Гомо- і гетерополіамінокислотні похідні фулерену с60, спосіб їх отримання та фармацевтична композиція на їх основі

Реферат: Винахід стосується фармацевтичної промисловості і медицини, а саме нових гомо- і гетерополіамінокислотних похідних фулерену С60 загальної формули: C60(H)x{NH(CH2)nCOO + }x{NH3 (L)COOH}x, де n=2-5, х=3, L=-(СН2)m, де m=1-5, або -CO(CH2)kCH(NH2)-, де k=1-2, які характеризуються тим, що сполуки містять ковалентно зв'язані амінокислотні групи і полярні іонні форми амінокислот, а також способу їх отримання і створення фармацевтичних композицій на їх основі. Спосіб отримання гомо- і гетерополіамінокислотних похідних фулерену, оснований на реакції нуклеофільного приєднання амінокислот до фулерену з утворенням ковалентно зв'язаних амінокислотних похідних фулерену з подальшим введенням полярних іонних форм амінокислот. UA 110345 C2 (12) UA 110345 C2 Фармацевтична композиція, що містить як активну речовину гомоі + гетерополіамінокислотні похідні фулерену формули C60(H)x{NH(CH2)nCOO }x{NH3 (L)COOH}x, де n=2-5, х=3, L=-(СН2)m, де m=1-5, або -CO(CH2)kCH(NH2)-, де k=1-2. UA 110345 C2 Галузь техніки Винахід відноситься до фармацевтичної промисловості і медицини, а саме до нових гомо- і гетеро-поліамінокислотних похідних фулерену С 60 формули (I), а також до способу їх отримання і створення фармацевтичних композицій на їх основі. 5 (H)x {NH(CH2)nCOO}x{NH3(L)COOH}x (I) де n = 2-5, x = 3, L = -(CH2)m, при m = 2-5 або -CO(CH2)kCH(NH2)-, де k = 1-2. 10 15 20 25 30 35 40 45 Попередній рівень техніки Застосування похідних фулерену в медицині засноване на ліпофільних властивостях фулеренового ядра, які дозволяють фулереновим похідним проникати крізь клітинні мембрани, і здатності фулерену з високим квантовим виходом генерувати синглетний кисень, який розщеплює ДНК. Ці властивості забезпечують цитотоксичні, антивірусні та інші властивості функціональних похідних фулерену (Bedrov D., Smith G.D., Davande H., “Passive transport of fullerenes through а lipid membrane.” J.Phys.Chem., B, 2008, v.112., p.2078-84, Qiao R., Roberts A.E., “Translocation of fullerene and its derivatives across а lipid bilay-er”, Nano Lett., 2007, v.7, p.614-9. Nelsen G.D., і ін., “In vivo biology and toxicology of fullerenes and their derivatives”, Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 2008, v.103, p.197-208, Pat US 6204391, 2005, “Water soluble fullerenes with antiviral activity”). Основна проблема, яка ускладнює біологічні дослідження похідних фулеренів і створення лікувальних препаратів на їх основі пов'язана з нерозчинністю фулеренів у воді, що ускладнює їх пряме введення в організм людини. Одним з можливих варіантів подолання цих труднощів є введення молекул фулерену в солюбілізуючі матриці. Відомі способи отримання водорозчинних форм фулерену за рахунок утворення аддукта з полівінілпіролідоном (Kiselev O.I. et al. //Mol. Materials. 1998. V. 11. P. 121; Piotrovsky L.B. et al. //Ibidem. 2000. V. 13. P. 41). Показана його ефективність проти вірусу грипу А- і В-типу. Відомий також спосіб отримання фулеренів, який передбачає змішування попередньо розчинених в органічному розчиннику фулеренів з полімерною матрицею в хлороформі, випаровування суміші під вакуумом до повного видалення розчинників, розчинення отриманого комплексу у фосфатно-сольовому буфері (рН 7,4-7,6) з подальшою обробкою продукту ультразвуком (RU №2162819, 02.10.01). При цьому як водорозчинну полімерну матрицю використовують мембранні кефаліни. Продукти, отримані в результаті таких модифікацій, є нестабільними композиціями з обмеженими можливостями зберігання. Перспективним методом отримання водорозчинних фулеренових композицій є хімічна модифікація сфери фулерену введенням гідрофільних солюбілізуючих лігандів. У міжнародній заявці WO2005/070827 представлена серія амінокислотних похідних фулерену, отриманих в результаті реакції циклоприєднання амінокислотних фрагментів до фулерену, і продуктів їх включення в біологічно-активні органічні субстрати. Представлені в даному технічному рішенні методи синтезу є багатостадійними і нетехнологічними. Отримані сполуки мають низьку розчинність у воді. В даний час отриманий великий ряд функціоналізованих фулеренів, які містять гідрофільні фрагменти як в бічному ланцюзі приєднаних до фулерену лігандів (детергентний тип комплексів), так і сферичний тип похідних, коли є полярні групи, розподілені по фулереновій сфері (такий тип включає фулереноли, аміноаддукти). Найбільш перспективними для використання є амінокислотні похідні фулерену. Аналогами даного винаходу є сполуки і способи їх отримання, описані в міжнародній заявці WO2009/00203, а також патенті РФ № 2236852. В міжнародній заявці WO2009/00203 описані поліфункціональні амінокислотні похідні фулерену формули , 1 UA 110345 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 де R є H, моно- або дигідроксиалкілом, галоїдалкілом, моно- або динітроксиалкілом, малеїнімід; N-Z є фрагментом α, β, γ, ω-амінокислоти загальної формули -NH-CmH2m-COOM або С4Н8N-COOM, где m = 2-5, а M є нітроксиалкільною групою, алкільною групою або сіллю лужного металу, або дипептид. Дані сполуки отримані в результаті реакції еквімолярного приєднання амінокислот до фулерену з наступним заміщенням активного водню органічним біологічно активним лігандом з утворенням сполук типу. Отримані сполуки, проявляють інгібуючу активність у відношенні метастазів пухлин, посилюють антилейкемічну активність циклофосфаміду, та можуть бути застосовані як донори монооксиду азоту або як вазоділататорів швидкої дії для антигіпертинезивної терапії. Основним недоліком сполук запропонованих даною заявкою є те, що вони є продуктами ковалентного приєднання, містять малу кількість полярних груп і мають низьку розчинність у воді. Найбільш близьким за технічною сутністю і досягненим результатом є засіб для інгібування репродукції оболонкових вірусів і спосіб його отримання (патент РФ № 2236852). В результаті взаємодії фулерену з сіллю амінокислоти в середовищі органічного розчинника у присутності поліалкіленоксида отримані фулеренполікарбонові аніони загальної формули C60Hn[NH(CH2)mC(O)O ]n, де С60 - фулеренове ядро, NH(CH2)mC(O)O - амінокарбоновий аніон; m дорівнює цілому числу від 1 до 5, n дорівнює цілому числу від 2 до 12. Для отримання цих сполук до розчину фулерену в о-дихлорбензолі (толуолі або будь-якому іншому органічному розчиннику) вносять амінокислоту у вигляді солі (калієвої або натрієвої), потім додають солюбілізатор. Порядок внесення до реакційного середовища амінокислоти і солюбілізатора не важливий, можна вносити їх у вигляді комплексу, заздалегідь змішавши. Як солюбілізатор використовують різні поліалкіленоксиди: поліетиленгліколі мол. маси від 150 до 400, і вище 400 (наприклад, ПЕГ-1500), а також диметиловий ефір поліетиленгліколю мол. маси 500. Для збільшення швидкості реакції додають будь-який сильний відновник (лужні метали). Співвідношення фулерену і амінокислоти збільшено більше ніж в 50 разів. Перетворення на бажану фармацевтично прийнятну сіль, зокрема натрієву або калієву, відбувалося шляхом обробки кислоти відповідною основою або шляхом додавання солі слабкої леткої кислоти. Зокрема, не розчинна у воді фулеренполікарбонова кислота перетворюється на бажані фармацевтично прийнятні солі, такі як натрієва сіль, які є розчинними у воді. Додавання солі слабкої леткої кислоти відбувається шляхом обробки розчину сіллю лужного металу і слабкої леткої кислоти. При концентрації розчину шляхом випаровування або ліофілізації слабка кислота видаляється, а фулеренполікарбонові кислоти виділяються у вигляді їх солей лужних металів. Цільовий продукт запропонований даним винаходом характеризується постійністю складу, вміст в цільовому продукті основної речовини складає всього 87,8%. У описі відсутні технологічні регламенти, пов'язані з визначенням оптимальних кількостей початкових сполук, співвідношень кількостей використаних розчинників і, особливо, опису методів виділення шуканих сполук. Основними недоліками фулеренамінокислотних похідних, отриманих представленим в патенті методом отримання є те, що даним способом отримують суміш фулеренкарбоксилатних аніонів, як сольових, так і кислотних форм. Отримати ізольовану сполуку способом, описаним в патенті неможливо. Також фулеренполіамінокислоти, отримані запатентованим способом, в кислотній формі є практично нерозчинними у воді. Отримати стабільну фармацевтичну композицію з фулеренполікарбоновими аніонами не вдалося, оскільки в процесі зберігання сполуки випадають в осад. Застосування в синтезі великого надлишку калієвої або натрієвої солей амінокислот і великих надлишків розчинників приводить до виникнення екологічних проблем, пов'язаних з утилізацією відходів виробництва, а також до подорожчання процесу виробництва. Використання лужних металів для збільшення швидкості реакції є технологічно неможливим при використанні хлорованих ароматичних розчинників. Проте, представлені в патенті унікальні біохімічні властивості препаратів на основі сполук фулерену з амінокислотними фрагментами висувають завдання отримання нових похідних фулерену, розробки високотехнологічного способу їх промислового отримання, який відрізняється простотою і ефективністю процесу, чистотою, екологічністю і доступністю початкових реагентів. Розкриття винаходу 2 UA 110345 C2 5 Для вирішення даного завдання пропонується група винаходів, об'єднаних єдиним винахідницьким задумом, а саме: гомо- і гетеро-поліамінокислотні похідні фулерену, спосіб отримання похідних фулерену і фармацевтичні композиції, які включають гомо- і гетерополіамінокислотні похідні фулерену як діючої речовини. Змінюючи співвідношення реагентів і умови проведення процесу, відповідно до заявленого способу, можна отримувати різні похідні фулерену. Вказане завдання вирішується гомо- і гетеро-поліамінокислотними похідними фулерену загальної формули (II): + С60(Н)х{NH(CH2)nCOO }x{NH3 (L)COOН)}x де n = 2-5, x = 3, L = -(CH2)m, де m = 1-5 (II) або -CO(CH2)kCH(NH2)-, де k = 1-2. 10 У випадку, коли m = n отримують гомо-поліамінокислотні похідні фулерену, при m ≠ n гетеро-поліамінокислотні похідні фулерену. 15 20 25 30 35 40 45 Вказане завдання вирішується способом отримання гомо- і гетеро-поліамінокислотні похідних фулерену, які утворюються при взаємодії фулерену з 10-разовим молярним надлишком безводих калієвих солей амінокислот в середовищі органічного ароматичного розчинника при додаванні до отриманої суспензії міжфазного каталізатора при перемішуванні і нагріванні до температури не вищої від 60 °C до повного знебарвлення розчину і формування твердого осаду, який потім виділяють, розчиняють у воді, після чого здійснюють обробку водних розчинів калієвих солей фулеренполіамінокислот 1Н розчином органічних або мінеральних кислот з подальшим додаванням розчинів амінокислот в полярних розчинниках. У способі використовують свіжоприготовані безводі калієві солі амінокислот в дрібнодисперсному стані, а виділення твердого осаду калієвих солей фулеренполіамінокислот здійснюють фільтруванням, промиванням етиловим спиртом і висушуванням. В процесі експериментів було виявлено, що фулеренполіамінокислоти вказаного складу можуть бути отримані тільки за використання свіжоприготованих безводих калієвих солей амінокислот. Як міжфазовий каталізатор використовують метилові ефіри поліетиленоксидів молекулярної маси 200, 400, 500. Вказане завдання вирішується також створенням фармацевтичних композицій, які містять як активну речовину гомо- і гетеро-поліамінокислотні похідні фулерену формули (II), які проявляють активність проти вірусу герпесу, вірусу гепатиту С, вірусів грипу різної природи, ВІЛ, а також протипухлинну і протипсоріатичну активність. Фармацевтичні композиції можуть бути виконані у формі пігулок, капсул, мазей, емульсій, супозиторіїв, розчинів, спреїв. Фармацевтичні композиції запропоновані даним технічним рішенням містять сполуки загальної формули (II) в кількості, ефективній для досягнення бажаного результату, і можуть бути введені у вигляді стандартних лікарських форм (наприклад, в твердій, напівтвердій або рідкій формах), які містять сполуки запропонованого технічного рішення як активний інгредієнт в суміші з носієм або наповнювачем, придатним для внутрішньом'язового, внутрішньовенного, перорального, сублінгвального, інгаляційного, місцевого, назального, ректального і вагінального введення. Активний інгредієнт може бути включений в композицію разом із зазвичай використовуваними нетоксичними фармацевтично прийнятними носіями, придатними для виготовлення розчинів, пігулок, пілюль, капсул, драже, супозиторіїв, емульсій, суспензій, мазей, гелів і будь-яких інших лікарських форм. Конкретний рівень дозувань і частота прийому ліків для кожного конкретного пацієнта буде залежати від багатьох чинників, включаючи активність конкретного похідного фулерену, метаболічну стабільність і тривалість дії, швидкість виділення, вік пацієнта, вагу тіла, загальний стан здоров'я, стать, лікарські комбінації, а також ступінь тяжкості захворювання у індивіда, який піддається лікуванню. Для орального застосування у вигляді суспензій композиції готують відповідно до методів, широко відомих в галузі приготування фармацевтичних рецептур, і вони можуть містити 3 UA 110345 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мікрокристалічну целюлозу або її похідні для забезпечення маси, альгінову кислоту або альгінат натрію як суспендуючий агент, метилцелюлозу як підсилювач в'язкості та підсолоджуючі агенти і/або аромати, відомі в цій галузі. У формі пігулок такі композиції можуть містити мікрокристалічну целюлозу, кальцій фосфат, крохмаль, стеарат магнію і лактозу і/або інші ексципієнти, зв'язуючі речовини, розширювачі, дезінтегратори, розчинники і змащуючі речовини, відомі в даній галузі. При застосуванні у вигляді назальних аерозолів або шляхом інгаляції такі композиції готують із застосуванням методів, добре відомих в галузі фармацевтичних рецептур, і вони можуть випускатися у вигляді розчинів у фізіологічному розчині, з використанням бензойної кислоти або інших відповідних консервантів, промоторів адсорбції для посилення біозастосовності, і/або інших солюбілізуючих або диспергуючих агентів, відомих в даній галузі. Розчини або суспензії для ін'єкцій можуть формуватися відповідно до відомих методів, з використанням нетоксичних, застосовуваних парентеральних розчинників або розчинників, таких як маніт, 1,3-бутандіол, вода, розчин Рінгера або ізотонічний розчин хлористого натрію або відповідних диспергуючих або змочувальних і суспендуючих агентів, таких як стерильні, м'які, стійкі олії, включаючи синтетичні моно- або дигліцериди, або жирні кислоти, включаючи олеїнову кислоту. При ректальному або вагінальному застосуванні у вигляді свічок такі композиції можуть готуватися шляхом змішування ліків з таким ексципієнтом, який не викликає подразнення, як масло какао, синтетичні гліцеридні складні ефіри або поліетиленгліколі, які є твердими речовинами за звичайних температур, але стають рідкими і/або розчиняються в порожнині тіла з виділенням ліків. При місцевому застосуванні у вигляді мазей, гелів, кремів, лініментів тощо такі композиції можуть готуватися шляхом змішування активних інгредієнтів з прийнятною мазевою основою. Як основи для мазей можуть бути використані жирові, вуглеводневі або гідрофільні основи, наприклад вазелін, вазелінова олія, парафін, віск, ланолін, поліетиленгліколь тощо. Як основи для гелів можуть бути використані метилцелюлоза, натрієва сіль карбоксиметилцелюлози, оксипропілцелюлоза, поліетиленгліколь або поліетиленоксид, карбопол, полівінілпіролідон, полівініловий спирт тощо. Технічний результат винаходу полягає в тому, що були отримані нові гомо- і гетеро+ поліамінокислотні похідні фулерену формули: С60(Н)х{NH(CH2)nCOO }x{NH3 (L) COOН)}x, де n = 2-5, x = 3, L = -(CH2)m, де m = 1-5, або -CO(CH2)kCH(NH2)-, де k = 1-2, які характеризуються тим, що сполуки містять ковалентно-зв'язані амінокислотні групи і полярні іонні форми амінокислот, розроблений новий промисловий спосіб отримання амінокислотних похідних фулерену С 60 з різним співвідношенням компонентів з використанням реакції нуклеофільного приєднання до фулерену амінокислоти з утворенням продуктів поліприєднання. Запропоновані фармацевтичні композиції, що містять як активну речовину гомо- і гетеро-поліамінокислотні похідні фулерену формули (II), які проявляють активність проти вірусу герпесу, вірусу гепатиту С, вірусів грипу різної природи, ВІЛ, а також протипухлинну і протипсоріатичну активність. Фармацевтичні композиції виконані у формі пігулок, капсул, мазей, супозиторіїв, розчинів, спреїв. Сполуки характеризуються новими властивостями: - розчинністю в суміші диметилсульфоксид-вода (1:100, 1:200); - високою біодоступністю; - високою ефективністю дії на інфіковані клітини; - низькою токсичністю. Запропонований спосіб дозволяє отримати різні гомо- і гетеро-поліамінокислотні похідні фулерену залежно від співвідношення реагентів і умов проведення процесу. Спосіб заснований на використанні у стадії синтезу оптимальних співвідношень початкових реагентів (1:10), мінімальних кількостей органічного розчинника і міжфазного каталізатора, з подальшому виділенням заявлених композицій з використанням концентрованих розчинів органічних і мінеральних кислот, з подальшим введенням амінокислот ряду NH 2LCOOH, де L = -(CH2)m, або CO(CH2)kCH(NH2), що приводить до кількісного отримання фулеренамінокислотних композицій певного складу і можливості застосування для їх промислового синтезу заявленого способу, який відрізняється ефективністю і екологічністю. Заявлений винахід проілюстровано наступними прикладами. Варіанти здійснення винаходу Приклад 1. Отримання фулеренполіамінокапронової кислоти формули C60(Н3){NH(CH2)5COO }3{NH3+(CH2)5COOH}3. До розчину 7,2 г (0,01 моль) фулерену С60 в 400 мл о-дихлорбензолу додають 17 г (0,1 моль) свіжоотриманої тонко подрібненої безводої калійної солі ε–амінокапронової кислоти. До 4 UA 110345 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 отриманої суспензії при перемішуванні і нагріванні не вище 80 °C додають протягом 2-х годин суміш о-дихлобензолу і метилового ефіру поліетиленгліколю 400 в співвідношенні 2,5:1. Реакційну суміш перемішують за температури не вище 60 °C протягом 2-3 годин до повного знебарвлення розчину і формування твердого осаду. Потім суміш фільтрують, осад на фільтрі промивають декількома порціями етилового спирту і висушують у вакуумі за температури не вище 60 °C. Виділену калієву сіль фулеренамінокислоти розчиняють в 2 л дистильованої води. У розчин поволі перемішуючи додають 1Н розчин соляної кислоти до рН 5,1. Суміш відстоюють до повного осадження продукту. Потім водний шар декантують. До осаду, який є тонкою суспензією твердого продукту у воді, поволі перемішуючи додають розчин амінокапронової кислоти в суміші диметилсульфоксиду з водою (1:10). Суміш перемішують до повного розчинення. Потім розчинники видаляють відгоном у вакуумі. Твердий залишок висушують за температури не вищої від 60 °C у вакуумній сушильній шафі. Вихід цільового продукту кількісний по відношенню до початкового фулерену. Сполука є темно-коричневою твердою речовиною, розчинною в суміші диметилсульфоксид:вода, - 1:200, обмежено розчинністю в сумішах СН3СN:Н2О - 1:1 і ДМФА-Н2О. Термогравіметричний аналіз продукту показує наявність в комплексі 3 молів слабозв'язаної амінокапронової кислоти, яка відщеплюється з розкладанням за температури 200 °C. Термічне розкладання фулеренполіамінокислоти проходить за температури 345 °C з виділенням фулерену і продуктів його окислення. Кількість твердого залишку після розкладання сполуки, яка за даними дифракційного аналізу є незаміщеним фулереном, відповідає співвідношенню С60:амінокислотний фрагмент як 1:6. Кислотний гідроліз сполуки 0,1 молярним розчином НСl призводить до виділення гідрохлориду амінокапронової кислоти в кількості 3 молів на моль початкової речовини. Адсорбція сполуки на поверхні силікагелю призводить до розщеплювання іонних зв'язків і виділення вільної амінокапронової кислоти. Подальшим фотометричним аналізом продуктів реакції амінокапронової кислоти з нінгідрином визначена кількість іонозв′язаних амінокислотних груп. Їх кількість відповідає складу заявлених сполук. Електронний спектр поглинання продукту не містить смуг поглинання вільного фулерену. ІЧ-спектр продукту містить смуги поглинання, характерні для N-заміщених амінокислот: -1 -1 3+ -1 група-СООН- 1704 см , 1658 см , групи NH - 3100, 2550, 2000 cм , -N-H-валентні коливання -1 -1 -1 -1 -1 3300 см , N-H-деформаційні 1552 см , смуги поглинання C60-NH-R- 1104 см , 930 см , 830 см . Елементний аналіз продукту показує наступні співвідношення елементів: %С=76,84; %Н=4,80; %N=5,15, для брутто-формули С96Н75N6О12 (молекулярна маса 1503) розраховано: %С = 76,49 %Н = 4,90 %N = 5,57. Приклад 2. Отримання N-фулерен-γ-аміномасляної кислоти з в-аланіном формули: + С60(Н3){NH(CH2)3COO }3(NH3 CH2-CH2-COOH)3. До розчину 7,2 г (0,01 моль) фулерену С60 в 400 мл о-дихлорбензолу додають 14 г (0,1 моль) свіжоотриманої безводої калієвої солі γ-аміномасляної кислоти. До отриманої суспензії при перемішуванні і нагріванні не вище 60 °C додають протягом 2-3-х годин суміш одихлобензолу і метилового ефіру поліетиленгліколю 400 в співвідношенні 3:1. Реакційну суміш перемішують за температури не вищої від 60 °C протягом 2-3 годин до повного знебарвлення розчину і формування твердого осаду. Потім суміш фільтрують, осад на фільтрі промивають декількома порціями етилового спирту і висушують у вакуумі за температури не вищої від 60 °C. Виділений продукт розчиняють у дистильованій воді. У розчин поволі при перемішуванні додають 1Н розчин соляної кислоти до рН 5,1. Суміш відстоюють до повного осадження продукту. Потім водний шар декантують. До осаду, який є тонкою суспензією твердого продукту у воді, поволі при перемішуванні додають спиртовий розчин 2,7 г (0,03 моль) β-аланіну. Суміш перемішують протягом 2 годин до повного розчинення осаду. Після видалення розчинника виділено 12 г продукту. Сполука є темно-коричневою твердою речовиною, розчинною в суміші диметилсульфоксид:вода, - 1:200, обмежено розчинною в сумішах СН3СN:Н2О - 1:1 і ДМФАН2О. Термогравіметричний аналіз продукту показує наявність в комплексі 3 молів слабозв'язаного β-аланіну, який відщеплюється за температури 210 °C. Термічне розкладання всього комплексу проходить за температури 335 °C з виділенням фулерену в кількості, яка відповідає співвідношенню С60:амінокислотні фрагменти як 1 : 6. Кислотний гідроліз отриманої сполуки 0,01 молярним розчином HCl призводить до утворення гідрохлорида β-аланіну в кількості 3 молів на моль початкової речовини. 5 UA 110345 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спектри продукту в розчинах в диметилсульфоксиді і в 0,1 Н водному розчині NаOH містять смуги поглинання в області 217, 260, 335 нм, характерні для похідних фулерену і не містять смуг поглинання вільного фулерену. ІЧ-спектр сполуки містить смуги поглинання, характерні для N-заміщених амінокислот і -1 -1 -1 + катіонних форм амінокислот: групи -СООН- 1717 см , 1710 см , 1658 см , групи NH3 3100, -1 -1 2550, 2000 cм-1, N-H-валентні коливання 3400 см , N-H-валентні коливання – 3400 см , N-H-1 -1 -1 -1 деформаційні - 1552 см , смуги поглинання C60-NH-R- 1104 см , 930 см , 830 см . Елементний аналіз продукту показує наступні співвідношення елементів: %С=75,24; %Н=3,80; %N=6,25, для брутто-формули C81H48N6O12 (молекулярна маса 1296) розраховано: %С = 75,00 %Н = 3,70 %N = 6,48. Приклад 3. Отримання N-фулерен-ε-амінокапронової кислоти з глутаміном формули: + C60(Н3){NH(CH2)5COO-}3{NH3 (CO)(CH2)2CH(NH2) COOH}3. Процес проводять так само, як в прикладі 1. Тільки на стадії обробки осаду після осадження кислої форми фулерен-амінокапронової кислоти додають розчин 4,5 г глутаміну в суміші диметилсульфоксид-вода. Розчинники видаляють відгоном у вакуумі. Елементний аналіз твердого продукту показує наступні співвідношення елементів: %С=71,34; %Н=4,80; %N=8,25, для брутто-формули С93H69N9O15 (молекулярна маса 1551) розраховано: %C = 71,95 %Н = 4,50 %N = 8,12. ІЧ-спектр сполуки містить смуги поглинання, характерні для N-заміщених амінокислот і -1 -1 -1 катіонних форм амінокислот: групи -СООН- 1714 см , 1707 см -C=O(NH-C60) 1658 см , групи + -1 -1 NH3 3000, 2550, 2000 cм-1, N-H-валентні коливання 3400 см , N-H-деформаційні 1552 см , -1 -1 -1 смуги поглинання C60-NH-R- 1104 см , 930 см , 830 см . Кислотний гідроліз сполуки призводить до виділення глутамін гідрохлориду в кількості 3 молів на моль початкової речовини. Була вивчена противірусна активність сполук відносно ВІЛ, ВПГ, вірусу грипу, а також протипухлинна активність. У приведених нижче прикладах препарат, отриманий способом, описаним в прикладі 1, який за текстом називається препарат №1 (фулеренполіамінокапронова кислота). Приклад 4. Дослідження активності препарату фулеренполіамінокапронової кислоти відносно вірусу імунодефіциту людини. Дослідження проводилися в лабораторії вірусів імунодефіциту з випробувальним Центром експертної оцінки противірусних і дезинфекційних засобів (ГУ НДІ вірусології ім. Д.І. Івановського РАМН). До клітин додавали досліджуваний препарат та інфікували вірусом в дозі 0,01 ТЦІД50/клітину. Інкубували культури клітин при 37 °C в атмосфері з 5% СО2 і 98% вологості 4-5 днів. Облік результатів проводили фарбуванням клітин за допомогою барвника і світлової мікроскопії: дослідження цитопатичної дії вірусу (ЦПД) і вірусіндукованого утворення синцитію (синцитій - конгломерат декількох клітин із спільною клітинною оболонкою, яка утворилася в результаті злиття їх мембран). Ступінь цитодеструкції оцінювали під мікроскопом за загальноприйнятою чотирьоххрестовою системою знаками + або – відповідно до кількості загиблих клітин в кожній з чотирьох комірок, які відповідали одному досліджуваному показнику. ++++ - 100%-а загибель клітин в чотирьох комірках, використаних в досліді на одне розведення; +++ - 75%-а загибель клітин в кожній з чотирьох комірок; ++ - 50%-а загибель клітин в кожній з чотирьох комірок; + - 25%-а загибель клітин в кожній з чотирьох комірок; +- - початок дегенерації; - -відсутність цитодеструкції. Результати дослідження представлені в таблицях 1-2. Отримані дані (таблиця 1, 2) показали, що досліджені препарати фулеренполіамінокапронової кислоти демонстрували противірусну активність щодо вірусу імунодефіциту людини типу 1. ЕК50 (50%-ефективна концентрація) препарату 0,9 мкг/мл. Препарат у концентраціях 0,5-10 мкг/мл не проявляв цитотоксичної дії на клітини. Приклад 5. Дослідження протигерпетичної активності препарату фулеренполіамінокапронової кислоти в експериментах in vitro. Дослідження виконувалося ГУ НДІ вірусології ім. Д.І. Івановського РАМН, м. Москва. 6 UA 110345 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В процесі дослідження були вивчені цитотоксична і протигерпетична активність препарату в клітинних культурах Vero. У дослідженні були використані: культура клітин нирки мавп (VERO), яка перевивається, отримана з колекції культур тканин Інституту вірусології ім. І.Д. івановського РАМН; вірус герпесу простого (Herpes simplex virus), тип 1, штам Л2, розмножений в клітинах Vero. Клітини інфікували вірусом в дозі 100 ТЦІД50/0,2мл і 1000 ТЦІД50/0,2мл. Досліджували представлений зразок субстанції у вигляді порошку темного кольору. Препарат спочатку розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО) в співвідношенні 1:20, а потім готували робочі концентрації на середовищі Іґла МЕМ. Оцінку активності досліджуваних зразків проводили за ступенем захисту клітин від вірусіндукованої цитотоксичної дії ВПГ мікроскопічним методом і методом МТТ за оптичною щільністю. Результати дослідження. Була досліджена токсичність речовин у використаних концентраціях, а також розчинника (1,5 мл ДМСО в 50 мл води). Препарат в кінцевих концентраціях від 50 до 1000 мкг/мл додавали до моношару клітинної культури Vero і інкубували в атмосфері 5,0 % СО 2 при 37 °C протягом 24-48 годин. Моношар клітин фарбували 0,4% розчином трипанового синього і досліджували під мікроскопом. Зразок в концентрації до 100 мкг/мл не проявляв токсичної дії на культуру клітин Vero, при концентрації 200 мкг/мл з'являлися ознаки токсичної дії – спостерігалася загибель 25% клітин. Концентрації в 500 мкг/мл і більше вже були токсичними для клітин Vero (табл. 3). Дослідження захисних властивостей зразка проводили за однією схемою введення – за годину до інфікування, і у двох дозах вірусу - 100 ТЦІД50 і 1000 ТЦІД50. Результати представлені в таблицях 3 - 7. Проведені дослідження показали, що введення за 60 хвилин зразка препарату до інфікування клітинної культури вірусом герпесу простого в дозі 100 ТЦІД50 повністю захищає клітини від цитодеструктивної дії вірусу у всіх випробовуваних концентраціях – від 5,0 мкг/мл і вище (див. табл. 4 і 5). При збільшенні інфікуючої дози вірусу герпесу до 1000 ТЦІД 50/0,2 мл (див. табл. 6 і 7), зразок препарату забезпечує повний захист чутливої культури клітин від цитодеструктивної дії вірусу за даної схеми випробовування (інфікування клітин вірусом через 60 хвилин після внесення препарату до культурального середовища). Приклад 6. Вивчення активності фулеренполіамінокапронової кислоти (препарат № 1) відносно вірусу грипу A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl. Дослідження проводилися в ГУ НІІ вірусології ім. Д.І. Івановського РАМН, м. Москва. До завдання досліджень входило вивчення противірусної активності цих препаратів в культурі клітин MDCK відносно вірусу грипу A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl. Препарат розводили в ДМСО (5 мг субстанції + 0,5 мл ДМСО) з подальшим додаванням 4,5 мл середовища для культур клітин МЕМ, отримуючи, таким чином, стік в концентрації 1,0 мг/мл. У подальшому проводили розведення стоків середовищем МЕМ до робочих концентрацій 6,5 мкг/мл - 12,5 -25,0 - 50,0 - 100 мкг/мл. Визначення противірусної активності речовин проводили за зниженням репродукції вірусу грипу в культурі клітин MDCK, що виявляється ІФА. З цією метою клітини MDCK вирощували в 96-коміркових планшетах до повного моношару, відмивали від ростового середовища і вносили речовини в дворазовій концентрації в 100 мкл середовища МЕМ. Інфікування вірусом в робочій дозі 100-1000 ТЦІД50 проводили в двох режимах: через 2 години після внесення речовин і одномоментно. Планшети інкубували в термостаті з СО2 протягом 24 годин при 37 °C. Після інкубації середовище видаляли і клітини фіксували 80% ацетоном в PBS протягом 15 хвилин, добре висушували і здійснювали постановку ІФА, проводячи послідовно адсорбцію специфічних реагентів – моноклональних антитіл, кон′югата і субстрата (ортофенілендиамін). Реакцію враховували за оптичною щільністю при 492 нМ на спектрофотометрі фірми «Біоком». Кожне розведення вірусу досліджували в 3-х повторах, для яких обчислювали середнє значення оптичної щільності (ОЩ). Відсоток інгібірування визначали, як відношення між різницею ОЩ досліду і ОЩ клітинного контролю, розділене на різницю ОЩ вірусного контролю і ОЩ клітинного контролю, помножене на 100%. Виходячи із отриманих даних були визначені значення мінімальної концентрації речовини, яка викликає 50,0% інгібірування вірусної репродукції (МІК50). Оцінку пригнічення репродукції вірусу грипу A(H1N1) проводили в 3-х дослідах з різною множинністю зараження. Результати представлені в табл. 8 (протоколи 3 дослідів) і табл. 9 (середні значення отриманих результатів 3 дослідів). Як видно з таблиці 9, чітко простежується залежність ступеня репродукції і концентрації препарату: з підвищенням концентрації – знижується репродукція вірусу. Крім того, значних 7 UA 110345 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 відмінностей в показниках за різних режимів інфікування (через 2 години після внесення препарату або одномоментно) не відмічено. Таким чином, отримані результати вивчення активності різних розведень препарату відносно вірусу грипу A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl виявили високу активність пригнічення його репродукції в культурі клітин MDCK. При цьому режими внесення препаратів за 2 години до інфікування або одночасно з інфікуванням не впливали на їх активність в культурі клітин MDCK. Приклад № 7. Вивчення противірусної активності фулеренполіамінокапронової кислоти (препарат № 1) на моделі грипозної пневмонії мишей. Дослідження виконувалися в центрі хімії лікарських засобів (ЦХЛЗ-ВНІХФІ), м. Москва. У роботі використовували препарат у вигляді темно-коричневого кристалічного порошку. Для перорального застосування готували необхідні дози препарату, розчиняючи наважки в 1% розчині крохмалю, звареного на воді. Для внутрішньоочеревинного і внутрішньом'язового застосування наважки препарату розчиняли в 1,5% розчині ДМСО. У роботі був використаний вірус грипу А/Аічі/2/69 (H3N2), адаптований до мишей. Даний вірус широко використовується для визначення ефективності противірусних препаратів на моделі грипозної пневмонії мишей і був отриманий з музею вірусних штамів і клітинних культур ГУ НДІ вірусології РАМН. Для підготовки інфікуючого матеріалу мишей заражали інтраназально алантоїсним вірусом, після проявлення ознак хвороби їх забивали і за стерильних умов отримували гомогенат легеневої тканини. Далі ці гомогенати використовували для зараження 10-денних курячих ембріонів, з яких отримували алантоїсний вірус і після титрування його на мишах використовували для інфікування тварин. Білих безпородних мишей (самки) масою 12-14 г отримували з розплідника «Андрєєвка» (Московська обл.) і утримували на стандартному раціоні в регламентованих умовах віварію. Заздалегідь зважені миші (самки нелінійні, середня вага 12-14 г) інфікувалися інтраназально під легким ефірним наркозом вірусом грипу А/Аічі/2/69 (H3N2) (10ЛД 50 в 100 мкл). У попередньому досліді було проведено визначення ЛД50 шляхом титрування алантоїсного вірусу на таких же мишах, яких потім використовували в основному досліді. Була використана наступна схема лікування досліджуваним препаратом: за 24 години до інфікування, за 1 годину до інфікування, через 24 години і далі 1 раз на день через 24 години протягом 5 днів. Для перорального введення використовували одноразовий інсуліновий шприц із спеціальною голкою (лаваж), кожну дозу вводили в об'ємі 100 мкл. Для внутрішньоочеревинного і внутрішньом'язового лікування також кожну дозу вводили в об'ємі 100 мкл. Група вірусного контролю мала 10 мишей, інфікованих вірусом, але яких не лікували препаратами. Також в досліді були дві групи по 10 неінфікованих мишей, яким вводили внутрішньоочеревно і внутрішньом'язово по 100 мкл 1,5% ДМСО, який використовувався як розчинник препаратів. У решті груп також спочатку було по 10 тварин. За лікованими і контрольними тваринами велося щоденне спостереження, в перші 5 днів після інфікування миші зважувалися щодня, далі - через день. Активність хіміотерапії препарату на моделі грипозної пневмонії мишей оцінювали за трьома критеріями: показник захисту від смертельної вірусної інфекції, збільшення середньої тривалості життя і зменшення зниження ваги в групах тварин, які лікуються препаратом у порівнянні з контрольною групою. Лікування фулеренамінокапроновою кислотою було ефективним, зменшуючи смертність мишей від грипозної пневмонії і втрату ними ваги, і збільшуючи середню тривалість життя в порівнянні з вірусним контролем. Ефективність даного лікування залежала від дози препарату і способу лікування. Результати представлені в таблицях 10 - 11. Найбільш ефективним за всіма трьома параметрами (показник захисту від смертності, середня тривалість життя і втрата ваги) було лікування фулеренполіамінокапроновою кислотою внутрішньом'язово, яке в дозах 100 і 200 мг/кг/день запобігало загибелі 60-70% заражених тварин і втраті ними ваги, а також збільшувало тривалість їх життя майже в 2 рази. Внутрішньоочеревинне лікування фулеренполіамінокапроновою кислотою було ефективним тільки в дозах 50 і 100 мг/кг/день. Загибель тварин, значне зниження середньої тривалості життя і ваги мишей при внутрішньоочеревинному лікуванні їх фулеренполіамінокапроновою кислотою в дозі 200 мг/кг/день дають підставу вважати, що дана доза за цього способу введення є токсичною для інфікованих мишей. Приклад № 8. Вивчення протипухлинної дії фулеренполіамінокапронової кислоти (препарат № 1) при пухлинах лейкозу L1210, що перевиваються, аденокарциноми молочної залози Са-755 і карциноми Льюіса. Дослідження виконувалися в Інституті токсикології, м. Санкт-Петербург, 2006 р. відповідно до «Методичних рекомендацій із вивчення протипухлинної активності фармакологічних 8 UA 110345 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 речовин» («Інструкція із експериментального (доклінічного) вивчення нових фармакологічних речовин», Мінохоронздоров'я РФ, Ремедіум. М., 2000 р., с. 319-325). Штами пухлинних клітин лейкемії L1210, аденокарциноми молочної залози Са-755, а також штам пухлинних клітин карциноми Льюіса (3LL) отримані з НДІ онкології ім. проф. Н.Н. Петрова МОЗ РФ (м. Санкт-Петербург). У дослідженні використані наступні тест- системи: Миші лінії DBA/2 з перевитими клітинами лейкемії L1210. Вік мишей 6-8 тижнів, маса 19–25 г. Самці мишей лінії С 57 BL/6j з перевитими клітинами Ca-755. Вік мишей 6-8 тижнів, маса 19– 25 р. Самці мишей лінії С 57 BL/6j з перевитими клітинами 3LL. Вік мишей 6-8 тижнів, маса 18–24 г. Оцінка протипухлинної дії проводилася виходячи із: - оцінки накопичення асциту за реєстрацією збільшення ваги тварин; - оцінки тривалості життя тварин; - оцінки росту пухлин. Проводили вимірювання більшого розміру пухлини (довжина) і перпендикулярного до нього меншого розміру (ширина). Розраховували об'єм пухлини і уповільнення росту пухлин розраховували за формулою. Оцінюваним критерієм був день 3 досягнення кожною окремою пухлиною об'єму 500 мм . Результати впливу препарату на розвиток лейкемії L1210 представлені в таблиці 12. У таблиці 13 приведена середня тривалість життя тварин з пухлинами лейкемії L1210, що перевиваються, і контрольної групи, а також дані збільшення тривалості життя в порівнянні з контрольною групою в %. Як видно з таблиці 13 середня тривалість життя мишей контрольної групи з перевитими пухлинними клітинами лейкемії L1210 склала 6,0  0,21 днів. Введення препарату достовірно збільшило тривалість життя мишей до 10,7  0,37 днів і 10,6  0,37 днів, відсоток збільшення тривалості життя в порівнянні з контролем склав 78,33% і 76,67% для доз препарату 100 мг/кг і 200 мг/кг відповідно, проте відмінності між дослідними групами виявилися статистично недостовірними. В процесі експерименту проводилося щоденне зважування тварин з метою оцінки накопичення асциту і вивчення впливу порівнюваних препаратів на даний процес. Результати оцінки збільшення ваги представлені в таблиці 14. Як видно з таблиці 14 препарат достовірно зменшував накопичення асциту у мишей з перевитими пухлинами лейкемії L1210. Збільшення ваги тіла у мишей, які отримували досліджуваний препарат, була достовірно меншою, ніж в контрольній групі, причому у тварин, які отримували досліджуваний препарат в дозі 250 мг/кг, середнє збільшення ваги було достовірно нижчим (у 1,5 рази) в порівнянні з таким показником у тварин, які отримували препарат в дозі 100 мг/кг. Таким чином, отримані результати дозволяють зробити висновок про те, що препарат проявляє виражену протипухлинну дію і гальмує ріст пухлинних клітин лейкемії L1210 у мишей, що проявилося в достовірному збільшенні тривалості життя (78,33% і 76,67%) для доз 100 і 250 мг/кг і достовірному гальмуванні накопичення асциту експериментальних тварин (78-43%). Ознак інтоксикації на тлі введення досліджуваного препарату не зареєстровано. Аналіз отриманих даних виявив достовірні відмінності між дозою препарату 100 мг/кг і дозою 250 мг/кг збільшення дози препарату приводить до достовірного зменшення накопичення асциту у піддослідних тварин. За іншими показниками контраст (відмінність середніх для груп, що отримували різні дози досліджуваного препарату) був на рівні помилок, викликаних природним розкидом даних. Результати впливу препарату на розвиток аденокарциноми молочної залози Са-755 представлені в таблиці 15. У таблиці 16 приведена середня тривалість життя тварин з пухлинами аденокарциноми молочної залози Са-755 і контрольної групи, що перевиваються, а також дані збільшення тривалості життя в порівнянні з контрольною групою в %. Як видно з таблиці 16 середня тривалість життя мишей контрольної групи з перевитими пухлинними клітинами пухлинами аденокарциноми молочної залози Са-755 склала 37,9  0,74 днів. Введення препарату достовірно збільшило тривалість життя мишей до 71,9  2,58 днів і 73,4  0,92 днів, відсоток збільшення тривалості життя в порівнянні з контролем склав 89,71% і 93,67% для доз препарату 100 мг/кг і 200 мг/кг відповідно, проте відмінності між дослідними групами виявилися статистично недостовірними. 9 UA 110345 C2 5 10 15 20 25 30 Таким чином, отримані результати дозволяють зробити висновок про те, що препарат проявляє виражену протипухлинну дію і гальмує зростання пухлинних клітин аденокарциноми молочної залози Са-755 у мишей, що проявилося в достовірному збільшенні тривалості життя (89,71% і 93,67%) для доз 100 і 250 мг/кг. Ознак інтоксикації на тлі введення досліджуваного препарату не зареєстровано. Проведена оцінка впливу препарату на середні величини об'єму пухлин карциноми Льюіса в різні дні після перевивання. У контрольній групі пухлини розвинулися у 21 з 26 мишей (80,8%), перші пухлини були зареєстровані на 7 день після перевивання і реєструвалися до 40 дня. Перші пухлини в групі з дією препарату в дозі 100 мг/кг були зареєстровані на 7 день після перевивання і реєструвалися до 60 дня; у групі з дією препарату в дозі 250 мг/кг пухлини були зареєстровані на 8 день після перевивання і реєструвалися до 60 дня. Препарат мав виражений протипухлинний ефект на розвиток карциноми легенів Льюіса; відсоток уповільнення в групі препарату - 100 мг/кг в порівнянні з контрольною групою на 10-17 днів достовірно складав 71,77% і 58,5%, в групі препарату - 250 мг/кг в порівнянні з контрольною групою на 10-17 днів – 84,37% і 54,2% відповідно. У таблиці 17 представлений вплив препарату на зростання карциноми Льюіса, 3 аналізувалися терміни досягнення пухлиною розміру 500 мм ; у контрольній групі даний показник коливався від 12 до 20 днів, а в експериментальних групах - від 17 до 28 днів. Як видно з даної таблиці, препарат достовірно збільшував цей показник на 22-27% в порівнянні з контролем. Загибель мишей контрольної групи наступала в результаті прогресу росту пухлин основного вогнища, а також унаслідок широкого метастатичного ураження легенів. Індивідуальна тривалість життя мишей в контрольній групі коливалася від 28 до 39 днів, в групах з препаратом від 51 до 60 днів. У таблиці 18 представлений вплив препарату на середню тривалість життя мишей після перевивання пухлини. Як видно з таблиці 18 препарат достовірно збільшував середню тривалість життя приблизно на 70% в порівнянні з контрольною групою, різниця між дослідними групами статистично недостовірна. Індивідуальні вага легенів і кількість метастазів в легенях у мишей контрольної групи і дослідних груп під дією порівнюваних препаратів представлені в таблиці 19. Як видно з таблиці 19 препарат достовірно зменшував вагу легенів і кількість метастазів в легенях в 1,5-2 рази. Різниця між дослідними групами статистично недостовірна. Таблиця 1 Дослідження цитотоксичності препарату на моделі лімфобластоїдних клітин людини Умови досліду концентрація, мкг/мл Контроль клітин 0,5 1,0 Препарат № 1 5,0 10,0 100 Життєздатність клітин % 98 95 94 98 94 95 Кількість клітин 3 ×10 /мл 800 833 833 799 767 600 Таблиця 2 Дослідження противірусної активності препарату на моделі клітин людини, інфікованих ВІЛ-1 Умови досліду Контроль клітин Контроль вірусу Препарат № 1 Концентрація, мкг/мл Життєздат-ність клітин % Кількість клітин 3 × 10 /мл ЦПЕ/синцитії (+) 0 98 800 0 0 20 66 4,0 0,5 1,0 5,0 10 18 26 98 98 33 495 633 600 4,0 4,0 0 0 10 UA 110345 C2 Таблиця 3 Вивчення цитотоксичної дії зразка фулеренполіамінокапронової кислоти на культуру клітин Vero Концентрація речовини, мкг\ мл 50 100 200 500 1000 5 Цитотоксична дія на клітини,% 0,0 0,0 25,0 100,0 100,0 Примітка: ДМСО в концентрації, яка застосовується для розчинення, не має цитотоксичного впливу на клітини Таблиця № 4 Протигерпетична активність зразка фулеренполіамінокапронової кислоти в культурі клітин Vero при інфікуючій дозі вірусу герпесу -100 ТЦІД50/0,2 мл Концентрація речовини, мкг\ мл 5,0 10,0 50,0 100,0 Захист клітин від цитопатичної дії вірусу герпесу % 81,25 ± 12,5 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 Примітка: клітини інфікували за годину після введення зразків. Таблиця 5 Захисна дія препарату від цитодеструктивної дії вірусу герпесу, тип 1 при інфікуючій дозі вірусу 100 ТЦІД50 Концентрація препарату, мкг/мл 0 5,0 10,0 50,0 100,0 Контроль клітин Препарат № 1 Оптична щільність 0,403 ± 0,02 1,110 ± 0,08 1,015 ± 0,07 1,153 ± 0,06 1,79 ± 0,05 1,133 ± 0,07 Відмінності від контролю достовірні при р < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 10 Таблиця 6 Протигерпетична активність зразка фулеренполіамінокапронової кислоти в культурі клітин Vero при інфікуючій дозі вірусу герпесу -1000 ТЦІД50/0,2мл Концентрація речовини, мкг/мл 5,0 10,0 50,0 100,0 Захист клітин від цитопатичної дії вірусу герпесу % 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 Примітка: клітини інфікували за годину після введення зразків 11 UA 110345 C2 Таблиця 7 Захисна дія препарату від цитопатичної дії вірусу герпесу, тип 1 при інфікуючій дозі вірусу 1000 ТЦІД50 Концентрація препарату, мкг\мл 0 5,0 10,0 50,0 100,0 Контроль клітин Оптична щільність Відмінності від контролю достовірні при р 0,796 ± 0,06 1,027 ± 0,04 1,021 ± 0,04 1,033 ± 0,03 1,083 ± 0,01 1,133 ± 0,07 < 0,01 < 0,01 < 0,01 16 60 13,4 (1-10д., 2-11д.) 300 мг/кг/день 40 12,8(1-8д.,2-9д.) не вивчали не вивчали Фулеренполіамінокапронова кислота внутрішньом'язово 50 мг/кг/день 13,3(1-7д.,1-8д.) 11,4 (2-7д.1-8д., 2-11д.,) 100 мг/кг/день 50 40 >16 13,0 (1-8д. 1-9д.,1-11д.,) 200 мг/кг/день 70 60 13,8(1-7д.,1-13д.) 13,1 (1-7д., 2-11д.) 1,5% розчин 50 60 >16 >16 DMSO Фулеренполіамінокапронова кислота внутрішньочеревно 50 мг/кг/день 13,4 (2-8д.) 11,5 (2-7д.Д-9д.,2-11д.) 100 мг/кг/день 50 13,7 (1-3д.) 40 10д.3-7д.,2-8д.,1-9д.) 200 мг/кг/день 60 3,1(3-1д,1-2д,2-3д,1-5д,130 не вивчали 1,5% розчин 0 8д.) не вивчали >16 DMSO >16 Вірусний контроль 10,1(4-8д.,2-10д.,1-11д.) 7,3 (5-7д.,4-8д.) (10 LDso) 5 10 Примітка: *В дослідах смертність в групі вірусного контролю складала 70%, тобто з 10 мишей гинули 7. **У дослідах смертність в групі вірусного контролю складала 90%, тобто з 10 мишей гинули 9. *Схема лікування: за 24 і 1 години до зараження, далі через 24,48, 72 і 96 годин після зараження 13 UA 110345 C2 Таблиця 11 Зміна ваги тварин, заражених вірусом грипу А/А і ч і/2/69 (доза LD70), яких лікували препаратами Зміна ваги в % по днях після інфікування 1 день 2 день З день 4 день 5 день Фулеренполіамінокапронова кислота перорально 100 мг/кг/день +19 +23 +25 +22 +16 200 мг/кг/день +26 +31 +36 +36 +36 300 мг/кг/день +24 +27 +28 +24 +19 Фулеренполіамінокапронова кислота внутрішньом'язово 50 мг/кг/день +20 +22 +22 +17 +11 100 мг/кг/день +21 +25 +27 +23 +20 200 мг/кг/день +25 +27 +28 +24 +20 Фулеренполіамінокапронова кислота внутрішньочеревно 50 мг/кг/день +21 +27 +29 +21 +16 100 мг/кг/день +19 +23 +22 +18 +15 200 мг/кг/день +7 +6 +5 -4 -3 Вірусний +19 +24 +31 +9 +0,9 контроль Доза препарату 7 день 9 день 11 день 13 день +17 +38 +23 +24 +47 +35 +43 +51 +36 +51 +57 +38 +9 +21,5 +23 +11 +32 +22 +19 +35,5 +25 +26 +38 +36,5 +15 +18 -7 +31 +25 +4 +36 +33 +6 +40 +41 +15 -11 +4 +27 +37 Таблиця 12 Вплив препарату на тривалість життя мишей з пухлиною лейкемії L1210, що перевивається № тварини і тривалість її життя в днях 1 2 3 4 5 6 Контроль 6 7 7 6 6 5 Препарат № 1 100 мг/кг 9 11 13 11 12 10 Препарат № 1 250 мг/кг 10 10 10 9 10 11 Назва групи 7 6 11 13 8 6 10 10 9 5 10 11 10 6 10 12 5 Таблиця 13 Вплив препарату на середню тривалість життя тварин з пухлиною лейкемії L1210, що перевивається Назва групи Контроль Препарат № 1, 100 мг/кг Препарат № 1, 250 мг/кг СТЖ в днях, Мm 6,00,21 10,70,37* 10,600,37* ПТЖ % 78,33 76,67 Примітка: * — достовірні відмінності від контролю (при р < 0,05) Таблиця 14 Вплив препарату на розвиток асциту у мишей з пухлиною лейкемії L1210, що перевивається Контрольна група День Середнє збільшення ваги, Мm Препарат 100 мг/кг Середнє збільшення ваги, Мm Препарат 250 мг/кг % уповільнення в Середнє порівнянні з збільшення контролем ваги, Мm 14 % уповільнення в порівнянні з контролем UA 110345 C2 1 2 3 4 5 6 7 0,40,2 0,90,3 5,00,8 11,41,1 16,32,0 21,22,1 26,31,7 0,30,2 0,80,4 2,50,5 4,21,0 8,41,2 12,12,1 14,22,2 0,3±0,1 0,5±0,3 1,1±0,4 2,8±0,9 4,7±1,2 8,4±1,6 10,0±1,3 50,0 %* 63,2 %* 48,5 %* 42,9 %* 46,0 %* 78,0 %* 75,4 %* 71,2 %* 60,4 %* 62,0 %* Примітка: * — достовірні відмінності від контролю (при р < 0,05) Таблиця 15 Вплив препарату на тривалість життя мишей з пухлиною лейкемії Са-755, що перевивається Назва групи Контроль Препарат № 1, 100 мг/кг Препарат № 1, 250 мг/кг N тварини і тривалість її життя в днях 1 2 3 4 5 6 36 39 41 34 35 40 7 39 8 38 9 40 10 37 79 81 73 82 80 66 63 60 67 68 77 72 70 78 76 71 73 70 72 75 5 Таблиця 16 Вплив препарату на середню тривалість життя тварин з пухлиною аденокарциноми молочної залози Са-755, що перевивається Назва групи Контроль Препарат № 1, 100 мг/кг Препарат № 1, 250 мг/кг СТЖ в днях, Мm 37,90,74 71,92,58* 73,400,92* ПТЖ % 89,71 93,67 Примітка: * — достовірні відмінності від контролю (при р < 0,05) Таблиця 17 3 Вплив препарату на розміри карциноми Льюіса (досягнення V=500 мм ) 3 Група Контроль Препарат № 1, 100 мг/кг Препарат № 1, 250 мг/кг 10 День досягнення пухлиною об'єму 500 мм % збільшення, статистична Мm значущість 16,7  0,65 27,3 % * 21,3  1,21 22,9 %* 20,51,20 Примітка: * - достовірні відмінності від контролю (при р < 0,05) Таблиця 18 Вплив препарату на тривалість життя мишей після перевивання карциноми Льюіса Група Контроль Препарат 100 мг/кг Препарат 250 мг/кг Тривалість життя % збільшення, значущість Мm 32,81  0,86 55,92  0,98 56,380,68 15 70,42 %* 71,85 %* статистична UA 110345 C2 Примітка: * - достовірні відмінності від контролю (при р < 0,05) Таблиця 19 Вплив препарату на метастазування карциноми Льюіса у мишей Група № (кількість тварин) Контроль (n=21) Препарат № 1, 100 мг/кг (n=12) Препарат № 1, 250 мг/кг (n=13) 5 Вага легенів, мг Мm Кількість метастазів в легенях Мm Кількість крупних ( 3 мм) метастазів в легенях Мm 1486,7±64,08 70,5±5,50 13,4±2,05 491,9±63,72* 53,5±11,23* 5,8±1,91* 505,4±68,82* 55,8±11,60* 5,7±1,54* Примітка: * — достовірні відмінності від контролю (при р < 0,05) ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 20 25 30 35 1. Гомо- і гетерополіамінокислотні похідні фулерену загальної формули С 60(Н)x{NH(CH2)nCOO + }x{NH3 (L)СООН}х, де n=2-5, х=3, L=-(СН2)m, де m=1-5, або -CO(CH2)kСН(NH2)-, де k=1-2, які характеризуються тим, що сполуки містять ковалентно зв'язані амінокислотні групи і полярні іонні форми амінокислот. 2. Похідні фулерену за п. 1, в яких як амінокислотні групи використовують фрагменти амінокислот аліфатичного ряду загальної формули NH(СН2)nСООН, де n=2-5. 3. Похідні фулерену за п. 1, в яких як полярні іонні форми амінокислот використовують фрагменти амідів дикарбонових амінокислот загальної формули NH2(CO)(CH2)kCH(NH2)СООН, де k=1-2. 4. Спосіб отримання похідних фулерену за п. 1, який характеризується тим, що здійснюють взаємодію фулерену з 10-разовим молярним надлишком безводних калієвих солей амінокислот загальної формули NH2(СН2)nСООK, де n=2-5, в середовищі органічного ароматичного розчинника при додаванні до отриманої суспензії міжфазового каталізатора при перемішуванні і нагріванні до температури, не вищої від 60-80 °C, до повного знебарвлення розчину і формування твердого осаду, який потім виділяють, після чого здійснюють обробку водних розчинів калієвих солей фулеренполіамінокислот 1Н розчином органічних або мінеральних кислот з подальшим введенням розчину амінокислоти загальної формули NH2(L)СООН, де L=(СН2)m, де m=1-5, або -CO(CH2)kCH(NH2)-, де k=1-2 в полярних розчинниках, з перемішуванням, видаленням розчинників, промиванням і висушуванням осаду. 5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що використовують свіжоприготовані безводні калієві солі амінокислот в дрібнодисперсному стані, а виділення твердого осаду калієвих солей фулеренполіамінокислот здійснюють фільтруванням, промиванням етиловим спиртом і висушуванням. 6. Спосіб за будь-яким з пунктів 4, 5, який відрізняється тим, що як міжфазовий каталізатор використовують метилові ефіри поліетиленоксидів молекулярної маси 200, 400, 500. 7. Фармацевтична композиція, яка відрізняється тим, що як активну речовину містить похідне фулерену за п. 1. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 16