Антитіло, яке специфічно зв’язується з р-селектин-глікопротеїновим лігандом-1 людини

Реферат: Винахід належить до антитіла, яке специфічно зв'язується з Р-селектин-глікопротеїновим лігандом-1 людини (PSGL-1) без перешкоджання зв'язуванню між Р-селектин-глікопротеїновим лігандом-1 та Р-селектином, причому зазначене антитіло після зв'язування з Р-селектинглікопротеїновим лігандом-1 на активованій Т-клітині викликає смерть активованої Т-клітини. Винахід також належить до виділеної нуклеїнової кислоти, вектора, клітини-хазяїна, фармацевтичної композиції та застосування ефективної кількості антитіла у виготовленні лікарського засобу для модулювання опосередкованої Т-клітинами імунної відповіді у суб'єкта. UA 100356 C2 5 10 15 20 25 30 Ця заявка заявляє пріоритет Попередньої заявки США № 60/569,892, поданої 10 травня 2004 р., зміст якої включено шляхом посилання у повному обсязі. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Надмірно агресивні T-клітини часто призводять до небажаних імунних реакцій, які, у свою чергу, викликають різні порушення, наприклад, аутоімунні хвороби, відторгнення трансплантатів, алергічні хвороби та зумовлені T-клітинами ракові захворювання. Таким чином, контроль над агресивними T-клітинами є важливим для лікування таких порушень. Активність цих клітин може стримуватися шляхом імуносупресії або шляхом викликання імунологічної толерантності. Альтернативним рішенням є викликання апоптозу, який вважають таким, що бере участь у видаленні небажаних клітин, включаючи надмірно агресивні T-клітини. Див., наприклад, Kabelitz et al. (1993) Immunol Today 14, 338-340; і Raff (1992) Nature 356, 397-399. Короткий опис винаходу Винахід стосується антитіл та їх похідних, які викликають апоптоз після зв’язування з Рселектин-глікопротеїновим лігандом-1 (PSGL-1) в активованих T-клітинах. В одному аспекті винахід стосується імуноглобулінового ланцюга, який має три послідовності, які (i) містять, відповідно, RSSQSIVHNDGNTYFE, KVSNRFS та FQGSYVPLT (SEQ ID NOs: 1-3); (ii) містять, відповідно, SFGMH, YINGGSSTIFYANAVKG та YASYGGGAMDY (SEQ ID NOs: 4-6); (iii) містять, відповідно, RASSTVNSTYLH, GSSNLAS та QQYSGYPLT (SEQ ID NOs: 7-9); (iv) містять, відповідно, AYYIH, VNPNTGGTSYNPKFKG та SGSPYYRYDD (SEQ ID NOs: 1012); (v) містять, відповідно, RSSQSIVNSNGNTYLE, KVSNRFS та FQGSHVPWT (SEQ ID NOs: 1315); або (vi) містять, відповідно, TNAMNWVRQAPGKGLE, TYYADSVKD та GGSYWYFDV (SEQ ID NOs: 16-18). Кожен із щойно описаних наборів послідовностей відповідає трьом легко- або важколанцюговим ділянкам визначення комплементарності (CDR) антитіла, яке зв’язується з PSGL-1, таким як ділянки трьох антитіл мишей 15A7, 43B6 та 9F9, описаних нижче у прикладі. Нижче показано легкі ланцюги та важколанцюгові мінливі (V) ділянки цих трьох антитіл (SEQ ID NOs: 19-26, CDR є підкресленими і виділеними кольором: SEQ ID NO: 19 (легколанцюгова V-ділянка миші 15A7): SEQ ID NO: 20 (важколанцюгова V-ділянка миші 15A7): 1 UA 100356 C2 SEQ ID NO: 21 (легколанцюгова V-ділянка миші 43B6): 5 SEQ ID NO: 22 (важколанцюгова V-ділянка миші 43B6): SEQ ID NO: 23 (легколанцюгова V-ділянка миші 9F9): 2 UA 100356 C2 SEQ ID NO: 24 (важколанцюгова V-ділянка миші 9F9): 5 10 Оскільки антиген-зв’язувальна специфічність антитіла визначається його легко- та важколанцюговими CDR, вищеописані CDR можуть застосовуватися для утворення похідних антитіл, які зберігають антиген-зв’язувальну специфічність. Прикладами похідних антитіл є химерні антитіла, олюднені антитіла та їхні функціональні еквіваленти. Нижче показано легколанцюгову V-ділянку (SEQ ID NO: 25) та важколанцюгову V-ділянку (SEQ ID NO: 26) олюдненого антитіла 15A7, які включають SEQ ID NOs: 1-3 та SEQ ID NOs: 4-6, відповідно: SEQ ID NO: 25 (легколанцюгова V-ділянка олюдненого 15A7): SEQ ID NO: 26 (важколанцюгова V-ділянка олюдненого 15A7): 15 20 Цей винахід також стосується виділеної нуклеїнової кислоти, яка має послідовність, яка кодує один з вищеописаних імуноглобулінових ланцюгів. Термін "антитіло" або "імуноглобуліновий ланцюг" стосується виділеного поліпептиду, тобто поліпептиду, який був по суті відокремлений від інших білків, ліпідів та нуклеїнових кислот, з якими він є пов’язаним у природі. Поліпептид може складати принаймні 50, 70 або 95% сухої маси очищеної композиції. Термін "виділена нуклеїнова кислота" стосується нуклеїнової кислоти, структура якої не є ідентичною структурі будь-якої природної нуклеїнової кислоти або структурі будь-якого фрагмента природної геномної нуклеїнової кислоти. Таким чином, термін охоплює, наприклад, (a) ДНК, яка має послідовність частини природної молекули геномної ДНК, але не межує з 3 UA 100356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обома з кодуючих послідовностей, які оточують з боків частину молекули у геномі організму, в якому вона трапляється у природі; (б) нуклеїнову кислоту, включену у вектор або у геномну ДНК прокаріота або еукаріота таким чином, щоб одержана в результаті молекула не була ідентичною будь-якому природному вектор геномній ДНК ; (в) окрему молекулу, таку як кДНК, геномний фрагмент, фрагмент, одержаний шляхом полімеразної ланцюгової реакції (PCR), або рестрикт; і (г) рекомбінантну нуклеотидну послідовність, яка є частиною гібридного гена, тобто гена, який кодує злитий білок. Нуклеїнову кислота згідно з цим винаходом застосовують для експресії поліпептиду згідно з цим винаходом. Для цього можна функціонально з’єднувати нуклеїнову кислоту з прийнятними регуляторними послідовностями для утворення вектора експресії. Вектор стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона є зв’язаною, а також здатної до самостійної реплікації або об’єднання з хазяйською ДНК. Прикладами можуть бути плазмідний, космідний та вірусний вектор. Вектор згідно з цим винаходом включає нуклеїнову кислоту у формі, прийнятній для експресії нуклеїнової кислоти у клітині-хазяїні. В оптимальному варіанті вектор включає одну або кілька регуляторних послідовностей, функціонально з’єднаних з нуклеїновокислотною послідовністю, яка підлягає експресії. Прикладами регуляторної послідовності є промотори, енхансери та інші елементи контролю експресії (наприклад, сигнали поліаденілування). До регуляторних послідовностей також належать ті, які спрямовують конститутивну експресію нуклеотидної послідовності, а також тканинно-специфічні регуляторні та/або індуцибельні послідовності. В основі побудови такого вектора експресії лежать чинники, до яких належать вибір клітинихазяїна, що підлягає перетворенню, та потрібний рівень експресії. Вектор експресії може бути введений у клітини-хазяї для створення поліпептиду згідно з цим винаходом. Цей винахід також охоплює клітину-хазяїна, яка містить вищеописану нуклеїнову кислоту. Термін “клітина-хазяїн” стосується клітини, яка містить екзогенну кодуючу послідовність або некодуючу послідовність. Екзогенну послідовність вводять у клітину шляхом трансфекції фосфатом кальцію, опосередкованої DEAE-декстраном трансфекції або електропорації. Придатними клітинамихазяями є бактеріальні клітини (наприклад, E. coli, Bacillus subtilis та Salmonella typhimurium), клітини дріжджів (наприклад, Saccharomyces cerevisiae та Schizosaccharomyces pombe), рослинні клітини (наприклад, Nicotiana tabacum та Gossypium hirsutum) і клітини ссавців (наприклад, клітини гібридоми мишей, клітини CHO та 3T3 фібробласти). Для створення імуноглобулінового ланцюга згідно з цим винаходом можна помістити клітину-хазяїн у культуру за умов, які дозволяють експресію поліпептиду, який кодується вищеописаною нуклеїновою кислотою, і відокремити поліпептид від культури. В альтернативному варіанті нуклеїнова кислота згідно з цим винаходом може бути транскрибована й трансльована in vitro, наприклад, із застосуванням регуляторних послідовностей T7 промотора та T7 полімерази. Обсяг цього винаходу охоплює антитіло. Воно утворюється з першого імуноглобулінового ланцюга та другого імуноглобулінового ланцюга, які містять, відповідно, легколанцюгові CDR та важколанцюгові CDR антитіла миші 15A7, 43B6 або 9F9, як згадувалося вище. В оптимальному варіанті це антитіло утворюється легким та важким ланцюгами 15A7. Обсяг цього винаходу також охоплює інше антитіло, яке (i) специфічно зв’язується з Рселектин-глікопротеїновим лігандом 1 без перешкоджання зв’язуванню між Р-селектинглікопротеїновим лігандом 1 та P-селектином і, (ii) після зв’язування з Р-селектинглікопротеїновим лігандом 1 на активованій T-клітині, викликає смерть T-клітини. В одному варіанті втілення це антитіло специфічно зв’язується з людським Р-селектин-глікопротеїновим лігандом 1. Обсяг цього винаходу також охоплює ще одне антитіло, яке специфічно зв’язується з амінокислотними залишками 115-126 зрілого людського Р-селектин-глікопротеїнового ліганду 1. В оптимальному варіанті антитіло специфічно зв’язується з амінокислотними залишками 117123. У ще кращому варіанті воно специфічно зв’язується з амінокислотними залишками 119121, консенсусною послідовністю з-поміж усіх випробуваних епітопів. Дійсно, мутація одного або кількох із цих трьох амінокислотних залишків виключає зв’язування з антитілом. В одному прикладі це антитіло після зв’язування з Р-селектин-глікопротеїновим лігандом 1 на активованій T-клітині викликає смерть активованої T-клітини. В одному варіанті втілення одне з двох щойно згаданих антитіл утворюється легким ланцюгом та важким ланцюгом, які містять, відповідно, SEQ ID NOs: 1-3 та SEQ ID NOs: 4-6 (наприклад, SEQ ID NOs: 19 та 20 або SEQ ID NOs: 25 та 26). В іншому аспекті винахід стосується способу викликання смерті активованої T-клітини. Спосіб включає контакт одного з трьох описаних вище антитіл з активованою T-клітиною, згідно 4 UA 100356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з яким зв’язування антитіла з активованою T-клітиною викликає смерть клітини. Винахід також стосується способу модулювання опосередкованої T-клітинами імунної реакції у суб’єкта. Спосіб включає (1) визначення суб’єкта, який має, або у якого існує ризик наявності стану, пов’язаного з надмірною опосередкованою T-клітинами імунною реакцією, та (2) введення суб’єктові ефективної кількості одного з трьох описаних вище антитіл. Термін "надмірна опосередкована T-клітинами імунна реакція" стосується реакції, викликаної надмірним рівнем активованих T-клітин. Надмірний рівень стосується (1) рівня, вищого за нормальний рівень, та (2) рівня, вищого за потрібний рівень у суб’єкта, навіть якщо він не є більшим за нормальний рівень. Прикладами такого стану є запальна хвороба, аутоімунна хвороба, алергічна хвороба або T-клітинний рак, а також ситуація, за якої суб’єкт отримав або розглядається як такий, що отримав алогенний або ксеногенний трансплантат. Деталі одного або кількох варіантів втілення винаходу викладено нижче у супровідному описі. Інші особливості, цілі та переваги винаходу стануть зрозумілими з детального опису. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС В основі цього винаходу, принаймні частково, лежить несподіване виявлення того, що активовані T-клітини можуть зазнати апоптозу та виснаження через зв’язування антитіл або їхніх похідних з PSGL-1 на активованих клітинах. Антитіла та похідні є корисними для лікування станів, пов’язаних з надмірною або небажаною опосередкованою T-клітинами імунною реакцією або проліферацією T-клітин. Відповідно, винахід стосується поліпептидів, які містять імуноглобулінові легко- або важколанцюгові CDR антитіл проти PSGL-1, а також нуклеїнові кислоти, які їх кодують. Імуноглобулінові ланцюги та нуклеїнові кислоти можуть застосовуватися для утворення вищезгаданих антитіл та похідних. Імуноглобуліновий ланцюг згідно з винаходом одержують як синтетичний поліпептид або рекомбінантний поліпептид. Для одержання рекомбінантного поліпептиду нуклеїнова кислота, яка його кодує, може бути з’єднана з іншою нуклеїновою кислотою, яка кодує іншого учасника злиття, наприклад, глутатіон-S-трансферазу (GST), 6x-His-епітопну мітку, білок M13 гена 3 або імуноглобулінову важколанцюгову постійну ділянку. Одержана в результаті злита нуклеїнова кислота може бути введена у клітину для експресії білка. Злитий білок може бути відокремлений від клітини-хазяїна способами, які є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі. Виділений злитий білок піддають подальшій обробці, наприклад, шляхом ферментного гідролізу, для видалення іншого учасника злиття і отримання потрібного рекомбінантного поліпептиду. В альтернативному варіанті імуноглобуліновий ланцюг може бути одержаний з прийнятної клітини-хазяїна шляхом активації ендогенної експресії нуклеїнової кислоти, яка кодує ланцюг. Амінокислотний склад імуноглобулінового ланцюга згідно з винаходом може змінюватися без перешкоджання здатності до утворення антитіла, яке може зв’язуватися з PSGL-1. Наприклад, такий варіант може містити одне або кілька консервативних заміщень амінокислот. "Консервативне заміщення амінокислот" є заміщенням, при якому амінокислотний залишок замінюється на амінокислотний залишок, який має подібний боковий ланцюг. Групи амінокислотних залишків, які мають подібні бокові ланцюги, було визначено спеціалістами. До цих груп належать амінокислоти з основними боковими ланцюгами (наприклад, лізином, агнініном, гістидином), кислотними боковими ланцюгами (наприклад, аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою), незарядженими полярними боковими ланцюгами (наприклад, гліцином, аспарагіном, глутаміном, серином, треоніном, тирозином, цистеїном), неполярними боковими ланцюгами (наприклад, аланіном, валіном, лейцином, ізолейцином, проліном, фенілаланіном, метіоніном, триптофаном), бета-розгалуженими боковими ланцюгами (наприклад, треоніном, валіном, ізолейцином) та ароматичними боковими ланцюгами (наприклад, тирозином, фенілаланіном, триптофаном, гістидин). Таким чином, передбачений замінний амінокислотний залишок у поліпептиді в оптимальному варіанті є заміненим на інший амінокислотний залишок з тієї самої групи бокових ланцюгів. В альтернативному варіанті мутації можуть бути введені випадково по всьому поліпептиду згідно з цим винаходом або по його частині, наприклад, шляхом насичувального мутагенезу, і одержані в результаті мутанти відбирають на здатність до утворення антитіла, яке може зв’язуватися з PSGL-1, для визначення варіантів цього винаходу, як описано нижче у прикладах. Таким чином, наприклад, термін "імуноглобуліновий ланцюг, який містить SEQ ID NO: 19", охоплює імуноглобулінові ланцюги, які містять варіанти SEQ ID NO: 19. Вищеописані імуноглобулінові ланцюги та варіанти застосовують для одержання антитіла згідно з цим винаходом або його похідних. Термін "антитіло" включає інтактні молекули, а також їх фрагменти, такі як Fab, F(ab')2, Fv, scFv (одноланцюгове антитіло) та dAb (антитіло з одним 5 UA 100356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 доменом; Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544). Похідна антитіла стосується білка або білкового комплексу, який має варіант поліпептиду згідно з цим винаходом. Антитіло або похідна згідно з цим винаходом одержують шляхом коекспресії відповідних легко- та важколанцюгових CDRвмісних поліпептидів у відповідній клітині-хазяїні, як описано нижче у прикладі. В альтернативному варіанті вони можуть бути одержані способами, відомими спеціалістам у галузі одержання моноклональних та поліклональних антитіл та фрагментів. Див., наприклад, Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Для одержання антитіла згідно з цим винаходом PSGL-1 або його антигенний фрагмент може бути з’єднаний з білком-носієм, таким як KLH, змішаним з ад’ювантом, і введений шляхом ін’єкції до організму тварини-хазяїна. Антитіла, вироблені в організмі цієї тварини, можуть бути очищені шляхом афінної хроматографії пептиду. До тварин-хазяїв, яких зазвичай використовують, належать кролі, миші, морські свинки та щури. Різні ад’юванти, які можуть застосовуватися для посилення імунологічної реакції, залежать від виду хазяїна, і до них належать ад’ювант Фройнда (повний і неповний), мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію, поверхнево-активні речовини, такі як лізолецитин, плюронік-поліоли, поліаніони, пептиди, олійні емульсії, гемоціанін молюска фісурелії та динітрофенол. Корисними людськими ад’ювантами є BCG (бацила Calmette-Guerin) та Corynebacterium parvum. Поліклональні антитіла, гетерогенні популяції молекул антитіла, є присутніми у сироватці імунізованих суб’єктів. Моноклональні антитіла, гомогенні популяції антитіл до конкретного антигена одержують, застосовуючи стандартну гібридомну технологію. Див., наприклад, Kohler et al. (1975) Nature 256, 495; Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6, 511; Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6, 292; і Hammerling et al. (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. Зокрема, моноклональні антитіла одержують будь-яким способом, який забезпечує вироблення молекул антитіла безперервними лініями клітин у культурі, як описано у Патенті США № 4,376,110; способом із застосуванням B-клітинної гібридоми людини (Kosbor et al. (1983) Immunol Today 4, 72; Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026) та способом із застосуванням EBV-гібридоми (Cole et al. (1983) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Такі антитіла можуть належати до будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, та будь-якого його підкласу. Гібридома, яка виробляє моноклональні антитіла згідно з винаходом може бути культивована in vitro або in vivo. Здатність до утворення високих титрів моноклональних антитіл in vivo робить цей спосіб вироблення особливо корисним. Крім того, можуть застосовуватися способи, розроблені для вироблення "химерних антитіл". Див., наприклад, Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; і Takeda et al. (1984) Nature 314, 452. Химерне антитіло є молекулою, в якій різні частини походять з різних видів тварин, таких як ті, що мають мінливу ділянку, взяту з моноклонального антитіла миші, та постійну ділянку людського імуноглобуліну. В альтернативному варіанті способи, описані для вироблення одноланцюгових антитіл (Патенти США №№ 4,946,778 та 4,704,692), можуть бути застосовані для створення бібліотеки фагів одноланцюгових Fv-антитіл. Одноланцюгові антитіла утворюють шляхом з’єднання важко- та легколанцюгових фрагментів ділянки Fv через амінокислотний місток. Крім того, фрагменти антитіл можуть бути утворені відомими способами. Наприклад, до таких фрагментів належать, крім інших, фрагменти F(ab')2, які можуть бути вироблені шляхом гідролізу пепсином молекули антитіла, та фрагменти Fab, які можуть бути утворені шляхом відновлення дисульфідних містків фрагментів F(ab')2. Антитіла також можуть бути олюднені способами, описаними нижче у прикладі або відомими спеціалістам у даній галузі. Наприклад, моноклональні антитіла з потрібною специфічністю зв’язування можуть бути олюднені у промисловому масштабі (Scotgene, Шотландія; і Oxford Molecular,Palo Alto, Calif). Повністю олюднені антитіла, на зразок тих, які експресуються у трансгенних тваринах, охоплюються обсягом винаходу (див., наприклад, Green et al. (1994) Nature Genetics 7, 13; і Патенти США №№ 5,545,806 та 5,569,825). Обсяг цього винаходу також охоплює спосіб викликання смерті активованих T-клітин, наприклад, шляхом контакту активованих T-клітин з антитілом згідно з винаходом in vitro і шляхом введення суб’єктові, який цього потребує, ефективної кількості антитіла. Суб’єкти, які підлягають лікуванню, можуть бути визначені як такі, що мають, або у яких існує ризик наявності стану, пов’язаного з надмірною або небажаною опосередкованою T-клітинами імунною реакцією, наприклад, пацієнти, які страждають від аутоімунних хвороб, відторгнення трансплантатів, алергічних хвороб або зумовлених T-клітинами ракових захворювань. Цей спосіб може здійснюватись окремо або разом з іншими ліками або терапією. Термін "лікування" стосується введення композиції суб’єктові з метою виліковування, послаблення, полегшення, усунення, профілактики або поліпшення стану хвороби, симптому 6 UA 100356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порушення, хворобливого стану, який є вторинним відносно порушення, або схильності до виникнення порушення. "Ефективна кількість" є кількістю композиції, яка може забезпечити бажаний з медичної точки зору результат у підданого лікуванню суб’єкта. Прикладами хвороб, які підлягають лікуванню, є цукровий діабет, артрит (включаючи ревматоїдний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, остеоартрит та псоріатичний артрит), розсіяний склероз, енцефаломієліт, злоякісна міастенія, системний червоний вовчак, аутоімунний тиреоїдит, дерматит (включаючи атопічний дерматит та екзематозний дерматит), псоріаз, синдром Шегрена, хвороба Крона, афтозна виразка, запалення райдужної оболонки ока, кон’юнктивіт, кератокон’юнктивіт, діабет I типу, запальні хвороби кишечника, виразковий коліт, астма, алергічна астма, шкірний червоний вовчак, склеродерма, вагініт, проктит, медикаментозні висипи, лепрозні зворотні реакції, лепрозна вузлувата еритрема, аутоімунний увеїт, алергічний енцефаломієліт, гостра некротична геморагічна енцефалопатія, ідіопатична двостороння прогресуюча сенсориневральна втрата слуху, апластична анемія, справжня еритроцитарна анемія, ідіопатична тромбоцитопенія, поліхондрія, гранулематоз Вегенера, хронічний активний гепатит, синдром Стивенса-Джонсона, ідіопатичні тропічні афти, плоский лишай, базедова хвороба, саркоїдоз, біліарний первинний цироз печінки, задній увеїт, інтерстиціальний фіброз легенів, хвороба “трансплантат проти хазяїна”, випадки трансплантації (включаючи трансплантацію з застосуванням алогенних або ксеногенних тканин), такі як трансплантація кісткового мозку, трансплантація печінки або трансплантація будь-якого органу або тканини, алергії, такі як атопічна алергія, СНІД та T-клітинні новоутворення, такі як лейкемії або лімфоми. Згідно з одним з in vivo способів, терапевтичну композицію (наприклад, композицію, яка містить антитіло згідно з винаходом) вводять суб’єктові. Зазвичай антитіло суспендують у фармацевтично прийнятному носії (наприклад, фізіологічному розчині) і вводять перорально або шляхом внутрішньовенної інфузії, або вводять шляхом ін’єкції або імплантують підшкірно, внутрішньом’язово, інтратекально, внутрішньочеревинно, інтраректально, інтравагінально, інтраназально, внутрішньошлунково, внутрішньотрахеально або внутрішньолегенево. Потрібна доза залежить від вибору шляху введення; характеру композиції; характеру хвороби суб’єкта; розміру, маси, площі поверхні, віку та статі суб’єкта; інших застосовуваних медикаментів; та рішення лікаря. Прийнятна доза становить у межах 0,01-100,0 мг/кг. Зміни доз можуть передбачатися з врахуванням різних наявних композицій та різниці ефективності різних шляхів введення. Наприклад, пероральне введення зазвичай вимагає більш високих доз, ніж введення шляхом внутрішньовенної ін’єкції. Зміни цих рівнів доз можуть регулюватися з застосуванням стандартної емпіричної практики оптимізації, яка є добре зрозумілою спеціалістам у даній галузі. Поміщення композиції у прийнятний носій для доставлення (наприклад, полімерні мікрочастинки або вживлювані засоби) може підвищувати ефективність доставлення, зокрема, для перорального доставлення. Обсяг цього винаходу також охоплює фармацевтичну композицію, яка містить фармацевтично прийнятний носій та ефективної кількості антитіла згідно з винаходом. Фармацевтичну композицію застосовують для лікування вищеописаних хвороб. До фармацевтично прийнятних носіїв належать розчинник, дисперсійне середовище, покриття, антибактеріальний та протигрибковий агент, а також ізотонічний агент та агент затримки абсорбції. Фармацевтична композиція згідно з винаходом може бути рецептована у дозовані форми для різних шляхів введення з застосуванням традиційних способів. Наприклад, вона може бути рецептована у формі капсули, герметичної желатинової капсули або таблетки для перорального введення. Капсули можуть містити будь-які стандартні фармацевтично прийнятні матеріали, такі як желатин та целюлоза. Таблетки можуть бути рецептовані згідно з традиційними процедурами шляхом пресування сумішей композиції з твердим носієм та мастилом. Прикладами твердих носіїв є крохмаль, цукор та бентоніт. Композиція також може вводитись у формі таблетки або капсули з твердою оболонкою, яка містить зв’язувальну речовину, наприклад, лактозу або маніт, традиційний наповнювач та таблетувальний агент. Фармацевтична композиція може вводитись парентеральним шляхом. Прикладами парентеральних дозованих форм є водні розчини, активний агент в ізотонічному розчині або 5% розчині глюкози або іншому фармацевтично прийнятному наповнювачі. Циклодекстрини або інші солюбілізуючі агенти, загальновідомі серед спеціалістів у даній галузі, застосовують як фармацевтичні наповнювачі для доставлення терапевтичного агента. Ефективність композиції згідно з цим винаходом оцінюють як in vitro, так і in vivo. Див., наприклад, наведені нижче приклади. Тобто, композицію випробують на її здатність до викликання смерті активованих T-клітин in vitro. Для in vivo випробувань композиції вводять 7 UA 100356 C2 5 10 15 20 25 шляхом ін’єкції тварині (наприклад, мишачій моделі), а після цього оцінюють терапевтичний ефект. На основі результатів визначають відповідний діапазон доз та шлях введення. Представлені нижче конкретні приклади слід тлумачити як суто пояснювальні, і вони жодним чином не обмежують решту опису. Вважається, що спеціаліст у даній галузі на основі представленого авторами опису без зайвих зусиль може повністю скористатися даним винаходом. Усі наведені авторами публікації, таким чином, є включеними авторами шляхом посилання в їх повному обсязі. ПРИКЛАД 1: Мишачі моноклональні антитіла 15A7, 43B6 та 9F9 Утворення антитіл проти PSGL-1 Для утворення мишачих моноклональних антитіл, які специфічно зв’язуються з PSGL-1 (hCD162), застосовують стандартні способи. Тобто, мишей імунізували мембранною фракцією PHA-активованих людських T-клітин і умертвляли для одержання ліній клітин гібридоми. Супернатанти з одержаних в результаті ліній клітин гібридоми відбирали на зв’язування з клітинами CHO, які стійко експресували hCD162. Лінії, що виробляють антитіла, які зв’язуються з клітинами CHO, які експресують hCD162, але не є батьківськими клітинами CHO, розпізнавали, субклонували і піддавали подальшому аналізові, як описано нижче. Серед розпізнаних ліній були ml52-15A7, ml66-43B6 та ml28-9F9. Вони виробляли IgG1 антитіла 15A7, 43B6 та 9F9, відповідно. Імуноблот-аналіз показував, що ці три антитіла виводили з лізату активованих T-клітин білок, який може бути виявлений антитілом проти hCD162 (kpl-1, PharMingen, San Diego, CA). Щойно описані три антитіла випробували на їхню здатність до викликання апоптозу активованих T-клітин. Супернатанти культур, які містили моноклональні антитіла, секретовані трьома лініями клітин гібридоми, відповідно інкубували з неактивованими людськими Tклітинами (День 0) або in vitro активованими людськими T-клітинами (День 7) протягом 6 годин. Клітини після цього забарвлювали анексином V і піддавали FACS-аналізові. CD3-позитивні клітини стробоскопували для забезпечення підрахунку in vitro активованих людських T-клітин або спочиваючих людських T-клітин. Апоптозні клітини були позитивними на забарвлення анексином V. У Таблиці 1 показано відсоток апоптозних T-клітини серед усіх сканованих Tклітин. 30 Таблиця 1 Відсоток апоптозних T-клітини День 0 День 7 35 40 45 50 Необроблен. 4,17 12,63 Anti-myc m128-9F9 6,67 5,82 13,36 28,71 Необроблен. 18,18 24,18 Anti-myc m152-15A7 M166-43B6 15,52 5,23 6,57 23,08 51,66 49,44 Цей результат показує, що антитіла мишей 15A7, 43B6 та 9F9 (1) є hCD162-специфічними і (2) можуть утворювати людські активовані T-клітини і викликати апоптоз активованих T-клітин, але не спочиваючих людських T-клітин. Аналіз апоптозу також здійснювали на PHA-активованих мононуклеарах периферичної крові людини (PBMC). Було виявлено, що антитіла викликали апоптоз лише в активованих T-клітинах, але не у спочиваючих T-клітинах, B-клітинах або у нейтрофілах. Відомо, що антитіла, які виснажують T-клітини, такі як антитіла проти CD3, можуть викликати вироблення розчинних факторів. Терапія з застосуванням таких антитіл зазвичай призводить до синдрому агресивного цитокіну. Для того, щоб випробувати, чи викликає антитіло проти PSGL-1 пов’язані з цитокіном побічні ефекти, щойно виділені людські PBMC культивували з 15A7 протягом 24, 48 або 72 годин. Після цього визначали рівень цитокінів у супернатанті. Значна кількість IL-2, TNF-α та IFN-γ вироблялася у PHA-активованих PBMC (позитивний контроль), тоді як рівень цих цитокінів з оброблених 15A7 клітин не піддавався виявленню. Ці результати підтверджували, що антитіло проти PSGL-1 не має або майже не має впливу на спочиваючі клітини периферичної крові з точки зору як викликання апоптозу, так і активації клітин. Оскільки вищеописані антитіла вибірково викликають апоптоз активованих T-клітин, не викликаючи негативного впливу на спочиваючі T- або інші імунні клітини, виникнення лімфопенії або широкого імунодефіциту в результаті їх введення суб’єктові є малоймовірним, на відміну від введення антитіла проти CD3 або імунодепресанта. Картування епітопів антитіл проти CD 162 Для картування зв’язувальних епітопів мишачих 15A7, 43B6 та 9F9 у людських CD162 експресували й очищали групу злитих білків, які охоплюють ділянки людських CD162. Взаємодію між злитими білками та цими моноклональними антитілами досліджували способом 8 UA 100356 C2 5 10 сендвіч-ELISA (імуносорбентного аналізу з застосуванням фіксованих ферментів). Стисло кажучи, фрагменти, які охоплюють різні ділянки людського гена CD162, експресувалися як злиті білки важколанцюговою постійною ділянкою людського імуноглобуліну гамма 1 в E. coli. КДНК, яка кодує важколанцюгову постійну ділянку людського імуноглобуліну гамма 1, ампліфікували шляхом PCR з праймерами, які мають сайт BglII та сайт BamHI. Продукт PCR вирізали за допомогою BglII та BamHI і субклонували у вектор pET-32a (Novagen), який розщеплювали однаковими ферментами. Після цього кДНК, які кодують різні ділянки hCD162, ампліфікували шляхом PCR з праймерами, які мають сайт Ndel на кінці 5' та сайт BglII на кінці 3'. Продукти PCR вирізали за допомогою відповідних ферментів і у рамці зливали з послідовністю, яка кодує важколанцюгову постійну ділянку людського імуноглобуліну-гамма 1 у векторі pET-32a. Праймери, які застосовували у кожній побудові, перелічено у Таблиці 2, і послідовності праймерів перелічено у Таблиці 3. Таблиця 2 Назви праймерів, застосованих у кожному експерименті Для ампліфікації послідовностей, які кодують: Фрагменти hCD162, які експресуються в E. coli 42-119 42-80 61-99 81-119 42-70 42-60 50-80 50-70 42-319 115-126 115-126EtoR V ділянка кДНК Легкий ланцюг Важкий ланцюг Фрагменти hCD162, які експресуються у ссавцях 1-119 1-319 110-319 94-148 119-222 174-269 214-317 Химерні ланцюги 15A7 легкий ланцюг 15A7 важкий ланцюг 9F9 легкий ланцюг 9F9 важкий ланцюг 43B6 легкий ланцюг 43B6 важкий ланцюг Олюднені ланцюги 15A7 легкий ланцюг 15A7 легкий ланцюг, 1-ша пара 15A7 легкий ланцюг, 2-га пара 15A7 легкий ланцюг, 3-тя пара 15A7 легкий ланцюг, 4-та пара 15A7 важкий ланцюг 15A7 важкий ланцюг, 1-ша пара 15A7 важкий ланцюг, 2-га пара 15A7 важкий ланцюг, 3-тя пара 15A7 важкий ланцюг, 4-та пара 9 Прямий праймер Зворотний праймер AB1001 AB1001 AB1003 Ab1004 AB1001 AB1001 AB1002 AB1002 AB1001 AB1022 AB1024 AB1005 AB1008 AB1009 AB1005 AB1007 AB1006 AB1008 Ab1007 Ab1010 AB1023 AB1025 AB1058 AB1058 AB1059 AB1060 AB1011 AB1011 AB1058 AB1020 AB1018 AB1016 AB1014 AB1013 AB1012 AB1059 AB1021 AB1019 AB1017 AB1015 AB1030 AB1032 AB1026 AB1028 AB1034 Ab1036 AB1031 AB1033 AB1027 AB1029 AB1035 AB1037 AB1048 AB1049 AB1051 AB1053 AB1055 AB1038 AB1039 AB1041 AB1043 AB1045 AB1057 AB1050 AB1052 AB1054 Ab1056 AB1047 AB1040 AB1042 AB1044 AB1046 UA 100356 C2 Таблиця 3 Послідовності праймерів Назва AB1001 AB1002 AB1003 AB1004 AB1005 AB1006 AB1007 AB1008 AB1009 AB1010 AB1011 AB1012 AB1013 AB1058 AB1059 AB1014 AB1015 Ab1016 Ab1017 Ab1018 Ab1019 Ab1020 Ab1021 Ab1022 Ab1023 Ab1024 Ab1025 AB1026 AB1027 AB1028 AB1029 AB1030 AB1031 AB1032 AB1033 AB1034 AB1035 AB1036 AB1037 AB1038 AB1039 AB1040 AB1041 AB1042 Послідовність cccgggacCATATGcaggccaccgaatatgagtacc tatgagCATATGgattatgatttcctgccagaaacgg aaacggagCATATGgaaatgctgaggaacagcactgacacc aacccctCATATGaccactgtggagcctgctgcaaggcg gtggtcAGATCTtccatagctgctgaatccgtggacagg GTTCCTCAGATCTTCTGGAGGCTCCGTTTCTGGCAGG AGGCCCAAGATCTGGAGTGGTGTCAGTGCTGTTCCTC ggctccAGATCTgtagactcaggggttccaggccc gtggtcAGATCTgtgactgcccctcctgcatccaggcc GCCAGCAGATCTTGCTTCACAGAGATGTGGTCTGGGG cgcggatccatgcctctgcaactcctcctgttgc GCCAGCCTCGAGCTTCACAGAGATGTGGTCTGGGG GGTCTGctcgagCATAGCTGCTGAATCCGTGGACAGGTTC agacaggccaccgaagggaacctgtccacg cgtggacaggttcccttcggtggcctgtct ccgctcgagcgccaagattaggatggc cgggatccactcaaaccacagccatgg ccgctcgagtggtagtaggttccatgg cgggatcaactcaacccacaggcctg ctgtgcctcgagggctgtggtttgagtg cgggatccatggagatacagaccactcaac cgggatccgatgcaggaggggcagtcac ggccgtcactcgagttgtctgtgcctc TatgGATTCAGCAGCTATGGAGATACAGACCACTCAACCAgcA GATCTgcTGGTTGAGTGGTCTGTATCTCCATAGCTGCTGAATCCA TatgGATTCAGCAGCTATGCGGATACAGACCACTCAACCAgcA GATCTgcTGGTTGAGTGGTCTGTATCCGCATAGCTGCTGAATCCA CTAGTCTAGATGACCCAAACTCCACTCTCCC CTAGTCTAGAATTAGGAAAGTGCACTTAGCATCAGCCCGTTTGATTTCC TAACATtctagATGCTGTTGGGGCTGAAGTGGG GGATAGTCTAGAGGTTGTGAGGACTCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGG CTAGTCTAGATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGGG CTAGTCTAGAATTAGGAAAGTGCACTTTTTCCAGCTTGGTCCCCCCTCC CTAGTCTAGATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCC CTAGTCTAGAGGTTGTGAGGACTCACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGttcc CTAGTCTAGATGGATTTTCTGGTGCAGATTTTCAGC CTAGTCTAGAATTAGGAAAGTGCACTTAGCATCAGCCCGTTTCAGCTCC CTAGTCTAGATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTC CTAGTCTAGAGGTTGTGAGGACTCACCAGCTTCCAGTGGATAGACTGATGG TCTATCTAGATGAACTTCGGGTCCAGCTTGATTTTCCTTG TCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTG CCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAACTGGT GGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGG CTGAAAGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCA AGCTTCCTCCAGGCTGCACTAAGCCTCC GCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACT GGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTCGAG GCATAGAAGATGGTACTACTGCCACCATTAATGTAT GCGACCCACTCGAGTCCCTTCCCTGGAGCC 10 UA 100356 C2 Продовження таблиці 3 Назва AB1043 AB1044 AB1045 AB1046 AB1047 AB1048 AB1049 AB1050 AB1051 AB1052 AB1053 AB1054 AB1055 AB1056 AB1057 AB1058 AB1059 AB1060 5 10 15 20 25 Послідовність GTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCC GATTCACCATCTCCAGAGATAATGCC CCTCAGCCCTCAGAGAATTCATTTGCAGGTACAGGGT GTTCTTGGCATTATCTCTGGAGATGG GAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATT ACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGG CTGTGACCAGGGTGCCTTGGCCCCAATAGTCCAT AGCACCCCCTCCGTAACTAGCATATC ACCCTCTAGAGGTTGTGAGGACTCACCTGAGGAG ACTGTGACCAGGGTGCCTTGGCC TCTATCTAGATGGAGACAGACACAATCCTGCTATGG GTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGC GCTGCTCTGGGTTCCAGGCTCCACTGGTGACATTCA GATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTG GATCTGCAGGTGATAGTGACCCTATCCCCTACAGACG CAGACAAAGAGCTCGGAGATTGG CACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATA ATGATGGAAACACCTATTTTGAATG GATGAGAAGCTTGGGTGCCTTTCCTGGTTTCTGTTGGTACCATTCAAAATAGGTGTTTC GCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTC TGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGC GCAGAGAAGAGATGGTGAGGGTGAAGTGTGTCCCAG ACCCACTGCCACTAAACCTGGATGG CTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAG CCTTGGTGCCTTGACCGAACGTGAGAGGAACATATGAACCTTGAAAACAGTAATAGG ACCCTCTAGAATTAGGAAAGTGCACTTACGTTTGATTTCCACCTTGGTGCCTTGACCG TATATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGAC(C/A/T)GATGGGG(C/G)TGT(C/T)GTTTTGGC Вищеописані експресійні послідовності перетворювали на штам BL21 (DE3) Escherichia coli. Перетворені клітини збирали після 6 годин індукції з застосуванням IPTG (2 мM) і ресуспендували у PBS. Після обробки клітин ультразвуком та центрифугування при 14 000 г протягом 10 хвилин одержані в результаті супернатанти охолоджували для очищення злитих білків. Тобто супернатанти спочатку інкубували з кульками білка G або білка A протягом 3 годин при 4°C. Після цього кульки центрифугували при 3 000 г і промивали промивальним буфером I (0,05% Triton X-100, 50 мM Tris-HCl, pH 8,5, 400 мM NaCl, 1 мM CaCl2 та 1 мг/мл OVA) та промивальним буфером II (0,05% Triton X-100, 50 мM Tris-HCl, pH 8,5 та 150 мM NaCl) кожним по 5 разів. Злиті білки після цього елюювали, застосовуючи буфер для елюювання, який містив 0,1M гліцину-HCl, pH 2,7, і нейтралізували за допомогою 1 M Tris-HCl, pH 8,6. Кількість усіх очищених злитих білків визначали за допомогою комплекту Bio-Rad protein assay (Bio-Rad Laboratories, Cat. No. 500-0006) і перевіряли, застосовуючи SDS-PAGE. Сендвіч-ELISA здійснювали для дослідження взаємодії між фрагментам hCD162 та кожним з 15A7, 9F9 та 43B6. 96-лункові мікротитрувальні планшети вкривали антитілом кози IgG проти людини (Southern Biotechnology, Cat. No. 2040-01) (2 мкг/мл, 50 мкг/лунку) до наступного дня при 4°C. Планшети блокували шляхом інкубації з 0,25% BSA у PBS (150 мкг/лунку) протягом 1 години при 37°C. Блоковані планшети після цього інкубували зі злитими білками, які містили різні фрагменти людського CD162 (2 мкг/мл) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Після 4-разового промивання PBS, який містив 0,05% Tween 20 (PBST), планшети інкубували з випробувальними антитілами (2 мкг/мл) протягом 1,5 години при кімнатній температурі. Після інкубації планшети 4 рази промивали PBST. 50 мкл розведеного 1 до 3000 IgG кози проти миші, кон’югованого з лужною фосфатазою (Southern Biotechnology, Cat. No. 1031-04) після цього додавали у кожну лунку і планшети інкубували протягом 1 години при 37°C. Ферментну реакцію здійснювали шляхом додавання 50 мкл розчину субстрату лужної фосфатази (1 таблетка субстрату лужної фосфатази, розчинена у 5 мл субстратного буфера, який містив 0,012 M 11 UA 100356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Na2CO3, 0,16 M NaHCO3 і 1 мM MgCl2 при pH 8,6) і визначали поглинальну здатність при 405 нм. Було виявлено, що 43B6 та 9F9 були здатними взаємодіяти з усіма злитими білками, які містили залишки з 50 по 60 зрілого людського CD162, що свідчило про те, що епітопи 43B6 та 9F9 розташовувалися між залишками 50-60. На відміну від 9F9 та 43B6, 15A7 зв’язувався лише зі злитим білком, який охоплював залишки з 42 по 319, але не зі злитим білком, який охоплював залишки 42-119, що свідчило про те, що епітоп 15A7 розташовувався між залишками з 119 по 319. Місце розташування епітопа 15A7 після цього звужували до ділянки між залишками з 115 по 126. Зміна однієї амінокислоти у позиції 120 (Glu  Arg) зменшувала взаємодію між 15A7 та злитим білком, що свідчило про те, що первинний домен контакту 15A7 на людському CD162 розташовується у позиції 120 або поблизу від неї, і залишок Glu є суттєвим для взаємодії. Злиті білки, які охоплюють різні ділянки людського CD162, також експресували у клітинах ссавців і випробували на їхню взаємодію з 15A7. Фрагменти, які охоплюють ці ділянки, експресувалися як злиті білки важколанцюговою постійною ділянкою людського імуноглобуліну гамма 1 у клітинах ссавців. Спочатку кДНК, що кодує важколанцюгову постійну ділянку людського імуноглобуліну гамма 1, вставляли у вектор pcDNA3 (Invitrogen). Потім кДНК, які кодують різні ділянки hCD162, ампліфікували шляхом PCR з праймерами, які вводили сайт BamHI на кінці 5' та сайт XhoI на кінці 3'. Ці продукти PCR вирізали за допомогою відповідних ферментів і субклонували у вектор pcDNA3, який містив важколанцюгову постійну ділянку людського імуноглобуліну гамма 1. Назву та послідовність для кожного праймера перелічено вище у Таблицях 2 та 3. Щойно описані вектори експресі ссавців тимчасово трансфікували у клітини COS-7 за допомогою Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Cat. No. 11668-027) згідно з інструкціями виробника. Трансфіковані клітини вирощували у середовищі з наднизьким вмістом Ig (Invitrogen, Cat. No. 16250-078). Експресовані білки очищали і піддавали аналізові сендвіч-ELISA описаним вище способом. Результати аналізу ELISA показують, що лише злиті білки, які містять залишки з 94 по 148, були здатними взаємодіяти з 15A7. Ці результати узгоджуються з думкою про те, що епітоп 15A7 розташовується між залишками з 115 по 126. Усі вищенаведені результати свідчать про те, що епітопи 9F9, 43B6 та 15A7 є залежними від білка, замість залежності від вуглеводної модифікації, оскільки всі три антитіла зв’язуються з експресованими у бактеріях злитими білками. Вони також свідчать про те, що, хоча 15A7, 9F9 та 43B6 виявляють подібні властивості щодо специфічності зв’язування та функції викликання апоптозу в активованих T-клітинах, вони функціонують через різні домени людського CD 162 і по-різному себе поводять. ПРИКЛАД 2: Химерні антитіла 15A7, 43B6 та 9F9 Клонування легко- та важколанцюгових мінливих ділянок антитіл проти CD 162 КДНК, які кодують легко- та важколанцюгові мінливі ділянки (VL та VH) антитіл 15A7, 43B6 та 9F9 ампліфікували способом якірної PCR. 3' праймери, гібридизовані з C ділянками, та 5' праймери, гібридизовані з G хвостами, приєднували до кДНК, застосовуючи термінальну дезокситрансферазу. PCR фрагменти клонували у вектор pCRII (Invitrogen). Кілька незалежних клонів для кожного ланцюга секвенували й порівнювали. Відбирали послідовність, представлену більшістю незалежних клонів. Трансльовану амінокислотну послідовність після цього піддавали аналізові для підтвердження того, що вибрана послідовність має характеристики типової легко- або важколанцюгової V-ділянки миші і належить до конкретного підтипу. Після цього розпізнавали ділянки визначення комплементарності (CDR) шляхом порівняння трансльованих амінокислотних послідовностей з консенсусною послідовністю кожного підтипу. Назву та послідовність для кожного праймера представлено вище у Таблицях 2 та 3. Виведені амінокислотні послідовності легко- та важколанцюгових V-ділянок 15A7, 43B6 та 9F9 (SEQ ID NOs: 19-24) показано у Короткому викладі. Химерні антитіла Для утворення векторів для експресії химерних антитіл кДНК, які кодують V-ділянкиL та VH 15A7, 43B6 та 9F9, ампліфікували шляхом PCR, застосовуючи праймери для включення 5' сигнальної пептидної послідовності та 3' сигналу донора сплайсингу. Праймери також вводили сайти XbaI на обох кінцях продуктів PCR, які після цього вирізали за допомогою ферменту XbaI і лігували у розщеплений XbaI вектор pVK, pVg1, pVg2 або pVg4. Тобто, кДНК V-ділянкиL 15A7, 43B6 та 9F9 субклонували у плазміду pVk. Ця плазміда містила промотор CMV та послідовність, яка кодує людську легколанцюгову постійну ділянку. КДНК ділянки V H 15A7, 43B6 та 9F9 субклонували у плазміди pVg1, pVg2 або pVg4. Кожна з трьох плазмід мала промотор CMV. Вони також містили, відповідно, людські важколанцюгові постійні ділянки IgGl, IgG2 та IgG4. Кожну з вищеописаних кодуючих легкий ланцюг плазмід котрансфікували з кодуючою 12 UA 100356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 важкий ланцюг плазмідою у клітини COS-7. Супернатанти трансфікованих клітин охолоджували. Химерні антитіла у супернатантах піддавали аналізові на здатність зв’язуватися з людським CD162 і викликати апоптоз активованих T-клітин. Було виявлено, що всі химерні антитіла, вироблені з 15A7, 43B6 та 9F9, зв’язуються з трансфектантами Sp2/0, стійко експресуючи людський CD162, але не з батьківськими Sp2/0 клітинами, що свідчило про те, що вони зберігають специфічність до зв’язування з людським CD162. Крім того, було виявлено, що химерні антитіла викликають апоптоз у T-клітинах, які піддавали активації протягом 7 днів, що свідчило про те, що вони також зберігають цю функцію їхніх мишачих відповідників. Олюднені антитіла 15A7 миші використовували для одержання олюднених антитіл шляхом пересадження її CDR на людський каркас. Для збереження афінності та специфічності зв’язування важливою є консервація конформації V-ділянки при пересадженні CDR на людський каркас. Для відбору належного донора каркасу амінокислотні послідовності легко- та важколанцюгові V-ділянки 15A7 миші порівнювали з ділянками 50 мишачих антитіл, які були олюднені. Було виявлено, що мишаче антитіло, mDREG-55, має високу гомологію послідовності з Vділянкою 15A7 миші як у легкому, так і у важкому ланцюгах. Нижче представлено порівняння випрямленої послідовності 15A7 миші з цим антитілом mDREG-55 (CDR виділено): Вирівнювання легкого ланцюга: Вирівнювання важкого ланцюга: DREG-55 миші є моноклональним IgG1 антитілом проти L-селектину. Послідовності ділянок VL та VH 15A7 миші були, відповідно, на 64,3% (лише каркас: 73,8%) і на 70% (лише каркас: 81,6%) гомологічними послідовностям DREG55 миші. Олюднені DREG-55(HuDREG-55) будували, застосовуючи каркасні послідовності ділянок VL та VH з людського антитіла Gal. Таким чином, для олюднення 15A7 миші каркасні послідовності легкого та важкого ланцюгів людського Gal застосовували для заміни відповідників 15A7 миші. Кожна з легких та важких мінливих ділянок олюдненого 15A7 складалася з 4 пар синтетичних олігонуклеотидів (~ 80 основ завдовжки). Олігонуклеотиди кожної пари перекривалися приблизно 20 нуклеотидами. Нуклеотидні послідовності відбирали й синтезували для кодування білкових послідовностей олюднених мінливих ділянок, включаючи сигнальні пептиди. Збирання й ампліфікація генів здійснювали у чотири етапи: (1) чотири пари комплементарних олігонуклеотидів випалювали й розтягували фрагментом Кленова у 4 окремих реакціях; (2) одержані в результаті 4 фрагменти дсДНК змішували парами, денатурували, повторно випалювали і розтягували у двох окремих реакціях; (3) одержані в результаті два фрагменти дсДНК змішували, денатурували, повторно випалювали і розтягували для створення кінцевої дсДНК повної довжини; і (4) одержані в результаті ДНК ампліфікували шляхом PCR з праймерами для введення сайту XbaI на обох кінцях. PCR фрагмент після цього вирізали за допомогою XbaI і вставляли у відповідні XbaI-розщеплені вектори pVK та pVg4. Після цього у позиціях, у яких взаємодію між CDR та каркасом вважали важливою, залишки Gal 13 UA 100356 C2 знову змінювали на залишки 15A7 миші (тобто I62V та D74H). Нижче представлено порівняння випрямлених послідовностей 15A7 миші та олюдненого 15A7 (Hu15A7) з mDREG-55, де V62 та H74 є підкресленими. Вирівнювання легкого ланцюга: 5 10 15 20 25 30 35 40 Вирівнювання важкого ланцюга: Одержані таким чином плазміди кодували важкий та легкий ланцюги олюдненого 15A7. Ці плазміди після цього трансфікували у клітини COS-7. Після цього збирали виснажені супернатанти з культивованих клітин. Олюднений 15A7 у супернатантах випробували на його здатність зв’язуватися трансфектантами CHO, які стійко експресують hCD162, і викликати апоптоз у T-клітинах, які активували протягом 7 днів. Ці результати показують, що він зберігає ці здатності. Одержання химерних та олюднених антитіл Виробляли клітини, які виробляють олюднені та химерні антитіла. Тобто, Sp2/0 клітини (Sp2/0-Agl4; ATCC CRL 1581) стійко трансфікували відповідними плазмідами шляхом електропорації з застосуванням пристрою Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories) при 360 В і ємності 25 мкФ згідно з інструкціями виробника. До трансфекції плазміди лінеаризували шляхом 7 розщеплення ферментом BamHI. Усі трансфекції виконували, застосовуючи 10 клітин у PBS і 20 мкг кожною з плазмідних ДНК. Клітини з кожної трансфекції поміщали у 96-лункові планшети для тканинних культур. Через 48 годин селективне середовище (з додаванням DMEM10% FBS/гіпоксантину/тимідину) і застосовували 1 мкг/мл мікофенолової кислоти. Клітини, які виробляють антитіла, відбирали і виділяли шляхом дослідження присутності антитіла у супернатанті культури шляхом ELISA. Виділені клітини культивували у середовищі без сироватки або з низьким вмістом Ig і культивований супернатант збирали. Антитіла очищали шляхом пропущення через колонку стафілококового білка A-Sepharose CL-4B. Після 5-разового промивання кожного промивальним буфером I (0,05% Triton X-100, 50 мM Tris-HCl, pH 8,5, 400 мM NaCl, 1 мM CaCl2 та 1 мг/мл OVA) та промивальним буфером II (0,05% Triton X-100, 50 мM Tris-HCl, pH 8,5 і 150 мM NaCl), зв’язані антитіла елюювали з буфером для елюювання, який містив 0,1 M гліцину-HCl, pH 2,7, і нейтралізували за допомогою 1 M Tris-HCl, pH 8,6. Вимірювання афінності Афінність зв’язування вищеописаних мишачих, химерних та олюднених 15A7 антитіл визначали шляхом конкурентного зв’язування. 15A7 миші біотинілували за допомогою системи EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce -6 Biotechnology, Cat. No. 21217). Тобто, 0,5 мг (3,3 x 10 нмоль) 15A7 миші розчиняли у 187 мкл -5 PBS і змішували з 6,8x10 нмоль сульфо-NHS-біотину. Суміш після цього інкубували на льоду протягом 2 годин перед видаленням вільних біотинів шляхом діалізу при 4°C до наступного дня на PBS. Одержане таким чином мічене біотином 15A7 миші зберігали при 4°C до застосування. Трансфектанти Sp2/0, які стійко експресують людський CD162, застосовували як джерело людського CD162 антигена. Мічене біотином 15A7 миші застосовували як трасер. Збільшувані кількості конкурентного антитіла (мишачого, химерного або олюдненого 15A7) змішували з 35 нг 14 UA 100356 C2 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 міченого біотином 15A7 миші і інкубували з 1x10 експресуючими CD162 клітинами Sp2/0 протягом 1,5 години при 4°C з постійним збовтуванням. Після промивання до суміші додавали вторинне антитіло, стрептавідин-PE (Becton Dickinson Immunocytometry System Inc. Cat. No. 349023). Після інкубування протягом 45 хвилин при 4°C клітини знову промивали, ресуспендували у 300 мкл PBS-1% FBS і піддавали FACS-аналізові. Було виявлено, що половина максимальної конкуруючої концентрації 15A7 миші становила 3,72 мкг/мл, тоді як концентрація химерного та олюдненого 15A7 становила приблизно 5,71 мкг/мл та 4,51 мкг/мл, відповідно. Ці результати свідчать про те, що афінність мишачого, химерного та олюдненого 15A7 є порівнянною. Іншими словами, афінність зв’язування (Ka) для 7 -1 15A7 миші становить 4,03 x 10 M , тоді як ці показники для химерного та олюдненого 15A7 7 -1 7 -1 становлять 2,62 x 10 M та 3,33 x 10 M , відповідно. Конкурентний аналіз Конкурентний аналіз здійснювали для дослідження взаємодії між вищеописаними трьома мишачими антитілами, PSGL-1 та P-селектином. P-селектин є головним високоафінним лігандом для PSGL-1 на більшості лейкоцитів. Для того, щоб дослідити, чи перешкоджають три антитіла зв’язуванню P-селектину з PSGL-1, зв’язування очищеного людського P-селектину з активованими T-клітинами вимірювали у присутності трьох антитіл. KPL-1, про яке відомо, що воно блокує взаємодію P-селектину та PSGL-1, використовували як позитивний контроль. Людські PBMC активували 1% PHA протягом 2 днів і тримали у IL-2-вмісному середовищі протягом 3 днів. Клітини інкубували з титрованими 9F9, 15A7, 43B6, KPL-1 (антагоніст PSGL-1) або контрольним антитілом (9E10) протягом 30 хвилин з наступним додаванням рекомбінантного людського P-селектину (1,25 мкг/мл). Зв’язування P-селектину з активованими T-клітинами вимірювали за допомогою анти-P-селектин-FITC, який аналізували шляхом FACS. Згідно з попередніми повідомленнями, KPL-1 майже повністю усувало зв’язування Pселектину для активації T-клітин у низькій концентрації (0,31 мкг/мл). 43B6 блокувало зв’язування P-селектину з активованими T-клітинами так само ефективно, як KPL-1, тоді як для досягнення такого самого ефекту вимагалася висока концентрація 9F9. Дійсно, вимагалося 0,08 мкг/мл KPL або 43B6 для усунення 50% зв’язування. Натомість вимагалося 5 мкг/мл 9F9. Крім того, 15A7 не мало ніякого інгібіторного впливу на зв’язування P-селектину навіть при 20 мкг/мл. Несподівано було виявлено, що воно посилює зв’язування P-селектину з PSGL-1. Ці результати свідчать про те, що 15A7 та P-селектин зв’язуються з різними мотивами PSGL-1 на активованих T-клітинах. Те, що 15A7 не конкурує з P-селектином за PSGL-1, свідчить про те, що in vivo введення 15A7, очевидно, не впливає на природжений імунітет через вплив на P-селектин-залежне залучення лейкоцитів. Повідомлялося, що PSGL-1 експресується на низькому рівні у тромбоцитах. Досліджували вплив 15A7 антитіл на тромбоцити. Було виявлено, що антитіла не посилюють і не інгібують агрегацію людських тромбоцитів. ПРИКЛАД 3: Моноклональне антитіло хом’яка TAB4 проти мишачого PSGL-1 Моноклональне антитіло проти мишачого PSGL-1, TAB4, одержували у спосіб, подібний до способу, описаного у Прикладі 1. Воно викликало апоптоз T-клітин in vitro і виснажувало Tклітини in vivo. Для того, щоб визначити, чи впливає воно на зв’язування між мишачим PSGL-1 та мишачим P-селектином, здійснювали конкурентний аналіз у спосіб, подібний до способу, описаного у Прикладі 2. Було виявлено, що TAB4 не інгібує зв’язування мишачого P-селектину з- мишачим PSGL-1 навіть у концентрації 20 мкг/мл. ПРИКЛАД 4: Мишачі моноклональні антитіла 4B7, 5C4, 12E7, 14B3, 17E5 та 18D12 Характеризували додаткові моноклональні антитіла проти людського PSGL-1, 4B7, 5C4, 12E7, 14B3, 17E5 та 18D12. Після зв’язування з активованою T-клітиною всі вони викликали смерть активованих T-клітин. Конкурентний аналіз здійснювали у спосіб, описаний у Прикладі 2, для того, щоб визначити, чи блокують вони взаємодію між PSGL-1 та P-селектином. Було виявлено, що ці антитіла мають слабкий, якщо взагалі мають, інгібіторний вплив на зв’язування людського P-селектину з людським PSGL-1, навіть у найвищій випробуваній концентрації (5 мкг/мл). ІНШІ ВАРІАНТИ ВТІЛЕННЯ Усі відмітні ознаки, розкриті в цьому описі, можуть поєднуватись у будь-яку комбінацію. Кожна відмітна ознака, розкрита в цьому описі, може бути замінена на альтернативну відмітну ознаку, яка служить для тієї самої, рівноцінної або подібної мети. Таким чином, якщо прямо не вказано іншого, кожна розкрита відмітна ознака є лише прикладом із загальної групи рівноцінних або подібних відмітних ознак. 15 UA 100356 C2 З наведеного вище опису спеціаліст у даній галузі може легко визначити суттєві характеристики даного винаходу і без відхилення від його сутності та обсягу може здійснити різні зміни та модифікації винаходу для його пристосування до різних варіантів та умов застосування. Таким чином, інші варіанти втілення також охоплюються обсягом винаходу. 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. Антитіло, яке специфічно зв'язується з Р-селектин-глікопротеїновим лігандом-1 людини без перешкоджання зв'язуванню між Р-селектин-глікопротеїновим лігандом-1 та P-селектином, причому зазначене антитіло, після зв'язування з Р-селектин-глікопротеїновим лігандом-1 на активованій T-клітині, викликає смерть активованої T-клітини. 2. Антитіло за п. 1, яке включає перший імуноглобуліновий ланцюг, який являє собою легкий ланцюг, що містить SEQ ID NO: 1-3 та другий ланцюг, який являє собою важкий ланцюг, що містить SEQ ID NO: 4-6. 3. Антитіло за п. 2, у якого легкий ланцюг та важкий ланцюг містять, відповідно, SEQ ID NO: 19 та 20, або 25 та 26. 4. Антитіло за п. 3, у якого легкий ланцюг та важкий ланцюг містять, відповідно, SEQ ID NO: 25 та 26. 5. Антитіло за п. 1, яке специфічно зв'язується з амінокислотними залишками 115-126 Рселектин-глікопротеїнового ліганду-1 людини. 6. Антитіло за п. 5, яке специфічно зв'язується з амінокислотними залишками 117-123. 7. Антитіло за п. 6, яке специфічно зв'язується з амінокислотними залишками 119-121. 8. Антитіло за п.5, яке включає легкий ланцюг та важкий ланцюг, які містять, відповідно, SEQ ID NO: 1-3 та SEQ ID NO: 4-6. 9. Антитіло за будь-яким з пп. 1-8, яке являє собою химерне антитіло. 10. Антитіло за будь-яким з пп. 1-8, яке являє собою олюднене антитіло. 11. Антитіло за п. 1, вибране з групи, що включає такі як: (а) антитіло, що включає легкий ланцюг, який містить SEQ ID NO: 25; (б) антитіло, що включає важкий ланцюг, який містить SEQ ID NO: 26; та (в) антитіло, що включає легкий ланцюг, який містить SEQ ID NO: 25 та важкий ланцюг, який містить SEQ ID NO: 26. 12. Антитіло за п. 11, що включає важколанцюгову постійну ділянку IgG1 людини. 13. Антитіло за п. 11, що включає важколанцюгову постійну ділянку IgG2 людини. 14. Антитіло за п. 11, що включає важколанцюгову постійну ділянку IgG4 людини. 15. Виділене антитіло за п. 1, де антитіло має: (і) легкий ланцюг, що включає мінливу ділянку, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 25, приєднану до каппа легколанцюгової постійної ділянки людини, та (іі) важкий ланцюг, що включає мінливу ділянку, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 20 або SEQ ID NO: 26. 16. Антитіло за п. 15, що включає важколанцюгову постійну ділянку IgG1, IgG2 або IgG4 людини. 17. Антитіло за п. 16, що включає: (і) легкий ланцюг, що включає мінливу ділянку, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 25, приєднану до каппа легколанцюгової постійної ділянки людини, та (іі) важкий ланцюг, що включає мінливу ділянку, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 26, приєднану до важколанцюгової постійної ділянки IgG4 людини. 18. Композиція, що включає антитіло за будь-яким з пп. 1-17. 19. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло, що специфічно зв'язується з Р-селектинглікопротеїновим лігандом-1, яке включає SEQ ID NO: 19 та SEQ ID NO: 20. 20. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло, що специфічно зв'язується з Р-селектинглікопротеїновим лігандом-1, яке включає SEQ ID NO: 25 та SEQ ID NO: 26. 21. Вектор, який включає нуклеїнову кислоту за п. 19 або п. 20. 22. Клітина-хазяїн, яка включає вектор, що має нуклеїнову кислоту за п. 19. 23. Клітина-хазяїн, яка включає вектор, що має нуклеїнову кислоту за п. 20. 24. Клітина-хазяїн за будь-яким з пп. 22, 23, де клітина являє собою бактеріальну клітину, клітину дріжджів, рослинну клітину, клітину комахи або клітину ссавця. 25. Клітина-хазяїн за п. 24, де клітина ссавця являє собою клітинну гібридому. 26. Застосування ефективної кількості антитіла за будь-яким з пп. 1-8, у виготовленні лікарського засобу для модулювання опосередкованої T-клітинами імунної відповіді у суб'єкта, що має, або у якого існує ризик набуття стану, пов'язаного з надмірною опосередкованою Tклітинами імунною реакцією, де стан є запальною хворобою, аутоімунною хворобою, алергічною хворобою або T-клітинним раком. 16 UA 100356 C2 5 10 15 20 27. Застосування ефективної кількості антитіла за будь-яким з пп. 1-8, у виготовленні лікарського засобу для лікування або попередження відторгнення алогенного або ксеногенного трансплантату. 28. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло, що специфічно зв'язується з Р-селектинглікопротеїновим лігандом-1, яке включає SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 та 6. 29. Вектор, який включає нуклеїнову кислоту за п. 28. 30. Клітина-хазяїн, що включає нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло, що специфічно зв'язується з Р-селектин-глікопротеїновим лігандом-1, яке включає SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 та 6. 31. Клітина-хазяїн за п. 30, яка являє собою бактеріальну клітину, клітину дріжджів, рослинну клітину, клітину комахи або клітину ссавця. 32. Клітина-хазяїн за п. 31, де клітина ссавця являє собою клітинну гібридому. 33. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з Р-селектин-глікопротеїновим лігандом-1 людини без перешкоджання зв'язуванню між Р-селектин-глікопротеїновим лігандом-1 та Pселектином, причому зазначене антитіло включає (і) легкий ланцюг, що містить мінливу ділянку, зібрану праймерами АВ1049-1056, зв'язаними з каппа легколанцюговою постійною ділянкою людини, та (іі) важкий ланцюг, що містить мінливу ділянку, зібрану праймерами АВ1039-АВ1046, зв'язаними з важколанцюговою постійною ділянкою IgG4 людини, причому зазначене антитіло, після зв'язування з Р-селектин-глікопротеїновим лігандом-1 на активованій T-клітині, викликає смерть активованої T-клітини. 34. Антитіло за п. 33, у якому легкий ланцюг містить SEQ ID NO: 25. 35. Композиція, яка включає антитіло за п. 34. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 17