Композиція, яка містить антиген вірусу папіломи, спосіб лікування цервікального раку, спосіб лікування гострокінцевої кондиломи

1 Композиция, содержащая антиген вируса папилломы, отличающаяся тем, что она содержит антиген вируса папилломы, смешанный с микрофлюидизированной композицией адъюванта, содержащей (а) стабилизирующий детергент, (б) мицеллообразующий агент и (с) биоразлагаемое и биосовместимое масло, при этом указанная антигенная композиция приготовлена как стабильная эмульсия типа масло-вводе и является свободной от иммуностимулирующих пептидов, а при введении животному, выбранному из группы, включающей человека, домашних животных и сельскохозяйственных животных, указанная композиция обладает способностью индуцировать специфический цитотоксический Т-лимфоцитный ответ против антигена вируса папилломы, содержащегося в композиции, который выбран из группы, состоящей из антигена HPV16 Е6, антигена HPV16 Е7, антигена HPV18 Е6, антигена HPV18 Е7, антигена HPV6 Е4, антигена HPV6 L1, антигена HPV11 Е4, антигена HPV11 L1 2 Способ лечения цервикального рака, включающий введение лекарственного средства, отличающийся тем, что он включает введение терапевтически эффективного количества антигенной композиции вируса папилломы человека по п 1 3 Способ лечения остроконечной кондиломы, включающий введение лекарственного средства, отличающийся тем, что он включает введение терапевтически эффективного количества антигенной композиции вируса папилломы человека по п 1 4 Композиция по п 1 , отличающаяся тем, что детергент выбран из группы, состоящей из Tween 20, Tween 40 и Tween 80, масло выбрано из группы, состоящей из сквалана, эйкозана и пристана, а мицеллообразующий агент выбран из группы, состоящей из Pluronic L62LF и poluoxamer 401 5 Композиция по п 1, отличающаяся тем, что детергент представляет собой polysorbate 80, а мицеллообразующий агент представляет собой poluoxamer 401 6 Композиция по п 1 , отличающаяся тем, что детергент выбран из группы, состоящей из polysorbate 80, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Zwittergent 3 -12, Teepol HB7 и Span 85 7 Композиция по п 1 , отличающаяся тем, что мицеллообразующий агент выбран из группы, состоящей из poluoxamer 401, Pluronic L62LF, Pluronic L101, Pluronic L64, EG10000, Tetromc 1501, Tetromc 150R1, Tetromc 701, Tetromc 901, Tetromc 1301 и Tetromc 130R1 8 Композиция по п 1 , отличающаяся тем, что размер частиц в композиции изменяется в пределах от 250 до ЗООнм Находящиеся на рассмотрении заявка США №08/919 787, поданная 24 июля, 1992, и заявка США №07/735 069, поданная 25 июля 1991, озаглавленные "Индукция цитотоксических Т лимфоцитных иммунных ответов", Syamal Raychaudhun и William H Rastetter(B настоящее время аннулированные), включаются в качестве ссылки во всей их полноте в данное описание Это изо (33) US О 00 49814 бретение относится к способам и композициям, полезным для индуцирования опосредованных цитотоксическими Т-клетками иммунных ответов у людей и домашних или сельскохозяйственных животных Считают, что цитотоксические Тлимфоциты(ЦТЛы) являются основным механизмом защитных сил организма в ответ на разнообразные вирусные инфекции и опухолевый или злокачественный рост Эти клетки уничтожают инфицированные или трансформированные клетки распознаванием фрагментов антигенов в ассоциации с разнообразными молекулами(названы молекулами МНС класса I) на инфицированных или трансформированных клетках ЦТЛ можно индуцировать экспериментально цито плаз мати ческой загрузкой определенных растворимых антигенов в специфические клетки Иммунизация только растворимым антигеном обычно недостаточна для индукции специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов Один способ, которым можно индуцировать иммунный ЦТЛ - ответ, включает использование способов рекомбинантной инженерии для введения критических компонентов рассматриваемого антигена в геном мягкого инфекционного агента Целью такой стратегии является генерирование антиген - специфичных цитотоксических Тлимфоцитных иммунных ответов на желаемый эпитоп путем введения хозяину слабой, самоограничивающейся инфекции Были описаны химерные векторы с использованием коровьей оспы, вируса полиомелита, адено - и ретровирусов, а также бактерий, например Listena и БСЖ Например, Takahashi et al 85 Proc Natl Acad Sei USA 3105, 1988, описывают использование рекомбинантного вируса коровьей оспы, экспрессирующего ген белка в оболочке gr160 ВИЧ, в качестве возможного средства для индукции цитотоксических Т-лимфоцитов Второй способ, которым можно индуцировать опосредованный клетками иммунный ответ, включает использование адъювантов Хотя данная область знания кажется переполненной дискуссией о использовании адъювантов, в этой области неясно, был ли индуцирован иммунитет, опосредованный(медиированный) клетками, и включал ли такой медиированный клетками иммунитет цитотоксический Т-лимфоцитный иммунный ответ Тем не менее, далее представляются разные публикации в этой области Stover et al, 361 Nature 456 1991 (не допускается, чтобы эта работа была предшествующим уровнем данной заявки) описывает иммунный ЦТЛ - ответ на р-галактоз ид азу с использованием рекомбинантной бактерии БСЖ, содержащей ген ргалактозидазы Такой ответ не был обнаружен при использовании неполного адъюванта Фрейнда и Р- галактоз ид азы Mitchell et al , 8 J Clinical Oncology 856, 1990(не допускается, чтобы эта работа рассматривалась, как предшествующий уровень данной заявки) описывает лечение пациентов с метастатической меланомой адъювантом, названным "DETOKC", и лизатами аллогенной меланомы, введенными пять раз в течение периода шести недель У небольшой части пациентов наблюдали повышение цитотоксических Т-клеток Авторы описывают потребность в повышении уровня продуцирования цитотоксических Т-лимфоцитов и предлагают комбинированную терапию адъювантом с интерлейкином-2, а также в качестве предварительного лечения циклофосфамидом для уменьшения уровня специфичных для опухоли Тсупрессорных клеток, которые могут иметь место Детокс включает детоксицированный эндотоксин(монофосфориллипид А) из Salmonella mmnesota, каркасы клеточных стенок Mycobactenum phlei, скваленовое масло и эмульгатор Allison и Gregonadis, 11, Immynology Today 427, 1990(не допускается, чтобы эта работа была предшествующим уровнем данного изобретения) указывают, что единственным адъювантом, "разрешенным для использования" в вакцинах человека, является алюминиевые соли(квасцы), которые не вызывают стойкого медиированного клетками иммунитета Allison и Gregonadis заявляют "здесь имеется, следовательно, потребность в разработке адъювантов с эффективностью полного адъюванта Фрейнда, но без его различных побочных действий, например гранулем" Они продолжают заявлять, что существует три возможные стратегии, например использование липосом, использование адъювантов, названных иммуностимулирующими комплексами(ИСКОМы, которые включают сапонин или Квил A(Quil А) (тритерпеноид с двумя углеводными цепями), холестерин и фосфатидилхолин), которые авторизованы для использования в вакцине против гриппа для лошадей[Могет et al , Immunological Adjuvants and Vaccines Plenum Press, 153], и использование эмульсии(ЭАР) сквалена или сквалана(с плуроновым средством или без него) и мурамилдипептида(МДП) Говорят, что SAF вызывает медиированный клетками иммунитет у мышей, хотя "считали, что субъединичные антигены не могут вызывать цитотоксические Тклеточные(ЦТЛ) иммунные реакции" Takahashi et al , 344 Nature 873, 1990, описывают рестриктированный помощник(класса II) и цитотоксическую Т-лимфоцитную индукцию путем использования ИСКОМов в однократной подкожной иммунизации у мышей Они заявляют, что адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда и забуференный фосфатом соляной раствор не индуцируют цитотоксическую Т-лимфоцитную активность против мишеней, в которых они были заинтересованы Они заявляют, что, в противоположность результатам с другими формами экзогенного растворимого белкового антигена, ими показано, что возможно примировать антиген специфические МНС(класса 1) - рестриктированные CD8* CD4 - ЦТЛ иммунизацией экзогенным интактным белком, используя ИСКОМы Они заявляют также, что описанные эксперименты допускают, что возможно вызывать индукцию ЦТЛ человека использованием ИСКОМов, содержащих белки ВИЧ, и что с использованием вакцин на основе ИСКОМов можно достичь долго достигаемой цели, т е индукции как ЦТЛ, так и антител очищенным белком Byars и Allison, 5 Vaccines 223, 1987, описы 49814 вают использование SAF-1, который включает твин 223, плуроник L121 и сквален или сквалан с мурамилдипептидом или без него, и предполагают, что их данные указывают на то, что композиция с мурамилдипептидом будет полезна для приготовления человеческих и ветеринарных вакцин Бустер - инъекции адъюванта вводили без мурамилдипептида Говорят, что мурамилдипептид значительно повышает продуцирование антител по сравнению с использованием адъюванта без мурамилдипептида Медиированный клетками иммунитет измеряли как гиперчувствительность замедленного типа кожными тестами для определения индукции Т-клеток-хелперов Такая гиперчувствительность была сильнее и более отсроченная, когда мурамилдипептид присутствовал в адъюванте Аналогичные адъюванты описываются Allison et al, патент США 4 770 874(где заявляется, что комбинация мурамилдипептида и плуронового пол иола существенна для вызывания сильной медиированной клетками и гуморальной иммунной реакции против яичного альбумина), Allison et al , патент США 4 772 466,Murphy-Corb et al , 246, Science 1293, 1989(где указано, что использование комбинированных адъювантов с мурамилдипептидом может повысить индукцию как гуморального, так и клеточного плеч иммунного ответа), Allison и Byars, 87, Vaccines 56, 1987(где указано, что медиированный клетками иммунитет вызывается SAF(c мурамилдипептидом), как показано гиперчувствительностью замедленного типа, пролиферативными ответами Т-клеток на антиген, продуцированием интерлейкина - 2 и специфическим генетически рестриктированным лизисом клеток-мишеней, несущих иммунизирующий антиген), Allison и Byars, Immynopharmacology of Infectious Diseases Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-Specific Resistance 191 - 201, 1987, Morgan et al , 29 J Medical Virology 74, 1989, Kenney et al , 121 J Immvnological Methods 157, 1989, Allison и Byars, 95 J Immynological Methods 157, 1986(где было показано, что эмульсии алюминиевых солей и минерального масла повышают образование антител, но не медиированный клетками иммунитет, и было показано, что композиции мурамилдипептида вызывают медиированный клетками иммунитет), Byars et al , 8 Vaccine 49 1990(не допускается, чтобы эта работа была предшествующим уровнем заявки), где указано, что их композиция адъюванта заметно повышает гуморальный иммунный ответ и в меньшей степени усиливает медиированные клетками иммунные ответы на гемагглютининовый антиген гриппа), Allison and Byars, 28 Molecular Immynology 279, 1991 (не допускается, чтобы эта работа была предшествующим уровнем заявки, которые заявляют, что функцией мурамилдипептида является индуцирование экспрессии цитокинов и повышение экспрессии генов главного комплекса гистосовместимости(ГКГ), и что получали лучшие клеточные ответы и ответы антител, чем с другими адъювантами, и что они надеются выяснить, эффективна ли аналогичная стратегия для людей), Allison and Byars, Technology Advances in Vaccine Development 401, 1988(которые описывают медиированный клетками иммунитет с использова нием SAF), Epstein et al 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990(которые дают обзор разных адъювантов, используемых для получения вакцин), Allison and Byars 95 J Immynological Methods 157, 1986(которые заявляют, что добавление мурамилдипептида к адъюванту заметно повышает медиированные клетками иммунные ответы на различные антигены, включая моноклональные иммуноглобулины и вирусные антигены), и Morgan et al 29 J Medical Virology 74 1989(которые описывают использование SAF-1 для получения вакцины для вируса Эпштейн-Барра Kwak et al , Idiotype Networks in Biology and Medicine, Eisevier Science Publisher, p 163, 1990(не допускается, чтобы эта работа была предшествующим уровнем заявки) описывают использование SAF без мурамилдипептида в качестве адъюванта для идиотипа В-клеточной лимфомы у человека В частности, эмульсию плуроника L121, сквалана и 0,4% твина 80 в забуференном фосфатом солевом растворе вводили с идиотипом Они заявляют, что "добавление адъюванта должно далее повышать гуморальные иммунные ответы и, кроме того, может облегчить индукцию клеточных иммунных ответов" Другие иммунологические препараты включают липосомы[АП|эоп et al , патенты США 4 053 585 и 4 117 113], циклические пептиды[Огееэтап et al , патент США 4 778 784], полный адъювант ФрейнflafAsherson et al , 22 Immynology 465, 1972, Berman et al , 2 International J Cancer 539 1967, Allison, 18 Immynopotentiation 73, 1973, and Allison, Non specific Factors Influencing Host Resistance 247, 1973], HCKOMbi[Letvm et al , 87 Vaccines 209, 1987], адъюванты, содержащие неионные блок сополимерные агенты, образованные с минеральным маслом, поверхностно - активное вещество и твин 80[Hunter and Bennett, 133 J Immunology 3167, 1984, and Hunter et al , 127 J Immunology 1244, 1981], адъюванты, составленные из минерального масла и эмульгирующего средства с убитыми микобактериями или без Hnx[SanchezPescador et al , 141 J Immunology 1720, 1988] и другие адъюванты, такие как липофильное производное мурамилтрипептида и мурамилдипептида, ковалентне конъюгированный с рекомбинантым 6enKOM(id ) Краткое изложение существа изобретения Заявитель обнаружил безопасный и выгодный способ и композиции, которыми у людей и домашних или важных для сельского хозяйства животных можно индуцировать иммунный ЦТЛ-ответ Способ включает использование антигенной композиции, которая слаботоксична или нетоксична для животных и не содержит иммуностимулирующего пептида(например мурамилдипептида), присутствие которого будет понижать желаемый клеточный иммунный ответ Кроме того, эта методология проста в использовании и не требует экстенсивной работы in vivo для изменения существующих клеток способами рекомбинантнои ДНК, чтобы сделать их более антигенными Это открытие неожиданное, поскольку не ожидали, что такие иммунные ЦТЛ-ответы могут быть индуцированы путем использования такой антигенной композиции, не содержат иммуностимулирующих 49814 пептидов или их эквивалентов Открытие заявителя позволяет использовать такие антигенные композиции при болезненных состояний широкого спектра или в качестве профилактического средства Введение такой антигенной композиции можно использовать, например, для лечения вирусных болезней, в которых важен иммунный ЦТЛ-ответ, например при лечении инфекции ВИЧ или гриппа, использование ее можно также расширить до использования при лечении бактериальных инфекций, рака, паразитарных инфекций и тому подобных В качестве профилактического средства антигенная композиция, комбинированная с подходящим антигеном, полезна для предупреждения инфекции вирусами, ответственными за вышеуказанные вирусные болезни, в частности профилактики ВИЧ-инфекции, а также для профилактики пациентов с риском рака, например после резекции первичной опухоли Таким образом, первым аспектом изобретения является представление способа индукции иммунного ЦТЛ-ответа у человека или домашнего(например кошки или собаки) или важного для сельского хозяйства животного(например козы, коровы или свиньи) к антигену, отличному от антигена В-клеточной лимфомы или яичного альбумина Способ включает стадии получения антигена, для которого желателен иммунный ЦТЛ-ответ, и получения нетоксичной антигенной композиции, которая включает стабилизирующий детергент, мицеллообразующий агент и биоразрушаемое и биосовместимое масло или состоит или по существу состоит из этих компонентов Эта антигенная композиция предпочтительно не содержит иммуностимулирующий пептидный компонент или имеет достаточно низкий уровень такого компонента, чтобы не уменьшился требуемый клеточный иммунный ответ Эту композицию предпочтительно предоставляют в виде стабильной эмульсии типа масло - в - воде То есть каждый из различных компонентов выбирают так, чтобы эта эмульсия оставалась в состоянии эмульсии в течение периода по меньшей мере одного месяца, предпочтительно в течение более чем одного года, без разделения фаз В этом способе антиген и антигенную композицию смешивают для образования смеси (пред почтительно микрофлюид изацией) и эту смесь вводят животному в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ЦТЛ-ответа у этого животного Такое введение требуется проводить только один раз Термин "стабилизирующий детергент" означает детергент, который позволяет компонентам эмульсии сохраняться в виде стабильной эмульсии Такие детергенты включают полисорбат, твин 80(сорбитан-моно-9-октадеканоат-поли(окси-1,2этандиил, производимый ICI Americas, Wilmington, DE), твин 40, твин 20, твин 60, цвиттергент 3 - 1 2 , типол НВ7 и спан 85 Эти детергенты обычно применяют в количестве приблизительно 0,05 - 0,5%, предпочтительно около 0,2% Термин "мицеллообразующий агент" обозначает агент, который способен стабилизировать эмульсию, образованную с другими компонентами, так чтобы образовывалась мицеллоподобная структура Такие агенты предпочтительно вызы 8 вают некоторое раздражение в месте инъекции, чтобы привлечь макрофаги для повышения клеточного иммунного ответа Примеры таких агентов включают полимерные поверхностно - активные вещества, описанные в публикациях BASF Wyadotte, например Schmolka, 54 J Am Oil Chem Soc 110, 1977, и Hunter et al , 129 J Immunol 1244, 1981, причем обе эти публикации включены в качестве ссылок, плуроник L62LF, L101 и L64, ПЭГ1000 и тетроник 1501, 150R1, 701, 901 1301 и 130R1 Химические структуры таких агентов хорошо известны в данной области Предпочтительно выбирают агент, который имеет гидрофильно липофильный баланс(ГЛБ) между 0 и 2, как определено Hunter and Bennett, 133 Journal of Immunology 3167, 1984 Этот агент предпочтительно применяют в количестве от 0,5 до 10%, предпочтительно в количестве от 1,25 до 5% Выбирают масло, которое промотирует удерживание антигена в эмульсии масло - в - воде, то есть обеспечивает носитель для требуемого антигена, и предпочтительно имеет температуру плавления менее, чем 65°С, так что эмульсия образуется либо при комнатной температуре(около от 20°С до 25°С), либо один раз температуру эмульсии снижают до комнатной температуры Примеры таких масел включают сквален, сквалан, эйкозан, тетратет-раконтан, глицерин и арахисовое масло или другие растительные масла Масло предпочтительно применяют в количестве от 1 до 10%, наиболее предпочтительно от 2,5 до 5% Важно, чтобы масло было биоразлагаемым и биосовместимым, так чтобы организм мог разрушать масло в течение некоторого времени и чтобы при использовании такого масла не были очевидными отрицательные действия, например гранулемы В указанной выше композиции важно, чтобы в ней не содержался пептидный компонент, в особенности мурамилдипептид(МДП) Такой пептид будет мешать индукции иммунного ЦТЛ-ответа, если он присутствует в количестве, большем, чем около 20микрограмм, на одно обычное введение композиции человеку Предпочтительно, чтобы такие пептиды полностью отсутствовали в антигенной композиции, несмотря на их очевидную стимуляцию гуморального компартмента иммунной системы То есть заявитель нашел, что, хотя такие пептиды могут усиливать гуморальную иммунную реакцию, они невыгодны, когда требуется цитотоксический Т-лимфоцитный иммунный ответ Другие связанные аспекты изобретения заключаются в том, что антигенную композицию образуют только из двух из указанных выше трех компонентов и используют с любым требуемым антигеном(этот термин включает белки, полипептиды и их фрагменты, которые иммуногенные), за исключением яичного альбумина(или других альбуминов, например человеческого сывороточного альбумина(НЗА), бычьего сывороточного альбуMHHa(BSA) и овальбумина (ОВА), для индукции иммунного ЦТЛ-ответа у указанных выше животных или людей Заявитель считает, что указанные выше композиции значительно выгоднее, чем предшествующие композиции(включая ИСКОМы, детокс и SAF) для использования для людей В отличие от 49814 таких композиции, данная композиция как включает мицеллообразующий агент, так и не имеет пептидов, каркасов клеточных стенок или компонентов бактериальных клеток Данная композиция также индуцирует иммунный ЦТЛ-ответ, который либо не имеет место при использовании предшествующих композиций, либо значительно повышается по сравнению с этими композициями Термин "нетоксичный" означает, что наблюдается слабое побочное действие антигенной композиции или не наблюдаетсятакого действия у обработанного такой композицией животного или человека Обычные специалисты в области медицины или ветеринарии должны признать, что этот термин имеет широкое значение Например, по существу у здорового животного или человека может допускаться только слабая токсичность, тогда как у человека, страдающего от иммунной болезни, может допускаться значительно более высокая токсичность В предпочтительных воплощениях антигенная композиция состоит по существу из двух или трех компонентов детергента, агента и масла, и способ состоит по существу в однократном введении смеси(антиген плюс антигенная композиция) человеку или животному, человека или животного инфицируют вирусом и он страдает от одного или нескольких симптомов(обычно определяемых врачами в соответствующей области) инфекции вирусом, и антигенная композиция нетоксична для человека или животного В других предпочтительных воплощениях антиген выбирают из антигенных частей ВИЧантигенов gp160, gag, pol, Nef, Tat и Rev, антигенов малярии белка спорозоита(СЗ) и поверхностного белка 2 спорозоита, поверхностных антигенов гепатита В Pre-S1, Pre-S2, HBc Ад и НВе Ад, антигенов гриппа НА, NP и NA, поверхностных антигенов гепатита А, антигенов вируса герпеса др340 EBV, gp85 EBV, gB HSV, gD HSV, gH HSV, раннего белкового продукта HSV, антигенов вируса папилломы человека(например HPV-антигенов, таких как антигены L1, Е4, Е6, Е7, в частности антигенов Е6 и Е7 из HPV16 и 18, двух наиболее обычных типов HPV, связанных с цервикальной карциномой, Е4 и L1, полученных из HPV6 и HPV11, двух наиболее обычных типов HPV, связанных с остроконечной кондиломой, антигена предстательной железы, gB цитомегаловируса, дН цитомегаловируса и белка дР72 IE, антигенов респираторно - синцитиального вируса белка F, белка G и белка N, и опухолевых антигенов карциномы СЕА, связанной с муцином карциномы, Р21 карциномы, Р53 карциномы, MPG меланомы, р97 меланомы и онкогенного продукта Neu карциномы, продукта гена р53 карциномы, антигена меланомы, названного MAGE, и мутированного белка р21 ras, присутствующего в различных злокачественных опухолях В другом аспекте изобретение характеризуется композицией, содержащей, состоящей или по существу состоящей из антигена, смешанного с описанной выше композицией, и антиген выбирают из перечисленных антигенных частей В другом близком аспекте изобретение характеризуется способами лечения пациента, инфи 10 цированного ВИЧ-вирусом, страдающего малярией, страдающего гриппом, страдающего гепатитом, страдающего раком, инфицированного вирусом герпеса, страдающего цервикальным раком, страдающего остроконечной кондиломой(остроконечные бородавки) или инфицированного респираторно-синцитиальным вирусом, введением композиции, включающей подходящий антиген(например, выбранный из перечисленных выше антигенов), смешанный с одной из выше указанных композиций антигена Эти антигены и способы лечения с их использованием являются только примерными антигенами, которые можно использовать в антигенных композициях - объектах данного изобретения Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидными из следующего описания предпочтительных воплощений его и из формулы изобретения Сначала будут кратко описаны рисунки Рисунки Фиг 1А - 1С и 4А - 4С являются графическими представлениями данных, сравнивающих индукцию ЦТЛ различными композициями овальбумина, Е Т представляет отношение эффектора к мишени на всех рисунках Фигуры 2А и 2В являются графическими представлениями данных, сравнивающих индукцию ЦТЛ разными композициями р-галактозидазы, ФигЗ является графическим представлением данных, сравнивающих индукцию ЦТЛ овальбумином в липосоме и в антигенной композиции, Фиг 5 и 6 являются графическими представлениями данных, показывающих влияние истощения клеток CD4 и CD8 на индукцию ЦТЛ, Фиг 7 является графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ белком др120, Фиг 8 является графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ смесью плуроника и твина и антигена, Фиг 9 является графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ смесью сквалана и плуроника и антигена, Фиг 10 является графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ смесью сквалана и плуронина и антигена, Фиг 11 является графическим представлением влияния овальбумина(ова) с разными антигенными композициями на иммунный ЦТЛ-ответ, Фиг 12 является графическим представлением индукции антител против gp120lllb у обезьян различными антигенными композициями, Фиг 13 изображает противоопухолевую активность клеток НОРЕ2 через десять дней после одной иммунизации растворимым белком Е7 в адъюванте и Фиг 14 изображает противоопухолевую активность клеток НОРЕ2 на 10, 19 день после двух иммунизации растворимым белком Е7 в адъюванте Антигенная композиция Антигенные композиции, полезные в этом изобретении, в общих чертах описываются выше Специалисты в данной области должны признать, что эквивалентные композиции легко получаются 11 49814 12 и, как можно ожидать, имеют эквивалентные свойсквалан - плуроник с такой же концентрацией, как ства в индукции иммунного ЦТЛ-ответа Такие и для трехкомпонентной смеси Плуроник, сквалан композиции легко испытывать на их свойства с или твин 80 готовили также индивидуально для использованием методик, эквивалентных методиопределения влияния индивидуального компоненкам, описанным в приведенных ниже примерах та на индукцию ЦТЛ Проводили также замену Здесь даются примеры изобретения с испольтвина 20, твина 40 или цвиттергента на твин 80 зованием антигенной композиции(АК), состоящей для определения влияния разных производных из около 2,5% сквалана, 5% плуроновой кислоты и твина на индукцию ЦТЛ в ова - системе Сквалан в твина 80 в забуференном фосфатом солевом растрехкомпонентной композиции заменяли на эйкотворе В частности, эмульсия АК включала 15мг зан или триаконтан и сополимерный плуроник в сквалана, 37,5мг полоксамера 401(плуроник L121), такой же трехкомпонентной системе заменяли на 6мг полисорбата 80(твин 80), 0,184мг хлорида ПЭГ 1000, плуроник L62LF и тетроники 1501 и калия, 0,552мг первичного кислого фосфата ка150R1 В качестве двухкомпонентных композиций лия, 7,36мг хлорида натрия, 3,3мг вторичного киразные аналоги в разных комбинациях смешивали слого фосфата натрия(безводного) на 1мл воды, и испытывали на ова - специфическую индукцию рН 7,4 Эту эмульсию микрофлюидизировали, исЦТЛ Они являются смесью холестерин - твин 80, пользуя стандартные способы(модель M110F Miсквалан -твин 20, пристан -твин 80 или оливковое crofluidics) с модулем обратного давления при масло - твин 80 Для изучения стабилизации мик0,773 - 0,984атм с постепенным возвращением к рофлюидизированную смесь сквалан - твин 80 атмосферному давлению, охлаждение и упаковку смешивали с декстрозой до конечной концентрав мокрый лед ции 5% Во всех случаях комбинации наполнителей смешивали в микрофлюидизаторе для полуВ других примерах антиген смешивали с микчения стабильной эмульсии В некоторых рофлюид изированной смесью сквалана(С), плуэкспериментах двухкомпонентные композиции роника(П) и твина 80(Т) для достижения конечной смешивали с разными концентрациями МДП для концентрации 0,2% твина 80, 1,25% плуроника и индукции иммунного ЦТЛ-ответа и гуморального 5% сквалана соответственно Для определения иммунного ответа В таблице 1 приводится исчерсубкомпонентов, необходимых для индукции антипывающий список различных композиций, испольгенспецифичного иммунного ответа, получали зуемых в этом исследовании смеси сквалан - твин 80, плуроник - твин 80 или Таблица 1 Влияние разных замен в двух- или трехкомпонентных системах Замена в трехкомпонентных композициях СТП Твин 40(Т) Твин 20(Т) Т1501(П) Т150Р1(П) Плуроник1621Р(П) Эй козан (С) ПЭГЮОО(П) Триаконтан (С) Цвиттергент(Т) Замена в двухкомпонентных композициях СТ ПТ СП Холестерин(С) + твин 80 Сквалан + твин 29(Т) Пристан(С) + твин 80 Оливковое масло(С) + твин 80 Однокомпонентная композиция Плуроник L121 Сквалан Твин 80 Сквалан + твин 80 + 5% декстроза *ЦТЛ - испытание повторяли Композицию адъюванта синтекс(микрофлюидизированная, SAFm) использовали в качестве адъювантного контроля, она состоит из двух частей Часть I состоит из забуференного фосфатом солевого раствора, Процент киллинга при Е Т 100 1 84 66 48 0 0 47 * * * * 76 45 26 0 65 42 69 0 0 0 86 содержащего как конечную концентрацию 5% сквалана, 1,25% плуроника и 0,2% твина 80(наполнитель или I-SAF) Часть II состоит из Nацетилмурамил-І_-треонил-О-изо-глутамина(ТпгМДП), производного компонента стенок клеток микабактерий Для целей иммунизации антиген 49814 14 13 7 смешивают с микрофлюидизированным наполР131, получали электропорацией 10 Р815нителем(часть I) для получения гомогенной клеток в 1мл забуференного фосфатом соляного эмульсии В приготовленную микрофлюидизирораствора с 10мг линеаризованного при помощи ванную композицию адъюванта CHHTeKc(SAFm) Pstl pCH110[Pharmacia LKB Biotechnology Inc, добавляют МДП и смесь недолго интенсивно Piscatway, NJ] и 1мг линеаризованного при поперемешивают Концентрацию МДП в смеси измощи Pvul pSV2 neo[Southern et al , 1 J Мої Appl меняют для определения, была ли достигнута Genet 327, 1982] с последующей селекцией в оптимальная его концентрация для ЦТЛ400 антибиотика G418 СЗ-4-Трансфектант полуиндукции В качестве адъювантного контроля чали из гибридомы IgM 662 BALB/c трансфекцимышей также иммунизировали растворимыми ей плазмидой, кодирующей ген р-гал, слитый с антигенами, смешанными с квасцами в соответтретьим и четвертым экзоном тяжелой цепи ствии с инструкцией про из водителя (Pie гее lgM[Rammensee et al , 30 Immunogenetics 296 Chemical, Rockford, IL) или с полным адъювантом 1989] Фибробласт ЗТЗ, экспрессирующий Фрейнда(ПАФ) gp160lllb, 15 - 12, был получен Dr Germain ь NIH(Bethesda, MD) К -трансфектированная LЭту композицию антигена используют для клеточная линия была предоставлена Dr индукции цитотоксического Т-лимфоцитного имd d Carbone, Monash University, Australia D и l_ мунного ответа у мышей Обычные специалисты трансфектированные L-клеточные линии были в данной области должны признать, что такая предоставлены Dr Ted Hensen, Washington мышиная модель является показателем того, что University, St Louis эквивалентные эксперименты или способы лечения будут подобным образом индуцировать цитотоксический Т-лимфоцитный иммунный ответ у людей, домашних или сельскохозяйственных животных Количество композиции антигена и антигена, полезное для продуцирования желательной клеточного иммунного ответа можно определить эмпирически стандартными способами, хорошо известными специалистам в данной области, без дополнительного экспериментирования Таким образом, если желательно снизить до минимума побочное действие при лечении такой смесью, специалисты в данной области могут определить минимальный уровень такой смеси для введения человеку, домашнему или сельскохозяйственному животному для вызывания иммунного ЦТЛ-ответа и, таким образом, индуцирования иммунитета к желаемому антигену При обычном использовании такую смесь нужно инъецировать любым одним из ряда стандартных методов, но в частности предпочтительна локальная внутримышечная инъекция, которая позволит эмульсии оставаться в стабильной форме в течение периода нескольких дней или нескольких недель Способы В представленных ниже примерах использовали следующие материалы и способы, если нет других указаний Мыши Самок мышей С57В/6 (Н-2Ь) и BALB/c(H-2d) покупали у Harlen Sprague(San Diego, California) Антигены Овальбумин(ова, сорт VII, Sigma Chemical Со, St Louis, МО) использовали в нативной форме, р-галактозидазу(р-гал, сорт VIII, BRL) использовали в нативной форме и после кипячения в 1М NaOH в течение 2мин для проведения щелочного гидролиза Рекомбинантный др120 покупали у American Biotechnology Опухолевые клетки и трансфектанты Использованные опухолевые клетки были la линиями EL4(C57BL/6, тимома Н-2Ь) и P815(DBA/2, мастоцитома H-2d) Получение производного ова-продуцирующего трансфектанта EL4, EG7-OBa, описано ранее Moore et al , 54 Cell 777, 1988 р-Гал-продуцирующий трансфектант, Иммунизация Мышей иммунизировали внутривенно 200мкл суспензии 25 х 106 спленоцитов после цитоплазматической загрузки, как описано Moore et al, смотри выше, и Carbone et al , J Exp Med 169 603, 1989 Для иммунизации композицией оваантиген или композицией р-гал-антиген ЗОмкг каждогобелкового антигена инъецировали каждой мыши подкожно в подушечку лапы и основу хвоста Каждая инъекция состояла из 67мкл микрофлюид изированной антигенной композиции(приготовлена в соответствии со стандартными способами) и ЗОмкг белкового антигена в конечном объеме 200мкл Конечный объем устанавливали при помощи ССРХ(сбалансированный солевой раствор Хенка), смотри руководство WhittakerfWelkersville, MD) МДП вводили в концентрациях от 0 до ЗООмкг Там, где сообщается, мышей иммунизировали растворимыми антигенами в ПАФ или квасцах в общем объеме 200мкл Стимуляция in vitro популяций клетокэффекторов Клетки селезенки(30 х 106) нормальных или иммунизированных мышей, которые были примированы по меньшей мере за 14дней ранее, инкубировали с 1,5 х 106 ЕС7-ова(облученные 20000 рад) для ова-иммунных ответов или с 1,5 х 6 10 СЗ-4-клетками(облученные 20000рад) для иммунного р-гал-ответа в планшетах на 24 лунки при 37°С в среде 7% СОг/воздух Все культивирования тканей выполняли в полной среде, состоящей из среды Дульбенко, модифицированной по способу HCKOB(IMDM), смотри Whittaker ManualfWelkersville, MD), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой(РЭС), 2мМ глутамина, гентамицином и 2 х 1 0 5 М 2меркаптоэтанола Для экспериментов с истощением in vitro праймированные in vitro или стимулированные in vitro клетки селезенки обрабатывали моноклональными антителам и (mAbs) RL 172(анти-СО4) или mABs 3,168(анти-СО8) для удаления CD4* или CD*-T-meTOK[Sarmiento et al, 125 J Jmmunol 2665, 1980, and Ceredig et al , 314 Nature 98, 1985] mAb RL 172 и mAb 3,168 получали от Dr Jonathan Sprent et Scnpps Clinic and 49814 15 Research Foundation, La Jolla, CA 6 Клетки селезенки(ЗО х 10 ) нормальных или иммунизированных мышей, которые были праймированы по меньшей мере на 21дней ранее, 6 инкубировали с 1,5 х 10 клетками 15 12(обработанные 200мкг митомицина С в тече8 ние 45минут на 10 клеток) или с 500мкг пептида 18111b, содержащего доминантный эпитоп ЦТЛ в мышах Balb/c, в полной IMDM-cpefle(lrvme Scientific, Santa Ana, CA), содержащей 10% предварительно подвергнутой скринингу FCS(ICN Flow, ICN Biochemicals, Inc , Costa Mesa, CA), 2мМ глу5 тамина, гентамицина и 2 х 10 М 2меркаптоэтанола Для стимуляции in vitro пептидами клетки селезенки культивировали в полной IMDM-среде, содержащей 5% супернатанта конканавалина А(СопА) Для экспериментов с истощением праймированные in vitro или стимулированные in vitro клетки селезенки обрабатывали mAbs RL172(aHTHCD4) или mAbs 3 168(анти-СО8) в присутствии малотоксичного кроличьего комплемента[СесіегІапе Laboratories, Ltd , Hornby Ontario, Canada] для удаления CD 4+ или С08+-Тклеток(22, 23) (mAbs) RL 172 и mABs 3 168 были подарены Dr Jonathan Sprent et Scnpps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA) Испытания на цитотоксичность Клетки мишени(1х 106) метили 100мкКи[51Сг]-хромата натрия в течение бОмин Для "обученных" пептидом мишеней(комитированных лимфоцитов) во время мечения мишеней 51Сг добавляли 50кмл пептидного раствора 1мг/мл в ССРХ После промывания 104 меченых мишеней и продукты серийного разведения клеток-эффекторов инкубировали в 200мкл RP10 в течение 4час при 37°С Собирали ЮОмкл супернатанта и специфический лизис определяли следующим образом Процент специфического лизиса = 1 0 0 х{(выделение посредством ЦТЛ - самопроизвольное выделение)/(максимальное выделение самопроизвольное выделение)} Самопроизвольное выделение в отсутствие цитотоксических Т-лимфоцитов(ЦТЛ) было < 25% максимального выделения детергентом во всех экспериментах Определение гуморального иммунного ответа у мышей и обезьян Каждую лунку планшетов на 90 лунок с Uобразным flHOM(Costar, Cambridge, MA) покрывали 150нг ova или gr120 в 50мкл ССРХ и инкубировали в течение ночи при 4°С Для определения гуморальных иммунных ответов против др120 и против ova у мышей планшеты блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином BSA в течение 1часа Серийно разведенные сыворотки добавляли в объеме 25мкл на лунку и инкубировали в течение 2часов Планшеты промывали и добавляли на лунку 50мкл разведенного 1 1000 антимышиного козлиного IgG, конъюгированного с HRPO(SBT, Alabama), в 1% BSA После 1часа инкубирования планшеты промывали и на лунку добавляли ЮОмкл субстрата OD405 проводили через 10 - 15минут Для определения гуморального иммунного ответа как образование обезь 16 яньих антител против др120 все указанные стадии, за исключением как блокирования планшетов, так и разбавления сыворотки, проводили в 5% нормальной козьей сыворотке в сбалансированном солевом растворе Хэнкса Синтез пептидов Синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 253 276(Последовательность № 1 EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER, где стандартный однобуквенный код используют для обозначения каждой аминокислоты) овальбумина(оуа 253 - 276), аминокислотным последовательностям 8 4 - 1 0 2 миелинового базового белка(МБР 84 102) (Последовательность №2 DENPVVHFFKNIVTPRTPP) и синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 308 322(18ШЬпоследовательность) gp120lllb, были "собраны" твердофазным пептидным синтезом с использованием синтезатора Applied Biosystems 430A Аминокислоты связывали через предварительно образованные симметричные ангидриды, за исключением аспарагина, глутамина и аргинина, которые связывали в виде сложных эфиров гидроксибензотриазола Эффективность связывания контролировали нингидриновой реакцией по методу Kaiser et al , 34 Anal Biochim 595, 1970 Пептиды выделяли из подложки при помощи HF после процедуры "низкий - высокий", описанной Tarn, et al , 21 J Am Chem Soc 6442, 1983, и экстрагировали из смолы 10% уксусной кислотой После лиофилизации пептиды обессоливали на колонке с сефадексом G-25 и пробы пептидов затем очищали ЖХВР хроматографией с обращенной фазой на препаративной колонке С-18 Vydac Очищенные пептиды(98%) растворяли в ССРХ при конечной концентрации 10мг/мл и разбавляли до желаемой концентрации в полной среде Гидролиз CNBr Пробы белка(например р-галактоз ид азы) обрабатывали 100-кратным молярным избытком бромида циана в растворе ЮОмМ трифторуксусной кислоты Реакция проходила в течение 18часов при комнатной(около 20°С) температуре при перемешивании После прохождения предписанного времени реакции пептидные фрагменты отделяли от реагента, используя аппаратуру SEP-PAK C-18(Waters), элюировали 95% ацетонитрилом и лиофилизовали Гидролиз щелочью Образцы белков(например р-галактозидазы) обрабатывали 1н NaOH и кипятили в течение 2минут и получаемые пептидные фрагменты отделяли от реагентов, используя аппаратуру С-18 SEP-PAK(Waters), и элюировали 95% ацетонитрилом и лиофилизовали Пример 1 Примирование рестриктированных(по классу) I ЦТЛ Moore et al , 113 UCLA Symp Мої Cell Biol 1989 and Carbone and Bevan, 171 J Exp Medicine 377, 1990, показывают, что мыши, иммунизированные клетками селезенки, заполненными цитоплазматически растворимым овальбуцином, были праймированы для ова-специфического 49814 18 17 иммунного ответа в виде рестриісгированньїх по ческого иммунного ЦТД-ответа сбор был отсроклассу І ЦТЛ Ова-экспрессирующий EL4чен по меньшей мере на восемь недель до того, трансфектант EG7-ova использовали для стимукак лимфоциты селезенки были собраны и кульляции in vitro примированных in vivo лимфоцитов тивированы в течение пяти дней в присутствии селезенки и использовали также в качестве миоблученных СЗ-4-трансфектантов шени для ова-специфического ЦТЛФиг 2В показывает, что ЗОмкг рмедиированного киллинга Это исследование галактозидазы в АК индуцировали сильный спе8 показывает также, что СО *-эффекторы, индуцицифический иммунный ЦТЛ-ответ против трансрованные ЕС7-ова-трансфектантом или клеткафектанта При отношении эффектора к мишеми селезенки, цито плаз мати чески загруженными ни(Э М) 3 1 иммунизированные р-гал-АК мыши ова, распознают детерминанту, картированную показали около 80% специфического киллинга Ь пептидом ова 258 - 276 в контексте Н-2К , лизиСЗ-4 Тем не менее, только 20% киллинга той же руют EG7-ova и нейтрализуют также клетки EL4, мишени достигали эффекторами, выделенными покрытые ова 258 - 276 Таким образом, чтобы из мышей, иммунизированных р-гал в ССРХ, при оценить, может ли эндогенный путь по рестриктаком же отношении Э М(фиг 2А) Поскольку ни 8 тированным(по классу I) СD8 -T-клеткам быть EL4, ни Р815 не экспрессируют продукты гена индуцирован растворимым антигеном, указанную МНС класса II и лизис показывает сингенную ревыше систему использовали для определения, стрикцию, эти ova-и р-гал-специфические эффекможно ли обычные антигенные композиции исторы являются рестриктированными ГКГ класса пользовать для введения растворимого антигена I в рестриктированный путь класса I Для демонстрации полезности антигенной a) ова (ova) композиции мышей иммунизировали раствориМышей C57BL иммунизировали один раз мым ова, капсулированным в два типа липосом, различными количествами оуа(30мкг - 1мг на один из которых был рН-чувствительной липосомышь) с использованием антигенной композиции мой Через одну неделю клетки селезенки стиили без нее Мышей инъецировали подкожно и в мулировали in vitro, как описано выше, и испытыоснование хвоста Клетки селезенки отбирали у вали по сравнению с 51Сг-меченым EG7-ova или иммунизированных мышей по меньшей мере EL4 Фиг 3 показывает характерный результат, через две недели после иммунизации и in vitro демонстрирующий, что ova в липосоме не может стимулировали трансфектантами EG7-ova Конпримировать мышей для заметной индукции имцентрация до ЗОмкг была так же эффективна, как мунного ЦТЛ-ответа Похожие результаты надоза 1мг Поэтому исследования ЦТЛ, как обычблюдали, когда для иммунизации использовали но, проводили с клетками селезенки мышей, ova в квасцах примированных от ЗОмкг ova После культивироПример 2 Распознавание эпитопа ЦТЛ вания с EG7-ova in vitro в течение пяти дней приCarbone and Bevan, смотри выше, показали, мирование оценивали по присутствию ovaчто ЦТЛ, индуцированные в мышах C57BL/6 специфических эффекторов, способных лизиротрансфектантом ЕС7-ова и цито плаз мати чески вать EG7-ova ова-нагруженными спленоцитами, распознают Мыши, инъецированные растворимым ova в клетки EL4, покрытые пептидом ова 258 - 276 ССРХ вплоть до 1мг, не продемонстрировали Для определения того, индуцирует ли растворидоказательства примирования ЦТЛ(фиг 1А) Одмый овальбумин в АК похожие иммунные ЦТЛнако, мыши, иммунизированные ЗОмкг ova в анответы, клетки селезенки получали от иммунизитигенной композиции, описанной выше(на фигурованных мышей и стимулировали in vitro EG7рах показана как АК), показали значительный ова Эффекторы испытывали против клеток EL4, трансфектант-специфический иммунный ЦТЛпокрытых пептидом 253 - 276 ова или контрольответ(фиг 1С) Кроме того, степень киллинга ным пептидом, полученным из базального белка EG7-ova клетками селезенки, иммунизированнымиелина(ББМ 84 - 102) Результаты показывают, ми ova-AK, была сравнима со степенью киллинга что ова-АК праймировали ЦТЛ со специфичноova-наполненными клетками селезенки иммунистью, подобной специфичности ЦТЛ, праймирозированных мышей(фиг 1 В) ванных трансфектантами, или цитоплазмически То, что специфичность ЦТЛ-примирования in наполненных ова(фиг 1 А, 1В и 1С) Клеткиvivo была антиген-специфичной, было показано эффекторы, праймированные ова-АК, эффективнеспособностью клеток селезенки иммунизироно лизировали EG7-OBa и нетрансфектированванных р-галактозидазой мышей проявлять втоные EL4-meTKH, покрытые 50мкг/108 клеток оваричный иммунный ЦТЛ-ответ in vitro при стимупептида, но не лизировали EL4-meTKH, покрытые ляции EG7-ova Не наблюдали индукцию ова50мкг/108 клеток ББМ-пептида специфических ЦТЛ Carbone and Bevan, смотри выше, указывали, b) р-галактоз ид аза что в р-галактозидазной системе р-галПохожие результаты получали с использоваэкспрессирующий трансфектант и спленоциты, нием другого растворимого белкового антигена, цито плаз мати чески нагруженные растворимой рР-гал Для анализа р-гал-специфичного иммунногалактозидазой, индуцировали ЦТЛ, которые го ЦТЛ-ответа используемой мишенью был полулизировали р-гал-экспрессирующий трансфекченный из мышей BALB/c р-гал-экспрессирующий тант и нетрансфектантные клетки Р815, покрыСЗ-4-трансфектант Иммунизация мышей BALB/c тые гидролизованнои щелочью р-галактозидазой растворимым р-гал давал фоновый иммунный Растворимая р- галактоз ид аза индуцирует ЦТЛ, ЦТЛ-ответ Поэтому для определения специфи 19 имеющие специфичность, схожую со специфичностью ЦТЛ при иммунизации в АК(фиг 2) Пример 3, Эффекторы ЦТЛ являются CD88Т- клетка ми То, что растворимые белковые антигены в АК индуцируют СО8*-эффекторы-Т-клетки, было показано следующим образом Спленоциты от иммунизированных мышей культивировали в течение пяти дней с облученными трансфектантами in vitro После этого времени клетки собирали и истощали на CD4* - или СО8*-Т-клетки , используя моноклональные антитела против CD4 или CD8 плюс комплемент Истощенные популяции испытывали по сравнению с 1Cr-EG7-OBa в ова-системе или 51Сг-Р13 1 в р-гал-системе Данные, показанные на фиг 4, указывают, что в овасистеме истощение Т-клеток на CD8 отменяет цитотоксическую активность, присвоенную всей популяцией клеток-эффекторов Тем не менее, истощение популяции Т-клеток на CD4* не оказывает действия на лизис EG7-OBa Аналогично в р-гал-системе обеднение Тклеток на CD8* отменяет цитолитическую активность клеток селезенки, иммунизированных ргал-антигенной композицией Пример 4 Растворимый ова в AF примирует С D8*-T- клетки Для демонстрации того, что система ова-АК примирует популяции CD8*-Т-клеток in vivo и что она критическая для вторичной иммунной реакции in vitro, селезенки иммунизированных ова-АК мышей и нативных мышей истощали на популяции CD44 и CD88 Эти обработанные популяции затем стимулировали in vitro только EG7-OBa или EG7-OBa в комбинации с CD4* и С08*-Т-клетками мышей, иммунизированных ова-АК, или с различными комбинациями CD4* или СО8*-Т-клеток мышей, иммунизированных ова-АК, с CD4* и С08*-клетками нативных мышей Фиг 5 показывает, что праймированные С08*-клетки важны для проявления вторичного иммунного ЦТЛответа in vitro Эти данные показывают также, что для эффективного вторичного иммунного ЦТДответа in vitro требуются С04*-Т-клетки CD4*-Tклетки не нужны для примирования Аналогично, С08*-Т-клетки были нужны для демонстрации ргал-специфического вторичного иммунного ЦТЛответа in vitro Приведенные выше примеры показывают влияние антигенной композиции на индукцию иммунного ответа в виде рестриктированных по классу I ЦТЛ против растворимых белковых антигенов Медиированный антигенной композицией растворимый антиген индуцировал примирование ЦТЛ и оно сходно по активности с примированием, индуцированным трансфектантами и спленоцитами, цито плаз мати чески нагруженными растворимым ова или р-гал В овальбуминовой системе, EG7-OBa, цито плаз мати чески нагруженные ова слленоциты и ова-АК индуцировали (а) рестриктированные СО8*-ЦТЛ класса I, (b) ЦТЛ, которые распознают мишень, сенсибилизированную синтетическим пептидом ова 253 - 276, и (с) долгоживущие ЦТЛ только после одной иммунизации В р-галактозидазной системе р-гал-АК индуцировал ЦТЛ, которые 49814 20 распознают р-гал-экспрессирующий трансфектант СЗ-4 и также нетрансфектированные клетки Р815, сенсибилизированные р-гал, гидролизованный щелочью То есть аналогично тому, что наблюдали с ЦТЛ, индуцированными иммунизацией клетками селезенки, цито плаз мати чески загруженными р-галактозидазой Индукция оваспецифических ЦТЛ антигенной композицией необычна, поскольку ни ова, капсулированный в рН - чувствительную липосому, ни квасцы не могут индуцировать примирование ЦТЛ in vivo Эти примеры показывают, что используемая выше антигенная композиция и ее эквиваленты, полезные в терапии человека и в разработке вакцины для индукции ЦТЛ в разных видах рака и вирусных болезнях Пример 5 Это специфический пример для показа использования вышеуказанной АК для продуцирования рестриктированных ЦТЛ класса I, праймируемых растворимым др120 из ВИЧ Экспрессирующая др120ШВ клеточная линия(15 - 12) была продуцирована в полученной из фибробластов мышей Balb/c клеточной линии ЗТЗ Ее получали от Drs Ron Germain and Jay Berzofsky, National Institute of Health, Bethesda, M D Экспрессирующую gp160 клеточную линию использовали для стимуляции in vitro примированных in vivo лимфоцитов селезенки и использовали также в качестве мишени для индукции др160 - специфичных ЦТЛ Мышей Balb/c иммунизировали один раз Юмкг др160 на мышь с АК или без нее Мышей инъецировали в подушечки лапок и основание хвоста подкожно Клетки селезенки брали у иммунизированных мышей через две недели после иммунизации и стимулировали in vitro облученными gp160трансфектантами После пяти дней культивирования in vitro примировали оценивали по присутствию специфических эффекторов, способных лизировать др160-трансфектанты, но не нетрансфектированные клеточные линии Результаты приводятся на фиг 7, где иммунные ЦТЛответы потенциировали АК и дг120 Следующий пример демонстрирует использование антигенных композиций этого изобретения с использованием только одного или двух компонентов Эти примеры показывают, что иммунные ЦТЛ-ответы можно индуцировать только двумя из указанных выше трех компонентов Пример 6, Определение критических компонентов, необходимых для индукции ЦТЛ Для определения того, все ли указанные выше компоненты необходимы для индукции антиген-специфичных ЦТЛ, мышей иммунизировали овальбумином в микрофлюидизированной композиции различных комбинаций двух из трех компонентов, присутствующих в указанных выше АК Используемые комбинации двух компонентов были следующими скваланл'вин в PBS, сквалан/плуроник в PBS или плуроник/гвин в фосфатно - буферном растворе Включали другую серию групп, где мышей иммунизировали ова в однокомпонентной композиции, т е композиции только сквалана в фосфатно - буферном растворе, плуроника в PBS или твина в фосфатно - бу 49814 22 21 ферном растворе Указанную выше трехкомпочто овальбумин в композиции микрофлюидизинентную антигенную композицию модифициророванной двухкомпонентной системы может вали для исключения одного компонента, однопримировать ова-специфические ЦТЛ in vivo временно заменяя его на фосфатно - буферный Мы далее оценивали относительный вклад раствор индивидуальных компонентов в их способность индуцировать ЦТЛ при комбинировании с белкоУказанные выше антигенные композиции совыми антигенами Для целей иммунизации расстоят из 0,300г твина 80(Aldnch, WI), 1,875г плутворимый антиген смешивали с микрофлюидироника L121 (BASF, NJ) и 7,5г сквалана(АИпсгі, зированными наполнителями для получения WI), объем композиции доводили до 50мл достабильной гомогенной эмульсии с пределами бавлением фосфатно - буферный раствор размера частиц 250 - ЗООнм Для дальнейшего Двухкомпонентные композиции были определения компонентов композиции скваланСкваланл'вин 0,300г твина 80 и 7,5г сквалатвин 80-плуроник(СТП), ответственных за индукна, объем композиции доводили до 50мл добавцию ЦТЛ, иммунизировали мышей ова в смеси лением фосфатно - буферного раствора сквалан-твин 80(СТ), смеси плуроник-твин 80(ПТ) Плуроник/гвин 1,875г плуроника L121 и или смеси сквалан-плуроник(СП) и в качестве 0,300г твина 80, объем композиции доводили до контроля в сквалане(С), твине 80(Т) или плуро50мл добавлением фосфатно - буферного раснике(П) Мышей также иммунизировали оватвора ЗАРт(содержал 70мг МДП) или ова-квасцы в Плуроник/сквалан 1,875г плуроника L121 и качестве адъювантного контроля Для положи7,5г сквалана, объем композицию доводили до тельного контроля мышей иммунизировали клет50мл добавлением фосфатно - буферного расками селезенки, цито плаз мати чески наполнентвора ными растворимым ова Использовали также Образцы затем пропускали через микродругие комбинации и замещения, результаты флюидизатор, модель 110Т, Microfluidics corp , приводятся в Таблице 1 разливали по сосудам и хранили при 4°С до использования Для определения примирования ЦТЛ мышей иммунизировали один раз Через две недели Овальбумин(3ідта, МО) взвешивали и полупосле иммунизации клетки смешивали с облучали раствор его концентрации 0,Змг/мл в ченными ЕС7-ова(ова-экспрессирующими EL4CCPXfWhittaker, смотри выше) Исходный расклетками) в течение пяти дней и тестировали по твор 0,Змг/мл комбинировали с двухкомпонентсравнению с 51Cr-EG7-OBa или 51Сг-Е1_4ной композицией в следующих количествах клетками Результаты(фиг 11) показывают, что 5частей раствора овальбумина концентрации ЗОмкг ова в комбинации с СТП или СТ примируют 0,Змг/мл, З.Зчасти двухкомпонентной композиции иммунный ответ рестриктированных по классу I и 1,7части ССРХ ЦТЛ в мышах Примирование ова-специфических Композицию интенсивно перемешивали и ЦТЛ ова в СТП или ова в СТ, по-видимому, лучвыдерживали на льду до инъецирования Все ше, чем примирование, индуцированное клеткарастворы смешивали непосредственно перед ми селезенки, цито плаз мати чески загруженными инъекцией растворимым ова Ова в ПТ или в СП может инКаждая мышь получала 200мкл одной комподуцировать ова-специфичный иммунный ЦТЛзиции, содержащей ЗОмкл ова, инъекцией в поответ у мышей, но ответ нестойкий и недостадушечки обеих задних лап и любое оставшееся точный Подобно SAFm, добавление МДП в комколичество раствора инъецировали подкожно в позицию СТ не компрометирует оваоснование хвоста Мышей оставляли для отдыха специфическую индукцию ЦТЛ у мышей(Таблица в течение от двух до четырех недель до отбора 2) Никакой ова-специфической индукции ЦТЛ не клеток селезенки было, когда мышей индуцировали ова в смеси с Через две недели после иммунизации полуиндивидуальными компонентами С, П или Т, ни чали клетки селезенки и стимулировали in vitro когда мышей иммунизировали ова-SAFm или облученным EG7-OBa Через пять дней после ова-квасцы Мыши, иммунизированные вплоть до культивирования присутствие ова1мг ова в (а) ССРХ, в (b) SAFm или (с) адсорбиспецифических ЦТЛ измеряли испытанием по рованного на квасцах, не примировали ова51 51 сравнению с Cr-EG7-OBa или Сг-Е1_4 в специфичные ЦТЛ 51 4часовом анализе на выделение Сг Результаты, показанные на фиг 8 - 1 0 , демонстрируют, 23 49814 24 Таблица 2 Индукция ова-специфичного иммунного ЦТЛ-ответа не блокируется СТ + МДП Стимулятор EG7-OBa % цитотоксичности в мышах, иммунизированных* ова-СТ-МДП Мишень** С-М Ова - СТ Ова - СТ ЗООмг/мышь EG7-OBa 100 1 0 100 82 33 1 0 86 67 11 1 0 33 39 3 1 0 6 13 1 1 0 0 0 3 1 0 0 0 *Мышей иммунизировали ЗОмкг ова в различных композициях **Процент цитотоксичности рассчитывали с учетом процентного киллинга по сравнению с неэкспрессирующими антиген клеточными линиями Пример 7 Компоненты, необходимые для продуцирования ова-специфических антител Мыши были иммунизированы три раза с интервалами две недели ЗОмкг ова в ССРХ, СТП, СТ, ПТ или СП В качестве положительного контроля мыши были иммунизированы ова-SAFm, так ова-СТ-МДП 72мг/мышь 76 62 25 3 0 0 как известно, что SAFm индуцирует сильную гуморальный иммунный ответ Через семь дней после второй и третьей иммунизации мышам делали кровопускание и сыворотку испытывали на оваспецифичный гуморальный иммунный ответ Результаты приводятся в таблице 3 Они показывают, что мыши, иммунизированные ова в СТП, СР или в SAFm, показывают похожие гуморальные иммунные ответы против ова после двух иммунизации Таблица 3 Индукция гуморального иммунного ответа против ова Композиция ЗОмкг ова/животное ССРХ СТП СТ ПТ СП SAF-m Число мышей реагирующих/число мышей инъецированных 0/3 3/3 3/3 нд НД4 3/3 *НД - недоступный Пример 8 Индукция ЦТЛ специфических для др120ВИЧ Gp120 NIB ВИЧ использовали в качестве второй антигенной системы для определения индукции ЦТЛ в СТП, СТ или в МП-Т Мыши были иммунизированы 1мкг gp120 Nib в ССРХ, СТП, РТ или в СТ В качестве контрольных опытов мыши были иммунизированы 1мкг др120 ІІІЬ в SAFm или ПАФ(полный адъювант Фрейнда) или в RIBIадъювантной системе, содержащей МФЛ(монофосфориллипид А) и ДМТ(димиколит трегалозы) Через три недели после иммунизации 1/разбавление(титр) сыворотки < 1/20, < 1/20, < 1/20 1/4860, 1/4860, > 1/4860, > 1/4860 нд, нд, нд нд, нд, нд 1/4860, 1/4860, 1/48600 приготовляли клетки селезенки и стимулировали in vitro обработанными митомицином клеткамитрансфектантами 1 5 - 1 2 или пептидом 18111b После пятидневного культивирования получаемые клетки-эффекторы испытывали по сравнению с коровья оспа gp160 IIIB или родоначальными инфицированными коровьей оспой клетками Р815 в качестве мишеней Результаты показывают, что композиция др120-сквалан-твин 80 и композиция не др120-сквалан-твин 80-плуроник или др120ССРХ индуцировали др120-специфический иммунный ЦТЛ-ответ у мышей(таблица 4) Таблица 4 Индукция др120-специфического иммунного ЦТЛ-ответа у мышей Стимулятор 18lllb/IL-2 % цитотоксичности у мышей, иммунизированных* Мишень** С-М дг120-ССРХ др120-СТ вак др120 100 1 23 42 33 1 23 38 11 1 0 0 др120-СТП НД*** НД НД 25 49814 26 Продолжение таблицы 4 Индукция др120-специфического иммунного ЦТЛ-ответа у мышей Стимулятор 18lllb/IL-2 18lllb/IL-2 15-12 % цитотоксичности у мышей, иммунизированных* Мишень** С-М дг120-ССРХ др120-СТ 3 1 0 35 15-12 100 1 0 50 33 1 0 35 11 1 0 27 3 1 0 18 ЗТЗ+ 18111b 100 1 0 59 33 1 0 59 11 1 0 57 3 1 0 29 вак др120 100 1 35 84 33 1 19 65 11 1 12 37 3 1 0 22 1 1 0 0 *Мыши были иммунизированы 1мкг gp120lll в разных композициях **% цитотоксичность рассчитывали с учетом процента киллинга по сравнению с неэкспрессирующими антиген клеточными линиями ***НД - недоступен Пример 9 Индукция дг120-специфического гуморального иммунного ответа у мышей Для индукции др12-специфических гумораль др120-СТП НД 0 0 0 0 13 2 0 0 НД НД НД НД НД ных иммунных ответов мыши были иммунизированы 1мкг др120ШЬ три раза с интервалами две недели Животным пускали кровь и испытывали на присутствие антител IgG, детектирующих gp120lllb, анализом ELISA Результаты показывают, что др120-СТ является лучшим иммуногеном, чем др120-ССРХ, др120-ЗАРт(таблица 5) или др120-СТП Таблица 5 Индукция гуморального иммунного ответа против др120 Композиция 1мкг др120/животное HBSS СТП СТ ПТ СП SAF-m Число мышей реагирующих/число мышей инъецированных 0/3 1/3 3/3 3/3 2/3 2/3 Пример 10, др120-специфические гуморальные иммунные ответы у обезьян Обезьян(две на группу) были иммунизированы gp120-SAFm, др120-СПТ, др120-СТ или др120ССРХ В качестве контроля группу обезьян иммунизировали рекомбинантной коровьей оспой, содержащей gp160lllb Обезьян иммунизировали с интервалами две недели и кровь отбирали через две недели и три недели после второй иммунизации Пре - и иммунную сыворотки каждой обезьяны серийно разбавляли и анализировали на активность против gp120 no ELISA, как описано в материалах и способах Данные(фигура 12) показывают, что обезьяны, иммунизированные др120СТП или gp120-SAFm, индуцировали схожие иммунные ответы Одна обезьяна, иммунизированная др120-СТ, индуцировала гуморальный иммунный ответ против др120, похожий на ответ группы, иммунизированной gp120-SAFm или др120-СПТ Одна обезьяна, иммунизированная др120-СТ, индуцировала сильный гуморальный иммунный от 1/разбавление(титр) сыворотки < 1/20, < 1/20, < 1/20 1/4860, 1/4860, > 1/4860, > 1/4860 > 1/4860,> 1/4860, > 1/4860 1/20, 1/540, 1/540 1/180, > 1/4860, 1/540 вет против др120 после двух иммунизации Пример 11 Активность АК in vivo в комбинации с белком Е7 16 ВИЧ 1 Генерация рекомбинантного белка Е7 16 ВИЧ для иммунизации a) PCR и клонирование гена Е7 Ген Е7 16 ВИЧ клонировали из плазмиды, полученной от Dr Raren Vousden(Ludwig Institute), кодирующей ген Е7, полученной из клеточной линии карциномы CaSki Кодирующие области были амплифицированы PCR с использованием праймеров, которые кодируют 5' - и 3' - концы генов, фланкированных клонирующими сайтами Bam HI и Sal I Продукт Е7 PCR лигировали в экспрессирующий вектор pGEX-4T-1 (Pharmacia Biotech), получая экспрессирующую плазмиду pGEX E7 Штамм Е coli XLI - голубой(стратаген) трансфектировали экспрессируюицей плазмидой pGEX E7 Последовательность Е7 получали из плазмид образующихся колоний, она была идентична последовательности Е7, полученной из клеток CaSki 27 49814 b) Получение и очистка бактериально экспрессированного Е7 Бактериальная экспрессирующая плазмида pGEX Е7 кодирует слитый белок глутатион-Sтрансферазы(СЗТ), состоящий из GST у аминоконца, сайта расщепления тромбинпротеазы и белка Е7 у карбоксиконца Белок Е7 получали и очищали, как описано в информационной литературе к продукту от производителя вектора pGEX4Т-1 (Pharmacia Biotech) Говоря кратко, бактерии, содержащие вектор экспрессии pGEX E7, индуцировали для экспрессии слитого белка добавлением в культуральную среду изопропил-p-Dтиогалактозидазы Клетки собирали и лизировали мягкой ультразвуковой обработкой Лизат вводили в глутатионсефарозу 4B(Pharmacia Biotech) После связывания слитого белка с матрицей смолу промывали для удаления неспецифически связанных белков Связанный слитый белок гидролизовали тромбином для выделения белка Е7 из слитого белка глутатион-З-трансферазы (GST) Препарат белка Е7 анализировали SDS-PAGE и концентрацию белка Е7 определяли анализом Bradforda(BioRad) На литр бактериальной культуры получали 9мг растворимого белка Е7 2 Генерация трансфектанта Е7 Х21 Кодирующие последовательности для белка HPV16 Е7(смотри выше) были встроены в патентованную DEC эукар йоти чес кую экспрессирующую плазмиду INPEP4 В пределах этого вектора экспрессия Е7 контролировалась промотор/энхансерными транскрипциональными элементами цитомегаловируса Кроме того, первые три нуклеотида кодирующей последовательности Е7 были удалены и заменены лидерной последовательностью легкой цепи иммуноглобулина, помещенной непосредственно против входа(слева) и в рамки считывания с кодирующим районом Е7 После трансфекции в мышиную клеточную линию Х21 отдельные С418-резистентные клоны испытывали при помощи нозернблоттингов на образование матрицы Е7 Каждый клон обнаруживал детектируемую матрицу Е7 Затем выполняли вестерн-блоттинг клеточных лизатов двух из этих клонов, 4Е7 и 1С7(НОРЕ1 и НОРЕ2 соответственно) и показали образование белка Е7 3 Активность in vivo иммунизации растворимым антигеном Е7/АК В этих исследованиях использовали самок К/К мышей фона СЗН(Н2 , Harlan Sprague Dawley) Животных содержали в соответствии с "Руководством для наблюдения за лабораторными животными и их использованию"[ОННЗ Publication No NIH 86 - 23, Bethesda, MD NIH, 1985], они получали корм и воду по потребности В этих исследованиях использовали трансфекцированную Е7 клеточную линию(НОРЕ2 Н2Ю ) Опухолевую клеточную линия сохраняли серийным пассированием in vitro Было показано, что эта клеточная линия сохраняет Е7 - цитоплазматическую антигенную экспрессию, определяемую анализом вестернблоттингом, после повторения пассивирований in vitro Опухоли инициировали у сингенных мышей СЗН подкожной инъекцией 150000 пассированных in vitro клеток 28 Опухоли измеряли в двух перпендикулярных направлениях с интервалами в две недели Объем опухоли(\/) рассчитывали в соответствии со следующей формулой У(мм ) = (LxW2), деленная на 2, где L = длине самой длинной оси, измеренной в мм, W = длине перпендикулярной оси(мм) Данные в Таблице 6 представляют как опухолевые мыши(число имеющих опухоли животных по сравнению с общим числом инъецированных животных) Данные в фигурах 13 и 14 представляют как средний размер опухоли(мм3) каждой обработанной или контрольной группы Каждую обработанную группу сравнивали с контрольной группой, которая не получала лечения Терапию начинали через Юдней после инокуляции клеток НОРЕ2, когда основная часть опухолей была пальпируемой(приблизительно 50 - 75мм2) Терапию инициировали иммунизацией мышей растворимым белком Е7 в АК или квасцахадъювантах(подкожно при общем объеме 0,2мл) Непосредственно перед иммунизацией АК смешивали в течение бОсекунд с белком Е7 в сбалансированном солевом растворе Хэнкса(ССРХ), так чтобы каждая мышь получала либо ЗОмкг, либо 90мкг белка Е7 в 0,2мл Квасцьі(Ріегсе Chemical Со) смешивали с белком Е7 в соответствии с инструкциями по приготовлению, так чтобы каждое животное получало 90мкг белка Е7 в 0,2мл Животные в группе второй обработки получали вторую иммунизацию через 9дней(19дней после инокуляции опухолевых клеток) Бустер-иммунизацию проводили непосредственно перед инокуляцией, как описано выше В этом примере(Таблица 6 Хр #233) через 41 день после инокуляции опухолевых клеток только 4/8 и 5/8 мышей, получивших одну инъекцию растворимого Е7 в АК(30мкг или 90мкг соответственно), имели измеримые опухоли Напротив, все из мышей, иммунизированных белком Е7 в квасцах(8/8) имели активно растущие опухоли Дополнительно, как показано на Фигуре 13, значительное ингибирование роста опухоли наблюдали только в группах обработки, иммунизированных белком Е7 в АК, по сравнению с контрольными(необработанными) или обработанными квасцами группами Ингибирование роста опухоли(Фигура 13) или повышенные скорости регресса опухоли(таблица 6) не наблюдали у мышей, которые получали одну инъекцию Е7 в квасцах Похожие результаты наблюдали также, используя группы обработки, которые получали две иммунизации, на 10 и 19день после контрольного заражения опухолью(таблица 6 и фигура 14), хотя некоторое замедление роста опухоли наблюдали у мышей, получивших две инъекции Е7 в квасцах Результаты показывают, что значительную противоопухолевую активность, измеряемую пониженным числом имеющих опухоли мышей, и ингибирование роста опухоли наблюдали после иммунизации растворимым Е7 в АК Наоборот, все животные, иммунизированные одной или двумя инъекциями растворимого белка Е7 в квасцах, имели растущие опухоли Говоря кратко, иммунизация растворимым белком Е7 в АК привела к значительному ингибированию роста опухолевых 29 49814 ЗО клеток, что не наблюдали при использовании иммунизации растворимым Е7 в квасцах Таблица 6 Противоопухолевая активность иммунизации растворимым Е7 в адъюванте №эксперимен 223 223 223 223 223 223 223 Обработка Контрол Е7вАК Е7вАК Е7 в квасц Е7вАК Е7вАК Е7 в квасц а Число имеющих опухоли мышей/общее число инокулированных мышей b Все иммунизации начинали на 10день после имплантации Доза(мкг/мышь) 30мкгх1° ЭОмкгх 1 ЭОмкгх 1 е ЗОмкг х 2 ЭОмкгх 2 ЭОмкгх 2 а Опухолевые животные 41 день 7/8 4/8 5/8 8/8 3/8 1/4 8/8 с Вторая иммунизация(х 2) на 19день после имплантации Другие воплощения изобретения находятся в пределах следующей формулы изобретения ІНМШ 31 49814 їіг 2Е 32 33 49814 34 р у м я н е й Miaj&JJii'f 11 35 49814 36 4 ' '|3 ' їН8 ЗУ ФІГ ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 НІ!