Композиція з ліпо-хітоолігосахаридами для покращення росту рослин та врожайності

Реферат: Композиція для покращення росту рослин та врожайності містить принаймні один ліпохітоолігосахарид та одну або більше хітинових сполук. Спосіб покращення росту рослин та врожайності включає застосування запропонованої композиції до насіння або рослин або одночасно, або послідовно. UA 98630 C2 (12) UA 98630 C2 UA 98630 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фіксація азоту відіграє надзвичайно важливу роль в сільському господарстві завдяки одержанню атмосферного азоту в формі, придатній для застосування рослинами. У рослин родини стручкових Leguminosae симбіотична взаємодія між рослинами та азотфіксуючою бактерією родини Rhizobiaceae („мікориза") покращує ріст рослин та урожайність. Симбіотична взаємодія виникає, коли рослина вивільнює флавоноїдні сполуки, які стимулюють мікоризні бактерії в грунті з утворенням „нод-факторів". Нод-фактори - це сигнальні сполуки, які стимулюють ранні стадії нодуляції (утворення бульб) на коріннях рослин, які ведуть до утворення вузлів на корінні, які містять азотфіксуючі мікоризні бактерії. Не зважаючи на те, що цей процес у бобових відбувається з часом, сільськогосподарські процедури слід розпочинати раніше. Такі процедури включають підготовку азотфіксуючої бактерії для насіння або грунту та застосування нод-факторів безпосередньо до насіння або грунту до або при посадці. Недавно було встановлено, що нод-фактори покращують зародження, ріст та врожайність бобових чи небобових культур завдяки іншим процесам, ніж нодуляція (US 6 979 664, Prithivaraj et al., Planta 216: 437-445, 2003). Хоча дія нод-факторів на нодуляцію достатньо досліджена і описана, наприклад в Ferguson and Mathesius, J.Plant Growth Regulation 22: 47-72, 2003, механізми дії нод-факторів, незалежні від нодуляції, є недостатньо зрозумілими. Застосування нод-факторів до насіння бобових та небобових стимулює зародження, появу ростків, ріст рослин та врожайність сільськогосподарських та садових культур, наприклад як описано в US 6 976 664 та US 5 922 316. Також відомо вплив нод-факторів на розвиток кореневої системи (Olah, et al, The Plant Journal 44:195-207, 2005). Позакореневе застосування нод-факторів також покращує фотосинтез (US 7 250 068), плодоносіння та цвітіння (WO 04/093 542) сільськогосподарських та садових культур. Нод-фактори - це ліпо-хітоолігосахаридні сполуки (ЛХО). Вони складаються з олігомерної основи залишків -1,4-зв'язаного N-ацетил-D-глюкозаміну ("GIcNAc") з N-зв'язаним жирним ацильним ланцюгом в невідновленому кінці. ЛХО розрізняються за кількістю залишків "GIcNAc" в основі, довжиною та ступенем насичення жирного ацильного ланцюга, а також замісниками відновлення та залишками невідновлених сахарів. Структура ЛХО є характеристикою кожного виду мікоризи і кожен штам може утворювати різні ЛХО з різними структурами. ЛХО є первинним детермінантом хазяйської специфічності в симбіозі бобових (Diaz, Spaink, and Kijne, Mol. Plant-Microbe Interactions 13: 268-276, 2000). Синтез ЛХО можна стимулювати шляхом додавання відповідного флавоноїду для утворення певного роду і виду мікоризи протягом росту мікроорганізму. Флавоноїдні молекули зв’язуються з микоризою та закріплюються на генах мікроорганізму з утворенням ЛХО, які вивільнюються в ферментаційному середовищі. Згідно їх природи рослини вивільняють відповідний флавоноїд, який зв'язується з мікоризою в грунті, закріплюється на генах мікроорганізму з утворенням ЛХО. Такі ЛХО вивільнюються мікроорганізмом в грунт, зв'язуються з корінням бобових рослин та ініціюють каскад генної експресії рослин, що стимулює утворення азотфіксуючих нодульних структур на корінні бобових. Альтернативно, можна одержувати модифіковані та синтетичні молекули ЛХО шляхом генної інженерії або хімічного синтезу. Синтетичні ЛХО з аналогічною молекулярною структурою взаємодіють з рослинами та стимулюють нодуляцію аналогічним шляхом, як і природньо одержані молекули. Хітини та хітозани, які є основними складовими стінок клітин грибів та екзоскелетїв комах та ракоподібних, також складаються з залишків GIcNAc. Такі композиції застосовують до насіння, коріння або позакореневої системи широкого спектру сільськогосподарських та садових культур. Композиції хітину та хітозану покращують захист рослин проти патогенів, зокрема шляхом стимулювання рослин з одержанням хітіназ, ензимів, які розкладають хітин (Collinge, et al., The Plant Journal 3: 31-40, 1993). Флавоноїди являють собою фенольні сполуки, що мають два ароматичні кільця, зв'язані тривуглецевим містком. Флавоноїди продукуються рослинами та мають багато функцій, наприклад такі як корисні сигнальні молекули, а також як захист проти комах, тварин, грибів та бактерій. Класи флавоноїдів включають халькони, антоціанідини, кумаріни, флавони, флаванони та ізофлавони (Jain and Nainawatee, J.Plant Biohem.& Biotechnol. 11: 1-10, 2002; Shaw, et al, Environmental Microbiol. 11: 1867-1880, 2006.) Винахід включає способи і композиції для покращення росту рослин та підвищення врожайності. Типова композиція містить принаймні один ліпо-хітоолігосахарид та принаймні одну хітінову сполуку. Інша типова композиція містить принаймні один ліпо-хітоолігосахарид та принаймні одну флавоноїдну сполуку, вибрану з групи, що включає халькони, антоціанідини, кумаріни, флавони, флаванони та ізофлавони. Наступні типова композиція містить принаймні один ліпо-хітоолігосахарид та принаймні один гербіцид. 1 UA 98630 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Типовий спосіб включає застосування композиції згідно винаходу до рослин або насіння в ефективній кількості для покращення росту рослин та врожайності. Згідно іншого варіанту, спосіб включає послідовну обробку рослин або насіння принаймні одним ліпохітоолігосахаридом та принаймні однією хітиновою сполукою або принаймні однією флавоноїдною сполукою, вибраною з групи, що включає халькони, антоціанїдини, кумаріни, флавони, флаванони та ізофлавони. Винахід стосується композицій та способів покращення росту рослин та підвищення врожайності і є результатом дослідів, наведених тут, які свідчать про покращену дію на ріст рослин ліпо-хітоолігосахаридів в комбінації з хітином/хітозаном, флавоноїдними сполуками або гербіцидними сполуками при їх застосуванні до насіння та/або листя. Згідно мети винаходу „ліпо-хітоолігосахарид" (ЛХО) це сполука з загальною структурою ЛХО, тобто олігомерна основа залишків -1,4-зв'язаного N-ацетил-D-глюкозаміну ("GIcNAc") з Nзв'язаним жирним ацильним ланцюгом в невідновленому кінці, як описано в патентах US 5 549 718, US 5 646 018, US 5 175 149 та US 5 321 011. Така основна структура може містити модифікації та замісники, знайдені в природному ЛХО, такі як описані в Spaink, Critical Reviews in Plant Sciences 54: 257-288, 2000; D'Haeze and Holsters, Glycobiology 12: 79R-105R, 2002. Також винахід охоплює синтетичні ЛХО сполуки, такі як описані в WO2005/063784, та ЛХО, одержані за допомогою генної інженерії. Молекули попередника олігосахариду для будови ЛХО можна синтезувати за допомогою організмів генної інженерії, наприклад як в Samain et al., Carbohydrate Research 302:35-42, 1997. ЛХО, використані в винаході, можуть бути одержані зі штамів мікоризи Rhizobiaceae, які продукують ЛХО, таких як Azorhizobium, Bradyrhizobium (включаючи B.japonicum), Mesorhizobium, Rhizobium (включаючи Rdeguminosarum), Sinorhizobium (включаючи S.meliloti) та генетично одержані штами мікроорганізмів, які продукують ЛХО. Ці способи добре відомі та описані в рівні техніки, наприклад в патентах US 5 549 718 та 5 646 018, які включені тут посиланням. Доступні комерційні продукти, що містять ЛХО, такі як OPTIMIZE® (EMD Crop BioScience). ЛХО можна застосовувати різного ступеня чистоти та окремо або з микоризою. Спосіб виключно з ЛХО включає видалення клітин мікоризи з суміші ЛХО з мікоризою або видалення та очистку молекул ЛХО за допомогою фазового розділення розчину ЛХО з наступною HPLC хроматографією, як описано Lerouge, et al (US 5 549 718). Очищення може бути покращено повторним HPLC, очищені молекули ЛХО висушені заморожуванням для тривалого зберігання. Цей спосіб придатний для одержання ЛХО з усіх видів та родів Rhizobiaceae. В родині бобових специфічні види та роди мікоризи розвивають симбіотичну азотфіксуючу взаємодію зі специфічним хазяїном бобових. Такі комбінації хазяїн:мікориза описані в Hungria and Stacey, Soil Biol. Biochem. 29: 819-830, 1997, де перераховані ефективні флаваноїдні нодгенні індуктори видів мікориз та специфічні структури ЛХО, які одержані різними видами мікориз. Однак, специфічність ЛХО необхідна лише для встановлення нодуляції у бобових. Не потрібно підбирати ЛХО та види рослин для стимулювання росту рослин та/або врожайності при обробці ЛХО насіння або листя бобових чи небобових. Хітинові сполуки включають хітин (IUPAC: N-[5-[[3-ацетиламіно-4,5-дигідрокси-6(гідроксиметил)оксан-2-іл]метоксиметил]-2-[[5-ацетиламіно-4,6-дигідрокси-2(гідроксиметил)оксан-3-іл]метоксиметил]-4-гідрокси-6-(гідроксиметил)оксан-3-іл)етанамід та хітозан (IUPAC: 5-аміно-6-[5-аміно-6-[5-аміно-4,6-дигідрокси-2-(гідроксиметил)оксан-3-іл]окси-4гідрокси-2-(гідроксиметил)оксан-3-іл]окси-2(гідроксиметил)оксан-3,4-діол). Ці сполуки можуть бути отримані комерційно, наприклад у Sigma-Aldrich, або отримані з комах, панцирю ракоподібних або стінок клітин грибів. Способи одержання хітину та хітозану відомі з рівня техніки, наприклад, з US 4 536 207 (одержання з панциру ракоподібних), Pochanavanich and Suntornsuk, Lett. Appl. Microbiol 35: 17-21, 2002 (одержання з клітин стінок грибів) та US 5 965 545 (одержання з панцирів крабата гідроліз комерційного хітозану). Деацетиловані хітини та хітозани можна отримати з зі ступенем деацетилювання від менше ніж 35% до більше 90% та широким спектром молекулярної маси, наприклад, низькомолекулярні олігомери хітозану з молекулярною масою менше 15 кД та хітинові олігомери 0,5-2 кД; „практичний сорт" хітозану з молекулярною масою близько 150 кД; та високомолекулярний хітозан до 700 кД. Композиції з хітином та хітозаном для обробки рослин та грунту також комерційно доступні. Комерційні продукти включають, наприклад ELEXA®-4PDB (Plant Defense Booster, Inc.) та BEYOND™ (Agrihouse, Inc.). ЛХО та хітини/хітозани структурно пов'язані. Хітин та хітозан можуть стимулювати продукування хітинази рослинами і досліджено, що хітинази рослин можуть інактивувати та розкладати ЛХО, а також хітинові сполуки (Staehelin, et al., P.N.A.S. USA 91: 2196-2200, 1994; 2 UA 98630 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ferguson and Mathesius, J.Plant Growth Regulation 22: 47-72, 2003). Крім того, комерційно доступні композиції хітозану часто містять важкі метали, які є токсичними щодо мікоризних бактерій та перешкоджають продукуванню ЛХО. З цієї причини застосування мікоризних бактерій в комбінації з хітинами/хітозанами раніше було протипоказано. Однак, як показано в прикладах нижче, застосування ЛХО сполук та хітину/хітозану, послідовно або одночасно, до рослин або насіння викликає позитивний відгук в рості рослин та підвищенні врожайності. Оскільки механізм цієї дії не доведений, однією з гіпотез є те, що ЛХО сполуки зв'язуються зі специфічними рецепторами рослин або насіння та викликають цей позитивний відгук перед розкладанням ЛХО хітиназою, яке може статися. Крім того, цей новий спосіб обробки запобігає дії важких металів на продукування мікоризою ЛХО. Згідно одного з варіантів винаходу композицію одержують шляхом змішування хітозану та одного або більше ЛХО в сільськогосподарсько придатному розчиннику. Згідно іншого варіанту композиція також може містити хітин. Вміст хітозану може складати від 0,1 до 15% мас/об., переважно від 3 до 12%. Хітин може міститися в кількості від 0 до 4% мас/об. Вміст ЛХО може -5 -14 -6 -10 складати від 10 M до 10 M, переважно від 10 до 10 M. ЛХО компонент може містити очищений або частково очищений ЛХО, або суміш ЛХО з мікоризою, яка продукує ЛХО. Сільськогосподарсько придатним розчинником переважно є водний розчинник, такий як вода. Придатні флавоноїди включають сполуки з класу флавонів, флаванолів, флавонолів, флаванонів та ізофлавонів. Такі сполуки можуть включати, але не обмежуючись ними, геністеїн, даідзеін, формононетин, нарінгенін, гесперетин, лютеолін та апігенін. Флавоноїдні сполуки є комерційно доступними, наприклад Natland International Corp., Research Triangle Park, NC; MP Biomedicals, Irvine, CA; LC Laboratories, Woburn MA. Флавоноїдні сполуки можуть бути одержані з рослин або насіння, наприклад, як описано в US 5 702 752; US 5 990 291; US 6 146 668. Також флавоноїдні сполуки можуть бути одержані за допомогою організмів генної інженерії, таких як дріжджі, як описано в Ralston, et al., Plant Physiology 137: 1375-1388, 2005. Згідно одного з варіантів винаходу композицію одержують комбінуванням одного або більше флавоноїду з одним або більше ЛХО в сільськогосподарсько придатному розчиннику. "Ефективна кількість" композиції це кількість, яка покращує ріст рослин та врожайність, порівняно з ростом або врожайністю рослин або насіння, які не були оброблені композицією. Наприклад, вміст флавоноїду в композиції може складати від 20-800 m, переважно 100-500 -5 -14 -6 -10 m. Вміст ЛХО в композиції може складати від 10 M до 10 M, переважно від 10 до 10 M. ЛХО компонент може містити очищений або частково очищений ЛХО, або суміш ЛХО з мікоризою, яка продукує ЛХО. Сільськогосподарсько придатним розчинником переважно є водний розчинник, такий як вода. Не зважаючи на те, що ефективно та зручно комбінувати та застосовувати флавоноїд або хіти/хітозан та ЛХО компоненти в простій суміші, згідно одного варіанту винаходу флавоноїд або хітин/хітозан та ЛХО компонент можуть застосовуватися окремо та послідовно в будь-якому порядку. Можна використовувати інші добавки, одночасно або послідовно, включаючи добрива (наприклад, кальцій, азот, калій, фосфор), живильні мікроелементи (наприклад, іони міді, алюмінію, магнію, марганцю) та пестициди (наприклад, фунгіциди, інсектициди, гербіциди та нематоциди). В одному варіанті винаходу композицію, що містить принаймні один ЛХО та принаймні один гербіцид, застосовують до листя рослини для покращення росту рослин та врожайності. Придатні гербіциди включають, але не обмежені ними, бентазон, ацифлуорфен, хлорімурон, лактофен, кломазон, флуазіфоп, глюфозінат, імазахін та клетодим. Комерційні продукти, що містять кожну з цих речовин, є вже доступними. Концентрація гербіциду в композиції звичайно буде відповідати визначеним межам для даного гербіциду. Вміст ЛХО в композиції може -5 -14 -6 -10 складати від 10 M до 10 M, переважно від 10 до 10 M. Сільськогосподарсько придатним розчинником, застосованим в композиції, переважно є водний розчинник, такий як вода. Композицію звичайно застосовують до рослин в будь-який період боротьби з бур'янами, переважно після проростання. Згідно одного варіанта композиція містить принаймні один ЛХО з гербіцидом на основі гліфосату. Композиція може застосовуватися безпосередньо до насіння або вноситися в грунт в місці висаджування насіння або рослини до або під час посадки. В переважному варіанті композиції розпилюють на насіння, бульбу або листя. Можна обробляти розсаду, а також більш дозрілі рослини. Квіти та плоди також можна обробляти розпиленням. Коріння або садженці можна оприскувати або занурювати в композицію перед посадкою. „Ефективна кількість" композиції це кількість, яка покращує ріст рослин та врожайність, порівняно з ростом або врожайністю рослин або насіння, які не були оброблені композицією. 3 UA 98630 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Композицію можна застосовувати до однодольних або дводольних рослин, до бобових та небобових. В одному варіанті композицію застосовують до польових рослин. В іншому варіанті композицію застосовують до тепличних рослин. Наприклад, композицію можна застосовувати до насіння або листя бобових. Таких як соя, горох, нут, квасоля, арахіс, конюшина, люцерна, та небобових, таких як кукурудза, бавовна, рис, томати, канола, пшениця, ячмінь, цукровий буряк та трава. В цілому, при обробці насіння композицію застосовують до насіння одноразово і насіння можуть відразу висаджувати або зберігати до посадки. Композицію можна застосовувати до листя. Таке застосування звичайно включає розпилення композиції на листя рослин одноразово або більше разів протягом періоду росту. Крім того, якщо флавоноїдну сполуку та ЛХО застосовують послідовно, флавоноїдну сполуку можна застосовувати до насіння, a ЛХО до листя. ПРИКЛАДИ 1. Обробка листя сої (Northrup King S24-k4) комбінацією ЛХО + хітин/хітозан Дослідження проводили на соєвому полі з метою оцінки дії ЛХО та двох комерційних хітозанових сполук на врожайність зерна при їх застосуванні окремо або в комбінації. Цими двома комерційними хітозановими сполуками, використаними в дослідженнях, були BEYOND™ (Agri-House Inc., 307 Welch Ave, Berthuod, CO) та ELEXA®-4PDB (Plant Defence Booster, 235 Harrison St., Syracute, NY). Точна концентрація хітину/хітозану в BEYOND™ невідома, але приблизно встановлена в межах 6-12 %мас./об. хітозану та 0-3% мас/об, хітину згідно патенту US 6 193 988. Концентрація хітозану в ELEXA®-4PDB складає 4% мас/об. ELEXA®-4PDB не містить хітину. ЛХО продукований Rhizobium leguminosarum bv viceae і міститься в концентрації -8 приблизно 1*10 M. Польові дослідження проводили на ділянці, розташованій біля Whitewater, WI, що характеризується наносним глинистим грунтом. рН грунту складає 6.6, вміст органічних складових 4.8%, вміст фосфору та калію 41 ppm та 131 ppm, відповідно. Використовували в дослідженнях насіння сої Northrup King виду S24-K4. Обробку ЛХО проводили оприскуванням листя на V4 стадії росту (дивись Soybean Growth and Development, Iowa State University Extension Bulletin PM 1945, May 2004) з нормою витрати 1 кварта/акр в 25 галонах води. BEYOND™ розбавляли водою до концентрації 0.132 %мас./об., a ELEXA®-4PDB до концентрації 2.5 %мас./об. Кожен продукт наносили на листя оприскуванням з нормою витрати 1 кварта/акр в 25 галонах води. При застосуванні комбінації ЛХО-хітин/хітозан використовували таку ж концентрацію ЛХО та хітину/хітозану, як і при окремому застосуванні кожного продукту. Дослідження проводили у випадково розміщених ділянках з розміром ділянки 10 футів на 50 футів, міжряддя 30 дюймів. Проводили чотири повторних досліди. Насіння висаджували в глибину 1 дюйм з нормою витрати насіння 175,000 насінини на акр, використовуючи зернову сіялку John Deere 750 NT. Результати досліджень наведені в Таблиці 1. ЛХО, BEYOND™ та ELEXA®-4PDB суттєво підвищували врожайність зерна на 3.5, 6.6 та 5.0 бушель/акр, відповідно, при їх окремому нанесенні на листя (р=0.1). За статистикою застосування ELEXA®-4PDB в комбінації з ЛХО підвищувало врожайність на 6.2 бушель/акр, порівняно з ЛХО окремо, та на 4.7 бушель/акр, порівняно з ELEXA®-4PDB окремо. За статистикою застосування BEYOND™ в комбінації з ЛХО підвищувало врожайність на 5.3 бушель/акр, порівняно з ЛХО окремо, та на 2.2 бушель/акр, порівняно з BEYOND™. Обробка ЛХО + ELEXA®-4PDB підвищувала врожайність порівняно з контролем на 9.7 бушель/акр, демонструючи неочікуваний синергічний ефект такої комбінації в порівнянні з окремим застосуванням ЛХО або ELEXA®-4PDB. Таблиця 1 Обробка Контроль - необроблений ЛХО BEYOND™ ELEXA®-4PDB ЛХО + BEYOND™ ЛХО + ELEXA®-4PDB Імовірність, % LSD 10% CV% Врожай зерна (бушель/акр) 56.2 59.7 62.8 61.2 65.0 65.9