стандартизованого На фіг 6 приведена блок-схема алгоритму тодосліду (+20° С), ксикологічного аналізу методом лазернодопплерівської спектроскопії і оцінки токсичності 48 - тест-об'єкт в умовах впливу параметричстічних вод і ХІМІЧНИХ речовин, що розчинені у воді ного фактору (+30° С), 49 - джерело дії температурного параметричПриклад 1 ного фактору, По обґрунтуванню параметра контролю енергетичної характеристики руху клітин у популяції 50 - збирання і накопичення результатів в інформаційному просторі параметричної чутливості БІОЛОГІЧНИЙ об'єкт рухливих клітин поміщали у біологічного тест-об'єкту, вимірювальну камеру при заданій температурі Т = 20°С, що підтримували на протязі експерименту з 51 - статистика в реальному масштабі часу, точністю 0,1 °С Освітлювали лазерним світом із 52 - скид результатів з артифакторними знареєстрацією розсіяного світла і виміром флуктуаченнями, цій фотоструму, за якими будували кореляційну 53 - збирання статистичної інформації в реафункцію Одержували величину швидкості (v), льному масштабі часу, квадрату 54 - оцінка результатів і експертний висновок, 55 - закінчення процедури виміру (-А Технологія вимірювального процесу при ексшвидкості v / і енерговитрат на рух клітин у прес-аналізі токсичності водяного середовища з популяції (Е = v"2T]G(0)) Потім експерименти повикористанням запропонованої вимірювальної вторювали, але при температурі Т = 3 0 ± 0 1 ° С системи бютестування подана на фіг 5, де зазнаПо цих результатах обчисляли А ±а, де А - показчено блок-схему алгоритму процесу контролю токсичності водяного середовища загальна схема ник, що вимірюється технології контролю і оцінки токсичності та біологіУ таблиці 2 наведені значення для всіх дослічної активності ХІМІЧНИХ речовин джуваних параметрів біологічних об'єктів (сперма бугаїв і людини, клітин водоростей Pedmo-monas, Як бачиться зі приведеної схеми для бютестуDunahella Salma і найпростіших - інфузорій вання в короткострокових дослідах і оцінки токсичTetrahymena pyn-fbrmis) ності, щоб забезпечити точну оцінку функцюнальТаблиця 2 Оцінка величини К (АТ=10°С) = ± H ^ W А(ЗО°С) для різноманітних параметрів руху клітин № БІОЛОГІЧНИЙ об'єкт Параметри руху Рухливість Енерговитрати 1 78 ± 0 11 1 93±0 16 1 90 ± 0 07 2 06 ± 0 09 Кінетичний показник ферментативних реакцій, ДО 2 00 (див , наприклад, [Маршелл, 1981, Хочачка, Семеро, 1977]) (див .наприклад, [Гофман, 1971]) 1 2 Сперма людини Сперма бугаїв Швидкість 1 33 ±0 02 1 38 ± 0 01 3 Водорості Pedmomonas 1 36 ± 0 07 1 85 ± 0 18 2 16±0 11 1 45 ± 0 10 1 33 ±0 15 2 09 ± 0 14 1 77 ± 0 22 2 48 ±0 22 2 65 ±0 47 4 Dunahella Salma Інфузорії Tetrahymena pynfbrmis Результати, які подані в таблиці 2 дозволяють зробити наступні висновки З літературних джерел відомо, що при зростанні температури інкубації на 10°С швидкість ХІМІЧНИХ реакцій зростає в 2 рази (тут маємо на увазі ферментативні процеси синтезу і гідролізу АТФ), а на долю рухових АТФаз припадає 70-85% від спільної АТФазної активності сперматозоїдів У цім плані швидкість поступального руху статевих клітин досліджуваних видів явно не відбиває хімічну кінетику енерговитрат, тому що К(ДТ = 10°С) = 1,3 1,4 Крім того, швидкість поступального руху 23 45481 24 не має розмірності енергії, а тому безпосередні Аналіз приладових і статистичних погрішностей виміру параметрів руху клітин -2 За біологічний об'єкт дослідження розглянемо дані, тобто (v) і (Е = v riG(O)) співставляти неклітину сперміїв бугая правоможно Точність визначення долі рухливих клітин моОт чому нами пропонується використовувати жна оцінити, диференцюючи вираз для кореляційпоказник внутрішніх енерговитрат у вигляді Е, для якого К(ДТ = 10°С) (у випадку сперміїв) дорівнює ної функції G(TJ П О 1,9 2,1, що цілком узгоджується з загальними G(x)=P-G m o t (x) (i-p)-Gi уявами про внутрішні енерговитрати на рух клітин Деяка розбіжність К(ДТ = 10°С) для інших біологічних об'єктів, очевидно, пов'язана з резервними механізмами енергообміну в цих клітинах доВиходячи з того, що точність визначення ампсліджуваних організмів 3 цього випливає, що саме показник Е пропорційний відносним енерговитралітуди G(X) складає 0 01, можна знайти межу мотам клітин на рух і відбиває температурну кінетику жливості розв'язання Р при фіксованій швидкості ферментативніх процесів, пов'язаних із циклом синтезу АТФ v клітин Результати оцінки наведені в таблиці З Приклад 2 Таблиця З Залежність абсолютної погрішності рухливих клітин від швидкості і частоти вертіння головки сперміїв № Характеристика 1 Частота вертіння головки, Гц 2 Швидкість руху, мкм/с 3 Абсолютна погрішність виміру долі рухливих клітин Як очевидно з таблиці 3, у достатньо широкому діапазоні зміни середніх швидкостей руху сперматозоїдів абсолютна погрішність виміру р має величину біля 0 01 і лише при малих швидкостях вона незначно збільшується Для оцінки погрішності виміру середньої швидкості руху частинок у суспензії, зв'язаної з дискретністю визначення як амплітуди - напівширини кореляційної функції (0 01), так і з тимчасовим квантуванням корелятора (ЮОмкм), виразимо зміну швидкості, що визначається по напівширині кореляційної функції, через зміни значення AG(T) І часу затримки Дх Враховуючи незалежність цих параметрів одержимо вираз у вигляді 10 85 0 010 Av = 8 68 0 011 Значення 6 4 51 34 0 011 0 013 4(AG(x))" Р 2 2 17 0 021 .ЗДт 2 4 де, AG(x) = 0,01, X = 2,75 • 2щ = 47,69, v „ швидкість руху, Ду - змінювання швидкості руху сперміїв Підставивши значення конкретних швидкостей і рухливості клітин одержимо величини погрішностей визначення Е, що виникають через погрішності амплітудно-тимчасового квантування Результати приведені в таблиці 4 Таблиця 4 Погрішність визначення швидкості руху сперміїв № Частина рухливих Швидкість, МКМ/С 85 6 4% 1 9% 1 4% КЛІТИН, ВІДН ОД 1 2 3 0,1 0,4 0,7 З таблиці 4 очевидно, що в діапазоні, що характерний для досліджуваних швидкостей руху (ЗО 80мкм/с), і частиною рухливих клітин (0 3 - 0 7) погрішність визначення середньої швидкості руху сперміїв не перевищує 3% Оцінку приладової погрішності виміру питомих енерговитрат на рух клітин у популяції необхідно робити з урахуванням погрішностей швидкостей (0,03 0,05) і рухливостей (0 066) реально, що вимірюються в дослідах В цьому разі маємо помилку виміру енерговитрат порядку 6 6% Окрім приладових помилок у визначенні параметрів руху клітин у популяції існує статистична помилка виміру середньої по ансамблеві величини 59 5 7 6% 8 2% 1 4% 34 0 0% 2 5% 1 6% популяцій Оскільки розподіл клітин по швидкості руху має відносну напівширину 50%, то можна оцінити і статистичну точність виміру середньої по ансамблеві швидкості [ v ] Так, за час виміру (для г = ЮОмкс, t = 13 1 с), при концентрації організмів 1000клітин/мм3, зоні розсіювання світла (МІСТКІСТЬ = 9 05*100мм3) заміниться біля 400 клітин, тобто статистична точність виміру середньої швидкості руху складе 50% /400, тобто - 2 5%, а при концентрації організмів - 10000клітин/мм3, вона знизиться до величини 0 79% 3 цього маємо, що статистична помилка не перевищує в умовах реальних екс 25 45481 26 периментів приладових погрішностей го біологічного об'єкта дослідження використовували культуру мікроводорості Pedmomonas на З приведеного аналізу приладових і статистистаціонарній фазі росту, щоб виключити тимчасочних погрішностей виміру середніх параметрів вий фактор біологічного впливу на результати вируху ансамблю сперматозоїдів походить, що велимірів Число ДОСЛІДІВ в експериментах, що провочина помилки виміру швидкості, як правило не дили, не менше 5 перевищує 3%, частини рухливих клітин - 5%, а енерговитрат - не більш 7%, що у випадку досліЯк походить з результатів, поданих у таблиці дження рухливого біологічного об'єкта, що має 4, ЗОВНІШНІ фактори впливу й умови проведення власні флуктуації контрольованої характеристики, ДОСЛІДІВ вносять незначну помилку в результат є дуже задовільним виміру параметрів руху клітин (для прототипу ЗОВНІШНІ фактори вносять збурення , визначаючи поПриклад З милку, що не перевищує помилю/ в експериментах Оцінка впливу різноманітних факторів на рез біологічними об'єктами, наприклад вимірів енерзультат виміру швидкості, рухливості і внутрішніх говитрат - 53,28%, а длязапропонованого приенерговитрат строю цей розмір складає, ВІДПОВІДНО, - 9,94% Це За ЗОВНІШНІ фактори, що впливають на джересвідчить про некритичність процесу виміру до ло світла, оптичну схему й електронну частину пристрою, використовували впливу досліджуваних збурюючих факторів, що низькочастотні (1 5Гц) вібрації оптичної часдозволяє одержувати високовідтворювані результини пристрою для визначення вібростійкості, тати в різноманітних умовах проведення ДОСЛІДІВ вносили випадкові збурення в інтенсивність При цьому, необхідно звернути увагу нате, що лазерного променю, вимірювання проводили в режимах різноманінавіть в умовах значної дії ЗОВНІШНІХ факторів, тної зовнішньої засвітки зі штучним освітленням з оцінка енерговитрат по запропонованому варіанчастотою 100 Гц і природного денного освітлення, тові аналізатора якості сперми характеризується змінювали оптичну довжину кювети, високою точністю вимірів Зокрема, середній покавикористовували діафрагми з різноманітним зник варіабельності (р = 3,92%), що вимірюється, діаметром отвору, показник енерговитрат стосовно базового варіанта досліди проводили при різноманітному коефіцієнті підсилення у вимірювальному тракті, (р = 6,45%) ( обраного за прототип) зменшується змінювали величину вибірки досліджуваних на 39,22% сигналів Результати приведені в таблиці 5 За рухливоТаблиця 5 Аналіз характеристик надійності виміру параметрів руху клітин на лазернодоплерівському спектрометрі, ф - варіабельність вимірюємих енерговитрат) Показники параметрів руху клітин № Вид фактора впливу на вимірювальну систему Швидкість, мкм/с Рухливість, ВІДН ОД% Енерговитрати, ум од 1 Дослід контролю (природне освітлення, діаметр діафрагми 0 5мм, коефіцієнт підсилення 40дб , статистика сигналів 217) 46 92± 0 51 26 61 ± 1 50 584 52 ± 23 84 2 Помешкання цілком затемнене (темний режим виміру) 47 69± 0 61 26 02± 2 47 588 84 ± 46 96 3 Помешкання зі штучним освітленням, частотою модуляції 100Гц 46 67± 0 60 21 71 ± 1 03 4 Низькочастотна вібрація оптичної частини пристрою (1-5Гц, світлий режим) 43 78± 0 85 34 68 + 2 52 5 Змінювання діаметра діафрагми і коефіцієнта підсилення (d = 1 5мм, коеф піде =30дб, статистика 2 17 , світлий режим) 52 53± 1 45 20 82± 1 77 572 94 ± 44 07 53 81 ± 2 72 22 82± 214 644 47 ± 28 90 49 13 ± 2 64 21 41 ± 2 71 48 29± 1 20 25 06± 1 61 6 7 8 Змінювання статистики вибірки (d = 1 5мм, коеф піде =30дб, статистика 2 16 , світлий режим) Теж, що і дослід 5, 6, але при статистиці 215) Змінювання оптичної довжини кювети в межах 20% (світлий режим, параметри якудосліді 1) Р =4,08% Р =7,98% 471 07 ± 18 79 Р =3,93% 664 71 ± 47 69 Р =7,17% Р - 7,69% Р =4,48% 512 98 ±63 58 Р =12,39% 575 11 ± 22 40 Р =3,89% 27 45481 28 Продовження табл 5 9 10 Середні значення вимірів із середньоквадратичною помилкою і варіабельністю, в 48,60 ± умовах ЗОВНІШНІХ факторів впливу на вимірює систему (за результ ДОСЛІДІВ 1 - 8) 1 14 Варіабельність параметрів виміру, % Таким чином, на підставі вищевикладеного можна зробити наступні висновки Метод лазерно-допплерівської спектроскопії для оцінювання якості рухливих клітин - основний метод, що притягає увагу як вітчизняних, так і зарубіжних ДОСЛІДНИКІВ Проте, усі перераховані конструкції аналізаторів якості сперми не придатні для експрес-прогнозування стану клітин через свою складність, трудомісткість, низьку точність, а головне, відсутність інформації про рівень метаболізму, що зв'язаний з рухом клітин, їхні внутрішні енерговитрати на рух Непридатні також для цієї мети і розроблені ВІДОМІ методи оцінки якості сперми по біохімічних, цитологічних або фізіологічних показниках, як правило через свою методичну складність, потреби в дефіцитних реактивах, і особливо через велику тривалість у часі аналізів Використання запропонованого пристрою найбільш ефективне в медико-бюлопчному приладобудуванні, частково, в технології біохімічного очищення стічних вод, санітарної токсикології й екологічного моніторингу, а також при скринінгу біологічної активності ХІМІЧНИХ речовин і препаратів Галузі застосування технічних засобів, що розробляються, з унікальними властивостями надійності і експресності контролю параметрів руху біологічних мікрооб'єктів можуть бути найрізноманітнішими, зокрема лазерно-допплерівські прилади будуть використані В фундаментальних галузях біологічних наук, а саме дослідження характеристик руху клітин, оцінка впливу ЗОВНІШНІХ факторів на популяції рухомих клітин, оцінка чутливості і СТІЙКОСТІ популяцій, дослідження кінетики реакції клітин на різноманітні дії хімічної, фізичної і біологічної природи, дослідження флуктуацій параметрів ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ біологічних систем, дослідження флуктуаційних біфуркаційних перетворень в термодинамічне нерівноважних системах з інтенсивними процесами енерго, масо і інформаційного обміну, дослідження біологічних ритмів, дослідження колективних форм руху, дослідження явища стресу на різних рівнях організації біологічних систем Застосування в практичних галузях біологічної науки бютехнолопя (в тому числі марикультури), оцінка якості сперми (сільське господарство і медицина), оцінка токсичності ХІМІЧНИХ речовин (хімічне та ш вироб-ва), 2 48 24,90 ±1 60 6 42 576,00 ± 306,92 (±53,28%) Р 6,45% 3 90 скринінг біологічної активності препаратів в фармакологи, екологічний моніторинг, оцінка якості води, в тому числі стічної Запропонований лазерно-допплерівський пристрій для оцінки токсичності та біологічної активності ХІМІЧНИХ речовин в порівнянні з існуючими техничними засобами контролю токсичності водяного середовища має такі переваги компактність, надійність експлуатації і простота обслуговування аналізатора, можливість широкого використання у виробничих умовах, висока точність і об'єктивність виробленої оцінки якості водного середовища, уперше на розробленому приборі безпопередню вимірюється показник енерговитрат на рух клітин (як свідчення про рівень їхнього метаболізму), що корелює із спроможністю генофонду, що запліднює, без необхідності проведення спеціально організованого автокореляційного аналізу сигналів фотоприймача розсіяного лазерного випромінювання Така ознака визначає унікальність аналізатора в галузі медико-бюлопчного приладобудування, здатність аналізатора працювати в реальному масштабі часу дає можливість проведення оперативного контролю результату процесів заморожування або деконсервацм статевих клітин, технологичного процессу очищення стічних вод, та екологічної ситуації у водяному середовищі, прилад може бути використаний для оцінювання екологічної ситуації водяного середовища, скринінга крюмодифікаторів біологічних середовищ, бюмоніторингу, проведення токсикологічної інвентаризації основних джерел забруднення басейну Дніпра та ін з метою їх розподілу за рівнем токсичності та небезпеки для водних екосистем і в інших задачах бютестування Об'єктивність і точність аналізу функціонального стану біологічного тест-об'єкта в задачах бютестування при ОЦІНЦІ токсичності і біологічної активності ХІМІЧНИХ речовин, тому що спосіб базується на фундаментальній властивості ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ біологічних систем - параметричній чутливості Універсальність структурної блок-схеми Низькі працевитрати на проведення аналізів при бютестування й експрес-контролю токсичності ХІМІЧНИХ речовин, що утримуються у водяному середовищі за рахунок того, що вимірювальний комплекс практично автоматизований ЕКОНОМІЧНІСТЬ за рахунок малих витрат біологічного об'єкту і ХІМІЧНИХ реагентів (а також енерговитрат) 29 ЗО 45481 Порівняння джпщил кореляційної функції (1) разсілного сперміями світла G(T ) і тдпшгаі функції (2) при^=0 S25 і У=162УМЮИ/С 8' A > \ 0 6 І І0.5 \ \ \ * 0.3 -1 < I л і 0 Фіг З / 2 3 4 5 6 7 8 9 10 время, Т. «с. Фіг 1 53 19 55 Фіг 2 Фіг 4 31 32 45481 Статсптчнв oCpoCxs. давил. Фіг 6 Фіг 5 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71