Днк, яка включає промоторну послідовність (варіанти), і трансформована з її використанням трансгенна рослина

1. ДНК для експресії кодувальної послідовності, яка має нуклеотидну послідовність, яка на 50% або більше ідентична нуклеотидній послідовності SEQ ID NO: 2, і яка включає промоторну послідовність, яка має здатність забезпечувати експресію зв'язаної кодувальної послідовності специфічно в тапетумі, тканині ендотецію і сполучній тканині пиляків, але не в мікроспорах чи пилку, причому експресія кодувальної послідовності починається на стадії тетради і досягає максимального рівня на стадії вакуолізованого пилку. 2. ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що послідовність включає нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 2. 3. ДНК за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що кодувальна послідовність знаходиться в антисмисловій орієнтації. 2 (19) 1 3 74535 4 13. ДНК за п. 12, яка відрізняється тим, що провності починається на стадії тетради і досягає мамотор включає фрагмент, який одержують з SEQ ксимального рівня на стадії вакуолізованого пилку. 16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що ID NО:2. 14. Вектор для експресії кодувальної послідовності рослина являє собою рис, пшеницю, кукурудзу, гена, який представляє інтерес, в організмі-хазяїні, Sorghum bicolor чи грястицю збірну. такому, як мікроорганізм або рослина, який вклю17. Трансгенна рослина і її потомство, отримані чає ДНК за будь-яким з пп. 1-13. статевим і/або безстатевим шляхом, трансформо15. Спосіб одержання трансгенної рослини, який вані послідовністю ДНК за будь-яким із пп. 1-13. 18. Трансгенна рослина за пунктом 17, яка відрізполягає в тому, що рослину трансформують за няється тим, що рослина являє собою рис, пшедопомогою молекули ДНК, яка має послідовність, що на 50% або більше ідентична послідовності, ницю, кукурудзу, Sorghum bicolor чи грястицю збірпредставленій в SEQ ID NO: 2, і яка включає прону. моторну послідовність, яка забезпечує експресію 19. Трансгенна рослина, яка має чоловічу стеризв'язаної кодувальної послідовності специфічно в льність, трансформована послідовністю ДНК за тапетумі, тканині ендотецію і сполучній тканині будь-яким із пп. 1-13. 20. Трансгенна рослина за п. 19, яка відрізняєтьпиляків, але не в мікроспорах чи пилку, і зв’язану з ся тим, що рослина являє собою рис, пшеницю, нею кодувальну послідовність, з наступним відбором рослин, у яких експресія кодувальної послідокукурудзу, Sorghum bicolor чи грястицю збірну. Даний винахід стосується галузі генної інженерії рослин. Насамперед, він стосується нових послідовностей ДНК, що функціонують як промотори специфічної для пиляка транскрипції кодувальних послідовностей ДНК у рекомбінантних або химерних послідовностях ДНК. Даний винахід також стосується рекомбінантних або химерних послідовностей ДНК, що специфічно експресуються в пиляку рослини. Ці рекомбінантні чи химерні послідовності ДНК можуть застосовуватися для створення трансгенних рослин, але насамперед, трансгенних рослин з чоловічою стерильністю. Створення рослин з чоловічою стерильністю має важливе економічне значення для одержання гібридного насіння. Чоловіча стерильність попереджає самозапилення, яке у противному випадку відбувається в багатьох видів рослин і заважає селекції й одержанню гібридного насінного матеріалу. Пиляк являє собою чоловічий репродуктивний орган квіткових рослин, що складається з декількох тканин, таких як тапетум, ендотецій, сполучні тканини, судинні тканини і т.ін., і він відповідає за виробництво пилка. Розвиток пиляка можна розділити на дві загальні фази. Під час фази 1 відбувається розвиток морфологічних особливостей пиляка і клітини материнської мікроспори піддаються мейозу, що приводить до утворення тетрад мікроспор. Під час фази 2 відбувається диференціювання пилкових зерен і пиляків, і відбувається дегенерація тканини, розкриття пиляка і вивільнення пилкового зерна. Серед численних різних генів, що беруть участь у цих процесах розвитку, тільки невелика частина представлена специфічними для пиляка генами. Відомі дотепер специфічні для пиляка гени включають гени Osc4, Osc6, YY1 і YY2 [Hihara Y, та ін., Plant Мої. Biol., 30:1181-1193(1996); Tsuchiya Т., та ін., Plant Моl. Biol., 26:1737-1747 (1994)], гени ТА29 і ТА32 тютюну [Koltunow A.M. та ін., Plant Cell, 2:1201-1224 (1990)], гени SF2 і SF18 соняшнику [Domon С. та ін., Plant Моl. Biol., 15:643-646 (1990)], гени 108 томату [Smith A.G., та ін., Моl. Gen. Genet., 222:9-16 (1990)], NTM 19 тютюну [Oldenhof М.Т. та ін. Plant Моl. Biol 31:213-225 (1996)] і гени ВА42, ВА112 і А9 Brassica napus [Scott R. та ін., Plant Моl. Biol., 17:195-207 (1991); Shen, J.B. таін., Моl. Gen. Genet, 234:379-389 (1992)]. Деякі з цих генів виявлені виключно в спорофітних тканинах пиляків, інші є специфічними для пилка або присутні і в спорофітних і в гаметофітних тканинах пиляків. Рис являє собою приклад рослини, що розмножується шляхом самозапилення. Це утруднює одержання гібридних сортів рису тільки за допомогою алогамії. З відомого рівня техніки відомий метод, призначений для полегшення одержання гібридних сортів рису за допомогою алогамії, відповідно до якого пиляки видаляють із квіток рису для одержання рослин рису з чоловічою стерильністю, а потім на них переносять пилок з іншої рослини рису. Однак недоліком цього методу є те, що для його здійснення потрібно багато часу, і він є трудомістким. Таким чином, з метою одержання рослини рису або іншого виду самозапильної рослини, яка характеризується чоловічою стерильністю, що не мають описаних вище недоліків, при створенні даного винаходу зроблено спробу розробити спосіб, базований на застосуванні гена, який індукує аномальний розвиток пиляка. Таким чином, у винаході запропоновано: Молекули ДНК і способи специфічної експресії цікавої для винаходу кодувальної ділянки в тапетумі, ендотеції, сполучних тканинах пиляка, але не в мікроспорах або пилку, причому експресія цікавої для винаходу кодувальної послідовності починається на стадії утворення тетради і досягає максимального рівня на стадії вакуолізованого пилка. Зокрема, подано молекули ДНК і способи, які відрізняються тим, що: - ДНК має нуклеотидну послідовність, ідентичну щонайменше на 50%, оптимально на 65%, більш оптимально на 80% і найбільш оптимально на 90% чи більше, послідовності, наведеній у SEQ 5 74535 6 ID NO:1 порах чи пилку, причому експресія кодувальної - ДНК за винаходом включає нуклеотидну поспослідовності починається на стадії утворення лідовність, наведену в SEQ ID NO:1 тетради і досягає максимального рівня на стадії - молекули ДНК специфічно конструюють тавакуолізованого пилка. ким чином, щоб У винаході також описано молекули ДНК, що кодувальна послідовність мала антизначеннєвключають відкриту рамку зчитування, яка кодує ву орієнтацію. У винаході також запропоновані протеїн, характеризований амінокислотною послімолекули ДНК і способи, які відрізняються тим, що довністю, ідентичною на 50%, оптимально на 65%, кодувальна послідовність кодує поліпептид, здатбільш оптимально на 80% і найбільше оптимально ний порушувати формування життєздатного пилка на 90% чи більше, послідовності, наведеній у SEQ при експресії в клітинах пиляка. Відповідно до конID NO:4. Відповідно до іншого конкретного варіанкретного варіанта здійснення кодувальна послідота здійснення винаходу відкрита рамка зчитування вність кодує поліпептид, вибраний із групи, що кодує протеїн, характеризований амінокислотною включає РНКазу, DTA, TURF-13, пектатліазу, ginпослідовністю, наведеною в SEQ ID NO:4. Відповірекомбіназу, iaaL і токсин cytA. дно до конкретного варіанта здійснення винаходу Винахід також стосується зазначених вище зазначена раніше молекула ДНК характеризується молекул ДНК і способів, які відрізняються тим, що послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:7. послідовність ДНК за винаходом ідентична більш Крім того, у винаході описано експресійні векніж на 80%, оптимально на 90% і більш оптимальтори, що включають першу касету експресії, яка но на 95%, фрагменту, складеному з 30 послідовмістить ДНК за винаходом для експресії в організних основ, розташованому в будь-якій ділянці SEQ мі-хазяїні, такому як мікроорганізм або рослина, і ID NO:1. необов'язково другу касету експресії, що містить У винаході також запропоновані молекули цікавий для винаходу ген. Відповідно до конкретДНК, що включають промоторну послідовність, ного варіанта здійснення винаходу друга касета здатну забезпечувати експресію зв'язаної кодуваекспресії містить маркерний ген. льної послідовності специфічно в тапетумі, ендоВинахід також стосується протеїну, кодованого теції і сполучній тканині пиляка, але не в мікроспоописаною вище відкритою рамкою зчитування. рах або пилку, причому експресія кодувальної Крім того, винахід стосується трансгенних ропослідовності починається на стадії утворення слин і рослинного матеріалу і їхнього потомства, тетради і досягає максимального рівня на стадії отриманого статевим і/або безстатевим шляхом, вакуолізованого пилка. що були трансформовані послідовністю ДНК за Зокрема в даному винаході зазначені раніше винаходом. Зокрема, у винаході описано способи і молекули ДНК, які відрізняються тим, що - трансгенну рослину з чоловічою стерильніс- промоторна послідовність ідентична на 50%, тю, трансформовану послідовністю ДНК за винаоптимально на 65%, більш оптимально на 80% і ходом найбільше оптимально на 90% чи більше, нуклео- трансгенні рослину або рослинний матеріал тидній послідовності, представленій у SEQ ID за винаходом, де рослина являє собою рис, пшеNO:3 ницю, кукурудзу, Sorghum bicolor або грястицю - промоторна послідовність має нуклеотидну збірну. послідовність, представлену в SEQ ID NO:3 Крім того, у винаході запропоновано спосіб - промоторна послідовність включає додаткову одержання трансгенної рослини, яка містить ДНК, послідовність, що може бути функціонально зв'ящо включає промоторну послідовність і зв'язану з зана з цікавою для винаходу кодувальною послінею кодувальну послідовність, причому промотордовністю на послідовність забезпечує експресію кодуваль- додаткова послідовність включає послідовної послідовності специфічно в тапетумі, ендотеції ність, і сполучних тканинах, але не в мікроспорах чи пилідентичну на 50%, оптимально на 65%, більш ку, причому експресія кодувальної послідовності оптимально на 80% і найбільше оптимально на починається на стадії утворення тетради і досягає 90% чи більше, послідовності, представленій у максимального рівня на стадії вакуолізованого SEQ ID NO:10 пилка. Спосіб насамперед придатний для рослин - додаткова послідовність включає SEQ ID рису, пшениці, кукурудзи, Sorghum bicolor чи грясNO:10 тиці збірної. - промоторна послідовність і додаткова посліВідповідно до конкретного варіанта здійснення довність ідентичні на 50%, оптимально на 65%, даний винахід стосується специфічного для пилябільш оптимально на 80% і найбільше оптимально ка гена рису (Oryza sativa L.), що має послідовність на 90% чи більше, послідовності, наведеній у SEQ основ, представлену в SEQ ID NO:1, і гена, ідентиID NO:2 чного більш ніж на 80%, 30 послідовним основам у - промоторна послідовність і додаткова послібудь-якій ділянці цього гена. довність характеризуються нуклеотидною посліКрім того, цей винахід стосується специфічної довністю, наведеною в SEQ ID NO:2. для пиляка регуляторної послідовності, що вклюКрім того, запропоновано молекули ДНК, у чає промоторну послідовність і додаткову послідояких промотор включає фрагмент, що його можна вність, представлену в SEQ ID NO:2, яка відповіотримати з SEQ ID NO:2, оптимально фрагмент, дає послідовності основ між положеннями -1196 і здатний забезпечувати експресію зв'язаної коду240 зазначеного гена, яка представлена нуклеотивальної послідовності специфічно в тапетумі, ендами (nt) з 1 по 1436 SEQ ID NO:1. дотеції і сполучній тканині пиляка, але не в мікросДаний винахід також стосується промотору, 7 74535 8 що забезпечує специфічну для пиляка експресію, дає трансформованій клітині вибіркової переваги, який має послідовність, представлену в SEQ ID але експресія якого робить трансформовану клітиNO:3, яка відповідає послідовностям основ у пону фенотипійно відмінною від нетрансформованих ложеннях від -1196 до -1 зазначеного гена, відпоклітин. відним для nt 1 - nt 1196 SEQ ID NO:1. Селектований маркерний ген: ген, експресія Визначення якого в клітині рослини дає клітині вибіркову переЩоб полегшити розуміння опису і формули вагу. Вибіркова перевага, що її мають клітини, винаходу нижче наведено такі визначення: трансформовані селектованим маркерним геном, Химерний: поняття використовують для того, може полягати в їхній здатності рости в присутносщоб указати, що послідовність ДНК, така як вектор ті негативного агента селекції, такого як антибіотик або ген, включає більше від однієї послідовності або гербіцид, у порівнянні з ростом нетрансфорДНК різного походження, злитих за допомогою мованих клітин. Вибіркова перевага, що її мають методів рекомбінатної ДНК з утворенням послідотрансформовані клітини в порівнянні з нетрансфовності ДНК, яка не зустрічається в природних умормованими клітинами, може полягати в їхній посивах, і яка зокрема не зустрічається в рослині, що леній новонабутій здатності використовувати допідлягає трансформації. дану сполуку як живильну речовину, фактор росту Експресія: означає транскрипцію і/або трансабо енергетичне джерело. Поняття "селектований ляцію ендогенного гена чи трансгена в рослинах. У маркерний ген" також стосується гена або комбівипадку, наприклад, антизначеннєвих конструкцій нації генів, експресія яких у рослинній клітині дає поняття "експресія" може стосуватися транскрипції клітині як негативну, так і позитивну вибіркову петільки антизначеннєвої ДНК. ревагу. Ген: означає кодувальну послідовність і зв'яІдентичність послідовностей: відсоток ідентичзану з нею регуляторну послідовність, причому ності послідовностей визначають за допомогою кодувальна послідовність транскрибується з утвокомп'ютерних програм, базованих на алгоритмах ренням РНК, такої як мРНК, рРНК, тРНК, snPHK динамічного програмування. Комп'ютерні програ(М.я.РНК), значеннєва РНК і антизначеннєва РНК. ми, оптимальні згідно з даним винаходом, вклюПрикладами регуляторних послідовностей є прочають BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), моторні послідовності, 5'- і 3'-нетрансльовані поснабір пошукових програм, створених для дослілідовності і термінувальні послідовності. Можуть дження всіх доступних баз даних послідовностей бути присутні додаткові елементи, наприклад, інбезвідносно до того, що аналізується, протеїн чи трони. ДНК. Версія BLAST 2.0 (Gapped BLAST) цього інМаркерний ген: означає ген, що кодує селекструмента пошуку доступна науковій громадськостовану ознаку або ознаку, яку можна відібрати в ті через Інтернет [сучасна адреса результаті скринінгу. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/]. Вона базуєтьnt: являє собою скорочення для "нуклеотиду". ся на евристичному алгоритмі локального пошуку Поняття функціонально зв'язана з/з'єднана з: на відміну від глобального порівняльного аналізу і кажуть, що регуляторна послідовність ДНК, "функтому придатна для виявлення зв'язку між послідоціонально зв'язана з" або "з'єднана з" послідовнісвностями на основі тільки виділених ділянок. Бали, тю ДНК, що кодує РНК чи протеїн, якщо дві посліприписувані при пошуку з використанням програм довності розташовані так, що регуляторна BLAST, мають добре визначену статистичну інтерпослідовність ДНК впливає на експресію кодувапретацію. Ці програми оптимально здійснювати з льної послідовності ДНК. необов'язковими параметрами, приписуваними до Рослина: означає будь-яку рослину, зокрема відсутніх даних. насінний матеріал рослин. Трансформація: означає процес інтродукції Рослинний матеріал: означає листя, стебла, нуклеїнової кислоти в клітину. Зокрема, поняття коріння, квітки або частини квіток, плоди, пилок, стосується стабільної інтеграції молекули ДНК у пилкові трубки, насінні бруньки, зародкові мішки, геном цікавого для винаходу організму. яйцеклітини, зиготи, зародки, насіння, відсадки, Короткий опис послідовностей, поданих у пекультури клітин або тканин, чи будь-яку іншу часреліку послідовностей тину або продукт рослини. SEQ ID NO:1 нуклеотидна послідовність гена Промотор: означає послідовність ДНК, що ініRA8 рису ціює транскрипцію зв'язаної з нею послідовності SEQ ID NO:2 регулятор специфічної для пиляДНК. Промоторна ділянка також може включати ка експресії, який включає промотор RA8 плюс елементи, що діють як регулятори експресії генів, перший екзон, перший інтрон і частину екзона 2 такі як активатори, енхансери і/або репресори. SEQ ID NO:3 промотор RA8 Молекула рекомбінантної ДНК; означає комбіSEQ ID NO:4 виведена амінокислотна послінацію послідовностей ДНК, що з'єднані разом за довність протеїну, кодованого геном RA8 рису допомогою методу рекомбінатної ДНК. SEQ ID NO:5 праймер 1 Метод рекомбінатної ДНК: процедури, застоSEQ ID NO:6 праймер 2 совувані для з'єднання разом послідовностей ДНК, SEQ ID NO:7 послідовність кДНК RA8 описані, наприклад, у [Sambrook та ін., 1989, Cold SEQ ID NO:8 ПЦР-праймер Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory SEQ ID NO:9 ПЦР-праймер Press]. SEQ ID NO:10 нуклеотидна послідовність Маркерний ген, який можна відібрати в репершого екзона, першого інтрона і частини екзона зультаті скринінгу: означає ген, експресія якого не 2 гена RA8 рису 9 74535 10 Genebank, така амінокислотна послідовність є ноДепонування вою і не має істотної ідентичності з жодною з послідовностей генів, відомих у даний час. Експресія гена за даним винаходом відрізняДепонований Реєстраційний Дата депонується тим, що вона регулюється тимчасовими і матеріал номер вання просторовими факторами. Просторова схема експлазміда 29 липня КСТС 8899Р пресії включає експресію гена тільки в такому орpGA1173-9 1998р. гані квітки рису, як пиляк, але при цьому експресії немає в інших органах квітки, відмінних від пиляка, Депонування здійснене в Корейському наукоу листі, корінні і т. ін., а в пиляку експресія, насамво-дослідному інституті біології і біотехнології перед, відбувається в тапетумі, ендотеції і сполуч(Korea Research Institute of Bioscience and них тканинах, але не в судинних тканинах. ТимчаBiotechnology), філії Корейського інституту перспесова схема експресії відрізняється тим, що рівні ктивних досліджень у сфері науки і технології експресії гена зростають у міру дозрівання квіток, (Korea Advanced Institute of Science and причому слабка експресія гена починається на Technology) (KAIST). стадії, що передує мейозу, але його експресію Ген за даним винаходом виділяють з рису вперше можна виявити в той час, коли мікроспори (Oryza sativa L.), він специфічно експресується в вивільняються з тетрад. Максимальні рівні виявпиляку і його геномна послідовність представлена ляються на стадії вакуолізованого пилка, і вони в SEQ ID NO:1. Послідовність кДНК гена RA8 нарізко знижуються на стадії зрілого пилка безпосеведено в SEQ ID NO:7. Шляхом порівняння посліредньо перед цвітінням. довності кДНК і геномної послідовності встановлеГен за даним винаходом можна отримати за на присутність 2 інтронів і 3 екзонів у послідовності допомогою різних методів гібридизації. Наприклад, кодувального гена RA8. Інтрон 1 завдовжки 134 за допомогою методу, що передбачає гібридизапари основ локалізований між 14 і 15 кодонами, цію бібліотеки кДНК пиляка з бібліотекою кДНК, що відповідають nt 1289 - nt 1422 SEQ ID NO:1, і nt яка має походження не з пиляка, наприклад, з ли1556 - nt 2149 SEQ ID NO:1, а інтрон 2 завдовжки стя, коріння або проростків, з одержанням у ре594 пари основ локалізований на 59 кодоні в ділязультаті цього клону кДНК, специфічного для пинці амінокислотної кодувальної послідовності виляка гена, що дає негативну реакцію з бібліотекою веденої з цієї послідовності основ, що відповідає кДНК, яка походить не з пиляка. Крім того, отриnt 1556 - nt 2149 SEQ ID NO:1. Обидва інтрони маний клон кДНК застосовують як зонд для гібримістять консенсусні послідовності GT і AG на 5'- і дизації з геномною бібліотекою і виділяють клон, 3'-концах відповідно. У SEQ ID NO:1 три екзони що дає позитивну реакцію, і його субклонують для локалізовані в такий спосіб: екзон 1: nt 1247 - nt одержання геномного клону, специфічного для 1288; екзон 2: nt 1423 - 1555; екзон 3: nt 2150 - nt пиляка гена. Інший метод одержання гена включає 2766. У 5'-некодувальній фланкувальній послідовметод, відповідно до якого послідовності основ ності цієї кодувальної ділянки послідовність СААТSEQ ID NO:1 використовують для синтезу відповібокса, СААТ, локалізована на основах у положендного праймера для загальноприйнятого методу нях від -82 до -79, що відповідає nt 1116 - nt 1119 ГЦР. Відповідно до конкретного варіанта здійсненSEQ ID NO:1, а послідовність ТАТ Α-бокса, ня винаходу отриманий ген клонують у векторі TATAATA, локалізована на основах у положеннях pBluescript SK (-) і продукт позначено як плазміда від -53 до -47, що відповідає nt 1145 - nt 1151 SEQ pGA1173-9. Ця плазміда депонована в Korea ID NO:1. Полі-(А)-хвіст локалізований на 164-ій Research Institute of Bioscience and Biotechnology, основі (нуклеотид 2932 SEQ ID NO:1) по ходу траанексованій організації Korea Advanced Institute of нскрипції від кодона термінації трансляції TGA. У Science and Technology (KAIST) під реєстраційним 3'-некодувальній ділянці присутня консенсусна номером КСТС 8899Р 29 липня 1998p. послідовність сигналу поліаделювання ААТАА. Ділянка, що містить промотор RA8, наведена в Послідовність, що оточує перший АТС, практично SEQ ID NО:3, відповідає nt 1 - 1196 SEQ ID NО:1. відповідає консенсусній послідовності ініціації траТранскрибовані нуклеотиди гена RA8 починаються нсляції одночасткових рослин, відомій з літератури в положенні 1197 SEQ ID NО:1. Елемент, що регу[Joshi СР. та ін., Plant МоI. ВіоI., 35:993-1001 лює специфічну для пиляка експресію гена за да(1997)]. ним винаходом, локалізований в ділянці, що місВідкрита рамка зчитування цієї кодувальної тить промотор, екзон 1, інтрон 1 і частину екзона 2, ділянки складається з 264 амінокислотних залиші цю ділянку можна подати у вигляді SEQ ID NО:2, ків і має амінокислотну послідовність, представлещо відповідає послідовності основ між nt 1 і nt ну в SEQ ID NO:4. 1436 послідовності основ, наведеній у SEQ ID Виведений з цієї відкритої рамки зчитування NО:1. Цей регуляторний елемент можна отримати протеїн має молекулярну масу 26,4кДа і значення звичайним методом клонування з геномною ДНК рІ 6.1. Основні амінокислоти, що входять до скларису або плазміди pGAl 173-9, наприклад, коли ду протеїну, представлені аланіном (21,9%), гліципослідовність основ SEQ ID NО:2 застосовують ном (9,9%) і проліном (10,2%), а його амінокислотдля синтезу відповідного праймера і після цього на послідовність включає гідрофобну N-кінцеву здійснюють звичайну ПЦР. ділянку, яка може брати участь у спрямованому Рослинний експресійний вектор за даним випереносі протеїну в мембранну фракцію або в понаходом містить, наприклад, регуляторний елезаклітинний простір, екстенсинподібний мотив мент, наведений у SEQ ID NО:2, причому, регуляSPPPPPP і багату на гліцин ділянку. Відповідно до тор специфічної для пиляка експресії злитий з аналізу гомології з використанням бази даних 11 74535 12 іншим цікавим для винаходу геном. Як потрібний Рекомбінантні послідовності ДНК за винахоген може застосовуватися репортерний ген, такий дом можуть інтродукуватися в рослинну клітину за допомогою численних добре відомих методів. Фаяк ген -глюкуронідази (GUS), а для цілей індукції хівцям у даній сфері має бути ясно, що вибір споаномального розвитку пиляків рису може застосособу визначається типом рослини, яка підлягає вуватися DTA (ген токсичного продукту, що руйнує трансформації, а саме одночастковою чи двочастклітини), ген РНКази і т.ін. (див. нижче), але цікаковою рослиною. Придатні методи трансформації вий для винаходу ген не обмежений ними. рослинних клітин включають мікроін'єкцію Рослинний експресійний вектор може містити [Crossway та ін., BioTechniques 4: 320-334 (1986)], другу касету експресії, яка включає маркерний ген, електропорацію [Riggs та ін., Ргос. Natl. Acad. Sci, що дає можливість здійснювати добір трансфорUSA 83: 5602-5606 (1986), опосередковувану мантів. Приклади селектованих маркерних генів Agrobacterium трансформацію (Hinchee та ін., або маркерних генів, що їх можна відібрати в реBiotechnology 6: 915-921 (1988), безпосередній зультаті скринінгу, наведено нижче. Для певних перенос гена (Paszkowski та ін., ЕМВО J. 3: 2717видів-мішеней кращими можуть виявитися різні 2722 (1984), і спосіб балістичного прискорення маркери для селекції за ознакою стійкості до античасток з використанням пристроїв, що випускабіотика або гербіциду. Звичайно застосовувані для ються фірмами Agracetus, Inc., Медисон, штат Витрансформації селектувальні маркери включають сконсин і Dupont, Inc., Вілмінгтон, штат Делавар ген nptll, який дає стійкість до канаміцину, паромо(див., наприклад, патент США 4945050; і McCabe міцину, генетицину і споріднених антибіотиків та ін., Biotechnology 6: 923-926 (1988)]. Підлеглі [Vieira і Messing, Gene, 19: 259-268 (1982); Bevan трансформації клітини можуть являти собою дита ін., Nature 304: 184-187 (1983)], бактеріальний ференційовані клітини листя, ембріогенні клітини ген aad, що кодує спектиноміциндетоксикувальний або будь-який інший тип клітин. фермент аміноглікозид-3'-аденілтрансферазу і Для безпосередньої трансформації протоплазумовлює стійкість до стрептоміцину або спектистів поглинання екзогенного генетичного матеріаноміцину [Goldschmidt-Clermont Μ., Nucl. Acids лу протопластом можна посилити застосуванням Res. 19: 4083-4089 (1991)], ген hph, що дає стійхімічного агента або електричного поля. Раніше кість до антибіотика гігроміцину [Blochinger і проведено дослідження з використанням двочастDiggelmann, МоI. Cell Biol., 4: 2929-2931 (1984)], і кової рослини тютюну, що дозволило здійснити ген dhfr, що дає стійкість до метотрексату включення чужорідної ДНК і трансформацію по[Bourouis та ін., ЕМВО J., 2: 1099-1104 (1983)]. Інші томства рослин [Paszkowski та ін., ЕМВО J. 3: маркери, що їх можна використати, включають ген 2717-2722 (1984); Potrykus та ін., 1985, МоI. Gen. фосфінотрицинацетилтрансферази, що зумовлює Genet 199: 169-177]. За допомогою цієї методики стійкість до гербіциду фосфінотрицину [White та трансформують протопласти одночасткових росін., Nucl. Acids Res. 1?: 106,2 (1990); Spencer та ін., лин, наприклад, Triticum monococcum, Lolium Theor. Appl. Genet. 79: 625-631 (1990)], мутантний multiflorum (райграс італійський), кукурудзи і чорної ген EPSP-синтази, що кодує стійкість до гліфосату мексиканської солодкої кукурудзи. Додатковим [Hinchee й ін., Biotechnology 6: 915-922 (1988)], оптимальним варіантом здійснення є метод транмутантний ген ацетолактатсинтази (ALS), що зусформації протопласта кукурудзи, описаний в ЕР мовлює стійкість до імідазоліону або сульфонілсе0292435, а також в ЕР 0846771. Методи трансфочовини [Lee та ін., ЕМВО J., 7: 1241-1248 (1988)], рмації кукурудзи також описано в [Koziel та ін., мутантний ген psb, що зумовлює стійкість до атраBio/Technology 11:194-200 (1993)]. Трансформацію зину [Smeda та ін., Plant Physiol. 103: 911-917 рису можна здійснити за допомогою методик без(1993)], або мутантний ген протопорфіриногенокпосереднього переносу генів з використанням сидази, описаний в ЕР 769059. Можна також запротопластів або за допомогою бомбардування стосовувати селектувальні маркери, що дозволячастками. Опосередковувана протопластом транють здійснювати позитивний добір, такі як ген сформація описана для японських і індійських тифосфоманозоізомерази, описаний у заявці на папів рису [Zhang та ін., Plant Cell Rep. 7: 379-384 тент WO 93/05163. (1988); Shimamoto та ін., Nature 338: 274-277 Ідентифікацію трансформованих клітин також (1989); Datta та ін., Biotechnology 8: 736-740 можна здійснити за допомогою експресії придат(1990)]. Обидва типи рису також трансформують них для скринінгу маркерних генів, таких як гени, стандартними методами з використанням бомбарщо кодують хлорамфеніколацетилтрансферазу дування частками [Christou та ін., Biotechnology 9: (CAT), -глюкуронідазу (GUS), люциферазу і зеле957-962 (1991)]. У заявці на патент ЕР 0332581 ний флуоресцентний протеїн (GFP), чи будь-які описані методи одержання, трансформації і регеінші протеїни, що зумовлюють фенотипійно помітні нерації протопластів рослин род. тонконогових ознаки в трансформованих клітин. (Pooideae). Ці методи дають можливість здійснюЕкспресійний вектор можна сконструювати вати трансформацію всіх видів грястиці (Dactylis злиттям зазначеного регулятора специфічного для spp.) і пшениці. Крім того, трансформація пшениці пиляка експресії з потрібним геном і наступного описана в ЕР 0674715 і в Weekes зі співавторами, вмонтовування його шляхом лігування у відповід1993 [Plant Physiol. 102: 1077-1084]. Сконструйоний рослинний експресійний вектор. Наприклад, ваний у такий спосіб рослинний експресійний векрегуляторний елемент зливають з GUS без змін тор можна, наприклад, інтродукувати у калюси рамки зчитування і потім злитий продукт лігують з рису за допомогою загальноприйнятого методу бінарним вектором pGA1633, що має здатність трансформації рослин, при цьому індукується диекспресуватися в рослинах, одержуючи експресійференціювання коріння й листя і потім рослини ний вектор pGA1647. 13 74535 14 можна перенести в квітковий горщик для культиг) ген gin-рекомбінази гена Мі фага, що кодує вування, одержуючи тим самим трансформовані сайтспецифічну ДНК-рекомбіназу, яка може виклирослини рису. кати реаранжування генома і зниження життєздатОптимальним методом трансформації рослин ності клітин при експресії в рослинних клітинах є опосередковувана Agrobacterium трансформація. [Maeser та ін., Моi. Gen. Genet. 230: 170Як репрезентативний приклад опосередковуваної 176(1991)]; Agrobacterium трансформації експресійний вектор д) ген синтетази індолоцтова кислота-лізин PGA1647 переносять у Agrobacterium tumefaciens, (iaaL) Pseudomonas syringae, що кодує фермент, що несе бінарну Ті-плазміду, використовуючи меякий забезпечує кон'югацію лізину з індолоцтовою тод заморожування-відтавання [An G. та ін. (ред.) кислотою (ІАА). При експресії в клітинах рослин він Plant Molecular Biology Manual, cтop.A3/1-A3/19, спричиняє порушення розвитку внаслідок видаKluwer Academic Publishers, Dordrecht (1998)], а лення ІАА із клітин у результаті кон'югації [Romano потім вирощують у рідкому АВ-середовищі, доповта ін., Genes and Development 5: 438-446 (1991); неному відповідними антибіотиками [Chilton M-D, Spena та ін. Моl. Gen. Genet. 227: 205-212 (1991); Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 3672-3676 (1974)], і Roberto та ін., Pro Natl Acad Sci USA, 87: 5795-5801 отриманий у такий спосіб продукт спільно культи(1990)]; і вують з калюсами на середовищі 2N6-As, допове) ген токсину Cyt Bacillus thuringiensis неному 1мМ бетаїну [Hiei Y. та ін., Plant J., 6: 271israeliensis, що кодує москітоцидний (токсичний 282 (1994)] у темноті при 25°С протягом 2-3 днів. для комарів) і гемолітичний протеїн. При експресії Спільно культивовані калюси промивають стерив рослинних клітинах він викликає загибель клітин льною водою, що містить цефотаксим, і знову інчерез руйнування клітинної мембрани [McLean та кубують у Ν6-середовищі, що містить відповідний ін., J. Bacteriology 169: 1017-1023 (1987); Ellar та антибіотик і цефотаксим, протягом 3-4 тижнів, ін., патент США 4918006, 1990]. одержуючи активнорослі калюси. Ці калюси переПриклади носять у відповідне середовище для селекції, наНижче даний винахід описано докладніше з приклад, MS-середовище (фірма Life посиланням на приклади, які жодним чином не Technologies), доповнене 0,2мг/л НОК (нафталіноспрямовані на обмеження обсягу даного винаходу. цтова кислота), 2мг/л кінетину, 2% сорбіту, 1,6% Приклад 1: Виділення специфічного для пиляка фітагару (фірма Gibco), що відповідає антибіотирису гена RA8 ком і 250мг/л цефотаксиму, а потім культивують Стадія 1: Виділення гена RA8 протягом 2-3 тижнів в умовах безперервного освіКвітки рису (Oryza sativa L. Nakdong) на стадії тлення з інтенсивністю 30-60мкмолів м-2с-1, оптипізньої вакуолізованої поперечно розрізають на -2 -1 мально 40мкмолів м с , одержуючи проростки. Ці три частини. Як зразок з високим умістом пиляків проростки висаджують і вирощують у вегетаційній використовують середню ділянку, яка містить інтакамері в умовах 10год світло/14год темноти, одерктні пиляки і частини верхньої і нижньої квіткової жуючи трансгенні рослини рису. луски. З цієї ділянки з високим умістом пиляків У випадку, коли застосовуваний відповідно до виділяють мРНК, використовуючи набір для видіцього методу вектор містить злитий ген регулятолення мРНК "poly (A) Quick mRNA Isolation" (фірма рного елемента за даним винаходом і гени DTA чи Stratagene, США). Конструюють бібліотеки кДНК за РНКази і т.ін., трансформована вектором рослина допомогою набору "ZAP-cДHK Gigapack 2 Gold має ознаку чоловічої стерильності. Cloning" (фірма Stratagene), у яких як матрицю Кодувальна послідовність ДНК за даним винавикористовують мРНК. ходом може являти собою будь-яку послідовність Цю ж методику застосовують для листя, що ДНК, що кодує потрібний поліпептид. Однак особзбирають у 6-денних проростків рису для конструливо бажаними згідно з даним винаходом є кодуювання бібліотек кДНК листа. вальні послідовності ДНК, що кодують поліпептидЗі сконструйованих бібліотек кДНК пиляка доний продукт, при експресії якого в тканині пиляка вільно відбирають 33 клони кДНК і після цього дірослина не може утворювати життєздатний пилок. лянки кДНК, що одержують розщепленням відпоПриклади таких кодувальних послідовностей ДНК відного клону ДНК за допомогою EcoRI, мітять включають гени, описані в наведених нижче посирадіоактивним ізотопом 32Р і гібридизують із бляшланнях, повністю включених у даний опис як посиками з бібліотеки кДНК листа. лання: У результаті цього 6 клонів кДНК пиляка, що а) ген ланцюга А дифтерійного токсину (DTA), не дають позитивної реакції з бляшками з бібліощо інгібує синтез протеїнів [Greenfield та ін., Proc. теки кДНК листа, і серед цих клонів відбирають Natl. Acad. Sci., USA, 80: 6853 (1983); Palmiter та один клон, що найчастіше присутній у бібліотеці ін., Cell 50: 435-443(1987)]; кДНК пиляка, і позначають як RA8. б) ген пектат-ліази pel Erwinia chrysanthemi EC Фаг-хелпер fl R408 (фірма Stratagene) засто16, що розщеплює пектин, викликаючи лізис клітин совують для одержання рекомбінантної плазміди [Keen та ін., J. Bacteriology 168: 595 (1986)]; pGAl 173-4 (RA8) з цього клону RA8, у який фрагв) ген T-urfl3 (TURF-13) з cms-T мітохондрійних мент кДНК вмонтовують шляхом вирізання in vivo, геномів кукурудзи: цей ген кодує поліпептид, позі послідовності основ кДНК RA8, які клонують у начений як URF13, що руйнує мітохондрійні чи вищевказаній плазміді, визначають методом плазматичні мембрани [Braun та ін., Plant Cell 2: Sanger та ін. [Sanger F. та ін., Ргос. Natl. Acad. Sci. 153 (1990); Dewey та ін., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 5463-5467 (1977)]. USA, 84: 5374 (1987) і Dewey та ін., Cell 44: 439 Ці послідовності основ представлені в SEQ ID (1986)]; NO:7. Як видно з SEQ ID NO:7, нуклеотидна послі 15 74535 16 довність кДНК RA8 складається з 1008 пар основ. нують SacI-EcoRI-фрагмент завдовжки 4,3т.п.н. Відкрита рамка зчитування простягається від nt 51 Sacl-фрагмент завдовжки 2,9т.п.н. з SacIдо nt 842 SEQ ID NO:7,. що складається з 264 аміEcoRI-фрагмента завдовжки 4,3т.п.н. містить 5'нокислотних залишків. Протеїн, виведений з цієї фланкувальну послідовність і 5'-кодувальну ділянвідкритої рамки зчитування, має молекулярну масу ку, у той час як примикальний SacI-EcoRI26,4кДа і рІ 6,1. Послідовність, що оточує перший фрагмент завдовжки 1,5т.п.н. містить іншу кодуваATG, добре відповідає консенсусній послідовності льну ділянку і 3'-фланкувальну послідовність. Два ініціації трансляції одночасткових рослин, відомій з інтрони (інтрон 1 і інтрон 2) і 3 екзона присутні в літератури [Joshi С.Р. та ін., Plant МоI. Biol., кодувальній ділянці. Щодо SEQ ID NO:1 ці 3 екзони 35:993-1001 (1997)], полі-а-хвіст локалізований у локалізовані в такий спосіб: екзон 1: nt 1247 - nt положенні 164 послідовності основ, розташованої 1288; екзон 2: nt 1423-1555; екзон 3: nt 2150 - nt по ходу транскрипції щодо кодона термінації тран2766. Інтрон 1 складається з 134 пар основ і локасляції TGA. У 3'-некодувальній ділянці присутня лізований між 14-им і 15-им колонами, що відповіконсенсусна послідовність сигналу поліаделювандає nt 1289 - nt 1422 SEQ ID NO:1, а інтрон 2 скланя ААТАА. дається з 594 пар основ і локалізований на 59-ому Основні амінокислоти, що входять до складу кодоні, що відповідає nt 1556 - nt 2149 SEQ ID зазначеної вище амінокислотної послідовності, NO:1. Обидва інтрони містять консенсусні послідопредставлені аланіном (21,9%), гліцином (9,9%) і вності GT і AT на 5'- і 3'-кінцях відповідно. 5'проліном (10,2%), а їхня амінокислотна послідовфланкувальна послідовність кодувальної ділянки ність включає гідрофобну N-кінцеву ділянку, яка RA8 містить послідовність СААТ-бокса, СААТ проможе брати участь у спрямованому переносі простягається від основи -82 до -79, що відповідає nt теїну в мембранну фракцію або в позаклітинний 1116 - nt 1119 SEQ ID NO:1, а послідовність ТАТАпростір, екстенсинподібний мотив SPPPPPP і бабокса, TATAATA простягається від положення від гату на гліцин ділянку. Відповідно до аналізу гомо53 до -47, що відповідає nt 1145 - nt 1151 SEQ ID логії з використанням бази даних Genebank, така NO:1. амінокислотна послідовність є новою і її послідовSacl-фрагмент завдовжки 2,9т.п.н. клонують у ність не є в значній мірі ідентичною до жодної з плазмідному векторі pBluescript SK (-), і цю плазмівідомих дотепер послідовностей генів. ду позначають як pGAl 173-9. Ця плазміда депоноСтадія 2: Аналіз РНК методом блотингу вана в [Korea Research Institute of Bioscience and Для підтвердження того, що отриманий на наBiotechnology, філії Korea Advanced Institute of веденій вище стадії 1 ген RA8 специфічно експреScience and Technology (KAIST), 29 липня 1998p. сується в пиляку, загальну РНК виділяють з листя, під реєстраційним номером КСТС 8899Р]. коріння, молодих квіток, зрілих квіток і верхПослідовності основ фрагмента геномної ДНК, ньої/нижньої квіткової луски, маточок і тичинок що клонують у плазміді pGA1173-9, аналізують, квіток рису, піддають електрофорезу і потім перевикористовуючи метод Sanger та ін., і визначають носять на нейлонову мембрану. Для здійснення промоторну ділянку завдовжки приблизно 2,5т.п.н. блотингу РНК як зонд використовують мічену за у порівнянні з кДНК. допомогою 32Р-кДНК RA8. Для вивчення геномної варіабельності клону мРНК RA8 присутня тільки в квітках на різних RA8 геномну ДНК, виділену з листя 2-тижневих стадіях розвитку, але відсутня у листі й корінні. проростків рису, розщеплюють за допомогою Рівень експресії гена RA8 зростає в міру розвитку EcoRI, Hindlll чи Pst і потім піддають ДНК-блотингу квітки, досягаючи максимуму в зрілих квітках. Для з кДНК RA8. кДНК-зонд RA8 гібридизується з однітого, щоб визначити специфічність експресії щодо єю смугою геномної ДНК рису, що доводить, що певного органа квітки, експеримент із блотуванням ген RA8 існують в одній копії в геномі рису. РНК здійснюють з використанням загальної РНК, Приклад 2: Одержання рослинного експресійвиділеної з різних органів квітки. Кожний з органів ного вектора квітки розсікають під препарувальною лупою для Бінарний вектор, що містить репортерний ген того, щоб мінімізувати забруднення іншими оргаGUS і ген для селекції hph (гігроміциннами. Результат свідчить про те, що мРНК RA8 фосфотрансфераза), конструюють у такий спосіб. присутня в пиляках, але відсутня у плодолистку Плазміду pGA748 [An G., Binary Ті plasmid або верхній/нижній квітковій лусці. vectors, Agrobacterium protocols. Humana Press, Стадія 3: Виділення геномного клону RA8 cтop.47-58] розщеплюють за допомогою BamHI і Бляшки геномних бібліотек рису [які конструHindlll, і потім у неї вмонтовують промотор юють стандартними методами й одержують від CaMV35S [Benfey та ін., Science, 250: 959-966 Steve Kay і Nam-Hi Chua з Університету Рокфел(1993)]. Ген, що зумовлює стійкість до гігроміцину лера у формі ДНК фага лямбда EMBL, у яку вмон(гігроміцин-фосфотрансфераза, hph) [Gritz та ін., товують геномну ДНК рису] переносять на нейло(1983)] вмонтовують у сайт Bglll отриманої в такий нову мембрану [типу Hybond, фірма Amersham] і спосіб плазміди. Цю плазміду розщеплюють за гібридизують з радіоактивноміченою за допомогою допомогою Hindlll і Clal, "затуплюють" кінець і потім 32 Р кДНК RA8 як зонди для гібридизації. Гібридилигують. Отриману в такий спосіб плазміду роззовану нейлонову мембрану експонують на рентщеплюють за допомогою Sac для видалення фрагенівську плівку й одержують клони фата з блягмента завдовжки приблизно 0,5т.п.н. і потім пошок, що дають позитивну реакцію. ДНК фага вторно лигують. У сайт BamHI цієї плазміди лямбда виділяють з цих клонів фата, розщеплювмонтовують синтетичний адаптер, що несе сайти ють за допомогою ВатHI, одержуючи геномний розщеплення BamHI, Hindlll, Xbal, Sac, Hpal, Kpnl, фрагмент завдовжки 13,7т.п.н. і в ньому субклоClal і Bglll, створюючи плазміду pGA1182. 17 74535 18 Здійснюють ПЦР, використовуючи плазміду міцину калюси переносять у середовище для сеPGA1182 як матрицю, 5'-TTGGCATGCACATAC-3' лекції [наприклад, MS-середовище (фірма Life (SEQ ID NO:5) у функції праймера 1 і 5'Technologies) + 0,2мг/л НОК (нафталіноцтова кисCGGGATCCGTGTTTGACAGG-3' (SEQ ID NO:6) у лота) + 2мг/л кінетика + 2% сорбіту + 1,6% фітагафункції праймера 2. ру (фірма Gibco) + 50мг/л гігроміцину В + 250мг/л Отриманий фрагмент завдовжки приблизно цефотаксиму], а потім культивують протягом 2-3 120 пар основ розщеплюють за допомогою BamHI тижнів в умовах безперервного освітлення з інтені Sph, а потім умонтовують шляхом літування у сивністю 40 //мкмолів м-2с-1. Отримані в такий спофрагмент завдовжки приблизно 9т.п.н., що одерсіб проростки висаджують і вирощують у вегетажують шляхом розщеплення плазміни pGAl 182 за ційній камері в умовах 10год світла/14год темноти, допомогою цих же рестриктаз. Між сайтами ВатHI і одержуючи в цілому 22 трансгенніі рослини рису. Clal отриманої в такий спосіб плазміди вмонтовуДля добору лінії рослини з найбільш високим ють ген GUS [Jefferson та ін., ЕМВО J, 6: 3901рівнем експресії в пиляках серед цих двадцяти 3907 (1987)], створюючи бінарний вектор двох (22) трансгенних рослин рису, здійснюють pGA1633. гістохімічне фарбування на GUS квітковій ділянці Плазміду pGA1173-9, що містить геномну ДНК трансгенної рослини рису відповідно до методу RA8 завдовжки 2,9т.п.н., сконструйовану на стадії Dai та ін. [Dai Ζ. та ін., Plant МоI. ВіоI., 32; 10553 прикладу 1, піддають ПЦР із використанням син1065 (1996)], з тією модифікацією, що в розчині тетичних олігомерних праймерів, представлених у для фарбування міститься 20% метанолу, і потім SEQ ID NO:8 (AATTAACCCTCACTAAAGGG) і SEQ фіксують у фіксаційному розчині (50% етанолу, 5% ID NO:9 (GCGGATCCAGGTT-GAACCAC). Синтеоцтової кислоти і 3,7% формальдегіду). Дослітичний олігомер, послідовність якого наведена в дження зразків проводять за допомогою препаруSEQ ID NO:9, забезпечує створення сайта ВатHI в вальної лупи ( 7,5-кратне збільшення). На основі екзоні 2 гена RA8. цих результатів відбирають рослину рису з найПотім конструюють плазміду pGA1639, що місбільш високим рівнем експресії GUS у пиляках і тить ампліфіковану послідовність, зазначену випозначають як трансгенна лінія рослини А11279. ще. Плазміда pGA1639 містить Sacl-ВатHIПриклад 4: Гістохімічний аналіз GUS v трансфрагмент завдовжки 2,7т.п.н., що включає 5'генних рослинах рису фланкувальну ділянку екзона 1, інтрон 1 і частину Для вивчення просторової і тимчасової схем екзона 2 гена RA8. експресії гена RA8, молоді квітки, квітки на ранній Цей фрагмент з'єднують з кодувальною послістадії вакуолізованого пилка, зрілі квітки, листя і довністю -глюкуронідази в pGA1633, створюючи коріння трансгенної лінії рису АН279, отриманої в рослинний експресійний вектор pGA1647. У вектоприкладі 3, піддають гістохімічному аналізу щодо рі pGA1647, описану вище походженням з гена активності GUS відповідно до методики, описаної RA8 послідовність зливають у новов прикладі 3, і потім обстежують під мікроскопом. інтродукованому сайті BamHI в екзоні 2 з геном Як контроль використовують квітку нетрансфорGUS без якого-небудь розщеплення відкритої раммованої рослини рису. ки зчитування. У такий спосіб одержують трансляЕкспресія GUS під контролем промотору RA8 ційне злиття між частиною гена RA8 і кодувальною виявлена тільки в пиляках квіток рису, але не виявлена в інших органах квітки або в листі чи корінпослідовністю -глюкуронідази. ні. Крім того, рівень експресії репортерного гена Приклад 3: Одержання трансгенної рослини GUS підвищувався в міру дозрівання квіток і ексрису пресія зовсім не відбувалася в молодих квітках на Експресійним вектором pGA1647, сконструйостадії, що передує мейозу. ваним відповідно до способу, описаного в прикладі Для вивчення схем специфічної для пиляка 2; трансформують штам Agrobacterium tumefaciens експресії конструкції промотор RA8 - репортерний LBA4404 [Hoekema та ін., Nature, 303: 179-181 ген після фарбування і фіксації 4 пиляки з квіток (1983)) який несе бінарну Ті-плазміду pAL4404, рису на різних стадія розвитку, відповідно до мевикористовуючи метод заморожування-відтавання тодики, описаної в прикладі 3, занурюють у парап[An G. та ін., (ред.) Plant Molecular Biology Manual, ласт (фірма Sigma) і роблять зрізи завтовшки стор.А3/1-А3/19, Kluwer Academic Publishers, 10мкм. Зрізи обстежують за допомогою світлового Dordrecht (1988)]. Трансформований штам Agrobacterium мікроскопа ( 100-кратне збільшення), використоtumefaciens LBA4404 вирощують протягом 3 днів у вуючи темнопільне освітлення. На стадії, що перідкому АВ-середовищі, доповненому 30мг/л гігредує мейозу, активність GUS не виявлена в жодроміцину В і 3мг/л тетрацикліну, і його спільно куній з частин пиляка. Експресія GUS уперше льтивують із тритижневими калюсами, ріст яких виявлена в момент часу, коли мікроспори вивільіндукують зі скутелуму зрілого насіння у середоняються з тетрад. Найбільш високий рівень активвищі N6 [Chu С.С. та ін., Sci, Sin., 18: 659-668 ності GUS виявлений у пиляках на стадії вакуолі(1975)], що містить 2мг/л 2,5-Д, у середовищі 2N6зованого пилка. Однак у пиляках на стадії зрілого As, доповненому 1мМ бетаїну [Hiei Y. та ін., Plant пилка безпосередньо перед розкриттям чи після J., 6: 271-282 (1994)] у темноті при 25°С протягом нього активність GUS різко знижується. Установ2-3 днів. Спільно культивовані калюси промивають лено, що фарбування щодо GUS обмежено тапестерильною водою, що містить 100мг/л цефотактумом, сполучною тканиною і тканиною ендотецію. симу, і знову інкубують у N6-середовишд, що місПриклад 5: Одержання трансгенної рослини тить 40мг/л гігроміцину і 250мг/л цефотаксиму, кукурудзи протягом 3-х тижнів. Активнорослі, стійкі до гігроТрансформацію кукурудзи за допомогою ново 19 74535 20 го гена, отриманого за допомогою описаного вище у стані росту пересівають у середовище, що місспособу, здійснюють шляхом бомбардування міктить 3-20мг/л Basta . роснарядами або незрілих зиготичних зародків, Для добору з використанням гена манозофоабо розмножуваного серійно ембріогенного калюсфат-ізомерази тканини-мішені поміщають у відса типу І. повідні середовища, які не містять сахарози, але З незрілих зародків завдовжки 1,5-2,5мм, містять 1% манози. З цих середовищ амінокислоти отриманих з вирощеного в теплиці матеріалу, ініне видаляють. Через 5-8 тижнів калюс у стані росціюють розвиток культур ембріогенного калюса ту або пересівають у середовище D для підтритипу І кукурудзи [Green та ін., Miami Winter мання розвитку калюса, яке не містить сахарози і Symposium 20, 1983]. Зародки виділяють в асептимістить 1,5% манози, або в КМ-середовище для чних умовах з качанів зі стерилізованою поверхпідтримання розвитку калюса, що містить 1% санею приблизно через 14 днів після запилення. харози і 0,5% манози. Ембріогенний калюс, який Зародки або поміщають на D-середовище для росте в середовищі для селекції, пересівають кожініціації розвитку калюса, що містить 2% сахарози і ні 2 тижні протягом 4-8 тижнів до одержання кіль5мг/л хлорамбену [Duncan та ін., Planta 165: 322кості калюсів, достатніх для регенерації 10-20 рос332 (1985)], або в КМ-середовище для ініціації ролин. Тканину, що вижила після селекції, з звитку калюса, що містить 3% сахарози і 0,75мг/л вихідного шматочка тканини-мішені пересівають у 2,4-Д [Као 14 Michayluk, Planta 126: 105-110 вигляді одиничної колонії і позначають як незале(1975)]. Потім зародки і ембріогенний калюс кульжний випадок трансформації. тивують у темноті. З експлантатів приблизно через У цей момент часу, колонії, відібрані в середо14 днів виділяють зародки, що дають ембріогенну вищі з додаванням Basta , переносять у модифіреакцію. Зародки з D-середовища, ініціатора розковане MS-середовище [Murashige і Skoog, витку калюса, які дають ембріогенну реакцію, поPhysiol. Plant 15: 473-497 1962], що містить 3% міщають у D-середовище для підтримання розвитсахарози (MS3S), без селектувального агента і ку калюса, що містить 2% сахарози і 0,5мг/л 2,4-Д, поміщають на світло. У це середовище додають а ті, що дають ембріогенну реакцію зародки з Кмабо 0,25мг/л анцимідолу і 0,5мг/л кенетину для середовища, яке ініціює розвиток калюса, помітого, щоб індукувати розвиток зародка, або 2мг/л щають у Км-середовище для підтримання розвитбензиладеніну. Колонії, відібрані за допомогою ку калюса, що містить 2% сахарози і 5мг/л Дикамманози, переносять на модифіковане MSба. Після інкубації протягом 3-8 тижнів із середовище, що містить 2% сахарози і 1% манози щотижневим пересіванням у свіже середовище (MS2S+1М) з описаними вище добавками анцимідля підтримання розвитку калюса, одержують долу і кінетика, або на модифіковане MSкомпактні ембріогенні культури високої якості. середовище, що містить 2% сахарози і 0,5% маноШматочки активнорослого ембріогенного калюса зи (MS2S+0,5М) з описаною вище добавкою бенвідбирають як тканину-мішень для введення гена. зиладеніну. Шматочки калюса поміщають на пластині-мішені, Через 2 тижні регенерувальні колонії, відібрані що містять підтримувальне середовище, з 12% на середовищі з додаванням Basta , переносять сахарози, приблизно за 4год до введення гена. на середовище MS3S без анцимідолу і кенетину Шматочки калюса розміщають по колах радіусами чи бензиладеніну відповідно. Регенерувальні ко8 і 10мм від центра пластини-мішені. Плазмідну лонії, відібрані за допомогою манози, через 2 тижні ДНК осаджують на золоті мікроносії відповідно до переносять на безгормональне середовище інструкції фірми DuPont Biolistic. Два-три мкг кожMS2S+1М і MS2S+0,5М відповідно. Регенерувальної плазміди використовують для обробки 6 виконі паростки з корінням і без коріння з усіх колоній ристовуваних як снаряди мікроносіїв. Гени вводять переносять у ящики Magenta, що містять середоу клітини тканини-мішені за допомогою пристрою вище MS3S, і зрештою одержують невеликі ростипу PDS-lOOOHe Biolistics. Пристрій типу Biolistics лини з коренями, які переносять у грунт у теплицю. має такі параметри настроювання: відстань між Рослини тестують щодо експресії гена РМІ на диском, що руйнується, і макроносієм 8мм, відсоснові модифікованого аналізу в 48-ямкових тань між макроносієм і затримувальним екраном планшетах із хлорфенолом червоним з викорис10мм і відстань між затримувальним екраном і танням середовища, що не містить сахарози і місмішенню 7см. Кожну пластину-мішень обстрілютить 0,5% манози. Зразки листа (~5мм 5мм) поміють двічі, використовуючи диски, що руйнуються щають на середовище для аналізу і вирощують у при тиску залпу 650фунтів/кв.дюйм. Між затримутемноті протягом ~72год. Якщо в рослині відбувавальним екраном і тканиною-мішенню поміщають ється експресія гена РМІ, то воно може метаболіекран з нержавкої сталі розміром 200 200меш зувати манозу, і середовище набуває жовтого за[McMaster-Carr, Нью-Брунсвік, штат Нью Джерсі]. барвлення. Якщо експресія не відбувається, то Через 7 днів після введення гена шматочки середовище зберігає червоний колір. тканини-мішені переносять із середовища з висоВипадки трансформації також створюють з виким осмотичним тиском у середовище для добору. користанням калюса типу І, отриманого з незрілих Для добору з використанням гена BAR шматочки зиготичних зародків за допомогою стандартних тканини-мішені поміщають у підтримувальне семетодів культивування. Для введення гена прибредовище, що містить 100мг/л глуфосинату амолизно 300мг калюса типу І одержують, пересіваюнію (Basta ) чи 20мг/л біалафосу (Herbiace ). Всі чи на свіже середовище за 1-2 дні до введення амінокислоти видаляють із середовища для селегена, відбираючи шматочки тканини-мішені і розкції. Через 5-8 тижнів вирощування в цьому сереміщаючи по колах радіусом 10мм від центра пласдовищі з високим тиском добору будь-який калюс тини-мішені на середовище, що знову містить 12% 21 74535 22 сахарози. Приблизно через 4год тканину піддають середовища для індукції і переносять в осмотикум бомбардуванню за допомогою пристрою типу (тобто в середовище для індукції з додаванням PDS-1OOOHe Biolistics фірми DuPont. Цікаві для необхідної концентрації сахарози або мальтози, як винаходу плазміди осаджують на золоті частки правило, 15%). Зародкам дають пройти стадію розміром 1мкм, використовуючи стандартний проплазмолізу протягом 2-3год і потім піддають бомтокол фірми DuPont. Гени вводять, обстрілюючи бардуванню. На пластину-мішень поміщають, як пластину-мішень двічі, використовуючи диски, що правило, 20 зародків, хоча ця кількість не має вируйнуються при тиску залпу 650фунтів/кв.дюйм. рішального значення. Відповідну плазміну, яка Приблизно через 16год після введення гена несе ген, осаджують на золоті частки розміром калюс переносять на стандартне середовище для близько мікрометра, використовуючи стандартні культивування, що містить 2% сахарози без селекметодики. Кожну пластину з зародками обстрілютувального агента. Через 12-13 днів після введенють за допомогою пристрою на основі гелію типу ня гена шматочки тканини-мішені переносять на DuPont Biolistics, використовуючи тиск залпу середовище для селекції, що містить 40мг/л фос~1000фунтів/кв.дюйм і стандартний екран з розміфінотрицину у вигляді або Basta, або біалафосу. ром пор 80меш. Після бомбардування зародки Калюс пересівають на середовище для селекції знову переносять у темноту для відновлення пропротягом 12-16 тижнів, після чого калюс, що вижив тягом приблизно 24год (усе ще в осмотикумі). Чеі росте, переносять на стандартне середовище рез 24год зародки видаляють з осмотикуму і помідля регенерації, яке містить 3мг/л фосфінотрицину щають на середовище для індукції, де їх у вигляді Basta для одержання рослин. культивують протягом приблизно 1 місяця до реПриклад 6: Трансформація пшениці генерації. Приблизно через 1 місяць експлантати Оптимальний метод трансформації пшениці зародків із ембріогенним калюсом, який розвивапередбачає бомбардування частками незрілих ється, переносять у середовище для регенерації зародків пшениці і включає перед уведенням гена (MS+1мг/л НОК, 5мг/л GA), що додатково включає стадію культивування на середовищі з високим відповідний селектувальний агент. Приблизно чеумістом або сахарози, або з високим умістом марез 1 місяць розвинені проростки переносять у льтози. Перед бомбардуванням будь-яку кількість великі стерильні контейнери, іменовані GA7, що зародків (завдовжки 0,75-1мм) поміщають на MSмістять MS-середовище половинної міцності, 2% середовище з 3% сахарози [Murashige and Skoog, сахарози і таку ж концентрацію селектувального 1962] і 3мг/л 2,4-д для індукції соматичних зародків агента. Стабільна трансформація пшениці описаі витримують у темноті. У вибраний день, признана докладно в ЕР 0674715. чений для бомбардування, зародки видаляють із Перелік послідовностей 23 74535 24 25 74535 26 27 74535 28 29 74535 30 31 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 74535 Підписне 32 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601