Спосіб індукування стійкості до вірусу, що містить послідовність потрійного блока генів 3, за умови, що це не х вірус картоплі, у клітині рослини або рослині, трансгенна рослина, стійка до вірусу

1. Спосіб індукування стійкості до вірусу, що містить послідовність потрійного блока генів 3, за умови, що це не X вірус картоплі, у клітині рослини або рослині, який включає стадії: - одержання конструкції нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що відповідає щонайменше на 70% послідовності нуклеїнової кислоти потрійного блока генів 3 зазначеного вірусу або його відповідної кДНК, функціонально злиту з однією або більше регуляторною послідовністю (послідовностями), активною в рослині, - трансформування клітини рослини конструкцією нуклеїнової кислоти і, при необхідності, - регенерацію трансгенної рослини з трансформованих клітин рослини. 2. Спосіб згідно з пунктом 1, який відрізняється тим, що послідовність нуклеїнової кислоти конструкції нуклеїнової кислоти відповідає щонайменше на 90% послідовності нуклеїнової кислоти потрійного блока генів 3 зазначеного вірусу або його комплементарної кДНК. 3. Спосіб згідно з пунктами 1 або 2, який відрізняється тим, що вірус вибраний із групи, яка складається з вірусу пористості стовбура яблуні, вірусу 2 (19) 1 3 70915 4 12. Трансгенна рослина згідно з пунктом 11, яка 16. Трансгенна рослина згідно з будь-яким із пунквідрізняє ться тим, що конструкція нуклеїнової тів із 11 по 15, яка відрізняється тим, що регулякислоти має послідовність нуклеїнової кислоти, торна послідовність містить послідовність промояка відповідає щонайменше на 90% послідовності тору і послідовність термінатора, активні в нуклеїнової кислоти потрійного блока генів 3 зарослині. значеного вірусу або його комплементарної кДНК. 17. Трансгенна рослина згідно з будь-яким із пунк13. Трансгенна рослина згідно з пунктами 11 або тів із 11 по 16, яка відрізняється тим, що регуля12, яка відрізняється тим, що вірус вибраний із торна послідовність (послідовності) містить послігрупи, що складається з вірусу пористості стовбудовність промотору, яка є послідовністю ра яблуні, вірусу опіку чорниці, М вірусу картоплі, конститутивного або чужорідного рослинного провірусу мозаїки білої конюшини, вірусу мозаїки мотору. Cymbidium, X вірусу картоплі, вірусу смугастої мо18. Трансгенна рослина згідно з пунктом 17, яка заїки ячменю, вірусу сухості верхівки картоплі, відрізняє ться тим, що послідовність промотору вірусу куртини арахісу і ґр унтового вір усу буряку. вибрана з групи, що складається з 35S промотору 14. Трансгенна рослина згідно з будь-яким із пункВірусу Мозаїки цвітної капусти і/або поліубіквітитів із 11 по 13, яка є рослиною, вибраною із групи, нового промотору Arabidopsis thaliana. що складається з яблуні, чорниці, картоплі, коню19. Трансгенна рослина згідно з пунктом 17 або шини, орхідеї, ячменю або арахісу. 18, яка відрізняється тим, що послідовність про15. Трансгенна рослина згідно з пунктами 11 або мотору є промотором, який, в основному, активний 12, яка відрізняє ться тим, що трансгенна рослина у кореневих тканинах, зокрема par промотором є буряком, переважно цукровим буряком (Beta гена гемоглобіну з Perosponia andersonii. vulgaris). вірус є BNYVV і послідовність нуклеїнової 20. Тканина трансгенної рослини, вибрана з групи, кислоти потрійного блока генів З зазначеного віруяка складається з плоду, стовбура, кореня, бульсу складається з нуклеотидів між 3627 і 4025 5' би, насінини рослини згідно з будь-яким із попереланцюга геномної або субгеномної РНК 2 BNYVV дніх пунктів із 11 по 19. або його відповідної кДНК. Даний винахід стосується способу індукування вірусної стійкості у клітині й рослині, зокрема, BNYVV-стійкості у клітині й рослині цукрового буряка, і одержання клітини й рослини, стійких до вірусу. Широко поширене вірусне захворювання рослини цукрового буряка (Beta vulgaris), за назвою Rhizomania, визивається фітовірусом, вірусом некротичних жовтих жилок буряка (BNYVV) (23, 24), який передається кореням буряка ґрунтовим грибком Polymyxa betae (25). Захворювання уражає значні площі землі в акрах в областях, де рослини цукрового буряка вирощують для промислового використання в Європі, США і Японії, і поширені в деяких місцевостях у Західній Європі (26, 27). Оскільки не існує практичного способу ефективного контролю поширення вірусу у великих масштабах хімічними або фізичними засобами (28), ні в рослинах, ні у грунті, основною метою була ідентифікація природних джерел стійкості у плазмі зародка цукрового буряка й розробка, шляхом схрещування, різноманітності рослин цукрового буряка, що експресують гени стійкості. Була ідентифікована безліч таких генів толерантності до вірусу і деякі були вдало використані у схре щуванні комерційних сортів цукрового буряка (29, 30, 31).Тільки використання BNVVV-стійких або толерантних сортів дозволить фермерам вирощува ти рослини цукрового буряка у областях, інфікованих BNYVV, де рослини цукрового буряка є істотним компонентом сівозміни і значно впливають на прибуток фермерів. Ряд детальних досліджень показав, що різниця в чутливості до BNVVV-інфекції серед генотипів або сортів цукрового буряка генетично відбиває різницю у проникненні або транслокації вірусу у тканинах кореня (32). Однак, існують повідомлення, які чітко показують, що гени толерантності, навіть із різних джерел плазми зародка цукрового буряка або плазми зародка диких родинних культур (33), можуть забезпечувати визначені механізми стійкості. Це може забезпечити більш керовану ситуацію для створення стратегій довгострокової BNVVVстійкості. З 1986 року в ряді повідомлень і публікацій описувалося використання послідовностей ізольованих вірусних генів, експресованих у рослинах, для підтвердження високого рівня толерантності проти вірусу або навіть для підтвердження широкого спектра типів стійкості проти ряду родинних вірусів (34, 35, 36). Однією з найбільш підтверджених стратегій вір усної стійкості, заснованої на генетичній інженерії, у багатьох видів, що культивуються, таких, як картопля, гарбуз, огірок або томат, є використання послідовності вірусних генів, що кодує білок оболонки вірусу-мішені (37), який, під контролем регуляторних елементів рослин, буде експресований у рослині. Однак, у випадку стійкості, опосередкованої білком оболонки, експресія визначеного рівня стійкості у трансгенній рослині може бути віднесена до різних механізмів, таких, як спільна експресія РНК, і необов'язково до продукування білкової послідовності. Загалом, послідовність вірусу буде трансформована у відповідну культур у клітин або тканин видів рослин, використовуючи опосередковану систему трансформації Agrobacterium або спосіб 5 70915 6 прямого переносу генів, відповідно до обмежень ті клони трансгенної картоплі, які включали ген способу культивування тканин або клітин, що мо8KG (конструкція TGB3). Однак, коли ці трансгенні же бути вдало застосований для даних видів. Буде рослини інфікували PVX, за хисту від PVX не винирегенерована ціла рослина й описана експресія кало, що говорить про те, що білок ОК не грає ролі трансгена. у за хисті проти PVX. Хоча цукровий буряк, відомий як складний вид Задачею даного винаходу є одержання нового для культивування клітин, що дозволяє обмежене способу введення різних вірусни х стійкостей у клівикористання практичних методів генетичної інжетину й рослину й одержання стійких до вірусу клінерії для цього виду, є ряд окремих повідомлень тини й рослини. про вдалу трансформацію й регенерацію цілих Основною задачею винаходу є одержання норослин (38). Також були опубліковані декілька привого способу введення BNYVV-стійкості у клітину й кладів викликаної інженерією толерантності до рослину й одержання стійких до BNYVV клітини й BNYVV шляхом трансформування й експресії порослини, зокрема, клітини й рослини цукрового слідовності білка оболонки BNYVV у геномі цукробуряка (Beta vulgaris ssp.). вого буряка (39, W091/13159), хоча в них рідко Даний винахід забезпечує використання альповідомляються дані про повністю функціонуючі тернативної послідовності вірусу рослин, особливо рослини трансгенного цукрового буряка (40). ЗокBNYVV, для одержання високого рівня толерантрема, у повідомленнях демонструються обмежені ності до вірусної інфекції, особливо, для надійного дані про рівень стійкості, досягнутий в умовах інзабезпечення швидкого й повного блокування фікування з рослинами трансгенного цукрового розмноження вірусу й механізмів дифузії у рослибуряка, трансформованими геном, що кодує пони, особливо, у рослину цукрового буряка (Beta слідовність білка оболонки BNYVV (41, 42). vulgaris). включаючи фуражний буряк, буряк Swiss Повний зміст технології, включаючи спосіб Whard і столовий буряк, які також можуть бути трансформації цукрового буряка й використання об'єктами цієї вірусної інфекції. Експресія стійкості експресії послідовності білка оболонки BNYVV у буде отримана у трансгенних клітині або рослині, якості джерела стійкості у рослини трансгенного особливо у клітинах або рослинах цукрового буряцукрового буряка, отриманої зазначеним способом ка, отриманих способом трансформації за заявкою трансформації, викладений у заявці на патент на патент W095/10178 або іншими способами W091/13159. трансформації, заснованими на Agrobacterium На основі опублікованої інформації не можна tumefaciens або на прямому переносі генів. Через прийти до висновку, що механізм стійкості, опосесвою високу ефективність спосіб трансформації, редкованої білком оболонки, забезпечує якийсь як показано в W095/10178, уможливлює одержанпотенціал для додання рослині цукрового буряка ня великих кількостей трансформованих рослин, повного імунітету до BNVVV-інфекції шляхом повособливо, рослин цукрового буряка, які можуть ного інгібування механізмів розмноження й пронибути проаналізовані й охарактеризовані за рівнем кнення вірусу. Для ідентифікації механізму стійкосїхньої вірусної стійкості, особливо, BNYVVті, який здатний значно блокувати поширення стійкості, включаючи їхню оцінку на полі. вірусу на ранній стадії процесу інфікування, осноГеном вірусу некротичних жовтих жилок бурявним критерієм успіху була б розробка такої транска (BNYVV) складається з п'ятьох позитивних РНК, генної стійкості, на додаток до факту, що навіть дві з яких (РНК 1 і 2) кодують функції, необхідні рівень стійкості, порівнянний до такої, відомої у для інфікування всіх рослин, тоді як інші три (РНК генів стійкості, ідентифікованих усередині плазми 3, 4 і 5) утягнуті в опосередковане вектором інфізародка цукрового буряка, міг би різноманітити кування коренів цукрового буряка (Beta vulgaris) доступні механізми стійкості. (1). Рух BN YVV від клітини до клітини регулюється Оскільки показане, що захворювання поширюнабором трьох послідовних вірусних генів, що злеється в багатьох країнах або областях із швидкісгка перекриваються, на РНК 2, відомих, як потрійтю, що залежить від наявності багатьох місцевих ний блок генів (TBG) (2), який кодує, у послідовночинників навколишнього середовища і сільського сті, вір усні білки Р42, Р13 і Р15 (геномні продукти, господарства, існує великий інтерес до забезпепозначені за їх підрахованими Мr у кілодальтонах чення різноманітності джерел механізмів генетич(3). ної стійкості, які можуть, поодинці або у сполученУ приведеному нижче описі гени TGB і відпоні, дати стабільну й довгострокову стратегію відні білки будуть ідентифіковані наступними терстійкості для даних і майбутніх сортів рослин цукмінами: TGB1, TGB2, TGB3 або Р42, Р13 і Р15 по рового буряка, які вирощують для промислового номеру вірусного білка, що кодується ними. Дублівикористання. кати TGB подані у інших фітовірусів (4, 5) і у поПублікація Хu Н. et al. (Plant Cell Report, Vol. 1текс-, карла- і гордеївірусів (6). 5, pp. 91-96 (1995)) описує отриману за допомогою У таблиці 1 подані віруси, що мають послідовгенетичної інженерії конструкцію стійкості до вірусу ність TGB3, молекулярну вагу TGB3 зазначених картоплі X в чотирьох комерційних культиварах вірусів, їхні хазяїни й посилання. картоплі. Однак, у зазначеному документі заявлені 7 70915 8 Таблиця Розмір Хазяїн TGB3 Вірус пористості стовбура яблуні 8 кДа яблуня Вірус опіку чорниці 7 кДа чорниця Вірус картоплі Μ 7 кДа картопля Вірус мозаїки білої конюшини 8 кДа конюшина Вірус мозаїки Cymbidium 10 кДа орхідея Вірус Вірус смугастої мозаїки ячменя 17 кДа ячмінь Вірус сухості вер хівок картоплі Вірус куртини арахісу 21 кДа 17 кДа Грунтовий вірус буряка 22 кДа картопля арахіс цукровий буряк Винахідники тут пропонують новий спосіб забезпечення вірусної стійкості до вірусів рослини шляхом блокування механізмів розмноження й дифузії вірусу в зазначену рослину, особливо у тканини його кореня. Для демонстрації зазначеної стійкості винахідники нижче описують вплив суперекспресії послідовностей TGB, окремо або у сполученні, на механізм розмноження й проникнення BNYVV у рослини С. quinoa, які також є хазяїнами вірусу BNYVV і якими легше маніпулювати професіоналу. Винахідники також провели експерименти на Beta macrocarpa. Ці результати показали, що буде можливо одержати також трансформацію рослин способом за даним винаходом і одержати експресію гена TGB3 за допомогою зазначених рослин. Тому, як пояснюється у приведеному нижче описі, зазначений спосіб міг би бути використаний для одержання різноманітних стійкостей до вірусів у різноманітних видах рослинах, схильних інфікуванню вірусами, що характеризуються наявністю послідовності TGB3 у їхньому геномі. Відомо, що BNYVV не потребує синтезу вір усного білка оболонки для продукування місцевих ушкоджень на листі хазяїнів, наприклад, Chenopodium quinoa (7), відзначаючи, що рух від клітини до клітини не потребує формування вірусу. Однак, спосіб, яким компоненти TGB беруть участь у процесі пересування, незрозумілий, хоча проведені за допомогою комп'ютера порівняння послідовностей виявили характерні консервативні послідовності, які можуть забезпечити ключ до розгадки їх функцій. Таким чином, 5'проксимальний білок TGB (TGB1) незмінно містить групи основних послідовностей, характерних для ATP/GTP-зв'язуючи х геліказ, у той час, як другий білок (TGB2) завжди має два гідрофобних домени, що потенційно охоплюють мембрану, розділених гідрофільною послідовністю, яка містить високо консервативну пептидну основну послідовність невідомого призначення (6). Послідовність і розмір третього білка TGB (TGB3) є більш варіабельною, хоча N-термінальна частина, звичайно є, скоріше, гідрофобною. Були виявлені субгеномні РНК 5'термінальним картуванням у зворотному напрямку від відкритих рамок зчитування (ORFs) BNYVV TGB1 і TGB2 (Фігура 1), але таких різновидів не було виявлено в TGB3 BN YVV (2) або в будь-яких Посилання Jelkman, J. Gen. Virol. 75,1535-1542(1994) Cavileer et al., J. Gen. Virol. 75, 711-720 (1994) Zavriev et al., J. Gen. Virol. 72, 9-14(1991) Forster et al., Nucl. Acids Res. 16, 291-303 (1988) Neo et al., Plant Моl. Biol. 18, 1027-1029 (1992) Gustafson et al., Nucl. Acids Res. 14, 3895-3909 (1986) Scott et al., J. Gen. Virol. 75, 3561-3568 (1994) Herzog et al., J. Gen. Virol. 75, 3147-3155 (1994) Koenig et al., Virology 216, 202-207 (1996) інших вір усів, що містять TGB. У випадку вірусу картоплі X (PVX; посилання 8) і вірусу смугастої мозаїки ячменя (BSMV; посилання 9), є доказ, що продукти TGB2 і TGB3 експресуються з тих самих субгеномних РНК. Дотепер не повідомлялося ні про один приклад вірусу, у якому три члени TGB розташовані різним способом на одній РНК або розподілені за різними геномними РНК, і який припускав би, що їхнє з'єднання у визначеному порядку може бути важливим для регуляції їхніх функцій. Даний винахід стосується способу індукування вірусної стійкості до вірусу, що містить потрійний блок генів (TGB), з умовою, що він не є вірусом картоплі X. Найкраще, щоб зазначений вірус був обраний із групи, що складається з вірусу пористості стовбура яблуні, вірусу опіку чорниці, вірусу картоплі М, вірусу мозаїки білої конюшини, вірусу мозаїки Cymbidiuia, вірусу смугастої мозаїки ячменя і грунтового вірусу буряка; зазначений спосіб містить наступні кроки: - одержання конструкції нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка відповідає, щонайменше, 70% послідовності нуклеїнової кислоти TGB3 зазначеного вірусу або його відповідної кДНК, функціонально злиту з однією або більше регуляторною послідовністю (послідовностями), активною в рослині, - трансформування клітини рослини конструкцією нуклеїнової кислоти і, можливо, - регенерації трансгенної рослини з трансформованої клітини рослини. Найкраще, щоб рослина була рослиною, яка може бути інфікована описаним вище вірусом, і найкраще, щоб вона була обрана з групи, яка вміщує яблуню, чорницю, картоплю, конюшину, орхідею, ячмінь, арахіс і цукровий буряк. Даний винахід також стосується отриманої клітини рослини і трансгенної (або трансформованої) рослини (отриманої із зазначеної клітини рослини), стійкої до зазначених вірусів і нуклеїнової кислоти, що містить зазначену конструкцію. Винахідники також зненацька виявили, що можливо індукувати BN VVV-стійкість у рослині способом, яка містить наступні кроки: - одержання конструкції нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що відповідає, щонайменше, 70%, найкраще, щонай 9 70915 10 менше, 90%, послідовності нуклеїнової кислоти, дного рослинного промотору, переважно, обраного яка міститься між нуклеотидами 3627 і 4025 5' лаз групи, що складається з послідовності 35S пронцюга геномної або субгеномної РНК 2 BNYVV або мотору вірусу мозаїки кольорової капусти, промойого відповідної кДНК, функціонально злиту з одтору поліубіквітину Arabidopsis thaliana (43), пронією або більше регуляторною послідовністю (помотору, що, в основному, активний у тканинах слідовностями), активною в рослині, кореня, такого, як par промотор гена гемоглобіну - трансформування клітини рослини зазначеPerosponia andersonii (Landsman et al. Моl. Gen. ною конструкцією і, можливо, Genet. 214:68-73 (1988)) або їхньої суміші. - регенерації трансгенної рослини з трансфоОстанній аспект даного винаходу відноситься рмованої клітини рослини. до тканини трансгенної рослини, такої, як плід, Послідовність нуклеїнової кислоти, що місстовбур, корінь, бульба, насіння трансгенної роститься між нуклеотидами 3627 і 4025 5' ланцюга лини, відповідно до винаходу або до репродуктивгеномної або субгеномної РНК 2, що кодує білок ної структури (переважно, обраної з групи, що Р15, описана на фігурі 6 і в публікації (3). Зазначескладається з калусів, бруньок або зародків), на послідовність нуклеїнової кислоти і відповідна отриманих із трансгенної рослини або клітини відамінокислотна послідовності, описані в наступноповідно до винаходу. му описі як SEQ ID N0.1. Методики трансформації рослин, культивуІнший аспект даного винаходу стосується клівання тканини й регенерації, використані в способі тини рослини і трансгенної рослини (отриманої з відповідно до винаходу, є добре відомим професізазначеної клітини рослини), стійких до BNYVV і оналам у даній області. Найкраще, якщо методики вміщуючи х конструкцію нуклеїнової кислоти, що є такими, які описані в заявках на міжнародний має послідовність нуклеїнової кислоти, яка відпопатент W095/10178 і W091/13159, які відповідають відає, щонайменше, 70%, найкраще, щонайменше, заявці на європейський патент ЕР-В-0517833, що 90% послідовності нуклеїнової кислоти, що місвключені тут шля хом посилання. титься між нуклеотидами 3627 і 4025 5' ланцюга Найкраще щоб ці методики використовувалися геномної або субгеномної РНК 2 BNYVV або віддля одержання трансгенного цукрового буряка повідної кДНК, функціонально злиту з однією або відповідно до винаходу. більше регуляторною послідовністю (послідовносФігура 1 представляє Структур у РНК 2 BNYVV тями), активною в рослині. дикого типу й реплікони, що експресують білки Найкраще щоб зазначена клітина рослини або TGB. трансгенна рослина (отримана з зазначених клітин Фігура 2 представляє трансляцію in vitro реплірослини), стійкі до BNYVV, були отримані спосоконів генів TGB екстрактів зародків пшениці. бом відповідно до винаходу. Фігура 3 представляє ампліфікацію репліконів, Варіанти послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують білки TGB у протопластів Chenoописаної як SEQ IN N0.1, містять вста вку, заміну podium quinoa і експресію Р42. або делецію нуклеотидів, що кодують однакові або Фігура 4 представляє комплементарність різні амінокислоти. Тому даний винахід також стотранскриптів РНК 2, що містять дефекти в різних сується зазначених варіантів послідовності нуклеїгенах TGB, шляхом відповідних генів дикого типу, нової кислоти SEQ IN N0.1, що представляють отриманих із реплікону. більш, ніж 70% гомології з зазначеною послідовніФігура 5 показує вплив репліконів на інфекцію стю н уклеїнової кислоти, і які, що переважно, здаРНК 1 і 2 BNYVV дикого типу. тні гібридизуватися з зазначеною послідовністю Фігура 6 представляє нуклеотиди й амінокиснуклеїнової кислоти в жорстких або не жорстких лотну послідовність TGB3, що кодує Р15 BNYVV. умовах. Фігура 7 показує присутність районів, що коНайкраще щоб зазначені послідовності також дують, гена р15 BNYVV у геномі цукрового буряка були здатні індукувати BN VVV-стійкість у рослині. по ПЦР. Термін "індукувати вірусну стійкість у рослині" Фігура 8 показує інтеграцію гена Р15 BNYVV у означає індукування можливого зниження або знагеном цукрового буряка по саузерн-блот гібридичної затримки появи симптомів інфекції, розмнозації. ження вірусу або, механізмів його дифузії в рослиДля того, щоб визначити потенційне викорисні, особливо в тканині кореня. тання визначених послідовностей генів, виділених Регуляторна послідовність (послідовності) заіз вірусної РНК 2 BNYVV, і щоб створити BNYVVзначеної послідовності нуклеїнової кислоти є постійкість у цукрового буряка шляхом трансформаслідовністю (послідовностями) промотору і посліції рослин, винахідники досліджували, чи можливі довністю (послідовностями) термінатора, незалежні експресії TGB білка BNYVV шляхом активними в рослині. внесення ORF кожного у вірусний "реплікон", заКонструкція нуклеїнової кислоти може також лежний від реплікації, отриманий із РНКЗ BNYVV. включати ген селективного маркера, який міг би Винахідники показали, що при змішаній інфекції бути використаний для ідентифікації трансформолистя С. quinoa білки BNYVV TGB1 або TGB2, що ваних клітини або рослини і експресувати конструспільно експресуються, можуть комплементувати кцію нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу. BNYVV РНК 2, яка містить мутацію, що скасовує Найкраще щоб клітина була продиховою кліфункцію відповідного білка TGB. Ніякої комплеметиною і рослина була цукровим буряком (Beta vulнтації не спостерігали в TGB3, що містить репліgaris ssp.). отриманим з зазначених клітин. кон, однак, якщо тільки ORF TGB3 не була розтаВідповідно до винаходу, послідовність промошована у прямому напрямку від ORF TGB2 у тору є послідовністю конститутивного або чужорірепліконі. Будучи спільно інокульованим із РНК 11 70915 12 дикого типу 1 і 2, реплікон, що експресує ORF акриламідному гелі (15, 16). Радіоактивність, внеTGB3 BNYVV, інгібував інфікування. Дані збігаютьсену в трансляційні продукти, підраховували за ся з моделлю експресії білків TGB, у якій транслядопомогою біоаналізатора Fujix MAS1000 ція Р15 із дицистронною субгеномною РНК регуBioAnalyzer і вивіряли значення за вмістом метіолює рівні експресії Р15 in vivo. Винахідники також ніну при підрахуванні відносних рівнів трансляції. ідентифікували, що висока експресія Р15 могла Визначення вірусної РНК і білків. забезпечити швидке й повне блокування розмноЗагальну РНК екстрагували (2) із інокульоваження вірусу й механізмів дифузії у рослині. них листя на 10 день після інокуляції (рі) і з протоМатеріали й методи пластів - 48 годин після інокуляції (рі). Вірусну РНК Клони кДНК визначали нозерн-гібридизацією з антисмисловиТранскрипційними векторами для продукції ми транскриптами вірусної РНК, міченими 32Р, у РНК 1 і 2 повної довжини BNYVV дикого типу були якості зондів (17). Проба, специфічна РНК 1, була рВ15 (10) і рВ2014 (11), відповідно. Транскрипційкомплементарна нуклеотидам 4740-5650, проба, ними векторами для попередньо описаних мутанспецифічна РНК 2, була комплементарна нуклеотидам 2324-3789 і проба, специфічна РНК 3, була тів РНК 2 були pB2-14-F, -Η, -І і -J (2) і pB2-14-DSN, комплементарна нуклеотидам 1-380. Р42, Р14 і -Δ312, -Δ337, -ΔΒ1, -ΔΒ2, -ΔΒ2, -ΔΝ і -GAA (11). білок оболонки визначали вестерн-блотом екстраДелеційний мутант РНК 2 рВ2-14-НР1 одержували шляхом видалення послідовності між нуклеотидактів загального білка інфікованих протопластів, використовуючи кролячу поліклональну сироватку, ми 3158 і 3258. Порожній реплікон, похідний від специфічну для кожного білка (18). Стабільність РНК 3 BNYVV, rep0, одержували шля хом трансмутацій, внесених у РНК 2, тестували полімеразкрипції делеційного мутанта РНК 3 pB35ADES (12). ною ланцюговою реакцією після зворотної трансПослідовності TGB для введення в rep0 були ампкрипції (RT-PCR) екстрактів загальної РНК з інфіліфіковані полімеразною ланцюговою реакцією кованих рослин. Зворотні транскрипти одержували (ПЦР) при використанні праймерів, кожний з який за допомогою набору для зворотної транскрипції містив нематричний сайт BamHI на його 5'-кінці. Expand reverse transcription kit (Boeringer), слідуюФрагменти ПЦР, що відповідають гену Р42 (нуклечи указівкам виробника. ПЦР проводили в точносотиди 2127-3297), гену Р13 (нуклеотиди 3282ті, як описано (19), використовуючи 25 циклів на3650), гену Р15 (нуклеотиди 3627-4025) і обом геступного режиму: 94° (30 сек), 50° (30 сек), 72° (3 нам Р13 і Р15 (нуклеотиди 3282-4025), були рестхв). Пари праймерів для ПЦР ампліфікації різних риковані BamHI і введені в оброблену BamHI районів кДНК РНК 2 відповідали (або були комpB35ADES. Отримані конструкції використовували плементарні, у випадку другого члена кожної пари для транскрипції rep42, rep13, rep15 і rep1315, відпраймерів) нуклеотидам 1143-1151 і 3393-3412 повідно. Реплікон, що містить мутацію зрушення (ген Р42), і нуклеотидам 3151-3169 і 4128-4148 рамки в ORF P15 (Rep15-X), одержували шляхом (гени Р13 і Р15). Праймер, використаний для ініцізаповнення виступів вставкою сайта Xbal (нуклеоації синтезу кДНК перед реакціями ПЦР, був комтид 3948). Уведення мутацій зрушення рамки в плементарний нуклеотидам 4128-4148. rep13-І, rep1315-І і rep I5-J проводили, як описано Результати для відповідних мутацій у РНК 2 повної довжини Реплікони. що експресують білки TGB BNYVV. (2). Клоновані послідовності, ампліфіковані ПЦР, Забезпечуючи підтримку достатніх послідовбули перевірені на відсутність помилок шляхом ностей на 3'- і 6'-кінцях, транскрипт РНК 3 BNYVV, секвенування (13). із якого був делетований центральний район, моТранскрипти in vitro же ефективно реплікуватися на листі С. quinoa, Кінцеві транскрипти одержували шляхом runбудучи інокульований із РНК 1 і 2, і може експреoff транскрипції (10) полімеразою бактеріофага Т7 сува ти чужорідний ген, внесений на місце делегоплазмідною ДНК, лінеаризованою Hindlll для рВ15 ваної послідовності (12, 20). Винахідники викорисі конструкціями реплікону і Sail для рВ2-14, і відпотовували такі "реплікони", засновані на РНК 3, для відними конструкціями. Концентрацію і цілісність експресії кожного з білків TGB BNYVV поза їхнім транскрипту оцінювали по електрофорезу у агаронормальним оточенням на РНК 2 і тестували здатзному гелі. Листя механічно інокулювали з 50 μл ність кожного реплікону комплементувати мутант на лист буфера для інокуляції, що містить 1 μг РНК 2, дефектний у відповідному TGB гені. кожного транскрипта (2). У деяких експериментах Використані в цьому дослідженні реплікони транскрипти РНК 1 і 2 заміняли 0.025 μг високоінзображені на Фігурі 1. Фігура 1 являє собою геномфекційної вірусної РНК, очищеної з ізольованого з ну карту РНК 2. Гени TGB відтінені, і лінії над карBNYVV Stras 12 (10). Попередні експерименти потою означають довжину субгеномних РНК 2suba і казали, що ця кількість вірусної РНК була, прибли2subb. Зображені положення делецій і вставок, зно, еквівалентна за ефективністю (обмірювана індукованих зрушенням рамки, у РНК 2. 5'аналізом локальних ушкоджень) суміші, що містить термінальна кеп структура РНК позначена кругом. 1 μг кожного з транскриптів РНК 1 і 2. Для інфікуР21 являє собою головний вірусний білок оболонвання протопласта інокулювали 0.5 μг вірусних ки. RT = домен зчитування (3). (В) - реплікони, РНК 1 і 2 із 3 μг транскрипта реплікону для одеротримані з BNYVV РНК 3, що містять гени TGB жання 2.105 протопластів шляхом електропорації BNYVV (світле фарбування), або ген TGB 3, що (2). кодує Р17 вірусу куртини арахісу (PCV) (темне Отримані з репліконів транскрипти транслюфарбування). Показаний сайт BamHl у порожньовали в екстрактах зародків пшениці (14) і візуаліму репліконі (rep0), використаний для вставки позували трансляційні продукти, мічені [35S], шляхом слідовностей TGB, ампліфікованих ПЦР. Позначеавторадіографії після SDS-електрофорезу в полі 13 70915 14 ні положення вставок, індукованих зрушенням раваних протопластів, аналізували на лінії 1. Після мки, у різних мутантних репліконах Р13 і Р15. На електрофорезу в поліакриламідному гелі (15) і додаток до конструкцій rep42, rep13 і rep15, кожна електропереносу на нітроцелюлозу імунологічно з яких містить ген TGB, була забезпечена четвервизначали Р42, головний вірусний білок оболонки та конструкція (rep1315), що містить обидва гени (СР), і Р14 із сумішшю антисиворотки, специфічної Р13 і Р15, розташованих у тій же відносній формі, для кожного білка (18). Положення стандартів мощо й у РНК 2. Здатність кожного реплікону напралекулярних ваг позначені в кілодальтонах зліва від вляти експресію введеного гена або генів тестуваблота. Аналіз вестерн-блотом виявив, що рівень ли трансляцією in vitro транскрипта екстракту заР42 у протопластах, ін фікованих сумішшю rep42 родків пшениці. Кожний транскрипт rep42, rep13 і плюс транскрипти РНК 1 і мутанти зрушення рамки rep15 спрямовував синтез повного продукту (ФігурВ2-14-Н, викликаного вставкою сайта Spel усерера 2А, лінія 2; Фігура 2В, лінія 2 і 3), який не продудину гена Р42 РНК 2 (див. Фігур у 1), був, приблизкувався в трансляціях, запрограмованих транскрино, у два рази більше, ніж у протопластах, інфікоптом, що відповідає порожньому реплікону, rep0 ваних РНК 1 плюс РНК 2 дикого типу (Фігура 3В, (Фігура 2А, лінія 1; Фігура 2В, лінія 1). На фігурі 2 лінії 2 і 3). Відзначено, що рівні нагромадження (А) подані трансляційні продукти, мічені S35двох інши х імунологічно обумовлених продуктів метіоніном у порожньому репліконі rep0 (лінія 1) і гена РНК 2 (головного вірусного білка оболонки і rep42 (лінія 2), продемонстровані авторадіографіР14; Фігура 1) не були модифіковані присутністю єю після електрофорезу у поліакриламідному гелі rep42. Р13 і Р15 у таких експериментах не могли (15). Позначена смуга була ідентифікована як Р42 бути визначені імунологічно. шляхом порівняння її р ухливості з такою молекуБілки TGB BNYVV можуть бути комплементолярної ваги маркерів (не показані). На фігурі 2 (В) вані in trans. подані трансляційні продукти, спрямовані rep0 Здатність репліконів, що містять гени TGB, (лінія 1), rep13 (лінія 2), rep15 (лінія 3) і rep1315 підтримувати функції руху в ціли х рослинах тесту(лінія 4), продемонстровані авторадіографією пісвали спільним інокулюванням листя із місцевим ля електрофорезу в поліакриламідному гелі (16). ушкодженням хазяїна С. quinoa з одним із набору Смуги, експериментально ідентифіковані як Р13 і транскриптів РНК 2, який містить мутацію, що виР15, показані справа. Також була синтезована ключає функціонування гена TGB, плюс реплікон, фонова смуга, позначена зірочкою, коли в трансякий містить відповідний ген дикого типу. У всіх ляційний екстракт не вводили транскрипта. Відноекспериментах інокулюм також містив транскрипт сні рухли вості різноманітних трансляційних продуРНК 1 дикого типу у якості джерела РНК реплікази, ктів були такі, як очікувалося, за винятком того, що залежної від вірусної РНК, хоча цей факт нижче не передбачуваний Р13 мігрував дещо більш повільзавжди буде докладно згаданий. Для гена Р42 но, чим Р15, можливо, через його нетипічного амітестовані мутанти РНК 2 містили мутант зрушення нокислотного складу. Дицистронна конструкція рамки (рВ1-14-Н), викликаний вставкою сайта Spel rep1315 направляла синтез обох Р13 і Р15 (Фігура у нуклеотид 2280, набір мутантів, що містять коро2В, лінія 4) у відносних молярних кількостях 3:1 ткі делеції у рамці в різних положеннях у ORF P42 (значення скоректовані по різниці у вмісті метіоніну (мутанти pB2-14-DS12, -DSN, -ΔΒ1 , -ΔΒ2, -ΔΝ і в двох білках; якщо N-термінальний метіонін кожΔΗΡ1; Фігура 1А; також дивіться посилання 11), і ного білка видаляється пост-трансляційно, молярделеційний мутант (pB2-14-F; Фігура 1), де видане співвідношення складає 5:1). лення 935 нуклеотидів послідовності у зворотному Здатність репліконів ампліфікуватися вірусною напрямку від ORF P42 інактивувало промотор для системою реплікації in vivo тестували спільним субгеномної РНК (РНК 2suba), відповідальний за інокулюванням транскриптів реплікону в протосинтез Р42. Інокулюми, що містять транскрипт РНК пластах С. quinoa із РНК 1 і 2 BNYVV. Аналіз но1 плюс один будь-який із зазначених транскриптів зерн-блотом загальної РНК, екстрагованої з промутантної РНК 2, не продукували місцевих ушкотопластів 48 годин рі, виявив, що всі реплікони, які джень на С. quinoa і ніякого потомства вірусної містять гени TGB, ефективно ампліфікувалися РНК не визначалося в інокульованому листі 10 (Фігура 3 А). Фігура 3 (А) представляє визначення днів рі (Фігура 1, лінії 3 і 5; дивіться посилання 11 шляхом нозерн-гібридизації вірусних РНК у протодля інших мутантів). На фігурі 4 реплікон, показапластах С. quinoa. інокульованих із РНК 1 і 2 ний на вершині кожної лінії, інокулювали з листям BNYVV єдино (лінія 2) або з додавання rep0 (лінія С. quinoa разом із транскриптом РНК 1 дикого типу 3), rep42 (лінія 4), rep13 (лінія 5), rep1315 (лінія 6) і плюс або транскриптом РНК 2 дикого типу (лінія rep15 (лінія 7). РНК із здавано інокульованих про2), або транскриптом мутантної РНК 2, ідентифікотопластів аналізували на лінії 1. Протопласти збиваними над кожною лінією. У лініях 19 і 20 інокурали 48 годин рі і визначали вірусні РНК, викорислюм містив rep42 і rep15 (лінія 19) або rep42 і товуючи мічені 32Р зонди вірусних РНКrep1315 (лінія 20), на додаток до транскриптів РНК специфічних антисмислових РНК. Реплікони пока1 і рВ2-14-НР1. Лінія 1 містить РНК із неінокульозані кінцями стрілок. Фігура 3 (В) представляє імуваного контрольної рослини. Інокульоване листя нологічні визначення Р42 екстрактів загального збирали 10 днів рі і тестували на вміст вірусної білка протопластів C.quinoa, інокульованих із РНК РНК нозерн-гібридизацією, як описано на Фігурі 3. 1 і 2 BNYVV (лінія 2), транскриптом РНК 1 дикого Положення репліконів показані стрілками. Коли типу плюс транскрипт РНК 2 мутанта рВ1-14-Н, що транскрипт rep 42 включили в інокулюм, на інокумістить мутацію зрушення рамки гена Р42 (11) льованому листі з'явилися численні місцеві ушко(лінія 3), РНК 1 і транскрипти рВ2-14-Н плюс rep42 дження (20-80 на лист), за винятком інокулюма, (лінія 4). Білок, екстрагований із здавано інокульощо містить транскрипт делеційного мутанта рВ2 15 70915 16 14-НР1 РНК 2, що залишався безсимптомним. виступаючи у якості джерела послідовності TGB Отримані блідо-зелені ушкодження по зовнішньодикого типу для рекомбінації. му вигляду були схожі на ті, що з'явилися після Зненацька було виявлено, що реплікон, який інокуляції з РНК 1 плюс РНК 2 дикого типу, за виекспресує ген Р15 дикого типу (rep15), був нездатнятком мутанта pB1-14-F РНК 2, де сформувалися ний комплементувати Р15-дефектний мутант РНК некротичні місцеві ушкодження. У цьому остан2 pB2-14-J у змішаних інокулюваннях. На інокуньому випадку фенотип некротичного ушкодження льованому листі не формувалися місцеві ушкоможе мати відношення до продукції укороченої дження 10 днів рі, і у листі не виявляли вірусної форми білка зчитування (RT) мутантом РНК 2 (7). РНК шляхом нозерн-блота (Фігура 4, лінія 17). З Нозерн-гібридизація інокульованого листя 10 іншого боку, коли транскрипт pB2-14-J спільно іноднів рі виявила присутність нащадкової вірусної кулювали з rep1315, з'являлися місцеві ушкодженРНК довжини, очікуваної для РНК 1, 2 і rep 42 для ня (некротичного типу) і легко визначалися нащадвсіх м утантів РНК 2 (Фігура 4, лінії 2, 4, 7-11), за кові вірусні РНК (Фігура 4, лінія 18). У цьому винятком делеційного мутанта рВ2-14-НР1 (Фігура останньому випадку аналіз продукту RT-PCR, що 4, лінія 13). Як буде показано нижче, відсутність містить ген Р15 у нащадковій РНК 2, виявив, що комплементації рВ2-14-ΔΗΡ1 rep 42 існує внаслімутація, що скасовує функціонування гена, усе ще док делеції промотору для субгеномної РНК (РНК була присутня. Комплементація pB2-14-J усе ще 2subb), який, як вважається, направляє транслязберігалася, коли ORF P13 у дицистронних репліцію в прямому напрямку білків TGB. конах була перервана мутацією зрушення рамки Подібні експерименти по комплементації про(rep1315-І; Фігура 1), установлюючи, що експресія водили з rep13, rep15 і дицистронною конструкцією Р13 повної довжини з першої ORF дицистронного rep1315. Обидва rep13 і rep1315 виявляли здатреплікону не потрібна для комплементації копією, ність комплементувати нагромадження на листі розташованою в прямому напрямку від гена Р15. (Фіг.4, лінії 14 і 15) мутанта рВ2-14-І, у якому ген Доказ того, що Р15 експресується з дииистР13 був позбавлений функціонування шляхом ронною субгеномною РНК. вставки чотирьох нуклеотидів (вставка створена в Субгеномну РНК, отриману з РНК 2 (РНК сайті Xhol), хоча остаточні місцеві ушкодження2subb), довжиною, приблизно, 1500 нуклеотидів, були некротичними. Некротичні місцеві ушкодженвизначали в BNYVV-інфікованій тканині (2). 5'ня були також отримані під час змішаних інфекцій кінець цих видів не був точно картований, але пеіз зазначеними репліконами і РНК 1 і 2 дикого типу редбачалося, що він знаходиться недалеко від 5'(дивіться нижче), указуючи, що симптоматичний кінця ORF P13. Не виявлялося субгеномної РНК із фенотип, який відноситься до реплікону, є доміна5'-кінцем у зворотному напрямку від ORF Р15, нтним стосовно дикого типу. Нові симптоми мостворюючи можливість, що, як у BSMV (8), обидва жуть мати відношення до різниць у швидкості синР13 і Р15 експресовані з РНК 2 subb. тезу або рівню нагромадження Р13, коли він Згадана вище нездатність rep42 комплементуекспресується з, скоріше, реплікону, чим із РНК 2 вати Р42-дефектний мутант РНК 2 рВ2-14- НР1 повної довжини. може відбуватися з протилежних ефектів делеції У таких експериментах, які описані вище, важРНК 2 на синтез білків TGB, розташованих у пряливо продемонструвати, що мутація, уперше ввемому напрямку, якщо делеція скасовувала функцідена в ген Р42 або Р13 на транскрипті РНК 2, усе онування промотору РНК 2subb (права границя ще була подана на нащадковій РНК 2, що означає, делеції у pΒ2-14-ΔΗΡ1 знаходиться усього в 30 що дефектна копія гена TGB на транскрипті не залишках нагору за течією від кодону ініціації Р13). була конвертована у дикий тип шляхом рекомбіДля перевірки цієї гіпотези був проведений експенації РНК in planta (21) за допомогою копії, поданої римент, у якому транскрипт рВ2-14-ΔΗΡ1 був комна репліконі. Тому, експеримент RT-PCR проводиплементарний обом rep42 і rep1315. На листі, іноли на нащадковій вірусній РНК із рослини, інфікокульованих із цією сумішшю, розвивалися місцеві ваної РНК 1, транскриптом рВ2-14-Н (ген Р42, ушкодження і містилися нащадкові вірусні РНК розділений вставкою в сайт Spel) і rep42. Пара (Фігура 4, лінія 20). Якщо, з одного боку, rep13, але праймерів, використана в RT-PCR, гібридизуване rep1315 використовували разом із rep42 для лась із послідовностями РНК 2, що фланкують ген комплементації рВ2-24-НР1, симптомів не з'являР42 і, отже, ампліфікувала копію гена, поданого в лося і нащадкові вірусні РНК не визначалися ноРНК 2, але не копію на репліконі, де кінцеві послізерн-блотом (Фігура 4, лінія 19). Ці спостереження довності відсутні. Аналіз за допомогою ферментів збігаються з гіпотезою, що делеція рВ2-14-НР1 рестрикції виявив, що сайт Spel був відсутній в перекривається з експресією ORF TGB, що знахоотриманому ампліфікованому фрагменті ДНК, що дяться вниз за течією, можливо, шляхом блокуочікувано, скоріше, для мутованого, чим для TGB вання транскрипції РНК 2subb. Далі, факт, що комгена дикого типу. Подібний аналіз нащадкової віплементація була успішною з rep1315, але не з русної РНК із рослин, інфікованих РНК 1, рВ2-14-І rep13 показує, що Р15, як і Р13, транслюється з (мутація зрушення рамки в гені Р13, яка створює PHK2sub b. сайт Xhol) і або rep13, або rep1315, подібним споНезалежна експресія Р15 інгібує інфікування собом продемонстрували, що мутація, яка скасовірусної РНК дикого типу. вує функцію копії гена Р13 на транскрипті РНК 2, Здатність rep1315, але не rep15, комплеменбула конвертована на нащадковій РНК 2. Ми ротувати Р15-дефектний мутант РНК 2 pB2-14-J при бимо висновок, що rep42 і rep13, у дійсності, комінфікуванні листя може означати, що незалежна плементують функцію Р42 і Р13 шляхом, скоріше, експресія Р15 із моноцистронного реплікону слузабезпечення продуктом гена in trans, чим просто жить перешкодою циклу інфікування вірусу шля 17 70915 18 хом продукування продукту гена в надлишкових дикого типу в експерименті по комплементації, стосовно Р13 кількостях. Для перевірки цієї гіпотеможе впливати на активність руху від клітини до зи проводили експеримент, у якому rep15 інокулюклітини Р15 дикого типу, одержуваного з РНК 2. вали на листі С. quinoa разом із вірусними РНК 1 і Приблизно, повнорозмірна й укорочена форми 2 дикого типу. На інокульованому листі не з'являР15 конкурують один з одним за сайти зв'язування лися ушкодження, навіть у пізній час рі (Фігура 5А), на іншому компоненті (який може бути або вірусі ніякої вірусної РНК не визначалося шляхом ноного, або клітинного походження), що втягнутий у зерн-блота (Фігура 5В, лінія 6). Фігура 5 (А) предпроцес руху. ставляє листя С guinea, інокульовані з РНК 1 і 2 Як зазначено вище, порівняння послідовнос(зліва) або РНК 1 і 2 плюс rep15 (справа). Листя тей різних вірусів, що мають TGB, виявили невефотографували 20 днів після інокуляції, коли міслику схожість послідовності між різними генами цеві ушкодження на листі зліва розповсюджуваTGB3. Наприклад, TGB3 білок розміром 17 кДа лись таким чином, що покривали велику частину (Р17) фітовіруса куртини арахісу (PCV) не має поверхні листа. На фігурі 5 (В) аналіз шляхом нозначної подібності послідовності з Р15 BNYVV (4), зерн-блот гібридизації (як описане на Фігурі 3) вінезважаючи на те, що обидва віруси можуть інфірусної РНК містить листя С. quinoa, інокульовані з кувати С. quinoa. Щоб визначити, чи може незалеРНК 1 і 2 BNYVV єдино (лінія 1) або разом із rep0 жна експресія білка TGB3 PCV перешкоджати ін(лінія 2), rep42 (лінія 3), rep13 (лінія 4), rep1315 фікуванню BNYVV подібним способом із тим, як це (лінія 5), rep15 (лінія 6), rep15-J (лінія 7), rep15-Х відбувається з rep15, був сконструйований реплі(лінія 8) або repPCV-P17 (лінія 9). Положення репкон, отриманий із РНК 3 BNYVV, що містить PCV ліконів показані стрілками. (С) Аналіз шляхом ноTGB3 (repPCV-P17; Фігура 1). Листя С. Quinoa, зерн-гібридизації вірусної РНК містить інокульоваінокульоване з РНК 1 і 2 BNYVV плюс repPCV-P17 не листя (лінії 1, 3 і 5) і корені (лінії 2, 4 і 6) Beta не розвивало симптомів, і нащадкові РНК BNYVV macrocarpa або удавано інокульованих (лінії 1 і 2), не визначалися за допомогою нозерн-блота (Фігуінокульованих із РНК 1, 2 і З BNYVV (лінії 3 і 4), ра 5А, лінія 9). Це спостереження припускає, що або з РНК 1, 2 і 3 плюс rep15 (лінії 5 і 6). РНК 3 шлях, яким BNYVV і PCV рухаються від клітини до включили в інокулюм, тому, що вона необхідна клітини в С. Quinoa, має, щонайменше, один загадля системного руху у B.macrocarpa (22). При цих льний елемент, що, незважаючи на їхню різницю в умовах листя, інокульоване єдино з РНК 1 і 2, було послідовності, взаємодіє з продуктами TGB3 обох сильно інфіковане (Фігура 5А; Фігура 5В, лінія 2). вірусів. Інгібування вірусної інфекції rep15 було дозоВинахідники показали, що реплікони, які незалежним. Додавання до суміші інокулюма в десуть Р42 і Р13, можуть комплементувати РНК 2 сять разів менше rep 15 усе ще приводило до BNYVV, яка несе відповідний дефектний ген, але майже повного інгібування формування ушкощо реплікон, який несе Р15, не може. В останньоджень, але менші кількості реплікону були прогрему випадку комплементація може мати місце, одсивно менше ефективні при блокуванні інфекції. нак, якщо ген Р15 виступає у якості другого гена на Rep15 також блокував появу на щадкової вірусної дицистронній РНК (rep1315), що несе ген Р13 у РНК у інокульованому листі і коренях Beta першій частині. Потрібно відзначити, що відносне macrocarpa, системному хазяїні BNYVV (Фігура 5С, розташування генів Р13 і Р15 на rep1315 ідентичне лінії 5 і 6). Порожній реплікон, rep0, і реплікони, що розташуванню на РНК 2subb, субгеномної РНК, експресують інші два білки TGB (rep42, rep13, яка, вважають, направляє синтез обох білків в інrep1315), з іншого боку, не інгібували значно інфіфекціях дикого типу. Це припускає, що успішний кування BNYVV листя С. quinoa (Фігура 5В, лінії 2рух BNYVV від клітини до клітини вимагає присут5). ності Р13 і Р15 у відповідних відносних кількостях і Оскільки rep15 не перешкоджав ампліфікації що продукція обох білків з однієї і тієї ж субгеномРНК 1 і 2 у протопластах C. quinoa (див. Фігуру 3), ної РНК представляє механізм для координації це припускає, що реплікон перешкоджає руху віруїхнього синтезу. Нездатність rep 15 комплементусу з початкового місця інфікування в сусідні клітивати транскрипт рВ2-14-J РНК мутантного Р15 і ни (рух від клітини до клітини ) під час формування його здатність інгібувати інфікування вірусом дикомісцевих ушкоджень на листі. Формування ушкого типу, можуть обидва мати місце далі внаслідок джень не інгібувалось спільною інокуляцією РНК суперпродукції Р15 щодо Р13, коли перший із наStras 12 із репліконами rep15-J або rep15-Х (Фігура званих транслюється з реплікону й останній - із 5В, лінії 7 і 8), що кодують укорочені форми зі зруРНК 2. Коли Р15 експресується з дицистронного шенням рамки Р15. Ця знахідка підтверджує, що, реплікону rep 1315, з іншого боку, можуть бути скоріше, експресія Р15 із реплікону, чим проста отримані відповідні відносні кількості Р13-Р15, доприсутність відповідної послідовності РНК, необзволяючи відбуватися руху від клітини до клітини. хідна для інгібування під час експериментів по "Правильні" відносні рівні нагромадження Р13 і змішаній інфекції. У присутності rep 15-Х, однак, Р15 у інфікуванні дикого типу невідомі. Трансляція отримані місцеві ушкодження мали розмір, приrep1315 в екстракті зародків пшениці продукувала близно, однієї третини діаметра ушкоджень, сфовід трьох до п'ятьох разів більше - Р13, чим Р15, рмованих інфекцією Stras 12 єдино або Stras 12 але такі експерименти не обов'язково відбивають плюс rep15-J, і вміст нащадкової вірусної РНК в ситуацію in planta, тому що рівні перетворення інфікованому листі був значно нижчий (Фігура 5В, двох білків можуть значно розрізнятися. Відзначилінія 8). Ця знахідка припускає, що молекула Р15 мо, що ці результати показують, що опосередкомайже повної довжини, продукована rep15-Х, неваний TGB рух від клітини до клітини є менше чутзважаючи на те, що вона нездатна замінити Р15 ливим до суперекспресії Р42 і Р13 щодо 19 70915 20 "правильних" рівнів, характерних для нормальних пливає послідовність - енхансер TMV. EcoRI фраінфекцій, оскільки спільна інокуляція rep42, rep13 і гмент із плазміди рВ235Аск містить ген pat, викоrep1315 із вірусом дикого типу не інгібувала інфекристаний, як селективний маркер, що кодує цію (Фігура 5, лінії 3-5), хоча ушкодження, отримані фосфінотрицин ацетил трансферазу (отриманий в присутності вірусу дикого типу, були некротичвід Agre vo, Berlin Germany). У цьому фрагменті ними. Таким чином, це показує, що експресія Р15 у EcoRI послідовність нуклеїнової кислоти гена pat трансгенних рослинах могла забезпечити мехазнаходиться під контролем 5' і 3' сигналів експресії нізм для індукування BNYVV-стійкості ("опосередвірусу кольорової капусти. Плазміда pMJBS6, кованої патогеном стійкості"; посилання 23) у таких отримана з комбінації цього фрагмента EcoRI-pat і рослинах, забезпечуючи те, що можуть бути досячасткового гідролізу EcoRI плазміди pMJBX-Ubгнуті достатні рівні експресії Р15. P15, містить обидва гени pat і Р15. Ця плазміда Для досягнення кращого розуміння, як відносні pMJBS6 є висококопійною плазмідою на основі рівні Р13 і Р15 регулюються під час трансляції, вектора pUC18 і також містить ген-лактамази буде необхідно вивчити, яким способом цистрон (ampr). Р15 доступний для рибосом на РНК 2subb. Ініціація У плазміді pIGPD7, що несе той самий фрагтрансляції на внутрішньому цистроні еукаріотичної мент pat, що рВ235Аск, ген -лактамази був замінематричної РНК може відбуватися декількома мений на igpd (імідазол гліцерол фосфат дегідратаханізмами, включаючи (і) поточне сканування, коза) із Saccharomyces cerevisiae (Struhl et al., ли фракція рибосомальних субодиниць, які почиProceedings of the National Academy of Science нають сканування РНК на 5'-кінці, рухається за USA 73, pp.1471-1475 (1976). Селекція й підтримка перший (неоптимальний) AUG у зворотному наплазміди в Escherichia coli були досягнуті шляхом прямку без ініціації (24), і (іі) внутрішня ініціація, комплементації ауксотрофного по hisB штама коли рибосомні субодиниці зв'язуються прямо зі SB3930 на мінімальному середовищі у відсутності спеціальною послідовністю на РНК біля внутрішантибіотиків. Фрагмент Р15 із його убіквітиновим нього кодону ініціації (25). Малоймовірно, що трепромотором і послідовністю термінатора очищали тій можливий механізм, термінації-реініціації (24), як фрагмент розміром 2500 п.о., отриманий із пламоже бути прикладений до будь-якого з вірусів, що зміди pMJBX-Ub-P15 після її розрізування в єдимістять TGB, оскільки часткове перекривання між ному сайті Hindlll, із наступною частковою рестрицистронами TGB2 і TGB3 може вимагати звороткцією EcoRI. Цей фрагмент був затуплений і ного сканування після термінації TGB2 для досягвміщений у плазміду plGPD7 із тупими кінцями, нення кодону ініціації TGB3. Було запропоновано, розкриту за єдиним сайтом Ncol. Отримана плазщо білки TGB3 BSMV і PVX транслюються механіміда plGPDS4 містить обидва гени pat і Р15 у змом поточного сканування (8, 9). Ген Р15 BNYVV складі вектора без гена β-лактамази. може також бути о триманий поточним скануванРослинний матеріал. ням, хоча необхідно відзначити, однак, що вміст ініціювали пускові культури in vitro паростків кодону ініціації Р13 BNYVV (AU AAUGU) є майже цукрового буряка для одержання постійного й одоптимальним, і також нижче існують два AUG, які накового джерела стерильного стартового матерісубодиниці, що сканують, повинні ігнорувати для алу і підтримували з 4-тижневим періодом субкудосягнення кодону ініціації Р15. льтури, як описано в Hall et al., Plant Cell Reports Приклади 12, pp. 339-342 (1993). Наступні приклади є трансформацією рослин, Широкомасштабне виділення епідермісу цукпроведеною методами, описаними в заявці на рового буряка міжнародний Патент W095/10178, які включені тут Була використана модифікована версія спосошляхом посилання. бу змішання за Krese et al.. Plant Physiology 690, Рослинний матеріал і умови вирощування буpp. 1382-1386 (1989). Для кожного виділення пели такими, як описано в Hall et al.. Plant Cell ремішували 2 г листя (із видаленими головними Reports 12, pp.339-342 (1993) Pedersen et al., Plant жилками) від 4-тижневих стартових культур у зміScience 95, pp.89-97 (1993), і Hall et al.. Nature шувачі Waring при максимальних оборотах (23000 biotechnology 14,1996, у др уку. об/хв) протягом 60 сек у лабораторній склянці на Плазмідні вектори й підготовка ДНК. 250 мл, що містить 50 мл холодного (4°С) середоПлазміду рЕТ-Р15 (несучу послідовність нуквища Ficoll (100 г/л Ficoll, 735 мг/л СаСІ2×2Н2O,1 г/л леїнової кислоти Р15) обробляли рестриктазою за PVP40, автоклавованої). її єдиним сайтом BamHI і затуплювали за допомоФрагменти епідермісу потім видаляли на 297 гою ДНК-полімерази Т4. Після обчищення електμм нейлоновому фільтрі і промивали 500 мл стерофорезом у 0.8% агарозному гелі лінеаризовану рильної водопровідної води. Їх відмивали з фільтплазміду обробляли рестриктазою за її єдиним ра в чашку Петрі діаметром 9 см, використовуючи сайтом Ncol. Фрагмент гена Р15 розміром 400 пар 10 мл CPW9M, що містить 3.8% (маса/об'єм) Саоснов (п.о.) очищали електрофорезом і вбудовуСІ2×2Н2О (Krens et al.. Theoretical and Applied вали в pMJBX-Ub (несучу поліубіквітиновий проGenetics 79, pp. 390-396 (1990). Будь-які фрагменмотор Arabidopsis (Norris et al., Plant Molecular ти листя, що залишилися, видаляли і попередньо Biology 21, pp. 895-906 (1993), послідовністьінкубували чашки протягом 1 години при кімнатній енхансер TMV і термінатор Nos 3'), оброблену ентемпературі. донуклеазами рестрикції Ncol і Smal. В отриманій у Виділення протопластів гард-клітин із збагачетакий спосіб плазміді (pMJBX-Ub-P15) нуклеотидних епідермісом фракцій. на послідовність гена Р15 поставлена під контроль Для одержання фракції епідермісу центрифупромотору поліубіквітину Arabidopsis), за яким вигували суспензію протягом 1 хв при 55 x g, після 21 70915 22 чого видаляли супернатант. Осад ресуспендували Після 21 дня шматочки альгінату, що містять в 50 мл ферментативної суміші й аліквотні проби невидимі мікрокалуси переносили на чашку Петрі об'ємом 5 мл переносили на кожну з 10 чашок Педіаметром 9 см, що містить 20 мл Середовища К трі діаметром 6 см (Greiner, якість ТС), закривали (3% сахарози, 0.8% агарози, 1 μΜ ВАР, середовипарафільмом і інкубували протягом ночі при 25°С ще Pgo, рН=5.8, автоклавована). Культивування у темряві з легким перемішуванням. Середовище проводилося в темряві, як описано вище. для розщеплення субстрату містили CPW9M, із Пухкі, водянисті калуси по досягненні розміру добавками 0.5% (маса/об'єм) Cellulase RS і 3% приблизно 1-2 мм у діаметрі, відбирали індивідуа(маса/об'єм) Macerozyme R1O (Yakult Honsha, льно і культивували гр упами по 20 на свіжому СеTokyo, Japan), pH 5.8. На наступний ранок проторедовищі К. На цій стадії аналіз ПЦР підтвердив пласти, в основному, було видно плаваючими біля присутність трансформантів. поверхні живильної суміші. Після легкого переміЗ інтервалом у два тижні всі калуси переносишування суспензій із використанням стерильної ли для культивування на свіже середовище. піпетки для звільнення протопластів, що усе ще Регенеранти з'являлися протягом перших 8 прилипають до фрагментів кутикули, суміші об'єдтижнів культивування окремих калусів. Коли перші нували і пропускали через нейлонові фільтри 297 і стартові культури ста вали помітні і досягали розміру приблизно 2 мм, чашку переносили на світло 55 mм. Фільтрат змішували з рівним об'ємом ізоосмотичного РеrсоІІ, що містить 15% (маса/об'єм) (3000 люкс), 25°С, тривалість дня -15 годин. Паростки довжиною приблизно 4 мм переносахарозу (PercolII5S), і поділяли на 12 x 12 мл сили в пробірки для окремого культивування, що центрифужних пробірок. У кожній пробірці перший містять 15 мл Середовища К, і далі субкультиву1 мл CPW15S (Krens et al., 1990) і потім 0.5 мл 9% вали на світлі, як описано вище. (маса/об'єм) манітолу, що містить 1 мM СаСІ2 (9 М), обережно нашаровували зверху суспензії проОдержання коренів і перенос у грун т. Коли паростки досягали стадії чотирьох листя топластів. Після центрифугування при 55 x g про(звичайно після 5-6 тижнів при одному субкультитягом 10 хв живі гард-клітини було видно в смугах вуванні після 3 тижнів), їх переносили в пробірки на поверхні поділу CPW15S/9M. Для концентрації для культивування, що містять 15 мл Середовища протопластів ці смуги збирали і змішували з РеrсоІІI5S для одержання кінцевого об'єму 16 мл. L (3% сахароза, 0.8% агароза, 25 μΜ індолмасляна кислота (ІВА), середовище PGo, p=5.8, автоПотім він був поділений між 2 пробірками для клавована), (середовище PGo описане в De Greef центрифугування, нанесений шарами, як зазначеW. et al., Plants Science Letters 17, pp. 55-61 (1979)) но вище, і знову центрифугований. Обережне виі далі культивували, як описано вище. далення шарів 9М давало вихід збагаченій фракції протопластів гард-клітин для наступного підрахунКоли щонайменше один корінь досягав довжини 1 см, паростки видаляли з пробірок для кульку з використанням гемоцитометру. тивування і промивали під проточною водопровідТрансформація протопластів ною водою для видалення усіх фрагментів агару, і Трансформації проводили в пробірках для переносили в гр унт у теплиці в горщиках діаметцентрифугування об'ємом 12 мл, кожна містила 1 x 106 протопластів, суспендованих у 0,75 мл серером 9 см. Паростки покривали прозорою пластиковою довища 9М. Добавляли плазмідну ДНК (50 μг чашкою для забезпечення вологого навколишньоpMJBX-Ub-P15 і plGPDS4) і, негайно після змішуго середовища протягом 7 днів, після чого вони вання, краплями добавляли 0.75 мл середовища могли зростати без захисту. PEG (40% PEG 6000, розчинений у середовищі F (Krens et al.. Nature 296, pp. 72-74, (1982). Після Рослина, трансформована послідовністю SEQ ID N0.1 відповідно до винаходу, вижила і експреретельного перемішування суспензію витримували сувала Р15. при кімнатній температурі протягом 30 хвилин із Аналіз ДНК. періодичним перемішуванням. Далі добавляли 4 х Геномну ДНК, виділену з первинних трансфо2 мл аліквотного середовища F з інтервалом 5 хвилин. Після центрифугування протягом 5 хвилин рмантів, піддають електрофорезу в 0.8% агарозному гелі після обробки ферментами рестрикції і при 55 х g видаляли супернатант і ресуспендували переносять на нітроцелюлозну мембрану, викориосад у 9 М, і знову центрифугували. Нарешті, клістовуючи стандартні методики відповідно до протини ресуспендували в 1 мл середовища 9М для токолів виробника. Гібридизацію проводять із ДНК, підрахунку. Культура протопластів і селекція. у виді a 32Р-dATP-мічених зондів, чию присутність Протопласти зв'язували з альгінатом Са і бажано встановлювати. Мембрани промивали до культур ували в модифікованому рідкому середокінцевої чистоти 0.1% х SSC, 0.1% SDS при 60°С. вищі К8Р (Hall et al., 1990). Для селекції клітин, що Гібридизовану ДНК візуалізували в темряві за достабільно трансформуються, біалафосів, після 7 помогою рентгенівської плівки від 24 до 48 годин. днів добавляли активну сполуку Herbiace (Meiji Аналіз ПЦР. Seika Ltd, Japan) для одержання кінцевої концентВикористовували стандартні методики ПЦР рації 200 μг/л. На 18 день альгінатні диски розрідля визначення ряду цілих послідовностей плаззали на шматочки розміром 3 мм і переносили на мід. Реакції проводили, використовуючи 25 циклів середовище PGo (De Greet and Jacobs, Plant денатурації протягом 1 хв при 94°С, ренатурації Science Letters 17, pp. 55-61,1979), із добавками 1 протягом 1 хвилини; витримці 2 хвилини при 72°С μΜ BAP (PG1B) і 250 μг/л біалафосів, і додавали з кінцевим періодом 5 хвилин. Температури ренатверду форму за допомогою 0.8% агарози. турації оптимізували для кожної комбінації прайКультура калусів і регенерація. мерів. Присутність кодуючого району гена Р15 23 70915 24 BNYVV у геномі цукрового буряка підтверджували 16. Schagger H. & von. Jagow G., Anal. ПЦР, використовуючи пару олігонуклеотидів у якоBiochem. 166, pp. 368-379 (1987) сті праймерів: МОV1, смисловий праймер [5'17. Lemaire O. et al., Virology 162, pp. 232-235 GGTGCTTGTGGTTAAAGTAGATTTATC-3' (н уклео(1988) тиди з 3 по 29 на SEQ ID NO 1)] і MOV2 антисмис18. Niesbach-Klosgen U. et al., Virology 178, pp. ловий праймер [5'52-61 (1990) CTATGATACCAAAACC AAACTATAGAC-3' (ком19. Hehn A. et al., Virology 210, pp. 73-81 (1995) плементарний нуклеотидам із 369 по 395 на SEQ 20. Tamada T. et al -, J. Gen. Virol. 70, pp. 3399ID NO 1)]. Цей фрагмент довжиною 393 п.о. міс3409 (1989) тить повний кодуючий район гена Р15 для BNYVV 21. Kozak M., J. Cell. Biol. 108, pp. 299-241 (див. фігуру 7). (1989) Фігура 7: Аналіз продуктів ПЦР, отриманих із 22. Peiletier J. & Sonenberg N, Nature 334, pp. ДНК цукрового буряка з трансформантів Р15 (лінії 320-325 (1988) з 5 по 7) і нетрансформованої рослини (лінія 4). У 23. Tamada T. & Baba Т., Annals of the якості маркера розміру (лінія 1) використовували Phytopathological Society of Japan; 39, pp. 325-332 стандарт низької маси ДНК Low DNA Mass Ladder® (1973) (Life Technologies). Лінії 2 і З відповідають позити24. Kuszala Μ. & Putz С., Annals or вним контролям (pMJBS6/plGPDS4). Стрілка зліва Phytopathology 9, pp. 435-446 (1977) показує положення очікуваного продукту ПЦР. 25. Keskin. В., Archiv fur Mikrobiology 49 pp. Аналіз блот гібридизація за Саузерном. 348-374 (1964) Інтеграцію гена Р15 BNYVV у геном цукрового 26. Asher M.J.C., Rhizomania in The sugar beet буряка підтверджували блот гібридизацією за Сауcrop, ed. D.A. Cooke and R.K. Scott, Chapman & зерном. Ізолювали загальну ДНК первинних трансHall, London, pp. 312-338 (1993) генних регенерантів, виварювали ферментами 27. Richard-Molard M., Rhizomanie In Institut рестрикції (Pstl, Kpnl, Ncol, Sacl), піддавали електfrancais de la betterave industrielle. Compte-rendu рофорезу, блотингу і гібридизували з BNYVV Р15des travaux effectues en 1994, ITB, Paris pp. 225специфічними Р32-міченими зондами, використо229 (1995) вуючи ампліфікований ПЦР фрагмент M0V1-M0 V2 28. Henry CM. et al, Plant Pathology 41, pp. 483(див. фігуру 8). 489 (1992) Фігура 8: Аналіз блота за Саузерном. Лямбда 29. Grassi G. et al., Ph ytopath. Medit. 28, pp. ДНК, оброблену Hindlll, використовували у якості 131-139 (1989) маркера розміру (лінія 1). Лінії з 2 по 16, ДНК 30. Merdinoglu D. et al., Acad. Agric. Fr. 79, n°6, трансгеників: із 2 по 4 - оброблені SaCI, із 6 по 8 pp. 85-98 (1993) оброблені Pstl, із 10 по 12 - оброблені Ncol, із 14 31. Scolten O.E. et al.. Archives of Virology 136, по 16 - оброблені Kpnl. Лінії 5, 9, 13 і 17 відповідаpp. 349-361 (1994) ють нетрансформованій рослині. 32. Buttenr G. & Burcky K., Proceedings of the Джерела інформації First Symposium of the International Working Group 1. Richards Κ. Ε. & Tamada Т., Annu. Rev. on Plant Viruses witn Fungal Vectors, Braunschweig Phytopathol. 30, pp. 291-313 (1992) Germany, August 21-24 (1990) 2. Gilmer D. et al., Virology 189, pp. 40-47 (1992) 33. Whitney E.D., Plant. Disease 73, pp. 287-289 3. Bouzoubaa S. et al., J. Gen. Virol. 68, pp. 615(1989) 626 (1987) 34. Powell A.P, et al., Science 232, pp. 738-743 4. Herzog E. et al., J. Gen. Virol. 18, pp. 3147(1986) 3155 (1994) 35. Fritchen J. H. & Beachy R. N., Ann. Rev. 5. Scott K. P. et al., J. Gen. Virol. 75, pp. 3561Microbiol. 47, pp. 739-763 (1993) 3568 (1994) 36. Wilson. T.M.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6. Koonin E.V. & Dolja V.V., Crit:. Rev. Biochem. 90, pp. 3134-3141 (1993) and Моl. Biol. 28, pp. 375-430 (1993) 37. Gonsalves D. & Slightom J.L., Seminars in 7. Schmitt С et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Virology 4, 397-405 (1993) 89, pp. 5715-5719 (1992) 38. D'Halluin. K. et al., Biotechnology 10, pp. 3098. Morozo v S.Y. et al., J. Gen. Virol. 72, pp. 314 (1992) 2039-2042 (1991) 39. Kallerhof J. et al., Plant Cell Reports 9, pp. 9. Zhou H.; & Jackson A. O., Virology 216, pp. 224-228 (1990) 367-379 (1996) 40. Ehlers U. et al., Theoretical and Applied 10. Quillet L et al., Virology 172, pp. 293-301 Genetic 81, pp. 777-782 (1991) (1989) 41. Kraus J. et al., Field performance or 11. Bleykasten et al., J. Gen. Virol. 77, pp. 889transgenic sugar beet plants expresing BNYVV coat 897 (1996) protein plants, Fourth International Congress of Plant 12. Jupin. I. et al.. Virology 178, pp. 273-280 Molecular Biology, Int. Soc. for Plant Molecular (1990) Biology, Amsterdam (1994) 13. Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 42. Maiss E. et al., Proceedings of the Third 74, pp. 5463-5467 (1977) International Symposium on the Biosafety Results of 14. Fritsch С et al., J. Gen. Virol. 46, pp. 381-389 Field Tests or Genetically Modified Plants and (1980) Microorganisms, Monterey, PP. 129-139 (1994) 15. Laemmli U.K., Nature 227, pp. 680-685 43. Norris et al., Plant Molecular Biology 21, PP. (1972) 895-906 (1993) 25 70915 26 27 70915 28 29 70915 30 31 Комп’ютерна в ерстка А. Крулевский 70915 Підписне 32 Тираж 37 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601