Химерний цирковірус свиней pcv2gen-1rep та його застосування

Реферат: Винахід належить до химерної молекули нуклеїнової кислоти цирковірусу свиней (PCV2Gen1Rep), що має молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує цирковірус свиней типу 2 (PCV2), що містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білок цирковірусу свиней типу 1 (PCV1), де ORF Rep ген є ORF1. Химерна молекула нуклеїнової кислоти сконструйована шляхом заміщення ORF1 Rep гену PCV2 на ORF1 Rep ген PCV1. Винахід також належить до біологічно функціонального плазміду або вірусного вектора, який містить унікальні химерні молекули нуклеїнової кислоти, придатної клітини-хазяїна, трансфекованої плазмідом або вектором, інфекційного химерного цирковірусу свиней, що продукується придатною клітиноюхазяїном, процесу продукування імуногенного поліпептидного продукту, що використовує нову химеру, вірусної вакцини, що захищає свиню від вірусної інфекції або мультисистемного синдрому виснаження після віднімання (PMWS), спричиненого PCV2, способу захисту свиней від вірусної інфекції або мультисистемного синдрому виснаження після віднімання (PMWS), UA 106587 C2 (12) UA 106587 C2 спричиненого PCV2, способу одержання унікальної підвищення реплікації та титру PCV2 у клітинній культурі. химери PCV2Gen-1Rep, способу UA 106587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Галузь винаходу Даний винахід стосується унікального химерного цирковірусу свиней (PCV2Gen-1Rep), в якому послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білок PCV1, вставляють у геномний каркас PCV2, та його застосування як антигену у новій інактивованій або атенуйованій химерній вакцині для захисту свиней від вірусної інфекції або мультисистемного синдрому виснаження після віднімання (PMWS), спричиненого PCV2. Опис рівня техніки Всі патенти та публікації, процитовані у даному описі є включеними до цієї заявки шляхом посилання в усій повноті. У 1974 р. цирковірус свиней типу 1 (PCV1) був вперше виділений як стійка домішка до клітинної лінії PK-15 ATCC CCL-33 (I. Tischer і інші, "Characterization of papovavirus-and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines," Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2):153-167 (1974)). Після ідентифікації, PCV1 був визначений як убіквітарний свинячий вірус, що не спричиняє будь-які хвороби у свиней (G. M. Allan і інші, "Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material," Vet. Microbiol. 44:49-64 (1995); G. C. Dulac and A. Afshar, "Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs," Can. J. Vet. Res. 53:431-433 (1989); S. Edwards and J. J. Sands, "Evidence of circovirus infection in British pigs," Vet. Rec. 134:680-681 (1994); I. Tischer і інші, "Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus," Arch. Virol. 91:271-276 (1986)). Тоді як PCV1 не викликає жодних захворювань у свиней, потім було визначено, що цирковірус свиней типу 2 є патогенним. У 1991 р., варіантний штам PCV, позначений як цирковірус свиней типу 2 (PCV2) був вперше розпізнаний у свиней у Канаді, та було знайдено що він пов'язаний із мультисистемним синдромом виснаження після віднімання (PMWS) (G. M. Allan і інші, "Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe," J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); I. Morozov і інші, "Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)). PCV1 та PCV2 мають аналогічну геномну організацію у двох основних відкритих рамках зчитування (ORF): ORF1 кодує вірусний Rep білок, задіяний у вірусній реплікації, а ORF2 кодує вірусний капсидний білок. Загалом, PCV1 та PCV2 мають 68-76 % ідентичність нуклеотидних послідовностей в їх цілому нуклеотидному геномі, тоді як ізоляти у кожному генотипі мають більш, ніж 90 % ідентичність (A.K. Cheung, "The essential and nonessential transcription units for viral protein synthesis and DNA replication of porcine circovirus type 2," Virology 313:452-9 (2003)). PCV1 та PCV2 мають аналогічну геномну організацію у двох відкритих рамках зчитування (ORF) (A.K. Cheung, "Identification of the essential and non-essential transcription units for protein synthesis, DNA replication and infectious virus production of porcine circovirus type 1," Arch. Virol. 149(5):975-88 (2004); A. K. Cheung, "Transcriptional analysis of porcine circovirus type 2," Virology 305(1):168-180 (2003); A. Mankertz і інші, "Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus," J. Gen. Virol. 79(Pt 2):381-384 (1998); P. Nawagitgul і інші, "Open reading frame 2 °F porcine circovirus type 2 encoding a major capsid protein," J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000)). В обох вірусах, ORF1 відповідає за вірусну реплікацію та альтернативно спплайсований на 2 основні функціональні білки, Rep та Rep" (A.K. Cheung, "Identification of the essential and nonessential transcription units for protein synthesis, DNA replication and infectious virus production of porcine circovirus type 1," Arch. Virol. 149(5):975-88 (2004); A. K. Cheung, "Transcriptional analysis of porcine circovirus type 2," Virology 305(1):168-180 (2003); A. Mankertz and B. Hillenbrand, "Replication of porcine circovirus type 1 requires two proteins encoded by the viral rep gene," Virology 279:429-38 (2001); A. Mankertz і інші, "Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus," J. Gen. Virol. 79(Pt 2):381-384 (1998); A. Mankertz і інші, "Mapping and characterization of the origin of DNA replication of porcine circovirus," J. Virol. 71:2562-6 (1997)). ORF1 є високо консервативним між PCV1 та PCV2 з приблизно 83 % нуклеотидною та 86 % амінокислотною ідентичністю послідовностей (I. Morozov і інші, "Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)). ORF2 кодує імуногенний вірусний капсидний білок в обох вірусах (P. Nawagitgul і інші, "Open reading frame 2 °F porcine circovirus type 2 encoding a major capsid protein," J. Gen. Virol. 81:22812287 (2000)), та є більш варіабельним, ніж білок Rep, що має приблизно 67 % нуклеотидну та 65 % амінокислотну ідентичність послідовностей між PCV1 та PCV2 (I. Morozov і інші, "Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)). Нещодавно, третій ORF, ORF3, був ідентифікований у PCV2, а не у PCV1, та був, як повідомляють, задіяний в апоптозі (J. Liu і інші, "Characterization of 1 UA 106587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 a previously unidentified viral protein in porcine circovirus type 2-infected cells and its role in virusinduced apoptosis," J. Virol. 79:8262-74 (2005)). Раніше, патент США № 7,279,166 B2, патент США № 7,276,353 B2, M. Fenaux і інші, "A chimeric porcine circovirus type (PCV) with the immunogenic capsid gene of the pathogenic PCV type 2 (PCV2) cloned into у genomic backbone of the nonpathogenic PCV1 induces protective immunity against PCV2 infection in pigs," J. Virol. 78:6297-303 (2004), та M. Fenaux і інші, "Immunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2 (PCV2) and nonpathogenic PCV1 in weanling pigs," J. Virol. 77:11232-243 (2003), описували конструювання химерного вірусу, позначеного PCV1-2, в якому ORF PCV2 клонували у каркас геному PCV1. Публікації висвітлюють взаємний обмін капсидного гену ORF2, включаючи його міжгенні послідовності від PCV2 замість ORF2 PCV1, та додатково описують молекулу інфекційної реципрокної химерної нуклеїнової кислоти PCV2-1, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує PCV2, що має імуногенний ген ORF2 від непатогенного PCV1 замість гену ORF2 молекули патогенної PCV2 нуклеїнової кислоти. Тоді як химера PCV1-2 забезпечувала природно авірулентну ознаку, молекула реципрокної химерної нуклеїнової кислоти PCV2-1, що була одержана лише як експериментальна модель, залишалася вірулентною та не мала будьяких комерційних переваг порівняно із батьківським PCV2, окрім переваг для дослідження з метою порівняння вірусних характеристик PCV1-2. Жодні зі вказаних вище патентів або статей описували або передбачали створення будь-яких інших реципрокних химерних вірусів, що задіяні у геномному каркасі патогенного PCV2, та звичайно, жодні з них не передбачають заміну альтернативних відкритих рамок зчитування за межами вказаного та заданого ORF2 імуногенного капсидного гена. Додатково, химерний вірус PCV1-2 реплікує до титрів, подібних до титрів PCV2 у клітинах PK-15 (M. Fenaux і інші, "Immunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2 (PCV2) and nonpathogenic PCV1 in weanling pigs," J. Virol. 77:11232-243 (2003)). З іншого боку, PCV1 було адаптовано для зростання краще, ніж клітини PK-15, а PK-15 адаптований до клітинної культури зростання вірусу PCV1 краще, ніж PCV2, що реплікує щонайменше приблизно 1-log більші титри, ніж PCV2 у клітинах PK-15 (M. Fenaux і інші, "Two amino acid mutations in the capsid protein type 2 porcine circovirus (PCV2) enhanced PCV2 replication in vitro and attenuated the virus in vivo," J. Virol. 78:13440-6 (2004); M. Fenaux і інші, "Immunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2 (PCV2) and nonpathogenic PCV1 in weanling pigs," J. Virol. 77:11232-243 (2003)). Така підвищена здатність до реплікації PCV1 у клітинах PK-15 ймовірно викликана тим фактом, що PCV1 спочатку виділяли з клітинної лінії PK-15, як постійний забрудник клітинної культури, та таким чином його адаптовано до зростання у PK-15 клітинах. Проте, патогенні штами PCV2 не мають таку ж саму здатність до реплікації, що й PCV1, що має основну проблему, пов'язану із продукуванням вакцини PCV2, через відносно низький титр патогенну у клітинах PK-15. У результаті, задоволення ефективних рівнів продукування вакцин, виходячи з PCV2, такого, як інактивований цільний PCV2, природно авірулентного химерного PCV1-2 (виходячи з геномного каркасу джерела PCV1), рекомбінантних капсидних протеїнів PCV2 та ін., є реальною проблемою та утрудненням для виробників вакцин у цій галузі. При попередньому дослідженні міжгенних послідовностей PCV2, у PCV2 була ідентифікована інтерферон-α-стимульована елементом відклику (ISRE)-подібна послідовність (GAAANNGAAA), що може активувати генну транскрипцію у відповідь на IFN-α, подібну до визнаної в цій галузі активність ISRE-елементу (J.E. Darnell, Jr., і інші, "Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins," Science 264:1415-21 (1994)). Було показано, що вірус герпесу, пов'язаний із саркомою Капоші, експресує вірусні гени, що взаємодіють з вірусною кодованою ISRE-подібною послідовністю, що відповідає за додаткову активацію вірусного гену (J. Zhang, "Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus/human herpesvirus 8 replication and transcription activator regulates viral and cellular genes via interferonstimulated response elements," J. Virol. 79:5640-52 (2005)). Meerts і інші, нещодавно показав, що як клітини нирок свиней (PK-15) та моноцитні клітини свиней (3D4/31), оброблені IFN-α після інокуляції PCV2, мали збільшену кількість інфікованих клітин, аж до 529 % та 308 %, відповідно (P. Meerts і інші, "Enhancement of porcine circovirus 2 replication in porcine cell lines by IFN-gamma before and after treatment and by IFN-alpha after treatment," J. Interferone Cytokine Res 25(11):68493 (November 2005)). Цікаво, що, PK-15 клітини, оброблені IFN-α до інокуляції PCV2, мали зменшену кількість інфікованих клітин (69 %) (id.). Додатково до IFN-α, вплив IFN-γ на інфікування PCV2 як PK-15, так і 3D4/31 клітини, був також оцінений. Було знайдено, що лікування IFN-γ після інфікування PCV2 призводила до зростання кількості інфікованих клітин на 691 % у клітинах PK-15, та додатково IFN-γ перед PCV2 інокуляцією підвищувала кількість 2 UA 106587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 PCV2 антиген-позитивних клітин на 706 % у клітинах 3D4/31, через підвищену клітинну інтерналізацію вірусу (id.). Можливо, щоб фактор транскрипції, який відповідає за активацію IFNγ, був присутній у промоторному регіоні послідовності PCV2, проте у цей момент часу, це цілком гіпотетично та ще не обґрунтовано. Велика кількість вірусів не лише відповідає, але також маніпулює експресією IFN за допомогою різних маршрутів транскрипції для долання клітинного IFN відклику (S. Goodbourn, "Interferones: cell signalling, immune modulation, antiviral response and virus countermeasures," J. Gen. Virol. 81:2341-64 (2000)). Взяті разом, вплив IFN-α та IFN-γ на інфекцію PCV2 у клітинних культурах та роль ISRE-подібної послідовності у регуляції IFN-α та IFN-γ відкликів все ще предмет для вивчення. Тим не менш, додавання інтерферону для стимулювання зростання PCV2 мало неузгоджені результаті, як показано у попередніх дослідженнях. Тоді як інтерферон можна давати свиням, необхідно стежити за рівнем дозувань у інтерферонному кінцевому PCV2 продукті, оскільки інтерферон може викликати небажані реакції та бічні ефекти, особливо шкідливі для печінки. Більш бажаним буде покращення реплікацій них властивостей PCV2 шляхом застосування природного компоненту, що може бути безпечно введений свині. Отже, існує певна визнана у цій галузі проблема, викликана недостатніми кількостями продукування антигену при виробництві PCV2 вакцин, яку вирішує даний винахід шляхом розробки нових свинячих цирковірусних химер, що значно покращує низький титр і реплікацій ну здатність вірусу для виробництва великих партій химерних вакцин, ніж було одержано раніше. Тому важливим об'єктом цього винаходу є забезпечення унікальної комбінації PCV1 та PCV2, що зберігає антигенну здатність патогенних PCV2 щоб викликати адекватну імунну відповідь, але іноваційно досягає відмінних властивостей зростання титрів PCV1. Додатковим важливим об'єктом даного винаходу є одержання покращеного продукту химерної вакцини на основі PCV2 для захисту свиней проти вірусної інфекції або мультисистемного синдрому виснаження після віднімання (PMWS), спричиненого PCV2, де покращення включає кращу реплікацію, ніж батьківський PCV2. Додаткові цілі і об'єкти даного винаходу будуть відображені по ходу опису. Вищевказані об'єкти реалізують шляхом забезпечення нового химерного вірусу PCV2, що містить PCV1 ген в Rep у геномному каркасі зPCV2, як описано у цій заявці. СТИСЛИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід стосується унікального химерного цирковірусу свиней, в якому послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує реплікацію або Rep білок цирковірусу свиней типу 1 (PCV1), включена у геномний каркас цирковірусу свиней типу 2 (PCV2). Високобажане втілення даного винаходу відноситься до конструювання PCV2Gen-1Rep химери, в якій ген Rep відкритої рамки зчитування 1 (ORF1) PCV1 заміщує ORF1 ген PCV2 у геномній структурі PCV2. Даний винахід також охоплює біологічно функціональні плазміди, вірусні вектори та ін., що містять нові химерні молекули нуклеїнової кислоти, описані у цій заявці, придатні клітини-хазяїни, трансфековані плазмідами або векторами, що містять химерну ДНК, та способи одержання химерних конструктів. Додатково до обсягу даного винаходу включені атенуйовані або інактивовані вакцини, що містять, наприклад, химерну ДНК, плазмід, що містить химерну ДНК, химерний вірус, та інші, та нові способи захисту свиней від інфекції або мультисистемного синдрому виснаження після віднімання (PMWS), спричиненого PCV2, що включають введення свині, що потребує такого захисту, імунологічно ефективної кількості атенуйованої або інактивованої вакцини. Несподівано та корисно, химерний цирковірус свиней за даним винаходом забезпечує значно покращену реплікацію та титри порівняно із батьківським вірусом PCV2 та, таким чином, додаткове втілення даного винаходу направлено на новий спосіб покращення реплікації та титру PCV2 у клітинній культурі. СТИСЛИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Передумови створення винаходу і його відмінність від рівня техніки будуть додатково описані нижче з посиланням накреслення, що додаються, де: На Фігурі 1 показано, що химерний SDM-C6 DNA клон (з Rep геном PCV1 клонували у каркас PCV2 геному) є інфекційним при трансфекуванні у PK-15 клітини. Панелі A та a ілюструють PK15 клітини, трансфековані конкатомеризованим SDM-C6 химерним геномом; Панелі B та b ілюструють PK-15 клітини, трансфековані лінеаризованим SDM-C6 химерним геномом з одинарною копією; та Панелі C та c ілюструють реагенти трансфекції та MEM як негативні контролі. Панелі зліва забезпечують результати ІФА, забарвлені PCV2 ORF2 моноклональним антитілом, тоді як панелі справа забезпечують PK-15 клітинні моно шари, що накладені на результати ІФА. На Фігурі 2 проілюстровано характеристику параметрів зростання PCV1 (♦), PCV2 ( ), та химерного SDM-C6 (Δ) вірусів у PK-15 клітинах за допомогою одно стадійної кривої зростання. 3 UA 106587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 PK-15 клітини у планшетах на 6-12 лунок інокулювали двічі з кожним вірусом при множинності інфекції 0,1. Дві подвійні лунки інфікованих клітин збирали кожні 12 годин, а Та вірусні титри визначали за допомогою ІФА. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Відповідно до даного винаходу, забезпечено унікальні інфекційні химерні молекули нуклеїнової кислоти цирковірусу свиней (PCV2Gen-1Rep), живі химерні віруси, одержані з химерної молекули нуклеїнової кислоти і ветеринарні вакцини для захисту свиней від вірусної інфекції або мультисистемного синдрому виснаження після віднімання (PMWS), спричинених цирковірусом свиней типу 2 (PCV2). Даний винахід конкретно стосується конструювання та характеристики in vitro химерної молекули нуклеїнової кислоти цирковірусу свиней (PCV2Gen1Rep), де молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує PCV2, містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує реплікацію (Rep) білка цирковірусу свиней типу 1 (PCV1). З метою вставки в PCV2 молекулу нуклеїнової кислоти, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок Rep, може бути однією або більше функціональною нуклеотидною послідовністю, що кодують один або більше реплікаційних білків, які необхідні для вірусної реплікації непатогенного штаму цирковірусу свиней. Бажано використовувати повний ген відкритої рамки зчитування (ORF), що кодує білок Rep PCV1 та, переважно, використовувати ORF1 ген Rep з PCV1 для включення у геномний каркас PCV2. Навіть більш переважним для оптимальних властивостей химери є, щоб ORF1 ген Rep PCV1 заміщував відкриту рамку зчитування PCV2, особливо ORF1 ген Rep PCV2 у геномному каркасі PCV2. Друге втілення даного винаходу включає новий спосіб одержання химерної молекули нуклеїнової кислоти PCV2Gen-1Rep, як описано у цій заявці, що включає такі стадії: (a) видалення послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білок, з молекули нуклеїнової кислоти, що кодує PCV1; (b) включення послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білок PCV1, у молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує PCV2; та (c) відновлення химерної молекули нуклеїнової кислоти. Спосіб може бути зручно модифікований для конструювання варіацій химерного вірусу за даним винаходом, в якому стадія (а) може включати видалення послідовності нуклеїнової кислоти, що містить ген відкритої рамки зчитування (ORF), який кодує білок Rep PCV1 або, більш конкретно, видалення послідовності нуклеїнової кислоти, що містить ORF1 ген Rep PCV1. Як альтернативне втілення даного винаходу, стадія (b) може додатково включати видалення ORF1 гену PCV2, а потім включення послідовності нуклеїнової кислоти, що містить ORF1 ген Rep PCV1 в ORF1 генному положенні молекули нуклеїнової кислоти, що кодує PCV2. Новий химерний цирковірус свиней за даним винаходом переважно розроблений для забезпечення значно покращеної реплікаційної здатності та підвищених титрів порівняно із батьківським вірусом PCV2. Репрезентативна химера сконструйована у прикладах у цій заявці, що наведені нижче, та має назву "SDM-C6." Проба химерного вірусу SDM-C6 є інфекційною in vitro при трансфекуванні у клітини PK-15, що вказує на можливість заміщення Rep гену між PCV1 та PCV2. Покращення характеристик зростання SDM-C6 химерного вірусу характеризується одностадійною кривою зростання, що порівнює характеристики зростання химерного вірусу та вірусів дикого типу PCV1 та PCV2. Результати показують, що химерний вірус несподівано реплікує при приблизно 1-log титрі вище і більш ефективно, ніж його батьківський PCV2 вірус в клітинних культурах. Хоча химерний вірус реплікує до титрів, аналогічних у непатогенному PCV1, дослідження додатково показують, що химерний PCV2Gen-1Rep за даним винаходом несподівано реплікує швидше, ніж обидва його батьківські PCV1 і PCV2 віруси після трансфекції (тобто інфекції або інокуляції) PK-15 клітин. Оскільки було проблематично вирощувати PCV2 до більш високих титрів для адекватного виробництво вакцини в промислових масштабах - де навіть збільшення 11-log титру вважається значним - даний винахід дозволяє значні досягнення в галузі ветеринарії, що має важливі наслідки для розробки вакцин PCV2. Хоча 1-log різниця може не бути значною і для інших вірусів, 1-log збільшення титру PCV2 робить величезну різницю при виробництві вакцин PCV2, тобто вищі титри призведуть до скорочення об'єму вакцини на одну дозу, тим самим збільшуючи активність кінцевого продукту та ефективності всього процесу виробництва. Переважно, використання нової PCV2Gen-1Rep химери за даним винаходом забезпечує помітно краще виробництво PCV2 вакцин, ніж могло раніше бути досягнуто в минулому. Крім того, оскільки PCV2Gen-1Rep химера базується тільки на геномному каркасі PCV2 походження, це створює відмінну антигенну речовину у вакцині для захисту свиней проти вірусної інфекції або PMWS, спричинених PCV2 через присутність, в химерному конструкті, імуногенного ORF2 4 UA 106587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 капсидного гена PCV2, що важливо для виявлення імунної відповіді у щеплених свиней. Однією з основних відмінностей, що відрізняє SDM-C6 химерний вірус за даним винаходом від PCV1-2 химерного вірусу, описаного у патенті США № 7,279,166 B2 та патенті США № 7,276,353 B2, є послідовності нуклеїнових кислот: геномна послідовність PCV2Gen-1Rep химерного вірусу за даним винаходом (SDM-C6) має патогенне PCV2 походження, тоді як попередній PCV1-2 химерний вірус мав непатогенне PCV1 походження. У літературі повідомляли, що міжгенні послідовності генів Cap та Rep двох вірусів (PCV1 та PCV2) можуть відігравати важливу роль у регулюванні реплікації PCV (A. K. Cheung, "Detection of rampant nucleotide reversion at the origin of DNA replication of porcine circovirus type 1," Virology 333:22-30 (2005); A. K. Cheung, "Identification of an octanucleotide motif sequence essential for viral protein, DNA, and progeny virus biosynthesis at the origin of DNA replication of porcine circovirus type 2," Virology 324:28-36 (2004); A. Mankertz і інші, "New reporter gene-based replication assay reveals exchangeability of replication factors of porcine circovirus types 1 and 2," J. Virol. 77:9885-93 (2003)). Оскільки зміни штаму PCV2 для конструювання химерного вірусу SDM-C6 є додатковими до Rep гена з PCV1 замість Rep гену у ДНК послідовності PCV2, можна припустити, що ген Rep PCV1 може мати внесок до підвищеної здатності до реплікації. Проте, такі припущення мають бути чистими спекуляціями до фактичного конструювання конструкту та його аналізу у дослідженнях зростання, особливо через той фактор, що непатогенний PCV1 та патогенний PCV2 мають лише 68-76 % гомологію нуклеотидних послідовностей у їх повних геномах. Ген Rep PCV1 може не транслюватися у функціональні коди геному PCV2 або забезпечувати кращу здатність до реплікації у різних нуклеотидних послідовностях, що кодують PCV2. Таким чином, існуючі спостереження стосовно даного винаходу, про те, що химерний SDM-C6 вірус реплікує до аналогічного титру, як вірус PCV1, є несподіваним результатом. Як інша неочікувана ознака, вірус SDM-C6 також реплікує швидше, ніж обидва PCV1 та PCV2 батьківські штами, що вказує на те, що механізм підвищеної здатності до реплікації для химерного вірусу PCV2Gen-1Rep за даним винаходом все ще має бути визначений. На сьогодні, відсутні попередні повідомлення щодо включення Rep гену PCV1 у геномний каркас патогенного PCV2 та одержання інфекційного патогенну з покращеними реплікацій ними властивостями порівняно з обома батьківськими штамами, як описано у цій заявці. Зважаючи на підвищену реплікаційну здатність нового PCV2Gen-1Rep химерного вірусу, додаткове втілення даного винаходу тому відноситься до нового способу покращення реплікації та титру PCV2 у клітинній культурі, що включає наступні стадії: (a) конструювання PCV2Gen-1Rep химерного вірусу, в якому ORF1 Rep ген PCV2 заміщено на ORF1 Rep ген PCV1; (b) інокуляцію придатної клітинної лінії з PCV2Gen-1Rep химерою; (c) культивування PCV2Gen-1Rep химери у придатному вірусному ростовому середовищі за стандартних умов протягом достатньої кількості часу для індукування продукування вірусу; та (d) збирання химерного вірусу. У зазначеному вище способі, приклади придатної клітинної лінії можуть бути клітинною лінією нирок свині, що не містить антиген свиней (PK-15 клітини), клітинною лінією тестикул свині (ST) та подібними клітинними лініями, здатними до вирощування цирковірусу свиней або конкретно адаптованими для вирощування цирковірусів свиней. Також в обсяг даного винаходу включені біологічно функціональні плазміди, вірусні вектори та інші, що містять нові химерні молекули нуклеїнових кислот, описаних у цій заявці, придатні клітини-хазяєва, трансфековані цими плазмідами або векторами, та живий химерний цирковірус свиней, продукований клітинами-хазяїнами. Даний винахід додатково охоплює спосіб одержання імуногенного поліпептидного продукту, де спосіб включає вирощування, за придатних умов живлення, прокаріот них або еукаріот них клітин-хазяїнів, трансфекованих химерною молекулою нуклеїнової кислоти циркові русу свиней (PCV2Gen-1Rep), як описано у цій заявці, таким чином, що дозволяє експресію вказаного поліпептидного продукту, та виділення цільового поліпептидного продукту експресії химерної молекули. Придатно атенуйовані або інактивовані вакцини химерної вірусної молекули та молекули ДНК, та способи їх застосування, також включені в обсяг даного винаходу. Інокульовані свині захищені від серйозної вірусної інфекції та PMWS, спричиненого PCV2. Новий спосіб захищає свиней, що потребують захисту, від вірусної інфекції або PMWS шляхом введення свині імунологічно ефективної кількості вакцини за даним винаходом, такої, як, наприклад, вакцина, що містить імуногенну кількість химерної ДНК послідовності, що кодує PCV2Gen-1Rep, клонований химерний вірус, плазмідний або вірусний вектор, що містить химерні ДНК молекули, рекомбінантну PCV2Gen-1Rep ДНК послідовність, та ін. Інші антигени, такі, як PRRSV, PPV, інші інфекційні агенти для свиней та імуностимулятори, можуть бути введені свині одночасно з 5 UA 106587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 убезпеченням широкого спектру захисту від вірусної інфекції. Вакцини містять, наприклад, химерні молекули нуклеїнової кислоти PCV2Gen-1Rep, клонований химерний геном у прийнятних плазмідах або векторах, таких, як наприклад, вектор pSK, інактивованій або атенуйованій химерний вірус, та інші. У комбінації з нетоксичним фізіологічно придатним носієм та, необов'язково, одним або більше стандартними допоміжними речовинами. Переважно, вакцина застосовує інактивований химерний вірус як антиген. Допоміжна речовина, що може бути введена у сполученні із вакциною за даним винаходом, є речовиною, що підвищує імунологічну відповідь свині на вакцину, може бути введена у той самий час та у таку саму ділянку, що й вакцина, або у різні моменти часу, наприклад, як бустер. Допоміжні речовини також можуть бути корисно ведені свині таким чином або у таку ділянку, що відрізняються від способу або ділянки, в які вводять вакцину. Придатні допоміжні речовини, відомі фахівцям у ветеринарній галузі, включають, не обмежуючись наведеним, гідроксид алюмінію (галуни), імуностимулюючі комплекси (ISCOMS), неіонні блок-полімери або співполімери, цитокіни (подібні IL-1, IL-2, IL-7, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, та ін.), сапоніни, монофосфоріл ліпід A (MLA), мірамільні дипептиди (MDP) та ін. Інші придатні допоміжні речовини включають, наприклад, сульфат алюмінію-калію, термолабільні або термостабільні ентеротоксини, виділені з кишкової палички, токсин холери або його B підодиницю, токсин дифтериту, токсин правця, токсин коклюшу, повний або неповний ад'ювант Фройнда, та ін. Допоміжні речовини на основі токсинів, такі, як токсин дифтериту, токсин правця та токсин коклюшу, можуть бути інактивовані перед застосуванням, наприклад, шляхом обробки формальдегідом. Вакцини можуть додатково містити додаткові антигени для підвищення імунологічної активності химерного вірусу або ДНК за даним винаходом, таких, як, наприклад, вірус репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV), парвовірус свиней (PPV), інші інфекційні агенти свиней та імуностимулятори. Нові вакцини згідно з даним винаходом не обмежуються будь-яким конкретним типом або способом одержання. Клоновані вірусні вакцини включають, не обмежуючись наведеним, інфекційні ДНК-вакцини (тобто, використовуючи плазміди, вектори або інші традиційні носії для безпосереднього введення ДНК свиням), атенуйовані вакцини, інактивовані вакцини, генетично сконструйовані вакцини, та ін. Ці вакцини одержують стандартними способами, відомими в даній галузі. Оскільки антигенна речовина у вакцину за данім винаходом заснована на патогенному штамі PCV2, активна речовина має бути спочатку атенуйована або інактивована придатним визнаним у цій галузі способом. Щоб одержати інактивовані вірусні вакцини, наприклад, розмноження вірусу від інфекційного клону ДНК здійснюють способами, відомими в даній галузі або описаними у цьому документі. Послідовну інактивацію вірусу потім оптимізували за протоколом, загалом, відомим фахівцям в даній галузі. Інактивовані вірусні вакцини можуть бути одержані шляхом обробки химерного вірусу, одержаного з клонованого ДНК з агентами інактивації, такими, як формалін або гідрофобні розчинники, кислоти, та ін., шляхом опромінення ультрафіолетовим світлом або рентгенівським опромінюванням, шляхом нагрівання, та ін.. Інактивацію проводять таким чином, що є зрозумілим у цій галузі. Наприклад, у хімічній інактивації, відповідну пробу вірусу або сироватки, що містить вірус, як правило, обробляють протягом достатнього часу достатньою кількістю або концентрацією агента інактивації при досить високій (або низькій, в залежності від агента інактивації) температури або рН для інактивації вірусу. Інактивацію при нагріванні, як правило, проводять при температурі і протягом часу, достатнього для інактивації вірусу. Інактивацію шляхом опромінення часто проводять з використанням довжини хвилі світла або іншого джерела енергії протягом часу, достатнього для інактивації вірусу. Як правило, терміни "інактивований", "мертвий" або "інактивованій" застосовують взаємозамінно в контексті вірусних вакцин, маючи на увазі вакцину, що містить віруси, які були інактивовані. Вірус вважається інактивованим, якщо він не може інфікувати клітину, сприйнятливу до інфекції. Для одержання атенуйованих вакцин з патогенних клонів, тканинну культуру адаптованого живого патогенного PCV2Gen-1Rep спочатку атенуюють (надають не патогенність або нешкідливість) способами, відомими з рівня техніки, типово одержують послідовним пропусканням через клітинні культури. Атенуювання патогенних клонів може також бути здійснено генними делеціями або генними мутаціями з утворенням генів. Додатково можливо точно визначити нуклеотидні послідовності у вірусному геномі, що відповідають за вірулентність, та генетично сконструювати вірусний авірулент через, наприклад, сайт-направлений мутагенез. Сайт-направлений мутагенез може додавати, 6 UA 106587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 видаляти або змінювати рідин або більше нуклеотидів (див., наприклад, Zoller і інші, DNA 3:479488, 1984). Синтезують олігонуклеотид, що містить бажану мутацію та гібридизують його до частини одно ланцюгової вірусної ДНК. Гібридна молекула, одержана у результаті цієї процедури, задіяна у трансформування бактерій. Подвійна ДНК, що була виділена, яка містить відповідну мутацію, була використана для одержання повнорозмірної ДНК шляхом зшивки до фрагменту рестрикції останнього, який потім трансфекують у придатну клітинну культуру. Зшивка геному у придатний вектор для переносу може бути здійснена шляхом будь-якої стандартної методики, відомої фахівцю у цій галузі. Трансфекція вектору у клітини-хазяєва для продукування вірусного потомства може бути здійснена будь-якими традиційними способами, такими, як кальцій-фосфат або DEAE-декстран опосередкована трансфекція, електропорація, злиття протопластів та інші добре відомі способи (наприклад, Sambrook і інші, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Клонований вірус потім проявляє бажану мутацію. Альтернативно, можуть бути синтезовані два олігонуклеотиди, що містять відповідну мутацію. Вони можуть бути гібридизовані з утворенням подвійної ДНК, що може бути введена у вірусну ДНК з одержанням повнорозмірної ДНК. Клітинна лінія комах (подібна HI-FIVE) може бути трансформована вектором переносу, що містить молекули нуклеїнових кислот, одержані з вірусу або копійовані з вірусного геному, що кодує один або більше імуно-домінантних білків вірусу. Вектор переносу включає, наприклад, лінеаризовану бакуловірусну ДНК та плазмід, що містять імуногенні полінуклеотиди. Лінія клітини хазяїна може бути спільно трансфекована з лінеаризованою бакуловірусною ДНК та плазмідою з одержанням рекомбінантного бакуловірусу. Альтернативно, живі вектори, наприклад, такі, як поксвірус або аденовірус, можуть бути застосовані як вакцина у комбінації з химерою згідно з даним винаходом. Імунологічно ефективну кількість вакцини за даним винаходом вводять свині, що потребує захисту від вірусної інфекції або PMWS. Імунологічно ефективна кількість або імуногенна кількість, якою інокулюють свиню, може бути легко визначена або легко титрована звичайним аналізом. Ефективна кількість – кількість, при якій для захисту свині, яку піддають дії вірусу, що викликає PMWS, досягають достатній імунологічний відклик на вакцину. Переважно, свиню захищають тією мірою, якою один з усіх несприятливих фізіологічних симптомів або ефектів вірусної хвороби значно зменшено, полегшено або повністю попереджено. Вакцина може бути введена як одинарна доза або множина доз. Дозировки можуть знаходитися у діапазоні, наприклад, від приблизно 1 мікрограма до приблизно 1000 мікрограм плазмідної ДНК, що містить інфекційний химерний ДНК геном (в залежності від концентрації імуноактивного компонента вакцини), переважно, 100-200 мікрограмів химерного PCV2Gen1Rep ДНК клону. З рівня техніки відомі способи визначення або титрування придатних дозувань активного антигенного агента для знаходження мінімальних ефективних доз, виходячи з маси свині, концентрації антигену та інших типових факторів. Бажано, щоб вакцину вводили свині, яку ще не піддавали дії вірусу PCV. Вакцина, що містить антигенну речовину, може бути зручно введена інтраназально, трансдермально (тобто, накладена на або при поверхні шкіри для поглинання організмом, парентерально, та ін. Парентеральні маршрути введення включають, не обмежуючись наведеним, внутрішньом'язовий, внутрішньовенний, інтраперітонеальний, інтрадермальний (тобто, ін'єкцію або інше введення під шкіру), підшкірний маршрути та ін. Оскільки внутрішньом'язовий та інтрадермальний маршрути інокуляції були успішними в інших дослідженнях за допомогою вірусних інфекційних ДНК клонів (E. E. Sparger і інші, "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone," Virology 238:157-160 (1997); L. Willems і інші, "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep," Virology 189:775-777 (1992)), ці маршрути є найбільш переважними, додатково до практичного інтраназального маршруту введення. Хоча це менш зручно, також описано, що вакцину дають свині через інтралімфоїдний маршрут інокуляції. При введені у вигляді рідини, дана вакцина може бути одержана у вигляді водного розчину, сиропу, еліксиру, настоянки та ін. Такі композиції відомі з рівня техніки та їх типово одержують шляхом розчинення антигену та інших типових добавок у відповідному носії або системі розчинників. Придатні носії або розчинники включають, не обмежуючись наведеним, воду, сольовий розчин, етанол, етиленгліколь, гліцерин, та ін. Типовими добавками є, наприклад, сертифіковані барвники, ароматизатори, підсолоджувачі та протимікробні консерванти, такі, як тімерозал (натрій етилртутьтіосаліцилат). Такі розчини можуть бути стабілізовані, наприклад, шляхом додавання частково гідролізованого желатину, сорбітолу або клітинного культурального середовища, та можуть бути буферовані традиційними способами з використанням реагентів, відомих з рівня техніки, наприклад, гідрофосфату натрію, 7 UA 106587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дигідрофосфату натрію, гідрофосфату калію, дигідрофосфату калію, їх суміші, та ін. Рідкі композиції також можуть включати суспензії та емульсії, що містять суспендуючи агенти або емульгатори у комбінації з іншими стандартними допоміжними інгредієнтами композицій. Такі типи рідких композицій можуть бути одержані традиційними способами. Суспензії, наприклад, можуть бути одержані за допомогою колоїдного млина. Емульсії, наприклад, можуть бути одержані за допомогою гомогенізатору. Парентеральні композиції, розроблені для вприскування у системи рідин організмів, потребують належної ізотонічності та pH буферування до відповідних рівнів рідин організмів свиней. Ізотонічність може бути прийнятно відрегульована хлоридом натрію та іншими солями, у міру необхідності. Придатні розчинники, такі, як етанол або пропіленгліколь, можуть бути застосовані для підвищення розчинності інгредієнтів у композиції та стабільності рідкого препарату. Додаткові добавки, що можуть бути застосовані у даній вакцині, включають, не обмежуючись наведеним, декстрозу, традиційні антиоксиданти та традиційні хелаторні агенти, такі, як етилендіамінтетраоцтова кислота (EDTA). Парентеральні форми дозувань повинні також бути простерилізовані перед застосуванням. Наступні приклади демонструють певні аспекти даного винаходу. Проте, має бути зрозумілим, що ці приклади наведено тільки для ілюстрації та вони не призначені бути цілком визначеними умовами та обсягом даного винаходу. Має бути оцінено, що при типових умовах реакції (наприклад, температура, час реакції, та ін.) умови, що перевищують або нижчі за вказані діапазони, також можуть бути застосовані, хоча загалом це менш зручно. Приклади проведено при кімнатній температурі (від приблизно 23C до приблизно 28C) та атмосферному тиску. Усі частини та відсотки, наведені у цій заявці, є масовими, та усі температури виражені у градусах Цельсію, якщо не вказано інше. Додаткове розуміння даного винаходу може бути одержано з не обмежуючих прикладів, що наведені нижче. ПРИКЛАД 1 Конструювання химерного PCV2Gen-1Rep В усіх експериментах in vitro, що наведені нижче, були застосовані клітини PK-15, що не містили PCV. Ці клітини попередньо одержували шляхом кінцевого розведення (M. Fenaux і інші, "Cloned genomic DNA of type 2 porcine circovirus is infectious when injected directly into the liver and lymph nodes of pigs: characterization of clinical disease, virus distribution, and pathologic lesions," J. Virol. 76:541-51 (2002)). Конструкції одинарної копії PCV2 та PCV1 та димеризованих тандемних повторних інфекційних ДНК колоній були описані раніше (id.). Для конструювання химерного PCV2Gen-1Rep з ORF1 Rep геном PCV1, що заміщує ген PCV2 у каркасі PCV2 геному (включаючи його міжгенні послідовності), геном PCV1 одинарної копії інфекційного ДНК клону у pBluescript II SK+ вектор був ампліфікований за допомогою ПЛР з праймерами PCV1REPF (5" CAACTGGCCAAGCAAGAAAAG 3" (що відповідає SEQ ID NO:1)) та PCV1REPR (5" AACCATTACGATGTGATCAAAAAGACTCAGTAAT TATTTTATATGGGAAAAGGG 3" (що відповідає SEQ ID NO:2)) з одержанням фрагменту PCV1Rep гену з конструйованими сайтами рестриктази BalI і BclI на будь-якому кінці. ПЦР-реакція складалася з 45 мкл Platinum ПЛР SuperMix високої точності (Invitrogen, Carlsbad, CA), 20 пM праймера PCV1REPR, 20 pM праймера PCV1REPF, та 1 мкл PCV1 інфекційного ДНК клону одинарної копії. Термоциклерна реакція складалася з початкової денатурації протягом 2 хвилин при 94˚C, та 35 циклів денатурації при 94˚C протягом 30 сек., гібридизації при 55˚C протягом 30 сек., та подовження при 68˚C протягом 30 сек., з наступною кінцевою інкубацією при 68˚C протягом 7 хвилин. Фрагмент PCV1Rep був відділений 1 % агарозним гелем, та очищений за допомогою комплекту Geneclean II (Qbiogene, Irvine, CA). Фрагмент PCV1Rep був потім дигестований з BalI та BclI, окремо, та одержаний у результаті дигестований фрагмент пропускали через 1 % агарозний гель та очищений за допомогою комплекту Geneclean II. Геномний каркасний фрагмент PCV2 мінус Rep ген був ампліфікований з PCV2 інфекційного ДНК клону одинарної копії у pBluescript вектор за допомогою ПЛР з використанням праймерів PCV2GENF (5" CTTTTTGATCACTTCGTAATGGTTTTTA 3" (що відповідає SEQ ID NO:3)) та PCV2GENR (5" GCTTACCATGTTGCTGCTGAGGT 3" (що відповідає SEQ ID NO:4)). Сайти рестриктази BfrBI та BclI були введені на будь-якому кінці фрагменту. ПЛР реакція складалася з 20 пM праймера PCV2GENF, 20 пM праймера PCV2GENR, 40 мM dNTP (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), 200mM MgCl2, 10 мкл 10X PCR буфера, 72 мкл dH2O, 5 ланок AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA), та 1 мкл PCV2 інфекційного ДНК клону одинарної копії. Термоциклерна реакція складалася з початкової денатурації при 94˚C протягом 10 хвилин, та 38 циклів денатурації при 94˚C протягом 1 хвилини, гібридизації при 50˚C протягом 1 хвилини, та подовження при 72˚C протягом 45 сек., з наступним кінцевим подовженням при 72˚C 8 UA 106587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 протягом 7 хвилин. PCV2 геномний каркасний фрагмент (без гену Rep), PCV2Gen фрагмент, відділяли за допомогою 1 % агарозного гелю з використанням комплекту Geneclean II. Фрагмент PCV2Gen потім дигестували з BfrBI та BclI, окремо, пропускали через 1 % агарозний гель та очищували за допомогою комплекту Geneclean II. Для генерування химерного PCV інфекційного ДНК клону, протягом ночі здійснювали зшивку PCV1Rep та PCV2Gen фрагментів за допомогою комплекту для зшивки Stratagene DNA (LaJolla, CA). Суміш для зшивки застосовували для трансформування клітин TOP10 (Invitrogen) відповідно до протоколу виробника. Білі колонії відбирали, культивували протягом ночі, а плазмід екстрагували за допомогою комплекту Sigma's GenElute Plasmid Miniprep (St. Louis, MO). Плазміди дигестували з рестриктазою KpnI та пропускали через 1 % агарозний гель для ідентифікації аутентичних плазмідів з 2 смугами при приблизно 1.7 kb (PCV2Gen-1Rep) та 2.9 kb (pBluescript II SK+ вектор). ПРИКЛАД 2 Аналіз життєздатності химерного PCV2Gen-1Rep ДНК клону Аналіз життєздатності химерного PCV2Gen-1Rep ДНК клону здійснювали шляхом трансфекції клітин PK-15. Рестриктазу KpnI застосовували для видалення химерного PCV2Gen1Rep геному з pBluescript II SK+ плазмідний вектор. Химерний PCV2Gen-1Rep геном пропускали через 1 % агарозний гель, очищували за допомогою GeneClean II, та потім конкатомеризували T4 ДНК лігазою, істотно за допомогою традиційних методів, попередньо описаних (M. Fenaux і інші, 2002, supra). PK-15 клітини при приблизно 70 % конфлюентності, що зростали на Lab-Tek предметному склі, трансфекували конкатомеризованою PCV2Gen-1Rep геномною ДНК з використанням ліпофектаміну та Plus Reagent відповідно до протоколу виробника (Invitrogen). Через три дні після трансфекції, був проведений непрямий імунофлуоресцентний аналіз (IFA) з використанням PCV2 ORF2-специфічного поліклонального антитіла, як було описано раніше (id.) для визначення інфективності. Для додаткової оцінки інфективності PCV2Gen-1Rep химерного геному, PK-15 клітини при 70 % конфлюентності, що зростали у T-25 колбах, трансфекували приблизно 12 мкг конкатомеризованого химерного геному на колбу, як описано раніше (id.). Вірусний матеріал збирали через 3 дні після трансфекції та титрували за допомогою ІФА з PCV2 ORF2-специфічним поліклональним антитілом, як описано раніше (id.). ПРИКЛАД 3 Секвенування ДНК для підтвердження химерного геному Праймери Rep830F (5' GGTGTCTTCTTCTGCGGTAACG 3' (що відповідає SEQ ID NO:5)) та Rep830R (5' GTTCTACCCTCTTCCAAACCTTCC 3' (що відповідає SEQ ID NO:6)) застосовували для ампліфкації ділянки переходу між 3" PCV2Gen фрагментом та фрагментом PCV1Rep. Праймери Rep10F (5' GGAAGACTGCTGGAGAACAATCC 3' (що відповідає SEQ ID NO:7)) та Rep10R (5' CGTTACTTCACACCCAAACCTG 3' (що відповідає SEQ ID NO:8)) застосовували для ампліфкації ділянки переходу між 5’PCV1Rep фрагмента та 3" PCV2Gen фрагмента. Ампліфіковані ПЛР продукти секвенували для обох штамів. ПРИКЛАД 4 Сайт-направлений мутагенез Початковий химерний PCV2Gen-1Rep DNA клон не був інфекційним при трансфекції у PK-15 клітини. Після аналізу послідовності химерного геному, 6 нуклеотидна (GTAAGC) інерція була ідентифікована після ATG старт-кодону PCV1 ORF1 Rep гену. Для виправлення цієї помилки та небажаної інерції, введеної шляхом ПЛР та стадій клонування, праймери MVTF (5" CTCAGCAGCAACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG 3" (що відповідає SEQ ID NO:9)) та MVTR (5" CCGCTTTTCTTGCTTGGCATGTTGC TGCTGAG 3" (що відповідає SEQ ID NO:10)) застосовували для делеції 6 нуклеотидної інерції за допомогою комплекту для сайтнаправленого мутагенезу QuikChange II (Stratagene). TOP10 клітини трансформували з мутагенізованим продуктом відповідно до протоколу виробника (Invitrogen). Білі колонії відбирали та культивували протягом ночі. Клон SDM-C6 швидко висіювали на LB агарову пластину, що мітила ампіцилін, та вирощували всю ніч при 37 °C. Чотири колонії відбирали та культивували протягом ночі. Їх плазміди екстрагували та секвенували за допомогою праймерів Rep830F та Rep830R для гарантії того, що введені 6 нуклеотиди були видалені з химерного геному. Було знайдено, що 6 нуклеотидна (GTAAGC) інерція надавала химерному клону неінфекційну та небажану інерцію, що була успішно видалена за допомогою сайт-направленого мутагенезу. Було знайдено, що новий химерний клон, SDM-C6, є інфекційним після подальшої трансфекції у PK-15 клітини. ПРИКЛАД 5 Одержання вірусного матеріалу для характеристики химерного вірусу In Vitro 9 UA 106587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Одержували PCV1 та PCV2 вірусні матеріали, відповідно, з PCV1 та PCV2 інфекційних ДНК клонів шляхом трансфекції PK-15 клітин відповідно до традиційних методик, описаних раніше (M. Fenaux і інші, 2002, supra). Інфекційний титр кожного вірусного матеріалу визначали за допомогою ІФА з PCV2 ORF2-специфічним антитілом (id.). Химерний геном SDM-C6, що містив PCV1 Rep ген у каркасі PCV2 геному, був видалений з pBluescript II SK+ плазмід за допомогою рестриктази KpnI, та очищені за допомогою комплекту GeneClean II. Приблизно 40 мкг химерного геному SDM-C6 конкатомеризували T4 ДНК ліпазою та застосовували для трансфекції 4 колб (10 мкг на колбу) PK-15 клітин при приблизно 70 % конфлюентності за допомогою ліпофектаміну та Plus Reagent, як описано раніше (id.). Через три дні після трансфекції, химерний вірус SDM-C6 збирали шляхом потрійного виморожування та відтаювання трансфекованих клітин, та інфекційний титр химерного вірусного матеріалу SDMC6 визначали за допомогою ІФА з PCV2 ORF2 моноклональним антитілом (Rural Technologies Inc., Brookings, SD) при розведенні 1:1000 у фосфатному буферному сольовому розчині (10X, pH 7.,4) (Invitrogen). Вірусний матеріал SDM-C6 мав відмінний вірусний інфекційний титр, що 5.5 становив 0,5 × 10 TCID50/мл. PK-15 клітини, трансфековані як конкатомеризованим, так і лінеаризованим SDM-C6 геномом, були сильно позитивними за даними ІФА (Фіг. 1), що встановлювало той факт, що химерний геном SDM-C6 з PCV1 Rep геном, клонований у каркасі PCV2 геному, є інфекційним in vitro. ПРИКЛАД 6 Одностадійна крива зростання Для характеристики параметрів зростання химерного вірусу, та порівняння його з вірусами PCV1та PCV2 дикого типу, здійснювали одно стадійну криву зростання. PK-15 клітини культивували у восьми лунках шести планшет на 12 лунок. При конфлуентності у приблизно 70 %, кожну лунку промивали 2 мл MEM. Вісім лунок у подвійних планшетах інокулювали PCV1, PCV2, та SDM-C6 при 0,1 множинності інфекції (MOI). Через 1 годину після інкубації, інокулят виділяли. Клітинні моношари послідовно тричі промивали 2 мл PBS для видалення будь-якої надлишкової кількості вірусного інокуляту. Два мл MEM з 2 % FBS та 1X антибіотикаантимікотика додавали у кожну лунку, та планшети послідовно інкубували при 37 °C з 5 % CO2. Через 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, та 96 годин після інокуляції (hpi), клітини в одній лунці кожної подвійної планшети збирали шляхом зіскоблювання у супернатант. Зібрані клітини заморожували та відтаювали тричі та зберігали при -80 °C до титрування. Інфекційний титр при кожному hpi визначали у 8-лунковому Lab-Tek II предметному склі (Nalge Nunc International, Rochester, NY) за допомогою серійно розведених інокулятів з наступним ІФА з PCV2 ORF2 моноклональним антитілом за допомогою способу Спермана-Карбера (M. Fenaux і інші, 2002, supra). Дані показали, що SDM-C6 химерний вірус зростав також як і PCV1 вірус (Фіг. 2) до титру 4.0 3.0 2,20 × 10 TCID50/мл при 96 hpi, тоді як PCV2 зростав лише до 2,20 × 10 TCID50/мл при 96 hpi. 2.0 При 12 hpi,химерний SDM-C6 вірус зростав до титру 6,95 × 10 TCID50/мл, тоді як PCV1 та PCV2 віруси обидва мали недетектовні титри, що дозволяло дійти висновку, що химерні вірусні реплікати є більш швидкими, ніж батьківські віруси. PCV1 мав детектовний вірусний титр, що 2.0 становив 8,70 × 10 TCID50/мл при 24 hpi, тоді як PCV2 не мав детектовного титру до 48 hpi 1.0 (7,91 × 10 TCID50/мл). Таким чином, спостерігали, що химерний SDM-C6 вірус та PCV1 вірус зростали до аналогічних титрів, що було приблизно на 1-log вище титру батьківського PCV2 вірусу. Вище забезпечено детальний опис конкретних втілень даного винаходу з метою ілюстрації але не обмеження. Необхідно розуміти, що усі інші модифікації, раміфікації та еквіваленти, очевидні фахівцям у цій галузі, виходячи з даного опису, призначені для включення в обсяг даного винаходу так, як наведено у формулі даного винаходу. 10 UA 106587 C2 11 UA 106587 C2 12 UA 106587 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 1. Химерна молекула нуклеїнової кислоти цирковирусу свиней (PCV2Gen-1Rep), що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує цирковірус свиней типу 2 (PCV2), що містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білок цирковірусу свиней типу 1 (PCV1), що заміщає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білок цирковірусу свиней типу 2 (PCV2), і де послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білки PCV1 і PCV2, є геном відкритої рамки зчитування (ORF). 2. Химерна молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, де ORF Rep ген являє собою ORF1. 3. Плазмід, що містить химерну молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-2. 4. Придатна клітина-хазяїн, трансфекована плазмідом за п. 3. 13 UA 106587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5. Химерний цирковірус свиней, продукований клітиною-хазяїном за п. 4. 6. Вірусний вектор, що містить химерну молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-2. 7. Придатна клітина-хазяїн, трансфекована вектором за п. 6. 8. Химерний цирковірус свиней, продукований клітиною-хазяїном за п. 7. 9. Спосіб одержання імуногенного поліпептидного продукту, де вказаний спосіб включає: вирощування за придатних умов живлення прокаріотичної або еукаріотичної клітини-хазяїна, трансфекованої химерною молекулою нуклеїнової кислоти цирковірусу свиней за будь-яким з пп. 1-2 таким чином, що дозволяє експресію вказаного поліпептидного продукту, та виділення цільового поліпептидного продукту експресії химерної молекули. 10. Вірусна вакцина, що захищає свиню від вірусної інфекції або мультисистемного синдрому виснаження після віднімання (PMWS), спричиненого PCV2, що містить нетоксичний фізіологічно прийнятний носій та імуногенну кількість придатним чином атенуйованого або інактивованого інгредієнту, вибраного з групи, що складається з: (a) химерної молекули нуклеїнової кислоти цирковірусу свиней (PCV2Gen-1Rep), що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує цирковірус свиней типу 2 (PCV2), що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує Rep білок цирковірусу свиней типу 1 (PCV1), що заміщає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білок цирковірусу свиней типу 2 (PCV2); (b) плазміда або вірусного вектора, який містить химерну молекулу нуклеїнової кислоти цирковірусу свиней (PCV2Gen-1Rep), що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує PCV2, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білок цирковірус свиней типу 1 (PCV1), що заміщає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білок цирковірусу свиней типу 2 (PCV2); та (c) химерного цирковірусу свиней, одержаного з химерної молекули нуклеїнової кислоти цирковірусу свиней (PCV2Gen-1Rep), що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує PCV2, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує Rep білок цирковірусу свиней типу 1 (PCV1), що заміщає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білок цирковірусу свиней типу 2 (PCV2). 11. Вакцина за п. 10, де химерна молекула нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує Rep білки PCV1 і PCV2, що містить ген відкритої рамки зчитування (ORF). 12. Вакцина за п. 11, де химерна молекула нуклеїнової кислоти містить ген ORF1 Rep PCV1. 13. Спосіб захисту свині від вірусної інфекції або мультисистемного синдрому виснаження після віднімання (PMWS), спричиненого PCV2, що включає введення свині, яка потребує такого захисту, імуногенно ефективної кількості вакцини за будь-яким з пп. 10-12. 14. Спосіб за п. 13, що включає введення вакцини свині парентерально, інтраназально, інтрадермально або трансдермально. 15. Спосіб одержання химерної молекули нуклеїнової кислоти PCV2Gen-1Rep за п. 1, що включає такі стадії: (a) одержання молекули нуклеїнової кислоти, що кодує PCV2; (b) видалення послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білок з молекули нуклеїнової кислоти, що кодує PCV2; (c) включення послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує Rep білок PCV1, у молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує PCV2 з одержанням химерної молекули нуклеїнової кислоти PCV2Gen-1Rep; та (d) виділення химерної молекули нуклеїнової кислоти. 16. Спосіб за п. 15, де стадія (b) включає видалення послідовності нуклеїнової кислоти, що містить ген відкритої рамки зчитування (ORF), що кодує Rep білок PCV2. 17. Спосіб за п. 16, де ORF ген, що кодує Rep білок PCV2, є ORF1 Rep геном PCV2. 18. Спосіб за п. 16, де стадія (с) включає заміну видаленої послідовності нуклеїнової кислоти зі стадії (b) послідовністю нуклеїнової кислоти, що містить ORF ген, що кодує Rep білок PCV1. 19. Спосіб за п. 18, де ORF ген, що кодує Rep білок PCV1, є ORF1 Rep геном PCV1. 20. Спосіб за п. 19, де видалена послідовність нуклеїнової кислоти зі стадії (b) містить ген відкритої рамки зчитування (ORF), що кодує Rep білок PCV2. 21. Спосіб за п. 20, де ORF ген, що кодує Rep білок PCV2, є ORF1 Rep геном PCV2. 22. Спосіб підвищення реплікації та титру PCV2 у клітинній культурі, що включає такі стадії: (a) конструювання химерного вірусу PCV2Gen-1Rep, в якому ORF1 Rep ген PCV2 заміщений ORF1 Rep геном PCV1; (b) інокуляцію придатної клітинної лінії химерою PCV2Gen-1Rep; (c) культивування химери PCV2Gen-1Rep у придатному вірусному ростовому середовищі за стандартних умов протягом достатньої кількості часу з індукуванням продукування вірусу; та 14 UA 106587 C2 (d) збирання химерного вірусу. 23. Спосіб за п. 22, де придатна клітинна лінія є клітинною лінією нирок свиней, що не містить антигену свиней (PK-15 клітин), або клітинною лінією тестикул свиней (ST). Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 15