Виділене моноклональне антитіло людини, яке специфічно зв’язується з cd25 людини та інгібує зв’язування il-2 з сd25

1. Виділене моноклональне антитіло людини, яке специфічно зв'язується з СD25 людини та інгібує зв’язування IL-2 з CD25, вибране з групи, що містить: а) варіабельну ділянку важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 2, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 4; 2 (19) 1 3 90082 4 (iv) SEQ ID NO: 17, 18, 19 та SEQ ID NO: 20, 21 або 14. Трансфектома, яка містить послідовності нук22 відповідно. леїнової кислоти, що кодують важкий ланцюг ан5. Анти тіло за будь-яким із пп. 1-4, що містить: титіла людського походження і легкий ланцюг ан(і) амінокислотну послідовність варіабельної ділятитіла людського походження, та продукує нки важкого ланцюга, утворену з послідовності кількість антитіла, яке піддається визначенню, за VH1-69/JH4b або VH1-69/JH5b зародкової лінії будь-яким із пп. 1-11. людини, і амінокислотну послідовність варіабель15. Еукаріотична або прокаріотична клітина-хазяїн, ної області легкого ланцюга, утворену з послідовяка містить послідовності нуклеїнової кислоти, що ності A27/JК4 або A27/JК5 зародкової лінії людини, кодують важкий ланцюг антитіла людського похоабо дження і легкий ланцюг антитіла людського похо(іі) амінокислотну послідовність варіабельної ділядження, та продукує кількість антитіла, що підданки важкого ланцюга, утворену з послідовності ється визначенню, за будь-яким з пп. 1-11. VH1-69/D7-27/JH4b або VH1-69/D7-27/JH5b зарод16. Трансгенна тварина, відмінна від людини, яка кової лінії людини, і амінокислотну послідовність містить послідовності нуклеїнової кислоти, що к оваріабельної ділянки легкого ланцюга, утворену з дують важкий ланцюг антитіла людського похопослідовності A27/JК4 або A27/JК5 зародкової лінії дження і легкий ланцюг антитіла людського похолюдини. дження, здатна до продукування кількості 6. Антитіло за будь-яким із пп. 1-5, вибране з груантитіла, яке піддається визначенню, за будь -яким пи, що складається з IgG1, ІgG2, lgG3, lgG4, IGM, з пп. 1-11. IgA, lgA2, секреторного IgA, IgD та ІgE антитіла. 17. Трансгенна рослина, яка містить послідовності 7. Антитіло за будь-яким із пп. 1-6, яке дисоціює нуклеїнової кислоти, що кодують важкий ланцюг від CD25 людини з константою рівноважної дисоантитіла людського походження і легкий ланцюг ціації (KD) близько 10 -10 М або нижче, або 10 -11 М антитіла людського походження, здатна продук уабо навіть нижче, при визначенні методом плазвати кількість антитіла, яке піддається визначенмового поверхневого резонансу (SPR) на приладі ню, за будь-яким із пп. 1-11. ВІАсоrе 3000 із застосуванням рекомбінантного 18. Експресуючий вектор, який містить послідовCD25 як ліганду та антитіла як аналіта. ності нуклеїнової кислоти, що кодують моноклона8. Ан титіло за будь-яким із пп. 1-7, яке має одну льне антитіло людини, яке специфічно зв'язується або більше наступних властивостей: з CD25 та інгібує зв'язування IL-2 з CD25, за будь(a) елімінує Т-клітини, що експресують CD25; яким із пп. 1-11. (b) інгібує проліферацію Т-клітин, що експресують 19. Фармацевтична композиція, що містить антитіCD25; ло за будь-яким із пп. 1-11 або вектор за п. 18 та (c) інгібує викликану антитілом проти CD25 Тфармацевтично прийнятний носій, та, за необхідклітинну проліферацію мононуклеарів периферичності, інший терапевтичний агент. ної крові (РВМС); 20. Фармацевтична композиція, що містить антиті(d) інгібує змішану лімфоцитарну реакцію (MLR); ло за будь-яким із пп. 1-11 або вектор за п. 18 та (е) забезпечує інтерналізацію CD25, експресовадругий терапевтичний агент для їх окремого заних на Т-клітинах. стосування при лікуванні людини або тварини. 9. Антитіло за будь-яким із пп. 1-8, яке є фрагмен21. Композиція за п. 20, яка відрізняється тим, що том антитіла або одноланцюговим антитілом. інший терапевтичний агент є: 10. Антитіло за будь-яким із пп. 1-9, яке є білком, (і) імуносупресор, вибраний з групи, що включає злитим по зв'язуючому домену імуноглобуліну, що циклоспорин, азатіоприн, мікофенольну кислоту, містить: мікофенолят мофетилу, кортикостероїди, такі як (і) варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіапреднізолон, метотрексат, солі золота, сульфасабельну ділянку легкого ланцюга, як визначено у п. лазин, протималярійні засоби, бреквінар, лефлю1, злиті з поліпептидом шарнірної області імуногномід, мізорибін, 15-дезоксиспергуалін, 6лобуліну, меркаптопурин, циклофосфамід, рапаміцин, так(іі) константну ділянку СН2 важкого ланцюга імуноролімус (FK-506), ОКТ3 і антитимоцитний глобулін; глобуліну, злиту з шарнірною ділянкою, і (іі) протизапальний агент, вибраний з групи, що (ііі) константну ділянку СН3 важкого ланцюга ім увключає стероїдні препарати, НСПЗЗ (нестероїдні ноглобуліну, злиту з константною ділянкою. протизапальні засоби) і DMARD (протиревматичні 11. Антитіло за будь-яким із пп. 1-10, що додаткозасоби), такі як метотрексат, гідроксихлорокін, суво містить лінкер-хелатор, для зв’язування радіоальфасалазін, лефлуномід, блокатори рецептора ктивного ізотопу. IL-1, наприклад анакінра, блокатори TNF-α, напри12. Гібридома, що продукує моноклональне антиклад етанерсепт, інфліксимаб і адалімумаб, антитіло людини, яке специфічно зв'язується з СD25 та тіла до IL-6R, CTLA4Іg і антитіла до IL-15; інгібує зв'язування IL-2 з CD25, за будь-яким із пп. (ііі) агент для лікування запальних або гіперпролі1-11. феративних шкірних захворювань, вибраний з гру13. Гібридома за п. 12, яка містить В-клітину транспи, що включає вугільну смолу, вітамін А, антрагенної, відмінної від людини тварини, в якій перелін, кальципотрен, таразотен, кортикостероїди, будови генних сегментів V-(D)-J привели до утвометотрексат, ретиноїди, наприклад ацикретин, рення функціонального трансгена важкого циклоспорин, етанерсепт, алефасепт, ефалузиланцюга людського походження і функціонального маб, 6-тіогуанін, мікофенолят мофетилу, такролітрансгена легкого ланцюга людського походження, мус (FK-506), гідроксисечовину або терапію, зокзлиту з імморталізованою клітиною. рема таку, як УФВ (ультрафіолет В, широка і вузька смуга), УФА (ультрафіолет А) і PUVA (ПУ 5 90082 6 ВА, псорален, метоксален плюс ультрафіолет А); артеріїтів, включаючи гігантоклітинний артеріїт, або гіпопластичної анемії, астми, склеродермії і увеї ту; (iv) агент, вибраний з групи, що включає доксору(iv) запальне або гіперпроліферативне шкірне забіцин, цисплатин, блеоміцин, кармустин, хлорамхворювання є хворобою, вибраною з групи, що буцил і циклофосфамід. складається з псоріазу, включаючи бляшковий 22. Імунокон'югат, призначений для застосування псоріаз, акродерматиту пустули (РРР), ерозійного в лікуванні або попередженні захворювання, поплоскоклітинного лишаю, бульозного пемфігоїду, в'язаного з клітинами, що експресують CD25, що природженого бульозного епідермолізу, контактномістить антитіло за будь-яким із пп. 1-11, зв'язане го дерматиту і атонічного дерматиту, та з цитотоксичним агентом, радіоізотопом або лікар(v) лімфоїдна пухлина є п ухлиною, вибраною з ською речовиною. групи, що складається з Т-клітинного лейкозу, хво23. Біспецифічна або поліспецифічна молекула, роби Ходжкіна, волосатоклітинного лейкозу або призначена для застосування в лікуванні або пошкірної Т-клітинної лімфоми, включаючи грибопопередженні захворювання, пов'язаного з клітинадібний мікоз і синдром Сезарі. ми, експресуючими CD25, що містить антитіло за 27. Спосіб лікування або попередження злоякісної будь-яким із пп. 1-11 та яка додатково зв'язує один пухлини, при якому забезпечується інгібування і більше антигенів, таких як CD3, CD4, IL-15R, інфільтруючих CD25+ регуляторних Т-клітин, примембранозв'язаний або рецепторнозв'язаний TNFчому пухлина вибрана з групи, що складається з α або мембранозв'язаний або рецепторнозв'язараку шлунка, раку стравоходу, злоякісної меланоний IL-15. ми, колоректального раку, раку підшлункової зало24. Спосіб in vitro інгібування зростання і/або прози, раку молочної залози, дрібноклітинного раку ліферації клітини, яка експресує CD25, або елімілегенів, недрібноклітинного раку легенів, раку нації клітини, яка експресує CD25, що полягає у шийки матки, раку яєчника та раку нирок, що полявведенні антитіла за будь-яким із пп. 1-11 або гає у введенні суб'єктові антитіла за будь -яким із композиції за п. 19, або імунокон’югата за п. 22, пп. 1-11 або композиції за п. 19, або імунокон'югаабо біспецифічної або поліспецифічної молекули та за п. 22, або біспецифічної або поліспецифічної за п. 23 таким чином, що зростання і/або проліфемолекули за п. 23. рація клітини пригнічується або відбувається кіл28. Спосіб лікування або попередження гематололінг клітини, яка експресує CD25, причому клітина, гічного захворювання, вибраного з групи, що склащо експресує CD25, є активованою Т-клітиною. дається з Т-клітинного лейкозу/Т-клітинної лімфо25. Спосіб лікування або попередження відторгми, анапластичної гігантоклітинної лімфоми, нення трансплантата, гомологічної хвороби ("трахронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL)/малої нсплантат проти хазяїна"), імунного, аутоім унного і лімфоцитарної лімфоми (SLL), периферичної Тзапального захворювання, запального або гіперпклітинної лімфоми і вторинного амілоїдозу, що роліферативного захворювання шкіри та лімфоїдполягає у введенні суб'єктові антитіла за будь ної пухлини, що полягає у введенні суб'єктові аняким із пп. 1-11 або композиції за п. 19, або імунотитіла за будь-яким із пп. 1-11 або композиції за п. кон'югата за п. 22, або біспецифічної або поліспе19, або імунокон'югата за п. 22, або біоспецифічної цифічної молекули за п. 23. або поліспецифічної молекули за п.23. 29. Спосіб детектування присутності в зразку анти26. Спосіб за п. 25, який відрізняється тим, що гену CD25 або клітини, експресуючої CD25, що (і) відторгнення трансплантата є відторгнення алополягає в забезпеченні контакту зразка з антитітрансплантата і ксенотрансплантата у пацієнтів, лом за будь-яким із пп. 1-11 в умовах, що допусщо оперуються з приводу трансплантації органа кають утворення комплексу між антитілом і CD25; і або тканини, зокрема серця, легенів, комбінованої визначенні комплексу, що утворився. трансплантації легені-серце, трансплантації тра30. Діагностичний набір для виявлення присутносхеї, нирки, печінки, підшлункової залози, стравоті у зразку антигену CD25 або клітини, яка експреходу, кишківника, шкіри, кінцівки, пуповини, стовсує CD25, що містить антитіло за будь -яким із пп. бурових клітин або інсулоцитів; 1-11, та, за необхідності, пов'язане з міткою, що (іі) гомологічна хвороба ("трансплантат проти хаз явизначається. їна") є хворобою, вибраною з групи, що складаєть31. Антиідіотипічне антитіло, що зв'язується з анся з гомологічної хвороби в результаті переливантитілом за будь-яким із пп. 1-11. ня крові і гомологічної хвороби в результаті 32. Антиідіотипічне антитіло за п. 31, що зв'язуєтьпересадки кісткового мозку; ся з антитілом, що містить важкий ланцюг людсь(ііі) імунне, аутоімунне або запальне захворювання кого походження і легкий каппа-ланцюг людського є хворобою, вибраною з групи, що складається з походження, які містять в своїх варіабельних діляревматоїдного артриту, анкілозуючого спондилоанках амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 2 і 4, ртриту, псоріатичного артриту, діабету типу 1, інSEQ ID NO: 6 і 8, SEQ ID NO: 10 і 12 або SEQ ID сулінзалежного діабету типу 2, розсіяного склероNO: 14 і 16 відповідно. зу, системного еритематозного вовчака, важкої 33. Застосування антиідіотипічного антитіла за п. псевдопаралітичної міастенії, запального захво31 або 32 для визначення рівня моноклонального рювання кишківника, хвороби Крона, виразкового антитіла людини, яке специфічно зв'язується з коліту, дерматополіміозиту, синдрому Сегрена, CD25, у зразку. 7 90082 Споріднені заявки У даній заявці заявляється пріоритет відповідно до попередньої патентної заявки США із серійним номером 60/426,690, поданої 15 листопада 2002p., розкриття якої включено в дану заявку в повному обсязі як посилання. Передумови створення винаходу Високоафінний рецептор інтерлейкіну 2 (IL-2R) являє собою гетеротримірний рецептор клітинної поверхні, що складається з -, - і cполіпептидних ланцюгів (K D 10-11моль). 55kDа Ланцюг, відомий також як антиген IL-2R , CD25, р55 і Тас (активації Т-клітин), є унікальним до IL2R. -Ланцюг (CD 122; Р75) і c-ланцюг (CD 132) є частиною надсімейства цитокинових рецепторів (рецепторів гематопоетину) і являють собою функціональні компоненти інших цитокинових рецепторів, наприклад, IL-15R (Waldmann (1993) Immunol Today 14(6):264-70; Ellery et al. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 27-40). Рецептор із проміжної афінністю являє собою димер, що складається з - і c-ланцюгів (KD 10-9моль), у той час як низькоафінний рецептор складається з одномірної -субодиниці, що не має здатності до сигнальної трансдукції (K D 10-8моль) (Waldmann (1993) Immunol. Today 14(6):264-70). Спочиваючі Т-клітини, В-клітини і моноцити експресують декілька молекул CD25. Однак цей рецептор швидко транскрибується і експресується при активації (Ellery et al. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 27-40; Morris et al. (2000) Ann. Rheum. Dis. 59 (Suppl. 1):і109-14). Клітини, що експресують високоафінний IL-2R, експресують CD25 (CD25-субодиницю) у надлишку, що приводить до утворення як високоафінних, так і низькоафінних IL-2 зв'язувальних профілів (Waldmann et al. (1993) Blood 82(6):1701-12; de Jong et al. (1996) J. Immunol. 156(4): 1339-48). CD25 сильно експресується Т-клітинами при деяких аутоімунних хворобах, наприклад, при ревматичному артриті, склеродермі й уєвіті, а також при шкірних захворюваннях, наприклад, при псоріазі й атопічному дерматиті, і у різноманітних лімфоїдних новоутвореннях, наприклад, при Т-клітинній лейкемії і хворобі Ходжкіна (Waldmann (1993) Immunol. Today 14(6):264-70; Kuttler et al. (1999) J. Mol. Med. 77(l):226-9). Крім того, експресія CD25 зв'язана з відторгненням алотрансплантата і з реакціями "трансплантат проти хазяїна" (Jones et al. (2002) J. Immunol. 168(3): 1123-1130; Anasetti et al. (1994) Blood 84(4): 1320-7). Таким чином, CD25 є важливою мішенню при антитілоопосередкованій терапії, наприклад, для зменшення ступеня запалення при аутоімунних захворюваннях, для лікування злоякісних пухлин і для запобігання відторгнення трансплантата. Однак, незважаючи на те, що отримані на сьогоднішній день результати і клінічний досвід чітко визначають CD25 як корисну мішень при імунотерапії, вони також свідчать про те, що доступні в даний час мишачі і химерні антитіла не являють собою ідеальні терапевтичні агенти. Таким чином, існує 8 потреба в одержанні додаткових терапевтичних антитіл проти CD25, які були б ефективними для попередження і/або лікування ряду захворювань, при яких клітини експресують CD25. Короткий виклад суті винаходу Відповідно до даного винаходу запропоновані терапевтичні засоби на основі нових антитіл для лікування і/або попередження захворювань, при яких клітини експресують CD25, включаючи відторгнення трансплантатів органів, тканин і клітин, у тому числі відторгнення алотрансплантатів і ксенотрансплантатів, захворювань, пов'язаних з реакцією "трансплантат проти хазяїна", аутоімунних захворювань, запальних і проліферативних захворювань шкірного покриву і лімфоїдних новоутворень. Удосконалення антитіл, охоплюваних даним винаходом, полягає в тому, що вони цілком є антитілами людини і, таким чином, потенційно виявляють імуногенетичні властивості в пацієнтів у меншому ступені. Ці антитіла характеризуються також перевагами, обумовленими їх чудовими функціональними (наприклад, терапевтичними) властивостями. Як показано в даному описі, антитіла людини, запропоновані відповідно до даного винаходу, зв'язуються з CD25A при визначенні твердофазним імуноферментним аналізом (ELISA) або методом проточної цитометрії. Запропоновані антитіла людини, як правило, зв'язуються з CD25A з константою рівноваги дисоціації (KD) приблизно 10 -8моль або менше, наприклад, 10-9моль або менше, 10 -10моль або менше або 10 -11моль або навіть менше, що визначається методом поверхнево-плазмонного резонансу (SPR) у приладі BIAcore 3000 з використанням рекомбінантного IL-2R людини як ліганду й антитіла як аналізованої речовини. Такі антитіла, як правило, не вступають у перехресну реакцію з відповідними антигенами клітинної поверхні і, таким чином, не інгібують їхню функцію. Крім того, запропоновані антитіла людини інгібують (наприклад, блокують) взаємодію CD25 з його лігандом, тобто IL-2. Наприклад, зв'язування може бути загальмовано, щонайменше, приблизно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% або 100%. Прикладами клітин, що експресують CD25, і, таким чином, їхні клітинні функції, які можуть бути інгібовані запропонованими антитілами людини, включають серед інших Т-клітини, Вклітини і моноцити. Наприклад, як показано в даному описі, запропоновані антитіла людини можуть інгібувати зв'язування IL-2 з CD25. Таке інгібування зв'язування IL-2 з CD25 супроводжується інгібуванням різних клітинних механізмів, що приводяться в дію зв'язуванням IL-2. Як також показано в даному описі, антитіла запропоновані людини можуть інгібувати Т-клітинну проліферацію, індуковану антитілами проти CD3, в залежності від дози. Як також показано в даному описі, запропоновані антитіла людини можуть інгібувати реакцію змішаної культури лімфоцитів (MLR) також в залежності від дози. Інгібування проліферації в таких експериментах може контролюватися шляхом 9 90082 10 зменшення ступеня акумулювання клітинної маси ти охарактеризовані однією або більше з наступз використанням результатів ELISA-аналізу або них властивостей: зменшення ступеня включення BrdU у ДНК клітиa) специфічність до CD25 людини; ни. b) афінність зв'язування з CD25, що відповідає Антитіла людини, запропоновані відповідно до KD приблизно 10 -8моль або менше, наприклад, 109 даного винаходу, включають антитіла lgG1 (напримоль або менше, 10 -10моль або менше або 1011 моль або навіть менше, що визначається метоклад, IgG1, i IgG1, ) і IgG4 (наприклад, IgG4, i дом поверхнево-плазмонного резонансу (SPR) у IgG4, ). Однак даний винахід охоплює також і інші приладі BIAcore 3000 з використанням рекомбінаізотипи антитіл, включаючи IgG2, IgG3, IgM, IgA1, нтного IL-2R людини як ліганду й антитіла як IgA2, секреторні IgA, IgD і IgE. Антитіла можуть аналізованої речовини; являти собою цілі антитіла або їх антигензв'язуваc) надання толерантністі Т-клітинам; льні фрагменти, включаючи, наприклад, Fab, Fab', d) здатність блокувати взаємодію CD25 зі своF(ab)2, F(ab')2, Fv, одноланцюжкові Fv (scFv) фраїм лігандом, тобто IL-2; гменти або біспецифічні антитіла. Крім того, антиe) здатність видаляти Т-клітини, які експресугензв'язувальні фрагменти включають домензв'яють CD25; зувальні злиті протеїни імуноглобуліну, що містять f) здатність інгібувати проліферацію Т-клітин, (і) домензв'язувальний поліпептид (наприклад, які експресують CD25; варіабельну область важкого ланцюга або варіаg) здатність інгібувати Т-клітинну проліферабельну область легкого ланцюга), що вбудовуєтьцію мононуклеарних клітин периферичної крові ся в шарнірну область імуноглобуліну, (іі) СН2(РВМС), індуковану антитілами проти CD3; константну область важкого ланцюга імуноглобуh) здатність блокувати реакцію змішаної кульліну, що вбудовується в шарнірну область, і (ііі) тури лімфоцитів (MLR) і/або СН3-константну область важкого ланцюга імуногі) інтерналізація CD25, який експресується на лобуліну, що вбудовується в СН2-константну обТ-клітини. ласть. Такі домензв'язувальні злиті протеїни імуноТермін "надати толерантність" у тому змісті, у глобуліну додатково розкриті в US 2003/0118592 і якому він використовується в даному описі, ознаUS 2003/0133939. Конкретні запропоновані антитічає, що Т-клітини не здатні реагувати на антиген ла людини включають ті з них, що називаються після провокаційної проби з цим антигеном. АВ1, АВ7, АВ11 і АВ12, кодовані нуклеїновими Запропоновані антитіла людини проти CD25 кислотами важкого ланцюга імуноглобуліну людиможуть бути дериватизовані, приєднані або співени і каппа легкого ланцюга імуноглобуліну людини, кспресовані з іншими зв'язувальними імунологічщо містять послідовності нуклеотидів у своїх варіними специфічностями. У конкретному варіанті абельних областях, як це зазначено в SEQ ID здійснення винаходу антитіла приєднуються до №№: 1, 5, 9 або 13 і SEQ ID №№: 3, 7, 11 або 15 однієї або більше імунологічних специфічностей відповідно, та їх консервативні секвенціальні модля різних антигенів-мішеней, наприклад, для андифікації. В іншому варіанті здійснення винаходу тигену на ефекторній клітині. антитіла людини характеризуються наявністю ваТаким чином, даний винахід включає також біріабельних областей важкого ланцюга імуноглобуспецифічні і мультиспецифічні молекули, що зв'яліну людини і каппа легкого ланцюга імуноглобулізуються як з CD25 людини, так і з одним або більну людини, що містять послідовності нуклеотидів, ше різними антигенами-мішенями, наприклад, з як це зазначено в SEQ ID №№; 2, 6, 10 або 14 і CD3, CD4, IL-15R, з мембранозв'язаним або рецеSEQ ID №№: 4, 8, 12 або 16 відповідно, та їх консервативні секвенціальні модифікації. пторзв'язаним TNF- або з рецепторзв'язаним ILІнші конкретні запропоновані антитіла людини 15. включають ті з них, що містять CDR (гіперваріабеВ іншому варіанті здійснення винаходу запрольну область), що має CDR1 важкого і легкого лапоновані антитіла людини проти CD25 можуть бунцюгів імуноглобуліну людини, CDR2 важкого і ти дериватизовані, приєднані або співекспресовані легкого ланцюгів імуноглобуліну людини і CDR3 з іншою функціональною молекулою, наприклад, з важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну людини, іншим пептидом або протеїном (наприклад, Fabде: фрагментом). Наприклад, антитіло може бути фу(a) CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга ім ункціонально приєднане (наприклад, хімічним приноглобуліну людини містять послідовність аміноєднанням, генетичним злиттям, нековалентною кислот, вибрану з групи, що складається з CDR1, асоціацією або яким-небудь іншим шляхом) до CDR2 і CDR3 послідовностей амінокислот, показаоднієї або більше молекулярних частинок, наприних на фігурах 1-10 (SEQ ID №№: 17-19, 23-25, 29клад, до іншого антитіла (наприклад, з метою оде31 або 35-37), та її консервативні секвенціальні ржання біспецифічного або мультиспецифічного модифікації, і антитіла), цитоксину, клітинного ліганду або анти(b) CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга ім угену (наприклад, з метою одержання імунокон'юганоглобуліну людини містять послідовність аміноту, наприклад, імунотоксину). Ан титіло може бути кислот, вибрану з групи, що складається з CDR1, також приєднане до інших терапевтичних складоCDR2 і CDR3 послідовностей амінокислот, показавих, наприклад, до радіоізотопу, до дрібномолек уних на фігурах 1-10 (SEQ ID №№: 20-22, 26-28, 32лярного протиракового лікарського засобу, до про34 або 38-40), та її консервативні секвенціальні тизапального агенту або до імунодепресивного модифікації. агенту. Таким чином, даний винахід охоплює велиВ іншому варіанті здійснення винаходу запроку різноманітність кон'югатів антитіл, біспецифічпоновані антитіла людини проти CD25 можуть буних і мультиспецифічних молекул і злитих протеї 11 90082 12 нів, які всі зв'язуються з CD25-експресуючими клічервоний вовчак, злоякісна міастенія, запалення тинами і які можуть бути використані для спрямокишечнику, хвороба Крона, виразковий коліт, дерваної доставки інших молекул до таких клітин. матополіміазит, синдром Шегрена, артеріїт, вклюЗапропоновані антитіла людини, імунокон'югачаючи артеріїт гігантських клітин, гіпопластичну ти, біспецифічні і мультиспецифічні молекули іанемію, астму, склеродермію й увеїт; запальні або композиції можуть бути використані в багать ох гіперпроліферативні захворювання шкірного покрізних способах інгібування, кілінгу і/або модулюриву, наприклад, псоріаз, включаючи бляшкоутвовання активності і/або росту (наприклад, проліферюючий псоріаз, долонно-підошовний пустульоз рації) клітин, які експресують CD25. В одному з (РРР), ерозивний червоний плоский лишай, буль оваріантів здійснення винаходу запропонований зна пухирчатка, бульозний епідермоліз, контактний спосіб включає інгібування проліферації Т-клітин, дерматит і атопічний дерматит; і різноманітні лімякі експресують CD25. В іншому варіанті здійсненфоїдні новоутворення, наприклад, Т-клітинна лейня винаходу запропонований спосіб включає інгікемія, хвороба Ходжкіна, лейкоз "волосатих" клібування реакцій "трансплантат проти хазяїна", тин або лімфома шкірних Т-клітин, включаючи наприклад, MLR. У ще одному варіанті здійснення грибоподібний мікоз і синдром Сезарі. винаходу запропонований спосіб включає кілінг Іншими захворюваннями, що можуть піддаваклітин, які експресують CD25 (наприклад, шляхом тися лікуванню, є: комплементопосередкованого лізису або приєдзлоякісний розвиток хвороб, при яких інгібунання антитіла до цитоксину). Клітини переважно вання інфільтрації CD25+ регуляторних Т-клітин є вбиваються або інгібуються без кілінгу або інгібусприятливим чинником, наприклад, рак шлунка, вання активності клітин, що не експресують CD25, ракові захворювання стравоходу, злоякісна мелаале які можуть, наприклад, експресувати структурнома, рак ободової і прямої кишки, рак підшлунк оно-залежний антиген клітинної поверхні (напривої залози, рак грудей, дрібноклітинний рак легень, клад, без здатності вступати в перехресну реакцію недрібноклітинний рак легень, рак шийки матки, з залежними, але функціонально індивідуальними рак яєчок і гіпернефроїдний рак; антигенами клітинної поверхні). Клітини, що ек сгематологічні розлади, наприклад, Т-клітинна пресують CD25, які можуть бути інгібовані або лейкемія/лімфома в дорослих, анапластична вевбиті з використанням запропонованих антитіл ликоклітинна лімфома, хронічна лімфоцитарна людини включають, наприклад, активовані Тчейкемія (CLL)/малолімфоцитарна лімфома (SLL), лімфоцити, В-лімфоцити, моноцити, мікрофаги, периферійна Т-клітинна лімфома і вторинний амікупферові клітини печінки і клітини Лангерганса лоїдоз; дерми, які експресують CD25. шкірні захворювання, наприклад, гангренозна Таким чином, запропоновані антитіла людини піодермія, кільцеподібна гранулема, алергійний можуть бути використані для лік ування і/або попеконтактний дерматит, рубцевий пемфігоїд і герпес редження ряду захворювань і станів, при яких аквагітних; тивовані клітини, які експресують CD25, відіграють печінково-шлунково-кишкові захворювання, активну роль у патогенезі, шляхом введення антинаприклад, колагеновий коліт, склерозуючий хотіл пацієнтам, що страждають на ці захворювання лангіт, хронічний активний гепатит, вовчаковий або знаходяться в таких станах. Приклади хвороб, гепатит, аутоімунний гепатит, алкогольний гепаякі можуть піддаватися лікуванню (наприклад, у тит, хронічний панкреатит і гострий панкреатит; вигляді зниження інтенсивності процесу) або запосерцеві захворювання, наприклад, міокардит і біганню, включають, але не обмежуються ними, перикардит; відторгнення трансплантата, включаючи відторгсудинні захворювання, наприклад, артеріоскнення алотрансплантата і ксенотрансплантата, у лероз, гігантоклітинний артрит/ревматична поліміпацієнтів, яким пересаджуються або яким пересаальгія, синдром Такаясу, нодозний поліартрит, джені тканини або органи, наприклад, при тран спсиндром Кавасакі, гранулематоз Вегенера, мікрослантації серця, легені, комбінації серця і легені, копічний поліангіїт, синдром Черга-Штрауса, лейтрахеї, нирки, печінки, підшлункової залози, стракоцитокластичний ангіїт і вторинний лейкоцитоквоходу, кишечнику, шкірного покриву, кінцівки, п уластичний васкуліт; повини, стовбурних клітин, островкових клітин і ниркові захворювання, наприклад, гострий т.д. Запропоновані антитіла людини можуть, таким гломерулонефрит, хронічний гломерулонефрит, чином, бути використані як профілактичні засоби нефрит з мінімальними змінами і синдром Гудпаспри відторгненні алотрансплантата і ксенотрансптура; лантата або для реверсування, лікування або позахворювання дихальних шляхі в, наприклад, легшення приступів відторгнення алотрансплантаальвеоліт, облітеруючий бронхіоліт, силікоз і бета або ксенотрансплантата. риліоз; До інших хвороб, що можуть піддаватися лік уневралгічні захворювання, наприклад, мнованню, відносяться захворювання "трансплантат жинний склероз, хвороба Альцгеймера, злоякісна проти хазяїна", наприклад, захворювання "транспміастенія, хронічна демієлінізуюча поліневропатія і лантат проти хазяїна" при переливанні крові і заполірадикулоневрит, включаючи синдром Гійєнахворювання "трансплантат проти хазяїна" при пеБарре; ресадженні кісткового мозку; запальні, імунні або захворювання сполучних тканин, наприклад, аутоімунні хвороби, наприклад, ревматоїдний порецидивуючий поліхондрит, саркоїдоз, системний ліартрит, анкілозуючий спондилоартрит, псоріатичервоний вовчак, туберкульозний вовчак, дискоїдчний артрит, діабет типу 1, інсулін-залежний діаний червоний вовчак, дискоїдний вовчаковий нефбет типу 2, множинний склероз, системний рит, синдром хронічної втоми і фіброміалгія; 13 90082 14 ендокринологічні захворювання, наприклад, зуються з CD25. В одному з конкретних варіантів хвороба Гейвса, тиреоїдит Хасімото і поверхневий здійснення винаходу трансгенною твариною, відтиреоїдит; і мінною від людини, є трансгенна миша, що має вірусні інфекції, наприклад, тропічний спастигеном, який містить трансген або трансхромосому чний парапарез. важкого ланцюга імуноглобуліну людини і трансген В одному з конкретних варіантів здійснення або трансхромосому легкого ланцюга імуноглобувинаходу пацієнт, якому вводять антитіло, додатліну людини, які кодують все або частину запропоково піддається лікуванню одним або більше донованого антитіла. Трансгенна тварина, відмінна даткових терапевтичних агентів, наприклад, ім увід людини, може бути імунізована очищеним або нодепресивними агентами, протизапальними збагаченим препаратом CD25-антигену і/або кліагентами, хіміотерапевтичними агентами, цитотоктин, які експресують CD25. Переважно, щоб транссичними агентами або іншими агентами, що призгенна тварина, відмінна від людини, наприклад, начені для посилення терапевтичної дії антитіла. трансгенна миша, була здатна продукувати мноВідповідно до ще одного аспекту даного винажинні ізотипи моноклональних антитіл людини ходу запропонований спосіб виявлення присутноспроти CD25 (наприклад, IgG, Ig A і/або Ig M) у реті CD25 in vitro або in vivo у зразку або в пацієнта, зультаті V-D-J рекомбінації і переключення ізотинаприклад, з метою діагностики CD25-залежного пу. Переключення ізотипу може мати місце, напризахворювання, переважно на ранній стадії. Це клад, у формі класичного або некласичного може бути також корисно для контролю протікання переключення ізотипу. хвороби й ефекту лікування антитілом проти CD25 Відповідно до ще одного аспекту даного винаі для визначення і регулювання дозування антитіходу запропоновані виділені В-клітини від описаної ла, що підлягає введенню. В одному з варіантів вище трансгенної тварини, відмінної від людини, здійснення винаходу виявлення присутності CD25 наприклад, трансгенної миші, що експресують ану зразку досягається шляхом введення цього зразтитіла людини проти CD25. Потім виділені Вка, який слід перевірити, по можливості разом з клітини можуть бути імморталізовані шляхом злитконтрольним зразком, у контакт із запропонованим тя з імморталізованою клітиною з метою одержанмоноклональним антитілом людини таким чином, ня джерела (наприклад, гібридоми) антитіл людищоб між антитілом і CD25 міг би утворитися комни проти CD25. Такі гібридоми (наприклад, які плекс. Потім здійснюється виявлення утворення продукують антитіла людини проти CD25) також комплексу (наприклад, з використанням ELISAохоплюються даним винаходом. аналізу, проточної цитометрії або вестернЯк показано на прикладах у даному описі, заблотингу). Якщо разом із зразком, що перевіряєтьпропоновані антитіла людини можуть бути отрися, використовується контрольний зразок, вия вмані безпосередньо з гібридом, які експресують лення комплексу здійснюють в обох зразках, і антитіло, або можуть бути клоновані (наприклад, з будь-яке статистично істотне розходження між гібридом або фага, що демонструють антигензв'язразками в утворенні комплексу свідчить про призані ділянки антитіл) і рекомбінантно експресовані сутність CD25 у зразку, що перевіряється. Спосіб в клітині-хазяїні (наприклад, СНО-клітині (клітині in vivo може бути здійснений шляхом використання яєчка китайського хом'ячка) або NS/0-клітині). Інтехніки візуалізації, наприклад, PET (томографія шими прикладами клітин-хазяїнів можуть служити на позитронному випромінюванні) або SPECT мікроорганізми, наприклад, Е. coli і грибки, напри(комп'ютерна томографія на однофотонному виклад, дріжджі. В іншому варіанті здійснення винапромінюванні). ходу вони можуть бути отримані рекомбінантно в Відповідно до додаткового аспекту даний витрансгенній тварині, відмінної від людини, або ронахід відноситься до антиідіотипічних антитіл, що слині. Таким чином, відповідно до ще одного аспезв'язуються із запропонованими моноклональними кту даного винаходу запропоновані способи одерантитілами людини. Ці антиідіотипічні антитіла жання моноклональних антитіл людини, що можуть бути використані як імунодіагностичний зв'язуються з CD25 людини. В одному з варіантів інструмент для виявлення і кількісного визначення здійснення винаходу спосіб включає імунізацію рівнів вмісту моноклональних антитіл людини протрансгенної тварини, відмінної від людини, наприти CD25 у зразках, приготовлених у лабораторних клад, трансгенної миші, як це описано вище (наумовах або взятих у пацієнтів. Це може бути кориприклад, шляхом введення геному, що містить сно для вивчення фармакокінетики антитіла проти трансген важкого ланцюга імуноглобуліну людини і CD25 або для визначення і регулювання дозувантрансген легкого ланцюга імуноглобуліну людини, ня антитіла проти CD25 і для контролю протікання які кодують все або ділянку антитіла людини проти хвороби й ефекту лікування пацієнта. CD25), з очищеним або збагаченим препаратом Мишачі антиідіотипічні антитіла можуть бути CD25-антигену людини і/або клітинами, які експреотримані, наприклад, шляхом імунізації Balb/Cсують CD25 людини. Потім можуть бути отримані миші запропонованими моноклональними антитіВ-клітини (наприклад, селезінкові В-клітини) твалами людини і генерування гібридом із селезінки рини і злиті з клітинами мієломи з метою одержанцієї миші шляхом злиття з клітинами мієломи, наня іммортальних клітин мієломи, що секретують приклад, NS1, з використанням стандартної метомоноклональні антитіла людини проти CD25. дики. Відповідно до ще одного аспекту даного винаВідповідно до ще одного аспекту даного винаходу запропоновані молекули нуклеїнових кислот, ходу запропонована трансгенна тварина, відмінна які кодують антитіла людини проти CD25 (напривід людини, наприклад, трансгенна миша, яка ек склад, їх варіабельні області), а також рекомбінантпресує моноклональні антитіла людини, що зв'яні вектори експресії, що включають запропоновані 15 90082 16 нуклеїнові кислоти і клітини-хазяїни, трансфіковані Фіг.12 - діаграма, що ілюструє інгібування зв'ятакими векторами. Способи одержання антитіл зування антитіла Zenapax з CD25 моноклональшляхом культивування цих клітин-хазяїнів також ними антитілами людини АВ1, АВ7, АВ11 і АВ12. охоплюються даним винаходом. Конкретні запроФіг.13 - діаграма, що ілюструє інгібування пропоновані нуклеїнові кислоти містять послідовності ліферації Т-клітин, викликаної антитілами проти нуклеотидів, показані в SEQ ID №№: 1, 5, 9 або 13 CD3 (з використанням РВМС), моноклональними і SEQ ID №№: 3, 7, 11 або 15, які кодують відповіантитілами людини АВ1, АВ7, АВ12 у порівнянні з дно важкі і легкі ланцюги антитіла людини АВ1, інгібуванням контрольним антитілом (hlgG1/ ) і АВ7, АВ11 і АВ12 проти CD25. антитілом Zenapax . Інші ознаки і переваги даного винаходу стаФіг.14 - діаграма, що ілюструє інгібування MLR нуть очевидними з наведеного нижче докладного моноклональними антитілами людини АВ1, АВ7, опису і формули винаходу. АВ12 у порівнянні з інгібуванням контрольним анКороткий опис креслень титілом (hlgG1/ ) і антитілом Zenapax . Фіг.1 - послідовності амінокислот VJ-областей Фіг.15 - фотографії, що ілюструють викорислегкого (каппа) ланцюга моноклональних антитіл тання ФІТЦ (флуоресцинізотіоціанат)-фільтра, людини АВ1, АВ7, АВ11 і АВ12 (SEQ ID №№: 4, 8, який візуалізує інтерналізацію CD25 ФІТЦ-міченим 12 і 16 відповідно) із зазначеними CDR. АВ12. На Фіг.15А показаний результат преінкубації Фіг.2 - послідовності амінокислот VDJТ-лімфобластів ФІТЦ-міченим АВ12 після 18областей важкого ланцюга моноклональних антигодинної інкубації при 37°С, а на Фіг.15В показаний тіл людини АВ1, АВ7, АВ11 і АВ12 (SEQ ID №№: 2, результат культивації Т-лімфобластів після 186, 10 і 14 відповідно) із зазначеними CDR. годинної культивації при 37°С у присутності ФІТЦФіг.3 - послідовність амінокислот (SEQ ID №: міченого АВ12. На Фіг.15С для порівняння показа2) і відповідна послідовність нуклеотидів (SEQ ID ний результат культивації Т-лімфобластів після №: 1) VDJ-області важкого ланцюга моноклональ18-годинної культивації при 37°С у присутності ного антитіла людини АВ1 із зазначеними CDR. ФІТЦ-міченого ізотипичного контрольного антитіла Фіг.4 - послідовність амінокислот (SEQ ID №: (проти KHL). 4) і відповідна послідовність нуклеотидів (SEQ ID Фіг.16 - інтерналізація CD25 ФІТЦ-міченим №: 3) VJ-області легкого (каппа) ланцюга монокАВ12 за результатами виміру методом проточної лонального антитіла людини АВ1 із зазначеними цитометрії, де відношення середньої флуоресценCDR. тної інтенсивності (MFI) понад 1 указує на те, що Фіг.5 - послідовність амінокислот (SEQ ID №: інтерналізація мала місце. На Фіг.16А показаний 6) і відповідна послідовність нуклеотидів (SEQ ID результат преінкубації Т-лімфобластів ФІТЦ№: 5) VDJ-області важкого ланцюга моноклональміченим АВ12 при відповідно 4°С і 37°С, а на ного антитіла людини АВ7 із зазначеними CDR. Фіг.16В показаний результат культивації ТФіг.6 - послідовність амінокислот (SEQ ID №: лімфобластів у присутності ФІТЦ-міченого АВ12 8) і відповідна послідовність нуклеотидів (SEQ ID при відповідно 4°С і 37°С. №: 7) VJ-області легкого (каппа) ланцюга монокДокладний опис винаходу лонального антитіла людини АВ7 із зазначеними Відповідно до даного винаходу запропоновані CDR. терапевтичні засоби на основі антитіл для лікуФіг.7 - послідовність амінокислот (SEQ ID №: вання і діагностики різних захворювань, при яких 10) і відповідна послідовність нуклеотидів (SEQ ID клітини експресують CD25. Запропоновані відпові№: 9) VDJ-області важкого ланцюга моноклональдно до винаходу терапевтичні засоби припускають ного антитіла людини АВ11 із зазначеними CDR. застосування виділених моноклональних антитіл Фіг.8 - послідовність амінокислот (SEQ ID №: людини, які специфічно зв'язуються з епітопом, що 12) і відповідна послідовність нуклеотидів (SEQ ID є присутнім на CD25. Такі антитіла включають усі №: 11) VJ-області легкого (каппа) ланцюга моноквідомі ізотипи, наприклад, антитіла IgA, lgG1-4, лонального антитіла людини АВ11 із зазначеними IgE, Ig M i IgD. CDR. В одному з варіантів здійснення винаходу анФіг.9 - послідовність амінокислот (SEQ ID №: титілом є антитіло lgG1, більш конкретно, ізотип 14) і відповідна послідовність нуклеотидів (SEQ ID lgG1, або lgG1, . В іншому варіанті здійснення №: 13) VDJ-області важкого ланцюга моноклонавинаходу антитілом є антитіло IgG3, більш конкрельного антитіла людини АВ12 із зазначеними CDR. тно, ізотип IgG3, або IgG3, . У ще одному варіанті Фіг.10 - послідовність амінокислот (SEQ ID №: здійснення винаходу антитілом є антитіло IgG4, 16) і відповідна послідовність нуклеотидів (SEQ ID більш конкретно, ізотип IgG4, або IgG4, . І ще в №: 15) VJ-області легкого (каппа) ланцюга монокодному варіанті здійснення винаходу антитілом є лонального антитіла людини АВ12 із зазначеними антитіло IgA1 або IgA2. I ще в одному варіанті CDR. здійснення винаходу антитілом є антитіло IgM. Фіг.11 - діаграма, що ілюструє інгібування зв'яВ одному з варіантів здійснення винаходу анзування IL-2 зі своїм рецептором, тобто CD25, сутитіла людини продукують в трансгенній тварині, пернатантами моноклональних антитіл людини відмінної від людини, наприклад, в трансгенній АВ1, АВ7, АВ11 і АВ12 у порівнянні з інгібуванням миші, здатній продукувати множинні ізотипи монозв'язування IL-2 антитілом Zenapax (даклизумаб, клональних антитіл людини до CD25 шляхом V-Dрекомбинантне гуманізоване lgG1 антитіло проти J рекомбінації і переключення ізотипу. Такою траCD25, Roche). нсгенною твариною може бути також кролик, призначений для продукування поліклональних антитіл, як це розкрито в US 2003/0017534. Відп овідно, 17 90082 18 винахід охоплює також поліклональні антитіла нзв'язувальну ділянку") або його один ланцюг. "Анлюдини, що специфічно зв'язуються з CD25. Таким титіло" відноситься до глікопротеїну, що містить чином, аспекти даного винаходу включають не щонайменше два важких (Н) ланцюги і два легких тільки антитіла, фрагменти антитіл і фармацевти(L) ланцюга, взаємозв'язані дисульфідними зв'язчні композиції на їхній основі, але також і трансками, або до його антигензв'язувальної ділянки. генні тварини, відмінні від людини, В-клітини, траКожен важкий ланцюг складається з варіабельної нсфектоми клітин-хазяїнів і гібридоми, що області важкого ланцюга (у даному описі скорочепродукують моноклональні антитіла. Запропонона як VH) і константної області важкого ланцюга. вані також способи використання запропонованих Кожен легкий ланцюг складається з варіабельної антитіл для блокування або інгібування клітин, що області легкого ланцюга (у даному описі скорочена експресують CD25, які корисні при лікуванні заяк VL) і константної області легкого ланцюга. Обхворювань, зв'язаних з CD25. Винаходом охоплюласті VH і VL можуть бути додатково підрозділені ються також способи використання запропонована гіперваріабельні області, названі областями, них антитіл для виявлення клітини, що експресує що визначають комплементарність (CDR), переCD25. мішані з областями, які є більш консервативними і З метою більш швидкого розуміння даного виякі називаються остовними областями (FR). Кожна находу нижче наведені визначення деяких терміз областей VH і VL складається з трьох CDR і чотинів. Додаткові визначення викладені в док ладному рьох FR, аранжованих від аміно-кінців до карбокописі, який наводиться нижче. сильних кінців у наступному порядку: FR1, CDR1, Терміни "CD25" і "CD25-антиген" використовуFR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні області ються в даному описі взаємозамінно і включають важких і легких ланцюгів містять зв'язувальний будь-які варіанти, ізоформи і видові гомологи домен, що взаємодіє з антигеном. Константні обCD25 людини, що експресуються клітинами приласті антитіл можуть служити посередниками в родним шляхом або експресуються на клітини, зв'язуванні імуноглобуліну з хазяйськими тканинатрансфіковані CD25-геном. Синоніми CD25, прими або факторами, включаючи різноманітні клітийняті до вживання в даній області техніки, вклюни імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) чають антиген CD25, р55 і Тас (активація Т-клітин). і перший компонент (Clq) класичної комплементаЗв'язування запропонованого антитіла з CD25рної системи. антигеном інгібує і/або блокує зв'язування CD25 з Термін "антигензв'язувальна ділянка" антитіла його лігандом, тобто IL-2, і, отже, його кінцеву клі(або просто "ділянка антитіла") в контексті даного тинну функцію. Наприклад, в одному з варіантів опису відноситься до одного або більше фрагменздійснення винаходу запропоновані антитіла лютів антитіла, які зберігають здатність специфічно дини інгібують проліферацію Т-клітин, викликану зв'язуватися з антигеном (наприклад, з CD25). антитілами проти CD3. В іншому варіанті здійсПоказано, що антигензв'язувальна функція антитінення винаходу моноклональні антитіла людини ла може бути виконана фрагментами інтактного інгібують MLR. або повного антитіла. Приклади зв'язувальних Термін "інгібує ріст" в контексті даного опису фрагментів, охоплюваних терміном "антигензв'я(наприклад відносно клітин), передбачає включензувальна ділянка" антитіла, включають (і) Fabня будь-якого вимірюваного зменшення росту кліфрагмент, одновалентний фрагмент, що складатин при контакті з антитілом проти CD25 у порівється з доменів VL , VH, C L і С Н1; (ii) F(ab')2нянні з ростом цих же клітин, що не знаходяться в фрагмент, двовалентний фрагмент, що містить контакті з антитілом проти CD25, наприклад, інгідва Fab-фрагменти, взаємозв'язаних дисульфідбування росту клітинної культури на, щонайменним містком у шарнірній області; (ііі) Fd-фрагмент, ше, приблизно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, що складається з доменів VH і С H1; (iv) Fv70%, 80%, 90%, 99% або 100%. фрагмент, що складається з доменів VL і VH; (v) Терміни "інгібує зв'язування" і "блокує зв'язуdAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544вання" в контексті даного опису (наприклад, відно546), що складається з домену VH; (vi) виділену сно інгібування/блокування зв'язування IL-2 з гіперваріабельну область (CDR) і (vii) комбінацію CD25), застосовуються взаємозамінно й охоплюдвох або більше виділених CDR, що необов'язково ють як часткове, так і повне інгібуванможуть бути з'єднані синтетичними лінкером. Крім ня/блокування. Інгібування/блокування зв'язування того, хоча два домени Fv-фрагмента, тобто VL l і IL-2 з CD25 переважно зменшує або змінює норVH, кодуються для роздільних генів, вони можуть мальний рівень або тип клітинного сигналізування, бути з'єднані з використанням реком бінантних мещо має місце, коли IL-2 зв'язується з CD25 без тодів за допомогою синтетичного лінкера, що доінгібування або блокування. Інгібування і блок узволяє зробити їх у вигляді одного протеїнового вання припускають також включення будь -якого ланцюга, у якому області VL і VH спарені з утвовимірюваного зменшення афінності зв'язування ILренням одновалентних молекул (відомий як одно2 з CD25 при контакті з антитілом проти CD25 у ланцюжковий Fv-фрагмент (scFv); див., наприклад, порівнянні з лігандом, що не знаходиться в контакBird et al. (1988) Science 242:423-426; і Huston et al. ті з антитілом проти CD25, наприклад, блокування (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). зв'язування IL-2 з CD25 на, щонайменше, приблиПередбачається, що такі одноланцюжкові антитіла зно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, також охоплюються терміном "антигензв'язуваль90%, 99% або 100%. на ділянка" антитіла. Ще одним прикладом є доТермін "антитіло" в контексті даного опису мензв'язувальні злиті протеїни імуноглобуліну, що включає інтактні антитіла і будь-який антигензв'ямістять (І) домензв'язувальний поліпептид, що зувальний фрагмент антитіла (наприклад, "антигевбудовується у поліпептид шарнірної області ім у 19 90082 20 ноглобуліну, (іі) СН2-константну область важкого тичних послідовностей імуноглобуліну людини. ланцюга імуноглобуліну, що вбудо вується в шарЗапропоновані антитіла людини можуть включати нірну область, і (ііі) СН3 -константну область важтакож залишки амінокислот, не кодовані гаметичкого ланцюга імуноглобуліну, що вбудовується в ними послідовностями імуноглобуліну людини СН2-константну область. Домензв'язувальний по(наприклад, мутації, викликані неспецифічним або ліпептид може являти собою варіабельну область сайт-специфічним мутагенезом in vitro або сомаважкого ланцюга або варіабельну область легкого тичною мутацією in vi vo). Термін "антитіло людини" ланцюга. Домензв'язувальні злиті протеїни імуногв контексті даного опису не передбачає, однак, лобуліну додатково розкриті в US 2003/0118592 і включення антитіл, у яких CDR-послідовності, US 2003/0133939. Ці фрагменти антитіл одерж уотримані з зародкової лінії інших видів ссавців, ють з використанням способів, відомих фахівцям у наприклад, миші, трансплантовані на остовні посданій області техніки, причому ці фрагменти теслідовності імуноглобуліну людини. туються для використання в такий же спосіб, що і Терміни "моноклональне антитіло" і "композиінтактні антитіла. ція моноклональних антитіл" в контексті даного Термін "епітоп" означає протеїнову детермінаопису відносяться до препарату молекул антитіл нту, здатн у специфічно зв'язуватися з антитілом. одномолекулярної композиції. Композиція монокЕпітопи, як правило, складаються з хімічно активлональних антитіл демонструє одну специфічність них поверхневих гр упувань молекул, наприклад, зв'язування й афінність до конкретного епітопу. амінокислот або цукрових бічних ланцюгів, і, як Таким чином, термін "моноклональне антитіло правило, мають конкретні три простороволюдини" відноситься до антитіл, що виявляють структурні характеристики, а також конкретні хараодну специфічність зв'язування і які мають варіактеристики заряду. Конформаційні і неконформабельні і константні області, отримані з гаметичних ційні епітопи розрізняються тим, що зв'язування з послідовностей імуноглобуліну людини. В одному першими, а не з останніми, втрачається в резульз варіантів здійснення винаходу моноклональні таті обробки денатуруючими розчинниками. антитіла людини продукуються гібридомою, що Термін "біспецифічна молекула" передбачає включає В-клітину, отриману з трансгенної або включення будь-якого агенту, наприклад, протеїну, трансхромосомної тварини, відмінної від людини, пептиду або протеїнового чи пептидного комплекнаприклад, із трансгенної миші, що має геном, су, що має дві різні специфічності зв'язування. який містить трансген важкого ланцюга і трансген Наприклад, молекула може зв'язуватися або взалегкого ланцюга імуноглобуліну людини, і ця кліємодіяти з (а) антигеном клітинної поверхні і (b) тина вбудована в імморталізовану клітину. Fc-рецептором на поверхні ефекторної клітини. Термін "рекомбінантне антитіло людини" в Термін "мультиспецифічна молекула" або "геконтексті даного опису включає всі антитіла людитероспецифічна молекула" передбачає включення ни, що приготовляються, експресуються, створюбудь-якого агенту, наприклад, протеїну, пептиду ються або виділяються рекомбінантними засобаабо протеїнового чи пептидного комплексу, що ми, наприклад, (а) антитілами, виділеними з має більше двох різних специфічностей зв'язувантварини (наприклад, з миші), яка є трансгенною ня. Наприклад, молекула може зв'язуватися або або трансхромосомною для генів імуноглобуліну взаємодіяти з (а) антигеном клітинної поверхні, (b) людини, або з приготовленої з них гібридоми (опиFc-рецептором на поверхні ефекторної клітини і (с) сана більш докладно нижче в Розділі І), (b) антитіщонайменше, одним іншим компонентом. Таким лами, виділеними з клітини-хазяїна, трансформочином, винахід включає, але не обмежується ниваної для експресування антитіла, наприклад, із ми, біспецифічні, триспецифічні, тетраспецифічні й трансфектоми, (с) антитілами, виділеними з бібліінші мультиспецифічні молекули, що спрямовані отеки рекомбінантних химерних антитіл людини, і на CD25 і інші мішені, наприклад, на Fc-рецептори (d) антитілами, приготовленими, експресованими, на ефекторних клітинах. створеними або виділеними будь -якими іншими Термін "біспецифічні антитіла" включає також способами, що передбачають сплайсинг послідовдіатіла. Діатіла являють собою двовалентні біспеностей генів імуноглобуліну людини в інші ДНКцифічні антитіла, у яких домени VH і VL експресупослідовності. Такі рекомбінантні антитіла людини ються на один поліпептидний ланцюг, але з викомають варіабельні і константні області, отримані з ристанням лінкеру, що занадто короткий для того, гаметичних послідовностей імуноглобуліну людищоб забезпечити утворення тандема між двома ни. Однак у деяких варіантах здійснення винаходу доменами на одному і тому ж ланцюзі, що привотакі рекомбінантні антитіла людини можуть піддадить до змушеного спарювання доменів з комплетися in vitro мутагенезові (або, коли використовументарними доменами іншого ланцюга і створенється тварина, яка є трансгенною відносно посліню двох антигензв'язувальних центрів (див., довностей Ig людини, in vivo соматичному наприклад, Holliger, P., et ой. (1993) Proc. Natl. мутагенезові), і, таким чином, послідовності аміноAcad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. кислот областей VH і VL рекомбінантних антитіл (1994) Structure 2:1121-1123). являють собою послідовності, які, незважаючи на Термін "похідні антитіла людини" відноситься те, що вони були о тримані з гаметичних послідовдо будь-якої модифікованої форми антитіла, наностей областей VH і VL імуноглобуліну людини і приклад, до кон'югату антитіла й іншого агенту або відносяться до них, у природному вигляді не м оантитіла. жуть існувати в гаметичному наборі антитіл людиТермін "антитіло людини" в контексті даного ни in vivo. опису передбачає включення антитіл, що мають Термін "трансфектома" в контексті даного опиваріабельні і константні області, отримані з гамесу включає рекомбінантну еукаріотичну клітину 21 90082 22 хазяїна, яка експресує антитіло, наприклад, СНОТермін "KA" (М-1) в контексті даного опису пеклітини, NS/0-клітини, НЕK293-клітини, клітини редбачає віднесення до константи рівноваги асорослин або грибків, включаючи дріжджові клітини. ціації конкретної взаємодії антитіло-антиген і виТермін "гетерологічне антитіло" в контексті даводиться шляхом ділення kа на kd. ного опису визначений відносно трансгенного орТермін "ізотип" в контексті даного опису відноганізму, відмінного від людини, який продукує таке ситься до класу антитіл (наприклад, Ig або lgG1), антитіло. Цей термін відноситься до антитіла, що що кодується генами константної області важкого має послідовність амінокислот або кодуючу посліланцюга. довність нуклеїнових кислот, що відповідає виявТермін "переключення ізотипу" в контексті даленій в організмі, який не є трансгенною твариною, ного опису відноситься до явища, у результаті Відмінною від людини, і, загалом, належить до якого клас або ізотип антитіла змінюється з одного виду, який відмінний від того, до якого належить класу Ig на один з інших класів Ig. трансгенна тварина, відмінна від людини. Термін "непереключений ізотип" в контексті Термін "виділене антитіло" в контексті даного даного опису відноситься до ізотипового класу опису передбачає віднесення до антитіла, яке по важкого ланцюга, що продукується, коли не відбусуті не містить інші антитіла, що мають інші антивається переключення ізотипу; СН-ген, що кодує генні специфічності (наприклад, виділене антитіло, непереключений ізотип, як правило, являє собою яке специфічно зв'язується з CD25, є по суті вільперший СН-ген, що з'являється даунстрім при фуним від антитіл, які специфічно зв'язуються з антинкціональному реаранжуванні VDJ-гена. Переклюгенами, відмінними від CD25). Виділене антитіло, чення ізотипу класифікується як класичне або неяке специфічно зв'язується з епітопом, ізоформою класичне переключення ізотипу. Класичне або варіантом CD25 людини, може, однак, вступапереключення ізотипу має місце в результаті рети в перехресну реакцію з іншими спорідненими комбінантних подій, до яких залучена, щонайменантигенами, наприклад, з інших видів (наприклад, ше, одна область послідовності переключення в видових гомологів CD25). Крім того, виділене антрансгені. Некласичне переключення ізотипу може титіло може по суті не містити інший клітинний мати місце в результаті, наприклад, гомологічної матеріал і/або інші хімічні речовини. В одному з рекомбінації між людини і людини ( варіантів здійснення винаходу комбінація "виділеасоційована делеція). Переключення ізотипу може них" моноклональних антитіл, що мають різні спебути здійснене й іншими альтернативними механіцифічності, об'єднана в добре визначену композизмами некласичного переключення, у тому числі, цію. наприклад, міжтрансгенною і/або міжхромосомною Термін "специфічне зв'язування" в контексті рекомбінацією. даного опису відноситься до зв'язування антитіла Термін "перемикач-послідовність" в контексті з заздалегідь встановленим антигеном. Як правиданого опису відноситься до тих ДНКло, антитіло зв'язується з афінністю, що відповідає послідовностей, що відповідають за рекомбінацію KD приблизно 10 -8моль або менше, наприклад, на етапі переключення. "Перемикач-донороська" приблизно 10 -9моль або менше, приблизно 10послідовність, як правило, область 10 моль або менше або приблизно 10-11моль або переключення, буде складати 5' (тобто апстрім) навіть менше, що визначається методом поверхконструктивної області, що підлягає делеції під час нево-плазмонного резонансу (SPR) у приладі рекомбінації на етапі переключення. "ПеремикачBIAcore 3000 з використанням рекомбінантного ILакцепторна" область буде розташовуватися між 2R як ліганду й антитіла як аналізованої речовиконструктивною областю, що підлягає делеції, і ни, а з заздалегідь встановленим антигеном антиконстантною областю, що замінює (наприклад, , тіло зв'язується з афінністю, що відповідає K D, що і т.д.). щонайменше у десять разів менше, переважно Термін "схема глікозилювання" в контексті дащонайменше у 100 разів менше, його афінності ного опису визначений як схема вуглеводни х одипри зв'язуванні з неспецифічним антигеном (наниць, що ковалентно приєднані до протеїну, більш приклад, BSA, казеїн), відмінним від заздалегідь конкретно, до протеїну імуноглобуліну (антитіла). встановленого антигену або антигену, близького Схема глікозилювання гетерологічного антитіла по спорідненню. Вираз "антитіло, що розпізнає може бути охарактеризована як по суті аналогічна антиген" і "антитіло, специфічне до антигену" з асхемам глікозилювання, які мають місце в природстосовуються в даному описі взаємозамінно з тених умовах у антитіл, які продукуються визначерміном "антитіло, яке специфічно зв'язується з ним видом трансгенної тварини, відмінної від люантигеном". дини, якби середній фахівець у даній області Термін "kd" (с-1) в контексті даного опису петехніки визнав схему глікозилювання гетерологічредбачає віднесення до коефіцієнта кінетики рівного антитіла як більш схожу на зазначену схему новаги дисоціації конкретної взаємодії антитілоглікозилювання у визначеного виду трансгенної антиген. Зазначена величина називається також тварини, відмінної від людини, ніж у того виду, з величиною koff. якого були отримані СН-гени трансгену. Термін "kа" (Μ-1 с-1) в контексті даного опису Термін "що має місце природним шляхом" в передбачає віднесення до коефіцієнта кінетики контексті даного опису відносно будь -якого об'єкрівноваги асоціації конкретної взаємодії антитілота, відноситься до факту, що об'єкт може бути антиген. знайдений у природі. Наприклад, послідовність Термін "KD" (Μ) в контексті даного опису пеполіпептидів або полінуклеотидів, яка є присутредбачає віднесення до константи рівноваги дисоньою в організмі (включаючи віруси), яка може ціації конкретної взаємодії антитіло-антиген. бути виділена з джерела в природних умовах і яка 23 90082 24 не була навмисно модифікована людиною в лабо(наприклад, аспарагінову кислоту, глутамінову раторних умовах, має місце в природних шля хом. кислоту), з незарядженими полярними бічними Термін "реаранжований" в контексті даного ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, опису відноситься до конфігурації важкого ланцюсерин, треонін, тирозин, цистеїн, триптофан), з га або легкого ланцюга імуноглобулінового локусу, неполярними бічними ланцюгами (наприклад, де V-сегмент розташований таким чином, що безаланін, валин, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілапосередньо примикає до D-J- або J-сегменту у ланін, метіонін), з бета-розгалуженими бічними конформації, що фактично цілком кодує відповідно ланцюгами (наприклад, треонін, валин, ізолейцин) VH- або VL-домeн. Реаранжований генний локус і з бічними ланцюгами ароматичного ряду (наприімуноглобуліну (антитіла) може бути ідентифіковаклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). ний шляхом порівняння з гаметичною ДНК: реараТаким чином, передвіщений несуттєвий амінокиснжований локус буде мати, щонайменше, один лотний залишок в антитілі людини проти CD25 рекомбінований семичленний/дев'ятичленний гопереважно заміняється іншим амінок ислотним мологічний елемент. залишком з такого ж сімейства бічних ланцюгів. Термін "нереаранжований" або "гаметична Даний винахід охоплює також "похідні" посліконфігурація" в контексті даного опису з посиландовностей амінокислот, як це зазначено в SEQ ID ням на V-сегмент, відноситься до конфігурації, де №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 і 17-40, та їх консерV-сегмент не є рекомбінованим таким чином, щоб вативні секвенціальні модифікації, де один або безпосередньо примикати до D- або J-сегмента. більше амінокислотних залишків дериватизовані, Термін "молекула нуклеїнової кислоти" в коннаприклад, шляхом ацилювання або глікозилютексті даного опису передбачає включення молевання, без значного впливу або зміни характерискул ДНК і молекул РНК. Молекула нуклеїнової кистик зв'язування антитіла проти CD25. лоти може бути однонитковою або двонитковою, Крім того, даний винахід охоплює антитіла, у переважно двонитковою ДНК. яких у Fc-області були внесені одна або більше Термін "виділена молекула нуклеїнової кислоперетворень з метою зміни функціональних або ти" в контексті даного опису відносно нуклеїнових фармакокінетичних властивостей антитіл. Такі кислот, що кодують антитіла цілком або ділянки перетворення можуть привести до зменшення або антитіл (наприклад, VH, VL , CDR3), що зв'язуються збільшення ступеня C1q-зв'язування і CDC- або з CD25, передбачає віднесення до молекули нукFc R-зв'язування й опосередкованої антитілами леїнової кислоти, у якій послідовності нуклеотидів, клітинної цитотоксичності (ADCC). Заміни можуть що кодують інтактне антитіло або ділянку антитіла, бути, наприклад, зроблені в одному або більше не містять інших послідовностей нуклеотидів, що амінокислотних залишках 234, 235, 236, 237, 297, кодують антитіла цілком або ділянки антитіл, що 318, 320 і 322 константної області важкого ланцюзв'язуються з антигенами, відмінними від CD25, га, що, таким чином, приводить до перетворення причому інші послідовності можуть захищати нукефекторної функції зі збереженням у той же час леїнову кислоту в геномній ДНК людини природфункції зв'язування з антигеном, у порівнянні з ним шляхом. В одному з варіантів здійснення винемодифікованим антитілом, cf. US 5,624,821 і US находу антитіло людини проти CD25 включає 5,648,260. Додаткове відсилання може бути зробваріабельні амінокислотні області АВ1, АВ7, АВ11 лене до WO 00/42072, де розкриті антитіла з переабо АВ12 важкого ланцюга (VH) і легкого ланцюга твореними Fc-областями, що збільшують ADCC, і (VL), які кодовані послідовностями нуклеотидів, на WO 94/29351, де розкриті антитіла, що мають показаних у SEQ ID №№: 1, 5, 9 або 13 і SEQ ID мутації в N-кінцевій області СН2-домену, що змі№№: 3, 7, 11 або 15 відповідно. нює здатність антитіл зв'язуватися з FcRI і, таким Як розкрито і заявлено в даному описі, послічином, зменшує здатність антитіл зв'язуватися з довності, зазначені в SEQ ID №№: 1-40, включаC1q, що, у свою чергу, зменшує здатність антитіл ють "консервативні секвенціальні модифік ації", фіксувати комплемент. Крім того, у Shields et al., J. тобто модифікації послідовностей нуклеотидів і Biol. Chem. (2001) 276:6591-6604 говориться про амінокислот, що не значно впливають або змінюкомбінаційні варіанти, наприклад, T256A/S298A, ють характеристики зв'язування антитіла, яке коS298A/E333A і S298A/E333A/K334A, що поліпшудовано послідовністю нуклеотидів або містить поють ступінь Fс RIІІ-зв'язування. слідовність амінокислот. Такі консервативні Час напівжиття антитіл in vivo може бути також секвенціальні модифікації включають нуклеотидні поліпшений шляхом модифікування епітопу викой амінокислотні заміни, приєднання і делеції. Мористовуваного рецептора Ig-константного домену дифікації можуть бути введені в SEQ ID №№: 1-40 або Ig-подібного константного домену таким чистандартним способом, відомим у даній області ном, щоб молекула не містила інтактного СН2техніки, наприклад, сайтнаправленим мутагенезом домену або інтактної Fc-області Ig, cf. US і PCR-опосередкованим мутагенезом (PCR - полі6,121,022 і US 6,194,551. Крім того, час напівжиття меразно-ланцюгова реакція). Консервативні аміноin vivo може бути додатково збільшений шляхом кислотні заміни включають такі, у яких амінокислоздійснення мутацій у Fc-області, наприклад, шлятний залишок заміняється амінокислотним хом заміни треоніну лейцином у положенні 252, залишком, що має такий же бічний ланцюг. Сімейтреоніну серином у положенні 254 або треоніну ства амінокислотних залишків, що мають однакові фенілаланіном у положенні 256, cf. US 6,277,375. бічні ланцюги, чітко визначені в даній області техКрім того, з метою зміни ефекторної функції ніки. Ці сімейства включають амінокислоти з осноантитіл може бути модифікована схема глікозилювними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргівання антитіл. Наприклад, антитіла можуть бути нін, гістидин), з кислотними бічними ланцюгами експресовані в трансфектому, що не приєднує 25 90082 26 фукозну одиницю, нормально прикріплену до вугВідсоткова ідентичність між двома послідовлеводу, який прикріплений до Asn у положенні 297 ностями нуклеотидів може бути визначена шляхом Fc, з метою посилення афінності Fc відносно використання GAP-програми в пакеті програмного забезпечення GCG (доступного на сайті Fс RIII, що, у свою чергу, приведе до збільшення http://www.gcg.com) з використанням матриці ADCC антитіл у присутності NK-клітин, cf. Shield et NWSgapdna.CMP і вагового коефіцієнта на розриal. (2002) J. Biol. Chem., 277:26733. Крім того, схеви 40, 50, 60, 70 або 80 і коефіцієнта по довжині 1, ма глікозилювання може бути модифікована з метою модифікування CDC. Додаткове відсилання 2, 3, 4, 5 або 6. Відсоткова ідентичність між двома послідовностями нуклеотидів або амінокислот моможе бути зроблена до WO 99/54342 і Umana et же бути визначена також шляхом використання al., Nat. Biotechnol. (1999) 17:176, де розкрита лінія алгоритму Е. Me yers і W. Miller (Comput. Appl. СНО-клітин, створених для експресії GntIII, що Biosci., 4:11-17 (1988)), що введений у програму приводить до експресії моноклональних антитіл з перетвореними глікоформами і поліпшеною ALIGN (версія 2.0), з використанням таблиці вагових залишків РАМ 120, штрафного коефіцієнта на ADCC-активністю. розрив 12 і штрафного коефіцієнта на розрив 4. Крім того, з метою збільшення часу напівжиття Крім того, відсоткова ідентичність між двома посможе бути здійснено пегіліцювання запропоновалідовностями амінокислот може бути визначена них фрагментів антитіл, наприклад, Fabфрагментів. Це може бути виконане за допомогою шляхом використання алгоритму Needleman і Wunsch (J. Mol. Віоі. 48:444-453 (1970)), що введереакцій пегіліцювання, відомих у даній області ний у GAP-програму в пакеті програмного забезтехніки, як це описано, наприклад, у Focus on печення GCG (доступного на сайті Growth Factors (1992) 3:4-10; ЕР 154316 і ЕР http://www.gcg.com). з використанням або матриці 401384. В альтернативному варіанті здійснення винаBlossum 62, або матриці РАМ250 і вагового коефіцієнта на розриви 16,14, 12, 10, 8, 6 або 4 і коефіходу мутації можуть бути здійснені довільно по цієнта по довжині 1, 2, 3, 4, 5 або 6. всій або частині кодуючої послідовності антитіл Запропоновані послідовності нуклеїнових киспроти CD25, наприклад, шляхом мутагенезу насилот і протеїнів можуть бути додатково використані чення, а отримані модифіковані антитіла проти CD25 можуть бути відсортовані по активності їхяк "довідкова послідовність" з метою проведення пошуку у доступних для публіки базах даних, нанього зв'язування. приклад, для ідентифікації споріднених послідовТаким чином, антитіла, кодовані послідовносностей. Такий пошук може бути проведений з витями нуклеотидів (варіабельної області важкого і користанням програм NBLAST і XBL AST (версія легкого ланцюгів), розкриті в даній заявці, і/або які містять послідовності амінокислот (варіабельної 2.0) від Altschul, et al. (1990) J. Mol. Вiol. 215:40310. 3 метою одержання послідовностей нуклеотиобласті важкого і легкого ланцюгів), розкриті в дадів, що є гомологічними по відношенню до моленій заявці (наприклад SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, кул запропонованих нуклеїнових кислот, може бу12, 14, 16 і 17-40), містять по суті однакові антитіти проведений пошук BLAST по нуклеотидах за ла, які кодовані однаковими послідовностями або які містять однакові послідовності, що консерватидопомогою програми NBLAST, рахунок=100, довжина слова=12. З метою одержання послідовносвно модифіковані. Нижче наведено більш докладтей амінокислот, які гомологічні запропонованим ний розгляд способів генерування таких по суті молекулам протеїну, може бути проведений пошук однакових антитіл на основі часткових послідовBLAST по протеїнах за допомогою програми ностей (наприклад, варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів), розкритих у даній заявці як XBL AST, рахунок=50, довжина слова=3. Для одержання результатів порівняльного аналізу по розSEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 і 17-40. ривах у порівняльних цілях може бути використана Для послідовностей нуклеотидів і амінокислот програма Gapped BLAST, як це описано в Altschul термін "гомологія" вказує на ступінь ідентичності et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. між двома послідовностями нуклеїнових кислот або амінокислот при оптимальному порівняльному При використанні програм BLAST і Gapped BLAST можуть бути використані значення параметрів аналізі і при порівнянні з відповідними інсерціями і операторів замовчування відповідних програм делеціями. Альтернативно, суттєва гомологія має (наприклад, XBLAST і NBLAST). Див. сайт місце, коли сегменти ДНК гібридизуються в умовах http://www.ncbi.nlm.nih.gov. обраного методу гібридизації до комплементу нитки. Ідентичність між двома послідовностями, виНуклеїнові кислоти можуть бути присутніми у цілих клітинах, у клітинному лізаті або в частково ражена у відсотках, є функцією числа ідентичних очищеній або по суті чистій формі. Нуклеїнова положень, поділюваних цими послідовностями кислота є "виділеною" або "переведеною у по суті (тобто % гомології=число ідентичних полочисту форму" при її очи щенні від інших клітинних жень/загальне число положень 100), з урахуванкомпонентів або інших домішок, наприклад, від ням кількості розривів і довжини кожного розриву, інших клітинних нуклеїнових кислот або протеїнів, що необхідно для здійснення оптимального порівз використанням стандартних методів, включаючи няльного аналізу двох послідовностей. Порівняння обробку лугом/додецилсульфатом натрію (SDS), двох послідовностей і визначення відсоткової ідецентрифугування з використанням CsCl, колонконтичності між двома послідовностями може бути ву хроматографію, електрофорез в агарозовому здійснене з використанням математичного алгоригелі й інші методи, відомі в даній області техніки. тму, як це описано в прикладах, що наведені нижДив. F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in че і які не є обмежувальним чинником. Molecular Biology (Поточні протоколи в молекуляр 27 90082 28 ній біології), Greene Publishing and Wiley соційованих вірусів), що можуть виконувати еквіInterscience, New York (1987). валентні функції. Запропоновані композиції на основі нуклеїноТермін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або вих кислот, незважаючи на свій природний харакпросто "клітина-хазяїн") в контексті даного опису тер послідовності (за винятком модифікованих передбачає віднесення до клітини, у яку введений сайтів рестрикції тощо), обумовлений або комплерекомбінантний вектор експресії. Варто розуміти, ментарною ДНК (кДНК), або геномом, або їхніми що такі терміни припускають віднесення їх не тільсумішами, можуть бути піддані мутагенезові у відки до клітини конкретного суб'єкта, але і до потомповідності зі стандартними методами з метою ства такої клітини. Оскільки в наступних поколінодержання генних послідовностей. Для кодуючих нях можуть мати місце деякі модифікації або послідовностей ці мутації за бажанням можуть внаслідок мутації, або внаслідок впливу навколивпливати на послідовність амінокислот. Більш коншнього середовища, таке потомство фактично не кретно, маються на увазі ДНК-послідовності, що є може бути ідентичне батьківській клітині, однак фактично гомологічними відносно природних V, D, все-таки охоплюється терміном "клітина-хазяїн" в J, постійних, перемикачів й інших таких послідовконтексті даного опису. Рекомбінантні клітининостей, описаних у даній заявці, або дериватизохазяїни включають, наприклад, трансфектоми, вані з них (де термін "дериватизований" вк азує на наприклад СНО-клітини і NS/0-клітини. те, що послідовність ідентична іншій послідовності Термін "суб'єкт" в контексті даного опису або модифікована з неї). включає будь-яку тварину, у тому числі і людину. Нуклеїнова кислота вважається "операційно Термін "тварина, відмінна від людини" включає всі приєднаною", коли вона вводиться у функціональхребетні тварини, наприклад, ссавців і нессавців, ний взаємозв'язок з іншою послідовністю нуклеїнаприклад, нелюдиноподібних приматів), вівцю, нових кислот. Наприклад, промотор або енхансер собаку, корову, к урчат, амфібій, рептилій і т.д. операційно приєднується до кодуючої послідовноТермін "трансгенна тварина, відмінна від люсті, якщо він впливає на транскрипцію цієї послідодини" відноситься до тварини, відмінної від людивності. У відношенні транскрипції регуляторних ни, що має геном, який містить один або більше послідовностей термін "операційно приєднаний" трансгенів або трансхромосом людини важкого означає, що ДНК-послідовності, що приєднуються, і/або легкого ланцюга (або вбудованих, або не є суміжними і, якщо необхідно з'єднати дві кодуючі вбудованих у природну геномну ДНК тварини) і протеїнові області, є суміжними і знаходяться в який здатний експресувати антитіла людини в порамці зчитування. Для перемикач-послідовністей вному обсязі. Наприклад, трансгенна миша може термін "операційно приєднаний" вказує на те, що мати трансген людини легкого ланцюга і/або транці послідовності здатні здійснити переключення сген людини важкого ланцюга, або трансхромосорекомбінації. му людини важкого ланцюга, завдяки чому миша Термін "вектор" в контексті даного опису пепродукує антитіла людини проти CD25 при її імуніредбачає віднесення до молекули нуклеїнової кизації антигеном CD25 і/або клітинами, які ек спреслоти, здатної транспортува ти іншу нуклеїнову сують CD25. Трансген і/або трансхромосома люкислоту, до якої вона приєдналася. Одним з видів дини важкого і легкого ланцюгів можуть бути вектора є "плазміда", що відноситься до петлі ківбудовані в хромосомну ДНК миші або підтрим ульцевої двониткової ДНК, у яку можуть бути ліговатися екстрахромосомно. Такі трансгенні і трансвані додаткові сегменти ДНК. Інший вид вектора хромосомні миші (збірно названі в даному описі як являє собою вірусний вектор, де у вірусний геном "трансгенні миші") здатні продукувати множинні можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. Деізотипи моноклональних антитіл людини проти які вектори здатні до автономної реплікації в клітиCD25 (наприклад, IgG, Ig A, Ig M, IgD і/або IgE) у ні-хазяїні, в яку вони вводяться (наприклад, бактерезультаті V-D-J-рекомбінації і переключення ізоріальні вектори, що мають бактеріальну природу типу. Трансгенна тварина, відмінна від людини, реплікації, і вектори на основі епісомної ДНК ссавможе бути також використана для продукування ців). Інші вектори (наприклад, вектори на основі специфічного антитіла проти CD25 шляхом увенеепісомної ДНК ссавців) можуть бути вбудовані в дення генів, що кодують таке специфічне антитіло геном клітини-хазяїна після введення в клітинупроти CD25, наприклад, шляхом операційного хазяїн і, таким чином, реплікуватися разом з геноприєднання генів до гена, який експресується в мом-хазяїном. Крім того, деякі вектори здатні намолоці тварини. У наданих нижче підрозділах направляти експресію генів, до яких вони операційно водиться більш докладний опис різних аспектів приєднані. Такі вектори називаються в даному даного винаходу. описі як "рекомбінантні вектори експресії" (або І. Одержання антитіл людини проти CD25 просто "експресуючі вектори"). Взагалі, експресуЗапропоновані моноклональні антитіла людиючі вектори, що привносять користь у техніку рени можуть бути отримані різноманітними способакомбінації ДНК, як правило, знаходяться у вигляді ми, включаючи застосування звичайної методики плазмід. У даному описі "плазміда" і "вектор" мопродукування моноклональних антитіл, наприклад, жуть бути використані взаємозамінно, оскільки стандартної техніки гібридизації соматичних клітин плазміда є найбільш широко застосовуваною фоза Kohler і Milstein, Nature 256: 495 (1975). Незвармою вектора. Даний винахід, однак, припускає жаючи на те, що переважними є процедури гібриохоплення й інших форм експресуючих векторів, дизації соматичних клітин, у принципі, може бути наприклад, вірусних векторів (наприклад, дефек тзастосована й інша методика одержання моноклоних ретровірусов реплікації, аденовірусів і аденоанального антитіла, наприклад, вірусна або онкогенна трансформація В-лімфоцитів або методика 29 90082 30 індикації фагів з використанням бібліотек генів Nature Biotechnology 14:845-851) і НСо7-трансген антитіл людини. важкого ланцюга імуноглобуліну людини (як це Переважною тваринною системою для пригоописано в US 5,770,429). тування гібридом, що секретують моноклональні НСо12-миші мають JKD-лізис у своїх ендогенантитіла людини, є система організму миші. Проних генах легкого (каппа) ланцюга (як це описано у дукування гібридом у миші є добре розробленою і Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830), CMD-лізис сталою процедурою. Протоколи імунізації і техніка у своїх ендогенних генах важкого ланцюга (як це виділення імунізованих спленоцитів для злиття описано в прикладі 1 в WO 01/14424, Korman et відомі в даній області техніки. Партнери по злиттю al.), KCo5-трансген легкого каппа ланцюга імуног(наприклад, клітини мієломи миші) і процедури лобуліну людини (як це описано у Fishwild et al. злиття також відомі. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) і Нсо12У переважному варіанті здійснення винаходу трансген важкого ланцюга імуноглобуліну людини моноклональні антитіла людини, спрямовані проти (як це описано в прикладі 2 в WO 01/14424, CD25, можуть генеруватися з використанням траKorman et al.). У лінії KМ-мишей ендогенний ген нсгенної або трансхромосомної миші, яка несе легкого каппа ланцюга імуноглобуліну миші руйнучастини імунної системи людини, а не імунною ється гомозиготно, як це описано у Chen et al. системою миші. До числа таких трансгенних і тра(1993) EMBO J. 12:811-820, а ендогенний ген важнсхромосомних мишей відносяться миші, що назикого ланцюга імуноглобуліну миші руйнується говаються в даному описі як HuMAb-миші, напримозиготно, як це описано в прикладі 1 в WO клад, НСо7- і НСо12-миші і KМ-миші відповідно, і 01/09187. Ця лінія мишей несе трансген легкого збірно називаються в даному описі як "трансгенні каппа ланцюга імуноглобуліну людини, тобто миші" . KСо5, як це описано у Fishwild et al. (1996) Nature HuMAb-миша містить генні мінілокуси імуногBiotechnology 14:845-851. Ця лінія мишей несе лобуліну людини, що кодують нереаранжовані також трансхромосому важкого ланцюга імуноглобуліну людини, що складається з 14 фрагментів послідовності важкого ( і ) і легкого ланцюгів hCF (SC20) хромосоми, як це описано в WO імуноглобуліну людини разом з цільовими мутаці02/43478. ями, що інактивують ендогенні локуси - і Імунізація ланцюгів (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 З метою генерування моноклональних антитіл (6474):856-859). Таким чином, миші виявляють людини проти CD25 у повному обсязі трансгенні знижену експресію мишачого IgM або -легкого або трансхромосомні миші, що містять гени імуноланцюга й у відповідь на імунізацію, на введені глобуліну людини (наприклад, НСо12-, НСо7- або трансгени важкого і легкого ланцюгів імуноглобуKM-миші), можуть бути імунізовані збагаченим ліну людини, перетерплюють переключення з клапрепаратом CD25-антигену, рекомбінантним су на клас і соматичну мутацію, у результаті чого CD25-антигеном і/або клітинами, які експресують генеруються моноклональні антитіла IgG, людини CD25, як це описано, наприклад, у Lonberg et al. з високої афінністю (Lonberg, N. et al. (1994), див. (1994), див. вище; Fishwild et al. (1996), див. вище, вище; re viewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of і WO 98/24884. В альтернативному варіанті здійсExperimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. нення винаходу миші можуть бути імунізовані ДНК, and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. що кодує CD25 людини. Переважно, щоб на час 13:65-93, і Harding, F. і Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. першого щеплення вік мишей складав 6-16 тижнів. Acad. Sci 764:536-546). Підготовка HuMAb-мишей Наприклад, збагачений препарат CD25-антигену докладно описана в Taylor, L. et al. (1992) Nucleic або рекомбінантний CD25-антиген може бути виAcids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) користаний для імунізації HuMAb-мишей шляхом International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al. внутрішньочеревного щеплення. У випадку, якщо (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg N. et al., імунізація з використанням очищеного або збага(1994) Nature 368(6474):856-859; Lonberg, N. (1994) ченого препарату CD25-антигену не приводить до Handbook of Experimental Pharmacology 113:49одержання антитіл, миші можуть бути також імуні101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology зовані клітинами, які експресують CD25, напри6:579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. клад, клітинною лінією, що активізує імунні реакції. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. і Lonberg, Накопичений досвід на основі експериментів з N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, різними антигенами показує, що трансгенні D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. HuMAb-миші реагують краще, коли вони спочатку Додатково див. US 5,545,806; US 5,569,825; US імунізуються шляхом внутрішньочеревного (IP) 5,625,126; US 5,633,425; US 5,789,650; US або підшкірного (SC) щеплення клітин, які експре5,877,397; US 5,661,016; US 5,814,318; US сують CD25, у повному або неповному ад'юванті 5,874,299 і US 5,770,429 (Lonberg і Kay); а також Фройнда з наступними IP-щеплення (до загальної US 5,545,807 (Surani et al.); WO 98/24884, WO кількості 10) клітин, які експресують CD25, напри94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 клад, у забуференому фосфатом фізіологічному і WO 01/09187. розчині (ЗФР). Імунна реакція може контролюватиНСо7-миші мають JKD-лізис у своїх ендогенся в ході протоколу імунізації шляхом узяття проб них генах легкого (каппа) ланцюга (як це описано у сироватки крові, одержуваних у результаті ретроChen et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830), CMD-лізис орбітального забору крові. Сироватк а може бути у своїх ендогенних генах важкого ланцюга (як це відсортована FACS-аналізом (аналіз з викорисописано в прикладі 1 в WO 01/14424), KСо5танням активованого флюоресценцією клітинного трансген легкого каппа ланцюга імуноглобуліну сортера, як це описано нижче), і миші з достатніми людини (як це описано у Fishwild et al. (1996) 31 90082 32 титрами імуноглобуліну людини проти CD25 моцію. У даному контексті термін "операційно приєджуть бути використані для злиття. Миші можуть наний" означає, що ген антитіла лігований у векбути бустер-імунізовані шляхом внутрішньовеннотор, у результаті чого послідовності, що регулюго щеплення клітин, які експресують CD25, наприють транскрипцію і трансляцію в межах вектора, клад, за 3 і 2 дні до умертвіння і видалення селезівиконують свої функції регулювання транскрипції і нки і лімфатичних вузлів. трансляції гена антитіла. Експресуючий вектор і Генерування гібридом, які продукують монокпослідовності, що керують експресією, вибираютьлональні антитіла людини проти CD25 ся з можливістю бути сумісними з використовуваЗ метою генерування гібридом, які продукують ною експресуючою клітиною-хазяїном. Ген антитімоноклональні антитіла людини проти CD25, ла легкого ланцюга і ген антитіла важкого ланцюга спленоцити і клітини лімфатичних вузлів можуть можуть бути введені в роздільні вектори або, що бути виділені з імунізованих мишей і злиті з підхобільш типово, обидва гени вводяться в той самий дящою імморталізованою лінією клітин, наприекспресуючий вектор. Гени антитіл вводяться в клад, з лінією клітин мишачої мієломи. Потім експресуючий вектор стандартними м етодами отримані гібридоми можуть бути відсортовані для (наприклад, лігуванням по комлементарних сайтах продукування антигенспецифічних антитіл. Наприрестрикції на фрагменті гена антитіла і вектора клад, одноклітинні суспензії лімфоцитів селезінки або лігуванням по "тупих кінцях", якщо немає жодімунізованих мишей можуть бути злиті з SP2/0ного сайту рестрикції). Варіабельні області легкого Ag14-клітинами мієломи (АТСС, CRL 1581) з 50% і важкого ланцюгів описаних тут антитіл можуть ПЕГ (маса/об'єм). Клітини можуть бути посіяні в формувати гени повного антитіла будь -якого ізо5 типу антитіла шляхом їхнього введення в експрекількості приблизно 1 10 на одну лунку в плоскосуючі вектори, що вже кодують константну область донному титраційному мікропланшеті з наступною двотижневою інкубацією у вибірковому середовилегкого ланцюга і константну область важкого ланцюга бажаного ізотипу, у результаті чого VHщі, що містить, крім звичайних реагентів, 10% фесегмент операційно приєднується до СН-сегмента тальної клональної сироватки Clone Serum, кло(сегментів) в межах вектора, а VL-сегмент оперануючий фактор гібридоми 5 Origen Hybridoma ційно приєднується до CL-сегмента в межах векCloning Factor (IGEN) і ГАТ-середовище (гіпоксантин-аміноптеринтимідинове середовище) 1Х HAT тора. В додатковому або альтернативному варіанті здійснення винаходу рекомбінантний вектор (Sigma). Приблизно через два тижні клітини моекспресії може кодувати сигнальний пептид, що жуть культивуватися в середовищі, у якій ГАТполегшує секрецію ланцюга антитіла з клітинисередовище замінене ГТ-середовищем (гіпоксанхазяїна. Ген ланцюга антитіла може бути клоноватин-тимідинове "проміжне" середовище) НТ (Sigma). Потім індивідуальні лунки можуть бути ним у вектор, у результаті чого сигнальний пептид внутрішньорамочно приєднується до аміно-кінця відсортовані ELISA-аналізом щодо антитіл людигена ланцюга антитіла. Сигнальний пептид може ни, що містять каппа легкий ланцюг імуноглобуліявляти собою імуноглобуліновий сигнальний пепну, і FACS-аналізом з використанням клітин, які тид або гетерологічний сигнальний пептид (наприекспресують CD25, щодо CD25-специфічності. Як тільки починається екстенсивний ріст гібридом, клад, сигнальний пептид з неімуноглобулінового протеїну). клони можуть бути відсортовані для продукування Крім генів ланцюга антитіла запропоновані реIgG, як правило, через 7-10 днів. Гібридоми, які комбінантні вектори експресії несуть регуляторні виділяють антитіла, можуть бути повторно посіяні, послідовності, що керують експресією генів ланцюзнову відсортовані і, якщо залишаються позитивними у відношенні IgG людини, моноклональні га антитіла в клітині-хазяїні. Термін "регуляторна послідовність" передбачає включення промоторів, антитіла людини проти CD25 можуть бути субклоенхансерів і інших елементів керування експресіновані щонайменше двічі шляхом обмеженого єю (наприклад, сигналів поліаденілювання), що титрування. Потім стійкі субклони можуть культикерують транскрипцією і трансляцією генів ланцювуватися in vitro з метою генерування антитіла в середовищі тканинних культур для наступного га антитіла. Такі регуляторні послідовності описані, наприклад, у Goeddel; Gene Expression зняття характеристик. Technology (Технологія експресії генів). Methods in Генерування трансфектом, які продукують м оEnzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. ноклональні антитіла людини проти CD25 (1990). Фахівці в даній області техніки повинні роЗапропоновані антитіла людини можуть бути отримані також у трансфектомі клітини-хазяїна з зуміти, що проектування експресуючого вектора, включаючи підбір регуляторних послідовностей, використанням, наприклад, комбінації рекомбінанможе залежати від таких факторів, як вибір клітитних ДНК-методів і методів генної трансфекції, як ни-хазяїна, що підлягає трансформації, рівень це добре відомо в даній області техніки (Morrison, експресії бажаного протеїну, і т.д. Кращі регулятоS. (1985) Science 229:1202). Наприклад, для експресії антитіл або фрагм ерні послідовності для експресії клітини-хазяїна ссавця включають вірусні елементи, що направнтів цих антитіл ДНК, що кодують фрагментарні ляють високі рівні експресії протеїну в клітинах або повні легкі і важкі ланцюги, можуть бути отриссавця, наприклад, промотори і/або енхансери, мані з використанням стандартних молекулярнодериватизовані з вірусу цитомегалії (CMV), вакуобіологічних методів (наприклад, PCRампліфікацією, сайтнаправленим мутагенезом) і лізуючого мавпячого вірусу 40 (SV40), аденовірусу, (наприклад, аденовірусний промотор (AdMLP)) можуть бути введені в експресуючі вектори, завдяі вірусу поліоми. В альтернативному варіанті здійки чому гени операційно приєднуються до посліснення винаходу можуть бути використані невірусдовностей, що регулюють транскрипцію і трансля 33 90082 34 ні регуляторні послідовності, наприклад, убіквітиВ альтернативному варіанті здійснення винаходу клоновані гени антитіл можуть бути експреновий промотор або -глобіновий промотор. Крім генів ланцюга антитіла і регуляторних посовані в інших експресуючих системах, включаючи прокаріотичні клітини, наприклад, мікроорганізми, слідовностей запропоновані рекомбінантні вектори наприклад, Е. coli для продукування scFv-антитіл, експресії можуть нести додаткові послідовності, водорості, а також клітини комах. Крім того, антинаприклад, послідовності, що регулюють реплікатіла можуть бути отримані в трансгенних тваринах, цію вектора в клітинах-хазяїнах (наприклад, початок реплікації) і селективних генах-маркерах. Севідмінних від людини, наприклад, в овечому і кролячому молоці або в курячих яйцях, або в транслективні гени-маркери полегшують добір клітингенних рослинах. Див., наприклад, Verma, R., et al. хазяїнів, у які був уведений вектор (див., нап ри(1998). Antibody engineering: Comparison of клад, патенти США №№ 4,399,216, 4,634,665 і bacterial, yeast, insect and mammalian expression 5,179,017, всі видані Axel et al.). Наприклад, як правило, селективний ген-маркер додає стійкість systems (Виробництво антитіл методами генної інженерії: Порівняння експресуючих систем на лікарським речовинам, наприклад, препаратові основі бактерій, дріжджів, комах і ссавців). G418, гігроміцину або метотрексату, на клітиніJ.lmmunol.Meth. 216:165-181; Pollock, et al. (1999). хазяїні, у яку був уведений вектор. До числа краTransgenic milk as a method for the production of щи х селективних генів-маркерів відносяться ген дигідрофолатредуктази (DHFR) (для використання recombinant antibodies (Транс генне молоко як спосіб продукування рекомбінантних антитіл). в dhfr-клітинах-хазяїнах з метотрексатною селекціJ.Immunol.Meth. 231:147-157; і Fischer, R., et al. єю/ампліфікацією) і неоген (для селекції G418). (1999). Molecular farming of recombinant antibodies З метою експресії легких і важких ланцюгів in plants (Вирощування рекомбінантних антитіл у експресуючий вектор (вектори), що кодує важкі і легкі ланцюги, трансфікується в клітину-хазяїн рослинах на молекулярному рівні). Biol.Chem. 380:825-839. стандартними методами. Різні форми терміна Використання фрагментарних послідовностей "трансфектома" припускають охоплення широкої антитіл для експресії інтактних антитіл Антитіла різноманітності способів, звичайно використовувавзаємодіють з антигенами-мішенями, головним них для введення екзогенної ДНК у прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїн, наприклад, електчином, через амінокислотні залишки, що розташовані в шести CDR важкого і легкого ланцюгів. З цієї ропорацію, осадження фосфатом кальцію, DEAEпричини послідовності амінокислот в межах CDR декстранову трансфекцію тощо. Хоча теоретично і більш різноманітні між індивідуальними антитіламожливо експресувати запропоновані антитіла або ми, ніж послідовності, розташовані поза CDR. в прокаріотичних, або в е укаріотичних клітинаххазяїнах, експресія антитіл в еукаріотичних клітиОскільки CDR-послідовності відповідають за більшість взаємодій між антитілом і антигеном, стає нах, і більш переважно в клітинах-хазяїнах ссавця, можливим експресувати рекомбінантні антитіла, є найбільш кращим методом, оскільки такі еукаріоякі імітують властивості специфічних антитіл, що тичні клітини, і зокрема, клітини ссавця, мають зустрічаються в природі, шляхом конструювання більш активну здатність до об'єднання і секреції правильно складеного і імунологічно активного експресуючих векторів, що включають CDRпослідовності зі специфічного антитіла, що зустріантитіла, ніж прокаріотичні клітини. чається в природі, пересадженого на остовні посДо числа переважних клітин-хазяїнів ссавця лідовності з іншого антитіла, що має інші властидля експресії запропонованих рекомбінантних анвості (див., наприклад, Riechmann, L. et al. (1998) титіл, відносяться СНО-клітини (включаючи dhfrCHO-клітини, описані у Urlaub and Chasin, (1980) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; і Queen, С et al. (1989) Proc. Natl. Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, викорисAcad. Set. U.S.A. 86:10029-10033). Такі остовні товувані з DHFR-селективним маркером, наприпослідовності можуть бути отримані з публічних клад, як це описано у R. J. Kaufman and P. A. Sharp баз даних ДНК, що включають гаметичні послідов(1982) Mol. Biol. 159:601-621), NS/0-клітини мієломи, COS-клітини, НЕK293 -клітини і SP2-клітини. ності генів антитіл. Ці гаметичні послідовності будуть відрізнятися від зрілих послідовностей генів Більш конкретно, для використання з NS/0антитіл, оскільки вони не будуть включати повнісклітинами мієломи іншою переважною експресуютю укомплектовані варіабельні гени, що форм учою системою є система GS (глутамінсинтетаза) ються шляхом V(D)J-приєднання під час дозріванекспресії генів, розкрита в WO 87/04462, WO 89/01036 і ЕР 338 841. Коли рекомбінантні вектори ня В-клітин. Гаметичні послідовності генів будуть відрізнятися також від послідовностей антитіла експресії, що кодують гени антитіл, вводяться в високоафінного вторинного репертуару, що місклітини-хазяїни ссавця, антитіла продукуються тить мутації по усьому варіабельному гені, але, як шляхом культивації клітин-хазяїнів протягом часу, правило, групується в CDR-областях. Наприклад, достатнього для експресії антитіла в клітинаххазяїнах, або, що більш переважно, секреції антисоматичні мутації відносно не часто зустрічаються в аміно-кінцевій ділянці остовної області 1 і в картіла в культурному середовищі, у якому вирощубокси-кінцевій ділянці остовної області 4. Крім тоються клітини-хазяїни. Антитіла можуть бути відго, багато соматичних мутацій не значно змінюють новлені з культурного середовища з властивості зв'язування антитіла. З цієї причини використанням стандартних методів очищення протеїну. немає необхідності одержувати повну ДНКпослідовність конкретного антитіла з метою відноДодаткові рекомбінантні засоби для продук увлення інтактного рекомбінантного антитіла, що вання моноклональних антитіл людини проти має властивості зв'язування, аналогічні властивосCD25 35 90082 36 тям зв'язування первинного антитіла (див. WO легко клоновані в конструкції експресуючого век99/45962). Охоплення CDR-областей фрагментартора. ними послідовностями легких і важких ланцюгів є, Потім реконструйовані варіабельні області як правило, достатнім для цієї мети. Фрагментарна важкого і легкого ланцюгів об'єднуються з клонопослідовність використовується для визначення ваним промотором, лідерною послідовністю, посвнеску тих або інших сегментів гаметичних варіалідовністю ініціації трансляції, константною обласбельних і приєднувальних генів в одержанні варіатю, 3'-нетрансльованою послідовністю, бельних генів рекомбінантного антитіла. Потім послідовністю поліаденілювання і послідовністю така гаметична послідовність використовується завершення транскрипції з метою утворення консдля заповнення відсутніх ділянок варіабельних трукцій експресуючого вектора. Конструкції ек собластей. Лідерні послідовності важкого і легкого пресуючого вектора важкого і легкого ланцюгів ланцюгів розщеплюються під час дозрівання проможуть бути об'єднані в окремий вектор, котранстеїну і нічого не привносять у властивості кінцевофіковані, послідовно трансфіковані або роздільно го антитіла. З метою заповнення відсутніх послітрансфіковані в клітини-хазяїни, які потім зливадовностей клоновані кДНК-послідовності можуть ються з метою формування клітини-хазяїна, що бути поєднані із синтетичними олігонуклеотидами експресує обидва ланцюги. шляхом лігування або PCR-ампліфікації. В альтеАналогічна процедура може бути застосована рнативному варіанті здійснення винаходу уся варідля пересаджування нової антиген-специфічності абельна область може бути синтезована у вигляді в існуюче зріле антитіло. Переважно вибирати множини коротких олігонуклеотидів, що перекритаке акцепторне антитіло, що походить з варіабеваються, і об'єднана шляхом PCR-ампліфікації з льного гена тієї ж ембріональної лінії, що і CDRутворенням цілком синтетичного клону варіабельдонорське антитіло. Потім одна або більше CDRної області. Цей спосіб має певні переваги, наприобластей з донорського антитіла трансфікуються з клад, видалення або включення конкретних сайтів використанням описаного вище способу. рестрикції або оптимізація конкретних кодонів. Приклади плазмід для використання в консТранскрипти послідовності нуклеотидів важк отруюванні експресуючих векторів для IgG людини го і легкого ланцюгів з гібридом використовуються наведені нижче. Плазміди були сконструйовані для проектування множин синтетичних олігонуктаким чином, щоб PCR-ампліфіковані ДНКлеотидів, що перекриваються, з метою створення послідовності V-важкого і V-каппа легкого ланцюгів синтетичних V-послідовностей з можливостями могли бути використані для відновлення повних амінокислотного кодування, які ідентичні природмінігенів важкого і легкого ланцюгів. Ці плазміди ним послідовностям. Синтетичні послідовності можуть бути використані для експресування повважкого і каппа ланцюгів можуть відрізнятися від них lgG1, - або IgG4, -антитіл людини. Аналогічні природних послідовностей у трьох аспектах: ланплазміди можуть бути сконструйовані для експрецюжки повторюваних нуклеотидних основ перерисування інших ізотипів важкого ланцюга або для ваються з метою полегшення синтезу олігонуклеоекспресування антитіл, що містять лямбда легкі тидів і PCR-ампліфікації; оптимальна трансляція ланцюги. сайтів ініціації вводиться відповідно до правил Таким чином, в іншому варіанті здійснення виКозака (Kozak (1991) J. Biol. Chem. 266:19867находу запропоновані різноманітні способи приго19870); і HindIII-сайти будуються апстрім відносно тування антитіл людини проти CD25. В одному з сайтів ініціації трансляції. варіантів спосіб включає: Для оптимізованого кодування і відповідного приготування антитіла, що містить (1) остовні некодування у відношенні варіабельних областей області важкого ланцюга і CDR-області важкого як важкого ланцюга, так і легкого ланцюга, ниткові ланцюга імуноглобуліну людини, де, щонайменше, послідовності розбиваються на 30-50 нуклеотидів одна з CDR важкого ланцюга імуноглобуліну люприблизно в середній точці відповідного некодуюдини містить послідовність амінокислот, обрану з чого олігонуклеотиду. Таким чином, для кожного амінокислотних CDR-послідовностей, показаних ланцюга олігонуклеотиди можуть бути зібрані в на Фіг.1-10 (або відповідних амінокислотних залидвониткові множини, що перекриваються, які охошків у SEQ ID №№: 17-19, 23-25, 29-31 або 35-37); плюють сегменти з 150-400 нуклеотидів. Потім ці і (2) остовні області легкого ланцюга і CDR-області пули використовуються як темплати для продук улегкого ланцюга імуноглобуліну людини, де, щовання PCR-ампліфікованих продуктів, що складанайменше, одна з CDR-областей легкого ланцюга ються з 150-400 нуклеотидів. Як правило, одна імуноглобуліну людини містить послідовність амімножина олігонуклеотидів варіабельної області нокислот, обрану з амінокислотних CDRбуде розбита на два пули, що роздільно ампліфіпослідовностей, показаних на Фіг.1-10 (або відпокуються з метою генерування двох PCR-продуктів, відних амінокислотних залишків у SEQ ID №№: 20що перекриваються. Потім ці продукти, що перек22, 26-28, 32-34 або 38-40); де антитіло зберігає риваються, об'єднуються шляхом PCRздатність зв'язуватися з CD25. ампліфікації з метою утворення повної варіабельПотім шляхом проведення стандартних реакної області. Може виявитися також бажаним вклюцій на зв'язування, наприклад, наведених у ниж че чити фрагмент константної області, що перек ринаступних прикладах (наприклад, FACS-аналізом), вається, важкого або легкого ланцюга (включаючи може бути визначена здатність антитіла зв'язуваBbsl-сайт каппа легкого ланцюга або Agel-сайт тися з CD25. гамма важкого ланцюга) у PCR-ампліфікацію з Оскільки в даній області техніки добре відомо, метою генерування фрагментів, які можуть бути що CDR3-oблacтi важкого і легкого ланцюгів антитіла відіграють особливо важливу роль у специфі 37 90082 38 чності/афінності зв'язування антитіла по відно(8) інтерналізація CD25, який експресується на шенню до антигену, запропоновані рекомбінантні Т-клітини. антитіла, приготовлені, як це викладено вище, Зняття характеристик зв'язування моноклонапереважно містять СDR3-області АВ1, АB7, АВ11 льних антитіл людини з CD25 або АВ12 важкого і легкого ланцюгів. Крім того, Запропоновані антитіла людини проти CD25 антитіла можуть містити CDR2-області АВ1, АВ7, можуть бути виділені й охарактеризовані декільАВ11 або АВ12. Крім того, антитіла можуть містити кома різними способами. Наприклад, відібрані гібCDR1-області АВ1, АВ7, АВ11 або АВ12. Таким рідоми можуть бути вирощені на підходящих матчином, відповідно до даного винаходу запропонорацах для очищення моноклональних антитіл. вані також антитіла проти CD25, що містять (1) Потім супернатанти можуть бути відфільтровані і остовні області важкого ланцюга імуноглобуліну сконцентровані перед афінною хроматографією з людини, CDR1-область важкого ланцюга імуногвикористанням протеїн-А-сефарози (для антитіл лобуліну людини, CDR2-область важкого ланцюга lgG1-ізотипу) (Pharmacia, Piscataway, NJ), або сенімуноглобуліну людини і СDR3-область важкого сибілізованої IgG-сефарози проти людини, або ланцюга імуноглобуліну людини, де CDR3-область протеїн-G-сефарози у випадку антитіл IgG3важкого ланцюга імуноглобуліну людини являє ізотипу. Для забезпечення чистоти елюйований собою СDR3-область АВ1, АВ7, АВ11 або АВ12, як IgG може бути перевірений гель -електрофорезом і це показано на Фіг.1-10 (або відповідні амінокисвисокоефективною рідинною хроматографією. У лотні залишки в SEQ ID №№: 19, 25, 31 або 37); і ЗФР буферний розчин може бути замінений, а (2) остовні області легкого ланцюга імуноглобуліну концентрація може бути визначена шляхом виміру людини, CDR1-область легкого ланцюга імуноглооптичної щільності OD280 із застосуванням коефібуліну людини, СDR2-область легкого ланцюга цієнта поглинання 1,43. Моноклональні антитіла імуноглобуліну людини і CDR3-oблacть легкого можуть бути розділені на кратні частини і залишені ланцюга імуноглобуліну людини, де CDR3-область на збереження при -80°С. легкого ланцюга імуноглобуліну людини являє Для визначення того, чи зв'язуються відібрані собою CDR3-oблacть АВ1, АВ7, АВ11 або АВ12, як моноклональні антитіла людини проти CD25 з уніце показано на Фіг.1-10 (або відповідні амінокискальними епітопами, може бути використаний сайлотні залишки в SEQ ID №№: 22, 28, 34 або 40), де тнаправлений або багатосайтовий мутагенез. антитіло зв'язується з CD25. Антитіло може додатЗ метою визначення ізотипу очищених антитіл ково містити CDR2 важкого ланцюга і/або CDR2 може бути застосований ELISA-аналіз ізотипу. легкого ланцюга АВ1, АВ7, АВ11 або АВ12. АнтиЛунки в титраційному мікропланшеті можуть бути тіло може додатково містити CDR1 важкого лансенсибілізовані 10мкг/мл Ig проти людини і залицюга і/або CDR1 легкого ланцюга АВ1, АВ7, АВ11 шені на ніч при 4°С. Після блокування 5 %-им ЗФР або AB12. (бичачий сироватковий альбумін) планшети ввоПереважно, щоб CDR1, 2 і/або 3 описаних видяться в реакцію з 10мкг/мл моноклональних анще антитіл, одержаних методами генної інженерії, титіл або очищеними контрольними ізотипами при містили точну послідовність (послідовності) амінотемпературі навколишнього середовища протягом кислот, аналогічну AB1, АВ7, AB11 або AB12, роздвох годин. Потім лунки можуть бути введені в критим у даному описі. Однак середній фахівець у реакцію або з lgG1, IgG2, IgG3 або IgG4, IgE, IgA1, даній області техніки повинний розуміти, що можIgA2 людини, або з людськими IgM-специфічними ливе деяке відхилення від точних CDRзондами людини, кон'югованими лужною фосфапослідовностей AB1, АВ7, АВ11 або AB12 зі збетазою. Після промивання планшети проявляються реженням здатності антитіла ефективно зв'язуваз використанням pNPP-субстрату (1мг/мл) і аналітися з CD25 (наприклад, консервативні заміни). зуються на оптичну щільність (OD) на довжині Таким чином, в іншому варіанті здійснення винахвилі 405нм. ходу антитіло, одержане методами генної інженеЗ метою візуалізації присутності антитіл проти рії, може складатися з однієї або більше CDRCD25 у сироватках імунізованих мишей або зв'язуобластей, які, наприклад, на 90%, 95%, 98% або вання моноклональних антитіл з живими клітина99,5% гомологічні одній або більше CDR-областям ми, які експресують CD25, може бути використана AB1, АВ7, AB11 або AB12. проточна цитометрія. Коротко кажучи, лінії клітин, На додаток або як альтернатива простому які експресують CD25 (вирощених у стандартних зв'язуванню з CD25, антитіла, які одержані метоумовах вирощування) змішуються з різними кондами генної інженерії, наприклад, описані вище, центраціями моноклональних антитіл у ЗФР, що можуть бути відсортовані по їхній здатності зберімістить 0,1% бичачого сироваткового альбуміну гати інші функції запропонованих антитіл, напри(BSA) і 0,02% азиду натрію, і інкубуються при 4°С клад: протягом 30 хвилин. Після промивання клітини (1) високоафінне зв'язування з CD25; вводяться в реакцію з флуоресцеїн-міченим анти(2) інгібування або блокування зв'язування тілом IgG проти людини в умовах, аналогічних CD25 з IL-2; умовам первинного фарбування антитіла. Зразки (3) видалення Т-клітин, експресуючих CD25; можуть бути проаналізовані методом проточної (4) надання толерантності Т-клітинам; цитометрії за допомогою проточного цитометра (5) інгібування проліферації Т-клітин, експре(Наприклад, приладу Becton Dickinson FACS) з суючи х CD25; використанням світла і властивостей бічного роз(6) інгібування Т-клітинної проліферації РВМС, сіювання для пропускання одиничних живих клііндукованої антитілами проти CD3; тин. Може бути застосований інший аналіз з вико(7) інгібування MLR і/або ристанням флуоресцентної мікроскопії (на додаток 39 90082 40 або замість) аналізу методом проточної цитометставлено в даному описі і наведених прикладах. В рії. Клітини можуть бути пофарбовані точно так альтернативному варіанті здійснення винаходу само, як це описано вище, і перевірені методом трансген важкого ланцюга імуноглобуліну людини флуоресцентної мікроскопії. Цей метод дозволяє може підтримуватися екстрахромосомно, що має візуалізувати окремі клітини, але може мати знимісце у випадку трансхромосомних (наприклад, жену чутливість у залежності від щільності антигеKM-) мишей, як це описано в WO 02/43478. Такі ну. трансгенні і трансхромосомні тварини здатні проПотім IgG людини проти CD25 можуть бути дукувати множинні ізотипи моноклональних антидодатково перевірені на здатність вступати в реатіл людини відносно CD25 (наприклад, IgG, IgA кцію з CD25-антигеном вестерн-блоттингом. Короі/або IgE) у результаті V-D-J/V-J-рекомбінації і петко кажучи, можуть бути приготовлені клітинні ек среключення ізотипу. Проектування трансгенної тракти з клітин, які експресують CD25, і піддані або трансхромосомної тварини, відмінні від людиелектрофорезу в поліакриламідному гелі в присуни, що реагує на стимуляцію стороннім антигеном тності додецилсульфату натрію (SDS). Після елекз гетерологічним спектром антитіл, вимагає, щоб трофорезу відділені антигени переносяться в нітгетерологічні тpансгени імуноглобуліну, що місроцелюлозні мембрани, блокуються 20%-им тяться в трансгенній тварині, функціонували пранежирним молоком і зондуються моноклональнивильно упродовж всього шляху розвитку В-клітини. ми антитілами, що підлягають перевірці. Зв'яз уЦе включає, наприклад, переключення ізотипу вання IgG людини може бути виявлене шляхом гетерологічного трансгену важкого ланцюга. Відвикористання лужної фосфатази IgG проти людиповідно, трансгени конструюються таким чином, ни і розвинуто за допомогою таблеток живильного щоб можна було викликати переключення ізотипу і середовища BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, забезпечення однієї або більше з наступних хараMO). ктеристик генів антитіла: (1) клітинно-специфічна Інгібування активності клітин, експресуючих експресія і її високий рівень, (2) функціональне CD25 генне реаранжування, (3) активація алельного Крім специфічного зв'язування з CD25 моноквиключення і відгук на нього, (4) експресія достатлональні антитіла людини проти CD25 можуть нього первинного спектру, (5) сигнальна трансдукбути перевірені на їхню здатність інгібувати різну ція, (6) соматична гіпермутація і (7) домінування активність клітин, наприклад, Т-клітин і інших лімтрансгенного локусу антитіла під час імунного відфоцитів, експресуючих CD25. Наприклад, аналіз гук у. проліферації Т-клітин може бути здійснений із заНе обов'язково, щоб всі зазначені вище критестосуванням відомих методів. Відповідно до однорії були задоволені. Наприклад, у тих варіантах го з таких методів мононуклеари периферичної здійснення винаходу, де ендогенні локуси імуногкрові (РВМС) людини розбавляються в підходялобуліну трансгенної тварини є функціонально щому середовищі і потім стимулюються, наприпорушеними, трансген не обов'язково повинний клад, антитілом проти CD3, перед додаванням активувати алельне виключення. Крім того, у тих концентрацій експериментальних антитіл, які ваваріантах здійснення винаходу, де трансген місріюються, з метою визначення ефекту, якого вони тить функціонально реаранжований ген важкого досягають у відношенні проліферації Т-клітин. Ті/або легкого ланцюга імуноглобуліну, др угий криклітинна проліферація очищених Т-клітин може терій функціонального генного реаранжування не бути також оцінена в присутності моноклональних є необхідним щонайменше для того трансгена, що антитіл проти CD3 і проти CD28. уже є реаранжованим. Основи молекулярної ім уАналіз MLR також може бути здійснений із з анології див. в Fundamental Immunology (Фундаменстосуванням відомих методів. Наприклад, РВМС тальна імунологія), 2nd edition (1989), Paul William від першого донора можуть бути опромінені і зміE., ed. Raven Press, N.Y. шані РВМС від другого донора. Потім до клітин У деяких варіантах здійснення винаходу транможуть бути додані концентрації антитіла, які васгенні або трансхромосомні тварини, відмінні від ріюються, з наступним виміром MLR-реакції. людини, використовувані для генерування запроII. Одержання трансгенних тварин, відмінних понованих моноклональних антитіл людини місвід людини, що генерують моноклональні антитіла тять реаранжовані, нереаранжовані або комбіналюдини проти CD25 цію реаранжованих і нереаранжованих Відповідно до ще одного аспекту даного винагетерологічних трансгенів важкого і легкого ланцюходу запропоновані трансгенні і трансхромосомні гів імуноглобуліну в зародковій лінії трансгенної тварини, відмінні від людини, наприклад, транстварини. Кожний із трансгенів важкого ланцюга генні або трансхромосомні миші, здатні експресумістить щонайменше один СН-ген. Крім того, травати антитіла людини, що специфічно зв'язуються нсген важкого ланцюга може містити функціональз CD25. В одному з конкретних варіантів здійсненні перемикач-послідовності ізотипу, які здатні підтня винаходу запропонована трансгенна або трансримувати переключення ізотипу гетерологічного хромосомна миша, яка має геном, що містить тратрансгена, що кодує множинні СН-гени у Внсген важкого ланцюга імуноглобуліну людини, клітинах трансгенної тварини. Такі перемикачзавдяки чому після імунізації клітинами, експресупослідовністі можуть бути послідовностями, що ючими CD25, миша продукує антитіла людини зустрічаються в природі в локусі гаметичного ім упроти CD25. Трансген важкого ланцюга імуноглоноглобуліну у такого виду, який служить джерелом буліну людини може бути вбудований у хромосомСН-генів трансгена, або ж такі перемикачну ДНК миші, що має місце у випадку трансгенних, послідовністі можуть бути дериватизовані з тих наприклад, HuMAb-мишей, як це докладно предпослідовностей, що зустрічаються в того виду, що 41 90082 42 повинний прийняти трансгенну конструкцію (у тралогічної ДНК. Такі регуляторні послідовності монсгенній тварині). Наприклад, конструкція трансгежуть бути вбудовані в трансген з цього ж або спона людини, що використовується для продукуванрідненого виду запропонованої тварини, відмінної ня трансгенної миші, може продукувати більш від людини. Наприклад, сегменти гена імуноглобувисоку частоту подій переключення ізотипу, якщо ліну людини можуть бути об'єднані з енхансерною вона містить перемикач-послідовністі, аналогічні послідовністю імуноглобуліну гризуна для викоритим, що мають місце в природних умовах у локусі стання в трансгенній миші. В альтернативному важкого ланцюга імуноглобуліну миші, оскільки, як варіанті здійснення винаходу в трансген можуть це передбачається, перемикач-послідовністі в бути вбудовані синтетичні регуляторні послідовномиші оптимізовані для функціонування з ферментсті, причому такі синтетичні регуляторні послідовною рекомбіназною системою переключення у ності не є гомологічними відносно функціональної миші, у той час як перемикач-послідовністі у люДНК-послідовності, що, як це відомо, має місце в дини для цього не оптимізовані. Перемикачприродних умовах у геномах ссавців. Синтетичні послідовністі можуть бути виділені і клоновані вірегуляторні послідовності проектуються відповідно домими методами клонування або можуть бути до правил консенсусу, наприклад, тими, котрі спесинтезовані de novo з синтетичних олігонуклеотицифікують припустимі послідовності сайта акцепдів, що перекриваються, спроектованих на основі тора сплайсованого фрагмента або малюнка проопублікованої інформації про послідовності, які мотору/енхансера. Наприклад, мінілокус містить відносяться до послідовностей області переклюділянку геномного імуноглобулінового локусу, що чення імуноглобуліну (Mills et al., Nucl. AcidsRes має щонайменше одну внутрішню (тобто не кінець 15:7305-7316(1991); Sideras et al., Intl. Immunol. ділянки) делецію незначної частини ДНК (напри1:631-642 (1989)). Для кожної зі згаданих вище клад, інтрон або його частину), у порівнянні з гатрансгенних тварин функціонально реаранжовані метичним Ig-локусом, що зустрічається в природі. гетерологічні трансгени важкого і легкого ланцюгів Переважні трансгенні і трансхромосомні тваімуноглобуліну виявляються в значній частині Врини, відмінні від людини, наприклад, миші, деклітин трансгенної тварини (щонайменше 10%). монструватимуть продукування імуноглобуліну зі Трансгени, використовувані для генерування значним спектром, що фактично ідеально аналогізапропонованих трансгенних тварин, відмінних від чний спектрові людини після регулювання за об'єлюдини, включають трансген важкого ланцюга мом. імуноглобуліну, що містить ДНК, яка кодує щонайЦей спектр буде ідеально наближатися до деменше один сегмент гена варіабельної області, монстрованого в людині після регулювання за один сегмент D-гена, один сегмент J-гена і щооб'ємом, як правило, з розкиданням щонайменше найменше один сегмент гена константної області. у 10%, переважно в 25-50% або більше. Взагалі, Трансген легкого ланцюга імуноглобуліну, містить буде отримано щонайменше біля тисячі різних ДНК, яка кодує щонайменше один варіабельний імуноглобулінів (в ідеалі IgG), переважно від 10 4 сегмент гена, один сегмент J-гена і щонайменше до 10 6 або більше, у залежності від кількості різних один сегмент гена константної області. Сегменти V-, J- і D-областей, введених у геном миші і керогена, що кодують сегменти гена легкого і важкого ваних додатковою різноманітністю, що генеруєтьланцюгів, є ге терологічними відносно трансгенної ся реаранжуваннями V(-D-)J-сегментів гена і випатварини, оскільки вони дериватизовані з ДНК або дкових приєднань нуклеотидів до областей відповідають ДНК, яка кодує сегменти гена важкосполуки. Як правило, імуноглобуліни будуть виявго і легкого ланцюгів імуноглобуліну у виду, який ляти афінність (KD) відносно попередньо відібра-8 не представляє трансгенну тварину, відмінну від них антигенів нижче 10 моль, наприклад, нижче людини. Відповідно до одного з аспектів даного 10-9моль, 10 -10моль або 10 -11моль або навіть нижвинаходу трансген сконструйований таким чином, че. Трансгенні і трансхромосомні тварини, відмінні що окремі сегменти гена є нереаранжованими, від людини, наприклад, миші, як це описано вище, наприклад, вони не реаранжовані з можливістю можуть бути імунізовані, наприклад, клітинами, кодування функціонального легкого або важкого експресуючими CD25. В альтернативному варіанті ланцюга імуноглобуліну. Такі нереаранжовані траздійснення винаходу трансгенні тварини можуть нсгени підтримують рекомбінацію сегментів V-, D- і бути імунізовані ДНК, що кодує CD25 людини. Тоді J-генів (функціональне реаранжування) і переважці тварини будуть продукувати В-клітини, що зано підтримують вбудовування усіх або частини знають переключення класу через рекомбінацію сегмента гена D-області в кінцевий реаранжована етапі переключення (цис-переключення) і ексний важкий ланцюг імуноглобуліну в трансгенній пресують імуноглобуліни, що вступають у реакцію тварині при впливі CD25-антигеном. з CD25. Ці імуноглобуліни будуть являти собою В альтернативному варіанті здійснення винаантитіла людини (названі також "антитіла людини ходу трансгени містять нереаранжований "мінілосеквенціального типу"), де поліпептиди важкого і кус". Такі трансгени, як правило, містять суттєву легкого ланцюгів кодуються послідовностями трачастину С-, D- і J-сегментів, а також підмножину Vнсгенів людини, які можуть включати послідовноссегментів гена. У таких трансгенних конструкціях ті, дериватизовані в результаті соматичної м утації різноманітні регуляторні послідовності, наприклад, і рекомбінантних приєднань V-області, а також промотори, енхансери, перемикач-області класу, гаметично кодованими послідовностями; ці антитіпослідовності донорів сплайсованих фрагментів і ла людини можуть вважатися фактично ідентичакцепторів сплайсованих фрагментів для процесуними поліпептидній послідовності, кодованої сегвання РНК, сигнали рекомбінації тощо, містять ментами VL- і JL- або VH-, D H- і JH-генів людини, відповідні послідовності, дериватизовані з гетеронавіть незважаючи на те, що можуть бути присут 43 90082 44 німи інші негаметичні послідовності як результат Формування високоафінних моноклональних соматичної мутації і диференціальних рекомбінаантитіл людини проти CD25 може бути полегшено ційних V-J- і V-D-J-приєднань. Варіабельні області способом розширення спектра сегментів гена вакожного ланцюга антитіла, як правило, щонаймеріабельної області імуноглобуліну людини в транснше на 80% аналогічні гаметичним сегментам V- і генній тварині, відмінній від людини, що має геном, J-генів людини, а у випадку важких ланцюгів - гаякий містить вбудований трансген імуноглобуліну метичним сегментам V-, D- і J-генів людини; часто, людини, причому зазначений спосіб включає ввещонайменше на 85% аналогічні гаметичним послідення в геном трансгена V-гена, що містить сегдовностям людини, які присутні на трансгені; часто менти гена V-області, які не присутні в зазначенона 90 або 95% або більше аналогічні гаметичним му вбудованому трансгені імуноглобуліну людини. послідовностям людини, які присутні на трансгені. Часто трансген V-області являє собою дріжджову Однак, оскільки негаметичні послідовності привноштучн у хромосому (YAC), що містить частину матсяться соматичною мутацією і VJ- і VDJриці сегментів VH- або VL-(VK-)-генів людини, що приєднанням, антитіла людини секвенціального може мати місце в природних умовах у геномі лютипу часто будуть мати деякі послідовності варіадини або що може бути обумовлено спільним бельної області, що не кодуються V-, D- або Jсплайсингом, здійснюваним роздільними рекомбісегмантами гена людини, як це спостерігається в нантними методами, яка може включати неупорятрансгені (трансгенах) людини в ембріоні мишей. дковані або пропущені сегменти V-гена. Часто на Як правило, такі негаметичні послідовності (або YAC містяться щонайменше п'ять або більше фунокремі положення нуклеотидів) будуть замкнуті в кціональних сегментів V-гена. У цієї варіації можна CDR-областях або поблизу від них або в областях, зробити трансгенну тварину, отриману методом де відомо, що соматичні мутації утворюють класрозширення V-спектра, причому така тварина ек стери. пресує імуноглобуліновий ланцюг, який містить Відповідно до іншого аспекту даного винаходу послідовність варіабельної області, кодовану сегзапропоновані В-клітини, дериватизовані з трансментом гена V-області, що присутній на трансгені генних або трансхромосомних тварин, відмінних V-області, і С-область, кодовану на трансгені Ig від людини, як це наведено в даному описі. Влюдини. За допомогою способу розширення Vклітини можуть бути використані для генерування спектра можуть бути отримані трансгенні тварини, гібридом, експресуючих моноклональні антитіла що мають щонайменше 5 чітких V-генів; що можлюдини, що зв'язуються з високої афінністю (наливо у тварин, які містять щонайменше близько 24 приклад, з константою рівноваги дисоціації (KD) V-генів або більше. Деякі сегменти V-гена можуть -8 менше 10 моль) з CD25 людини. Таким чином, в бути нефункціональними (наприклад, псевдогени іншому варіанті здійснення винаходу запропонотощо); при бажанні ці сегменти можуть утримувавана гібридома, що продукує антитіло людини, яке тися або вибірково видалятися рекомбінантними має афінність (KD) менше 10 -8моль, наприклад, методами, які відомі фахівцям. Після конструюменше 10-9моль, 10 -10моль або 10 -11моль або навання гаметичної лінії миші, що передбачає ная ввіть менше, виміряну в результаті аналізу клітин, ність функціональної YAC з розширеним спектром експресуючих CD25, з використанням радіоактивV-сегментів, що фактично не присутні у трансгені но міченого моноклонального антитіла або шляIg людини, що містить сегменти J- і С-генів, ця хом визначення напівмаксимальної концентрації особливість може бути перенесена і розвинена в зв'язування з використанням FACS-аналізу або в інших генетичних фонах, включаючи і ті фони, де результаті аналізу методом поверхневофункціональна YAC розширеним спектром Vплазмонного резонансу з використанням приладу сегментів розвинена в гаметичній лінії трансгенної BIAcore. тварини, відмінної від людини, що має інший транУ даному винаході моноклональне антитіло сген Ig людини. У гаметичній лінії можна виростити містить легкий ланцюг імуноглобуліну людини секмножину функціональних YAC, що мають розшивенціального типу, що складається з (1) варіаберений спектр V-сегментів, з можливістю їхньої спільної області легкого ланцюга, що має поліпептильної роботи з трансгеном Ig людини (або множидну послідовність, яка фактично ідентична ною трансгенів Ig людини). Незважаючи на те, що поліпептидній послідовності, кодованій сегментом в даному описі використовується термін "YACVL-гена людини і сегментом J L-гена людини, і (2) трансгени", у таких трансгенах після їхнього вбуконстантної області легкого ланцюга, кодованої довування в геном фактично можуть бути відсутні сегментом С L-гена людини; і важкий ланцюг імунодріжджові послідовності, наприклад, послідовності, глобуліну людини секвенціального типу, що склаякі потрібні для автономної реплікації в дріжджах; дається з (1) варіабельної області важкого ланцютакі послідовності можуть факультативно бути га, що має поліпептидну послідовність, яка вилучені методами генної інженерії (наприклад, фактично ідентична поліпептидній послідовності, рестрикційним гідролітичним розкладанням і гелькодованій сегментом VH-гена людини, D-областю і електрофорезом у пульсуючому градієнті напруги сегментом ІН-гена людини, і (2) константної обласабо іншим підходящим методом) після того, як ті, кодованої сегментом С Н-гена людини. Варто реплікація у дріжджах більше не потрібна (напривідмітити, що D-гени людини можуть бути істотно клад, до введення в ES-клітину миші або прозигозмінені в результаті подій рекомбінації і соматичту миші). Способи поширення характерної особлиної мутації таким чином, що ви хідна гаметична вості експресії імуноглобуліну людини послідовність людини не відразу може бути розпісеквенциального типу включають вирощування знана. трансгенної тварини, що містить Ig-трансген (трансгени) людини, а також необов'язково містить фу 45 90082 46 нкціональну YAC з розширеним спектром VЦі біспецифічні і мультиспецифічні молекули сегментів. На YAC можуть бути присутніми сегмеспрямовують клітини, що експресують CD25, до нти як VH-, так і VL-гeнів. Трансгенна тварина може ефекторної клітини і, як і запропоновані моноклобути вирощена в будь-якому фоні, вибраному фанальні антитіла людини, стимулюють активність хівцем-практиком, включаючи фони, що містять Fc-рецептор-опосередкованої ефекторної клітини, інші трансгени людини, включаючи Ig-трансгени наприклад, фагоцитоз CD25-експресуючих клітин, людини і/або трансгени, кодуючі інші лімфоцитарні ADCC, вивільнення цитокінів або генерування супротеїни людини. Відповідно до винаходу запропероксидного аніону. понований також високоафінний імуноглобулін Запропоновані біспецифічні і мультиспецифічлюдини секвенціального типу, який продукується ні молекули можуть додатково включати третю трансгенною мишею, що має YAC-трансген розспецифічність зв'язування додатково до анти-Рсширеного спектра V-області. Хоча викладений специфічності зв'язування і анти-CD25вище описує переважний варіант запропонованої специфічності зв'язування. В одному з варіантів трансгенної тварини, розглядаються й інші варіанздійснення винаходу третя специфічність зв'яз ути, що класифікуються за трьома категоріями: вання являє собою частину антистимулюючого I. трансгенні тварини, що містять трансген нефактора (EF), наприклад, молекулу, яка зв'язуєтьреаранжованого важкого ланцюга і реаранжованося з поверхневим протеїном, що бере участь у го легкого ланцюга імуноглобуліну; цитотоксичній активності, і тим самим посилює II. трансгенні тварини, що містять трансген неімунну реакцію проти клітини-мішені. "Частина реаранжованого важкого ланцюга і нереаранжоваантистимулюючого фактора" може являти собою ного легкого ланцюга імуноглобуліну; і антитіло, функціональний фрагмент антитіла або III. трансгенні тварини, що містять трансген ліганд, що зв'язується з даною молекулою, наприреаранжованого важкого ланцюга і нереаранжоваклад, антигеном або рецептором, завдяки чому ного легкого ланцюга імуноглобуліну. посилюється ефект детермінант зв'язування для З цих категорій трансгенних тварин порядок РC-рецептора або антигену клітин-мішеней. "Часпереваги наступний: II>І>III, де ендогенні гени легтина анти стимулюючого фактора" може зв'язувати РС-рецептор або антиген клітини-мішені. В алького ланцюга (або щонайменше -ген) відкинуті методом гомологічної рекомбінації (або іншим метернативному варіанті здійснення винаходу частина антистимулюючого фактора може зв'язутодом), і І>II>III, де ендогенні гени легкого ланцюга ватися з об'єктом, який відмінний від об'єкта, з не відкинуті і мають бути доміновані алельним яким зв'язуються перша і друга специфічності. виключенням. Наприклад, частина антистимулюючого фактора IIІ. Біспецифічні/мультиспецифічні молекули, які зв'язуються з CD25 може зв'язуватися з цитотоксичною Т-клітиною (наприклад, через CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, Відповідно до ще одного варіанту здійснення CD40, ІСАМ-1 або іншу імунну клітину, що привовинаходу моноклональні антитіла людини проти дить до посилювання імунної реакції проти клітиCD25 можуть бути дериватизовані або зв'язані з ни-мішені). іншою функціональною молекулою, наприклад, з іншим пептидом або протеїном (наприклад, з Fab'В одному з варіантів здійснення винаходу запропоновані біспецифічні і мультиспецифічні мофрагментом), з метою генерування біспецифічної лекули містять як специфічність зв'язування щоабо мультиспецифічної молекули, яка зв'язується найменше одне антитіло, що включає, наприклад, з множиною сайтів зв'язування або з епітопамиFab, Fab', F(ab')2, Fv або scFv. Таке антитіло може мішенями. Наприклад, запропоноване антитіло може бути функціонально зв'язане (наприклад, бути також димером важкого або легкого ланцюга або будь-яким його мінімальним фрагментом, нахімічним приєднанням, генетичним злиттям, некоприклад, Fv або одноланцюговою конструкцією, як валентною асоціацією або яким -небудь іншим це описано у Ladner et al., US 4,946,778. Таке аншляхом) з однією або більше інших зв'язувальних титіло може бути також злитим протеїном імуногмолекул, наприклад, з іншим антитілом, пептидом або зв'язувальним міметиком. лобуліну зв'язувального домену, який представляє собою, як це розкрито в US 2003/0118592 і US Таким чином, цей винахід включає біспецифі2003/0133939. чні і мультиспецифічні молекули, які мають приВ одному з варіантів здійснення винаходу спенаймні одну першу специфічність зв'язування по цифічність зв'язування щодо Fc-рецептора забезвідношенню до CD25 і другу специфічність зв'язування по відношенню до другого епітопа-мішені. В печується моноклональним антитілом людини, зв'язування якого не блокується імуноглобуліном конкретному варіанті здійснення винаходу др угим G (IgG) людини. Термін "IgG-рецептор" в контексті епітопом-мішенню є CD3, CD4, IL-15R, мембраноданого опису відноситься до будь-якого з восьми зв'язаний або рецепторзв'язаний TNF- або реце-ланцюгових генів, розташованих на хромосомі 1. пторзв'язаний IL-15. В іншому варіанті здійснення Ці гени кодують у цілому дванадцять трансмем бвинаходу другим епітопом-мішенню є Fc-рецептор, ранних або розчинно-рецепторних ізоформ, які наприклад, Fс RI (CD64) людини або Fс RIгруп уються у три класи Fc -рецептора: Fс RI рецептор (CD89) людини, або рецептор Т-клітин. Таким чином, винахід включає біспецифічні і муль(CD64), Fe RII(CD32) і Fс RIII (CD 16). В одному з тиспецифічні молекули, здатні зв'язуватися як з переважних варіантів здійснення винаходу Fc ефекторними клітинами, що експресують Fс R, рецептор являє собою високоафінний Fс RIFc R або Fc R (наприклад, моноцитами, макрофарецептор людини. гами або поліморфонуклеарними клітини (PMN)), Продукування і зняття характеристик з цих п етак і з клітинами-мішенями, які експресують CD25. реважних моноклональних антитіл описані Fanger 47 90082 48 et al. в WO 88/00052 і в US 4,954,617. Ці антитіла включаючи цитолітичні Т-клітини (CTL)), клітиникілери, природні клітини-кілери, макрофаги, монозв'язуються з епітопом Fс RI-, Fс RII- або Fс RIIIцити, еозинофіли, нейтрофіли, поліморфонуклеарецептора на сайті, який відрізняється від Fc рні клітини, гранулоцити, мастоцити і базофіли. зв'язуючого сайту рецептора, і, таким чином, їх Деякі ефекторні клітини експресують специфічні зв'язування суттєво не блокується фізіологічними Fc-рецептори і виконують специфічні імунні функрівнями IgG. Специфічними антитілами проти ції. В переважних варіантах здійснення винаходу Fс RI, які корисні у цьому винаході, є mAb 22, mAb ефекторна клітина здатна індукувати ADCC, на32, mAb 44, mAb 62 і mAb 197. В інших варіантах приклад, нейтрофіл, здатний індукувати ADCC. здійснення винаходу антитіло проти Fс RI являє Наприклад, моноцити, макрофаги, які експресують собою гуманізовану форму антитіла 22 (Н22). FcR, беруть участь у специфічному кілінгу клітинПродукування і зняття характеристик з антитіла мішеней і представленні антигенів дії інших комН22 описані у Graziano, R.F. et al. (1995) J. понентів імунної системи або у зв'язуванні з клітиImmunol 155 (10): 4996-5002 і в WO 94/10332. Клінами, які представляють антигени. В інших варіантинна лінія, яка продукує антитіло Н22, була депотах здійснення винаходу ефекторна клітина може нована в Американській колекції типів культур 4 фагоцитувати антиген-мішень, клітину-мішень або листопада 1992 року за позначенням HA022CL1 і мікроорганізм. Експресія конкретного FcR на ефемає номер доступу CRL 11177. кторній клітині може регулюватись гуморальними В інших переважних варіантах здійснення вифакторами, наприклад, цитокінами. Наприклад, находу специфічність зв'язування по відношенню було виявлено, що експресія Fс RI може регулюдо Fc-рецептора забезпечується антитілом, яке ватися щодо її підвищення гамма-інтерфероном зв'язується з IgA-рецептором людини, наприклад, (IFN- ). Така посилена експресія підвищує цитотоFc RI (CD89), зв'язування якого переважно не ксичну активність клітин, які є носіями Fс RI, проти блокується імуноглобуліном A (IgA) людини. Термішеней. Ефекторна клітина може фагоцитува ти мін "IgA-рецептор" передбачає включення генного або лізувати антиген-мішень або клітину-мішень. продукту -гену (Fc RI), розміщеного на хромосо"Клітина-мішень" означає будь-яку клітину у мі 19. Відомо, що цей ген кодує декілька альтернасуб'єкта (наприклад, у людини або тварини), на тивно сплайсованих трансмембранних ізоформ з яку може бути направлена дія запропонованої 55-110kDa. Fc RI (CD89) конститутивно експресукомпозиції (наприклад, моноклонального антитіла ється на моноцитах/макрофагах, еозинофільних і людини, біспецифічної або мультиспецифічної нейтрофільних гранулоцитах, але не в популяціях молекули). В переважних варіантах здійснення неефекторних клітин. Fc RI має середню афінвинаходу клітина-мішень являє собою клітину, яка ність як до IgA1, так і до IgA2, яка зростає під дією експресує або зверхекспресує CD25. Клітини, які цитокінів, наприклад, G-CSF або GM-CSF (Morton, експресують CD25, як правило, включають актиH.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology вовані Т-клітини, моноцити і В-клітини. 16:423-440). Описані чотири Fc RI-специфічні моЗапропоновані біспецифічні і мультиспецифічноклональні антитіла, ідентифіковані як A3, А59, ні молекули можуть бути одержані з використанА62 і А77, які зв'язують Fc RI за межами лігандням хімічних методів (див., наприклад, D. М. Kranz зв'язувального домену IgA (Monteiro, R.C. etal, et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807), 1992, J. Immunol. 148:1764). "полідомних" методів (див. US 4,474,893, виданий Fc RI і Fс RI є переважними стимулюючими Reading) або ДНК-рекомбінантних методів. рецепторами для застосування у даному винаході, Зокрема, запропоновані біспецифічні і мультиоскільки вони (1) експресуються переважно на специфічні молекули можуть бути одержані шляімунних ефекторних клітинах, наприклад, моноцихом кон'югування складових специфічностей зв'ятах, PMN, макрофагах і дендровидних клітинах; (2) зування, наприклад, специфічностей зв'язування експресуються на високих рівнях (наприклад, проти FcR і проти CD25, із застосуванням методів, 5000-100 000 на клітину); (3) є медіаторами цитовідомих у даній області техніки і описаних у наветоксичної активності (наприклад, ADCC, фагоцитодених нижче прикладах. Наприклад, кожна специзу); і (4) опосередковують посилене антигенне фічність зв'язування біспецифічної і мультиспеципредставлення у антигенів, включаючи аутоантифічної молекули може генеруватися окремо і після гени, які націлені на них. цього кон'югува тися одна з одною. Коли специфічТермін "специфічне антитіло ефекторної кліностями зв'язування є протеїни або пептиди, для тини" в контексті даного опису відноситься до анковалентної кон'югації може бути застосований титіла або функціонального фрагменту антитіла, ряд зв'язуючих або зшиваючи х агентів. Приклади що зв'язується з Fc-рецептором ефекторних клізшиваючих агентів включають протеїн А, карбодіітин. Переважні антитіла для застосування у цьому мід, N-сукцинімідил-S-ацетилтіоацетат (SATA), винаході зв'язують Fc-рецептор ефекторних клітин 5,5'-дитіо-біс-(2-нітробензойну кислоту) (DTNB), она сайті, який не зв'язаний ендогенним імуноглофенілендималеїмід (oPDM), N-сукцинімідил-3-(2буліном. піридилдитіо)-пропіонат (SPDP) і сульфосукциніТермін "ефекторна клітина" в контексті даного мідил-4-(N-малеїмідометил)-циклогексан-1опису відноситься до імунної клітини, яка бере карбоксилат (сульфо-SMCC) (див., наприклад, участь в ефекторній фазі імунної реакції, на проKarpovsky et al. (1984) J. Exp. Med 160:1686; Liu, тивагу когнітивній фазі і фазі активації імунної реаMA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). кції. Приклади імунних клітин включають клітину Інші методи включаюь ті, які описані у Paulus мієлоїдного або лімфоїдного походження, напри(Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan клад, лімфоцити (наприклад, В-клітини і Т-клітини, et al. (Science (1985) 229:81-83) і Glennie et al. (J. 49 90082 50 Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Переважними Відповідно до ще одного аспекту даного винакон'югуючими агентами є SATA і сульфо-SMCC, ходу моноклональні антитіла людини проти CD25 обидва від Pierce Chem ical Co. (Rockford, IL). кон'югуються з терапевтичною складовою, наприКоли специфічностями зв'язування є антитіла, клад, цитотоксином, лікарським препаратом (навони можуть бути кон'юговані через сульфгідрильприклад, імунодепресантом) або радіоізотопом. ний зв'язок С-кінцевих шарнірних областей двох Такі кон'югати в даному описі називаються "імуноважких ланцюгів. В особливо переважному варіанкон'югатами". Імунокон'югати, які включають один ті здійснення винаходу шарнірна область модифіабо більше цитотоксинів, називаються "імунотоккована таким чином, щоб перед кон'югуванням синами." Цитотоксин або цитотоксичний агент містити непарне число сульфгідрильних залишків, включає будь-який агент, який є згубним для кліпереважно один. тин (наприклад, убиває). Приклади включають В альтернативному варіанті здійснення винатаксол, цитохалазин В, граміцидин D, бромід етиходу обидві специфічності зв'язування можуть дію, еметін, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінккодуватися у одному і тому ж векторі і експресуваристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даутися та комплектуватися у одній і тій же клітинінорубіцин, дигідроксиантрациндіон, мітоксантрон, хазяїні. Цей метод є особливо корисним, якщо мітраміцин, актиноміцин D, 1-дегідротестостерон, біспецифічною або мультиспецифічною молек углюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол, пуроміцин і їхні аналоги або гомологи. лою є злитий протеїн mAb mАb, mAb Fab, Придатні терапевтичні агенти для одержання Fab F(ab')2 або ліганд Fab. Запропонована біспезапропонованих імунокон'югатів включають, але цифічна або мультиспецифічна молекула, наприне обмежуються ними, антиметаболіти (наприклад, біспецифічна молекула, може бути одноланклад, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тіогуанін, цюговою молекулою, наприклад, одноланцюговим цитарабін, флударабін, 5-фторурацилдекарбазин), біспецифічним антитілом, одноланцюговою біспеалкілуючі агенти (наприклад, мехлоретамін, тіоецифічною молекулою, що включає одне одноланпахлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) і цюгове антитіло і зв'язуючу детермінанту, або одломустин (CCNU), циклофосфамід, бусульфан, ноланцюговою біспецифічною молекулою, що дибромманнітол, стрептозотоцин, мітоміцин С і містить дві зв'язуючі детермінанти. Біспецифічні і цисплатин (цис-дихлордіамінплатина (II) (DDP)), мультиспецифічні молекули можуть бути також антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (колишній одноланцюговими молекулами або можуть містити дауноміцин) і доксорубіцин), антибіотики (наприщонайменше дві одноланцюгові молекули. Методи клад, дактиноміцин (колишній актиноміцин), блеоодержання таких біспецифічних і мультиспецифічміцин, мітраміцин і антраміцин (АМС)) і антиних молекул описані, наприклад, в US 5,260,203; мітотичні агенти (наприклад, вінкристин і вінблаUS 5,455,030; US 4,881,175; US 5,132,405; US тин). Інші приклади терапевтичних цитотоксинів, 5,091,513; US 5,476,786; US 5,013,653; US що можуть бути кон'юговані з запропонованим 5,258,498; і US 5,482,858. антитілом, включають каліхеаміцини і дуокарміциЗв'язування біспецифічних і мультиспецифічни. них молекул з їх специфічними мішенями може Запропоновані антитіла можуть бути також бути підтверджено твердофазним імуносорбенткон'юговані з радіоізотопами, наприклад, йодом ним аналізом (ELISA), радіоімунологічним аналі131, ітрієм-90 або індієм-111, з метою генерування зом (RIA), FACS-аналізом, біоаналізом (наприцитотоксичних радіофармацевтичних засобів для клад, інгібування росту), BIAcore-аналізом або лікування пов'язаного з CD25 розладу, наприклад, вестерн-блотінгом. Кожен з цих аналізів зазначай раку. Запропоновані кон'югати антитіл можуть бути виявляє присутність комплексів протеїн-антитіло, застосовані для модифікування заданої біологічної які представляють конкретний інтерес, шляхом реакції, причому лікарська складова не повинна застосування міченого реагенту (наприклад, антирозглядатися як така, що обмежується класичними тіла), специфічного по відношенню до такого комхімічними терапевтичними агентами. Наприклад, плексу. Наприклад, комплекси FcR-антитіло мотака лікарська складова може бути протеїном або жуть бути виявлені з використанням, наприклад, поліпептидом, що має бажану біологічну активфермент-зв'язаного антитіла або фрагмента антиність. Такі протеїни можуть включати, наприклад, тіла, що розпізнає комплекси антитіло-FcR і спеферментно активний токсин або його активний цифічно зв'язується з ними. В альтернативному фрагмент, наприклад, абрин, ріцин А, псевдом оваріанті здійснення винаходу такі комплекси мональний екзотоксин А або токсин дифтерії, або жуть бути виявлені з використанням будь -якого із агент, що є активним на клітинній поверхні, наприряду інших імуноаналізів. Наприклад, антитіло клад, ферменти фосфоліпази, наприклад, фосфоможе бути помічене радіоактивним ізотопом і заліпаза С. стосовано у радіоімунологічному аналізі (RIA) Техніка кон'югування таких терапевтичних (див., наприклад, Weintraub, В., Principles of складових з антитілами добре відома, див., наприRadioimmunoassays, Seventh Training Course on клад, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Radioligand Assay Techniques (Принципи радіоім уImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy" (Монологічного аналізу, Сьомий навчальний курс з ноклональні антитіла для імунонаправлення лікарметодів радіолігандного аналізу), The Endocrine ських засобів у терапії ракових захворювань), у Society, March, 1986). Радіоактивний ізотоп може Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Монокбути виявлений з допомогою таких засобів, як лональні антитіла і терапія ракових захворювань), лічильник або лічильник сцинтиляції, або із застоReisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. суванням авторадіографії. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" IV. Ім унокон'югати 51 90082 52 (Антитіла для доставки лікарських засобів), у приклад, преднісоном і циклоспорином; преднісоControlled Drug Delivery (Контрольована доставка ном, циклоспорином і азатіоприном; або преднісолікарських засобів) (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), ном, циклоспорином і мофетилом мік офенолату. pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, В додатковому варіанті такі терапевтичні аген"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer ти включають один або більше протизапальних Therapy: A Re view" (Антитіла у ролі носіїв цитотокагентів, наприклад, стероїдний лікарський засіб сичних засобів у терапії ракових захворювань: або протизапальний лікарський засіб нестероїдноогляд), у Monoclonal Antibodies '84: Biological I го типу (NSAID). Переважні агенти включають, Clinical Applications (Моноклональні антитіла '84: наприклад, аспірин та інші саліцилати, інгібітори біологічне та клінічне застосування), Pinchera et al. Сох-2, наприклад, рофекоксиб і целехоксиб, (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And NSAID, наприклад, ібупрофен, фенопрофен, наFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of проксен, суліндак, диклофенак, піроксикам, кетопRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy" (Аналіз, рофен, дифлунізал, набуметон, етодолак, оксапрезультати і перспектива терапевтичного застосурозин та індометацин. вання міченого радіоактивними ізотопами антитіла В іншому варіанті здійснення винаходу такі теу терапії ракових захворювань), у Monoclonal рапевтичні агенти включають один або більше Antibodies For Cancer Detection And Therapy (МоDMARD, наприклад, метотрексат, гідроксихлороноклональні антитіла для виявлення і терапії рахін, сульфасалазин, інгібітори синтезу піримідину, кових захворювань), Baldwin et al. (eds.), pp. 303наприклад, лефлюномід, засоби для блокування 16 (Academic Press 1985), і Thorpe et al., "The IL-1-рецептора, наприклад, анакінара, і засоби для Preparation I Cytotoxic Properties Антитіла-Toxin блокування TNF- , наприклад, етанерцепт, інфлікConjugates" (Приготування і цитотоксичні властисимаб й адалімумаб. Додатковими придатними вості кон'югатів антитіло-токсин), Immunol. Rev., DMARD є антитіла проти IL-6R, CTLA4Ig і антитіла 62:119-58(1982). проти IL-15. В додатковому варіанті здійснення винаходу В іншому варіанті здійснення винаходу такі тезапропоновані моноклональні антитіла людини рапевтичні агенти включають один або більше приєднані до лінкера-хелатора, наприклад тіуксеагентів для лікування запального або гіперпролітану, який робить можливим кон'югування антитіла феративного захворювання шкірного покриву, наз радіоактивним ізотопом. приклад, лікарські засоби локальної дії, включаючи V. Фармацевтичні композиції кам'яновугільний дьоготь, вітамін А, антралін, каВідповідно до ще одного аспекту даного винальципотрієн, таразотен і кортикостероїди, лікарські ходу запропоновані композиції, включаючи, фарпрепарати для перорального введення або вприсмацевтичні композиції, що містять одне запропокування, наприклад, кортикостероїди, метотрексат, новане моноклональне антитіло людини або ретиноїди, наприклад, ацикретин, циклоспорин, комбінацію таких антитіл. Такі к омпозиції можуть етанерцепт, алефацепт, ефалюзимаб, 6-тіоганін, бути одержані з використанням фармацевтично мотефіл мікофенолату, такролімус, (FK-506) і гідприйнятних носіїв або розбавників, а також будь роксисечовина. Іншими прикладами є CTLA4Ig та яких інших відомих ад'ювантів і наповнювачів відінфліксимаб. Інші способи лікування можуть вклюповідно до традиційних методів, наприклад, опичати застосування сонячного світла або фототесаних у Remington: The Science і Practice of рапії, включаючи UVB (ультрафіолет В в широк оPharmacy (Теорія і практика фармацевтичного полосному і вузькополосному діапазоні), UVA th діла), 19 Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing (ультрафіолет А) і PU VA (псорален-метоксален Co., Easton, PA, 1995. плюс ультрафіолет А). Запропоновані композиції можуть також застоВ додатковому варіанті запропоновані компосовува тися в комбінованій терапії, тобто разом з зиції застосовуваються в комбінації з двома або іншими агентами, які мають відношення до захвобільше зазначеними вище терапевтичними засорювання або стану, що підлягає лікуванню. Наприбами, наприклад, метотрексат+фототерапія клад, комбінована терапія може включати запро(PUVA або UVA); метотрексат+ацитретин; ацитрепоновану композицію разом з щонайменше одним тин+фототерапія (PUVA або UVA); метотрекімунодепресантом, щонайменше одним протизасат+ацитретин+фототерапія (PUVA або UVA); гідпальним агентом, щонайменше одним антипсоріароксисечовина+фототерапія (PUVA або UVB); тичним агентом або щонайменше одним хіміотегідроксисечовина+ацитретин; циклоспорапевтичним агентом. рин+метотрексат; або кальципотрієн+фототерапія В одному із варіантів здійснення винаходу такі (UVB). терапевтичні агенти включають один або більше У ще одному варіанті здійснення винаходу такі імунодепресантів, наприклад, циклоспорин, азатітерапевтичні агенти включають один або більше оприн, мікофенолову кислоту, мофетил мікофенохіміотерапевтичних засобів, наприклад, доксорубілату, кортикостероїди, наприклад, преднісон, мецин, цисплатин, блеоміцин, кармустин, циклофостотрексат, солі золота, сульфасалазин, фамід, віндезин, вінкрстин і хлорамбуцил. протималярійні препарати, брекінар, лефлюномід, У ще одному варіанті здійснення винаходу з амізонбін, 15-дезоксипергуалін, 6-меркаптопурин, пропоновані антитіла можуть застосовуватися в циклофосфамід, рапаміцин, такролімус (FK-506), поєднанні з радіотерапією і/або трансплантацією ОКТ3 і антитимоцитглобулін. кісткового мозку. В додатковому варіанті здійснення винаходу У ще одному варіанті запропоновані антитіла запропоновані композиції застосовуються в комбіможуть застосовуватися в комбінації з іншими аннації з двома або більше імунодепресантами, натитілами, наприклад, іншими імуносупресивними 53 90082 54 моноклональними антитілами людини, наприклад, покрити сполуку або застосувати сполуку одночаантитілами, що зв'язуються з р75 IL-2-рецептора, сно з матеріалом для запобігання її дезактивації. або антитілами, що зв'язуються з, наприклад, Наприклад, така сполука може бути введена суМНС, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, В7, CD40, CD45, б'єкту у відповідному носії, наприклад, ліпосомах або розбавнику. Фармацевтично прийнятні розбаIFN- , TNF- , IL-4, IL-5, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-10, вники включають сольові і водні забуферені розCD11a, CD20 або CD58, або антитілами, що зв'ячини. Ліпосоми включають емульсії типа "вода-узуються зі своїми лігандами; або в комбінації з іншими імуномодулюючими сполуками, наприклад, маслі-у-воді" CGF, а також традиційні ліпосоми (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27). з розчинним IL-15R або IL-10. Фармацевтично прийнятні носії включають Термін "фармацевтично прийнятний носій" у стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні тому розумінні, у якому він використовується в порошки для негайного приготування стерильного даному описі, включає будь-який і всі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріарозчину або дисперсії для ін'єкцій. Використання такого середовища і засобів для фармацевтично льні і протигрибкові агенти, ізотонічні агенти і агенактивних речовин відоме у даній області техніки. ти, що затримують абсорбцію, і тому подібне, які є За винятком лише тих випадків, коли будь -яке фізіологічно сумісними. Переважно такий носій традиційне середовище або агент є несумісним з має бути придатним для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, активною сполукою, його застосування у запропонованих фармацевтичних композиціях також песпінального або епідермального застосування редбачається. У композиції також можуть бути (наприклад, шляхом ін'єкції або інфузії). включені додаткові активні сполуки. Термін "фармацевтично прийнятна сіль" відТерапевтичні композиції, як правило, мають носиться до солі, яка зберігає бажану біологічну активність спорідненої сполуки і не викликає жодбути стерильними і стійкими в умовах виготовлення і зберігання. Композиція може бути приготована них небажаних токсикологічних ефектів (див., нау вигляді розчину, мікроемульсії, ліпосоми або приклад, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. іншої упорядкованої структури, придатної для ви66:1-19). Приклади таких солей включають кислосокої концентрації лікарського засобу. Носієм мотно-адитивні солі і основно-адитивні солі. Кислотно-адитивні солі включають ті, що дериватизовані же бути розчин або дисперсійне середовище, яке містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприз нетоксичних неорганічних кислот, наприклад, клад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетилехлорводневої, азотної, фосфорної, сірчаної, бромнгліколь і тому подібне), і їх придатні суміші. Наводневої, йодводневої, фосфорної і подібних кислежна текучість може підтримуватись, наприклад, лот, а також з нетоксичних органічних кислот, наприклад, аліфатичних моно- і дикарбонових шляхом використання покриття, наприклад, лецитина, шляхом підтримання необхідного розміру кислот, феніл-заміщених алканових кислот, гідрокчастинок у випадку дисперсії і використання повесиалканових кислот, ароматичних кислот, аліфархнево-активних сполук. У багатьох випадках петичних і ароматичних суль фонових кислот і подібреважним було б включення у композицію ізотоніних. Основно-адитивні солі включають ті, що дериватизовані з лужноземельних металів, напричних агентів, наприклад цукрози, поліспиртів, наприклад, гліцеріну, маніту, сорбіту, або хлориду клад, натрію, калію, магнію, кальцію і подібних, а натрію. Пролонгована абсорбція композицій для також з нетоксичних органічних амінів, наприклад, ін'єкцій може бути забезпечена шляхом включення Ν,Ν'-дибензилетилендіаміну, N-метилглюкаміну, у композицію агенту, який уповільнює абсорбцію, хлорпрокаїну, холіну, діетаноламіну, етилендіаміну, прокаїну і подібних. наприклад, моностеаратних солей і желатину. В одному з варіантів здійснення винаходу заЗапропоновані композиції, включаючи фарм апропоновані моноклональні антитіла людини зацевтичні (терапевтичні) композиції, можуть бути стосовуються у кристалічній формі шляхом підшкізастосовані шляхом використання ряду методик, рних ін'єкцій, див. Yang et al. (2003) PNAS, відомих у даній області техніки. Фахівець -практик зрозуміє, що шлях і/або спосіб такого застосуван100(12):6934-6939. Стерильні розчини для ін'єкцій можуть бути ня буде відрізнятися в залежності від бажаних реодержані шляхом введення активної сполуки у зультатів. Активні сполуки можуть бути одержані необхідній кількості у відповідний розчинник з одразом з носіями, який захищатимуть сполуку від ним або комбінацією перелічених вище інгредієншвидкого вивільнення, а саме у вигляді препарату контрольованого вивільнення, включаючи імплантів, за необхідністю, з наступним мікрофільтруванням з метою стерилізації. Взагалі, дисперсії тати, трансдермальні пластирі і мікрокапсуловані одержують шляхом введення активної сполуки у системи доставки. Можуть бути застосовані біоростерильний носій, який містить основне дисперсійзкладні, біосумісні полімери, наприклад, етиленвіне середовище та інші необхідні інгредієнти з пенілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, поліортоестери і полімолочна кислота. релічених ви ще. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних розчинів для ін'єкцій Методи приготування таких композицій, взагалі, переважними методами приготування є вакуумне відомі фахівцям. Див., наприклад, Sustained і висушування і висушування заморожуванням (ліControlled Release Drug Delivery Systems (Системи офілізація), які дають порошок активного інгредієдоставки ліків пролонгованого і контрольованого вивільнення лікарських засобів), J.R. Robinson, ed., нта плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з його попередньо відфільтрованого стерилізоваMarcel Dekker, Inc., New York, 1978. ного розчину. Для застосування запропонованих сполук визначеним способом може виникнути необхідність 55 90082 56 Режими дозування підбираються таким чином, ки, є придатними. Дозовані лікарські форми для щоб забезпечити оптимальну бажану реакцію (намісцевого або трансдермального введення запроприклад, терапевтичний відгук). Наприклад, може понованих композицій включають порошки, спреї, бути введена одна ударна доза, можуть бути замазі, пасти, креми, лосьйони, гелі, розчини, пласстосовані декілька розділених доз протягом певнотирі і засоби для інгаляції. Активна сполука може го часу або доза може бути пропорційно зменшена бути змішана в стерильних умовах з фармацевтиабо збільшена, що диктується тією чи іншою терачно прийнятним носієм, а також з будь -якими конпевтичною ситуацією. Особливо переважним для сервантами, буферами або газамипарентеральних композицій є їх виго товлення у витиснювачами за необхідністю. вигляді дозованої лікарської форми для спрощенВирази "парентеральне застосування" і "заня застосування і забезпечення рівномірності доз. стосований парентерально" у тому розумінні, у Термін "дозована лікарська форма" у тому роз уякому він використовується в даному описі, ознамінні, у якому він використовується в даному описі, чають способи застосування, відмінні від ентеравідноситься до фізично дискретних одиниць, прильного і місцевого застосування, здійснювані як датних для введення у вигляді одиничних доз для правило, шляхом ін'єкції, і включають, але не обсуб'єктів, що підлягають лікуванню; кожна одиниця межуються ними, внутрішньовенну, внутрішнь омістить задану кількість активної сполуки, яка розм'язову, вн утрішньоартеріальну, внутрішньооборахована для забезпечення бажаного терапевтичлокову, інтракапсулярну, інтраорбітальну, ного ефекту, у поєднанні з необхідним фармацевінтракардіальну, вн утрішньошкірну, інтраперитотичним носієм. Специфікація запропонованих неальну, транстрахеальну, підшкірну, підшкірнодозованих лікарських форм визначається і безпожирову, інтраартикулярну, субкапсулярну, субарасередньо залежать від (а) унікальних характерисхноїдальну, інтраспінальну, епідуральну і тик активної сполуки і конкретного терапевтичного внутрішньогрудинну ін'єкцію або інфузію. ефекту, що треба досягти, і (b) обмежень, які існуПриклади придатних водних і неводних носіїв, ють у те хніці включення такої активної сполуки у які можуть застосовуватись у запропонованих фарецептур у для лікування вразливості у суб'єктів. рмацевтичних композиціях включають воду, етаПриклади фармацевтично прийнятних антиокнол, поліоли (наприклад, гліцерин, пропіленглісидантів включають: (1) водорозчинні антиоксидаколь, поліетиленгліколь і тому подібне), і їх нті, наприклад, аскорбінову кислоту, цистеїновий придатні суміші, рослинні олії, наприклад, оливкогідрохлорид, бісульфат натрію, метабісульфіт наву олію, і ін'єкційні органічні складні ефіри, такі як трію, сульфіт натрію і тому подібне; (2) маслорозетилолеат. Належна текучість може підтримувачинні антиоксиданті, наприклад, аскорбіловий патись, наприклад, шляхом застосування покриттів, льмітат, бутильований гідроксианізол (ВНА), наприклад, лецитину, шляхом підтримання необбутильований гідрокситолуол (ВНТ), лецитин, прохідного розміру частинок у випадку дисперсій, і пілгалат, альфа-токоферол і тому подібне; і (3) шляхом використання поверхнево-активних речометал-хелатуючи агенти, наприклад, лимонну кисвин. лоту, етилендіамінтетраоцтову кислоту (EDTA), Ці композиції також можуть містити ад'юванти, сорбіт, винну кислоту, фосфорну кислоту і тому такі як консерванти, зволожуючі агенти, емульгаподібне. тори і диспергатори. Запобігання появи мікрооргаЗапропоновані терапевтичні композиції можуть нізмів може бути забезпечене як технікою стерилібути складені з урахуванням конкретних шляхі в їх зації, як це зазначено вище, так і шляхом застосування, наприклад, для перорального, надодавання різних антибактеріальних і протигрибзального, місцевого (включно з буккальним і під'я кових агентів, наприклад, парабену, хлорбутанолу, зиковим), ректального, вагінального і/або парентефенолу, сорбінової кислоти і тому подібне. Також рального введення. Такі рецептури можуть може бути бажано включення ізотонічних агентів, традиційно бути присутніми у вигляді дозованої наприклад, цукрози, хлориду натрію і тому подіблікарської форми і можуть бути приготовлені будь не. Крім того, може бути застосована пролонговаякою методом, відомим у фармації. Кількість актина абсорбція для уприскуваної фармацевтичної вного інгредієнта, який може бути поєднаним з форми, що забезпечується шля хом включення матеріалом носія для одержання разової дозоваагентів, які уповільнюють абсорбцію, наприклад, ної лікарської форми, буде змінюватися в залежмоностеарату солей алюмінію і желатину. ності від суб'єкта, який проходить лікування, і конКоли запропоновані сполуки застосовуються кретного способу застосування. Кількість по відношенню до людей і тварин у вигляді фарактивного інгредієнта, який може бути поєднаним з мацевтичних препаратів, вони можуть бути призматеріалом носія для одержання разової дозованачені окремо або у вигляді фармацевтичної комної лікарської форми, буде, взагалі, тією кількістю позиції, яка містить, наприклад, від 0,01 до 99,5% композиції, яка забезпечує досягнення терапевти(більш переважно від 0,1 до 90%) активного інгречного ефекту. Взагалі, із ста відсотків ця кількість дієнта у комбінації з фармацевтично прийнятним становитиме від приблизно 0,01% до приблизно носієм. 99% активного інгредієнта, переважно від приблиНезалежно від обраного шляху застосування зно 0,1% до приблизно 70%, найбільш переважно запропоновані сполуки, які можуть бути викорисвід приблизно 1% до приблизно 30%. тані у придатній гідратованїй формі, і/або запроЗапропоновані лікарські форми, придатні для поновані фармацевтичні композиції включаються у вагінального введення, включають також песарії, фармацевтично прийнятні дозовані лікарські фортампони, креми, гелі, пасти, піни або спреї, які місми з використанням методів, відомих фахівцям у тять такі носії, які, як відомо в даній області техніданій області техніки. 57 90082 58 Фактичні рівні дозування активних інгредієнтів введені у вигляді ін'єкцій ударних доз. В іншому у запропонованих фармацевтичних композиціях варіанті здійснення винаходу запропоновані мономожуть бути змінені з метою забезпечення такої клональні антитіла можуть бути застосовані для кількості активного інгредієнта, яка дозволяє зазапобігання відторгнення трансплантату в дозах безпечити досягнення бажаної терапевтичної реавід 0,5 до 1,5мг/кг внутрішньовенно через тиждень кції у конкретного пацієнта, композиції і способу у кількості до п'я ти доз, причому перша доза ввозастосування, без токсічної дії на пацієнта. Вибрадиться перед операцією. Таке застосування може ний рівень дозування залежать від різноманіття бути поєднане з імуносупресивним терапевтичним фармакокінетичних факторів, включаючи активзасобом, наприклад, із стероїдами, такими як преність конкретних застосовуваних композицій, заднісон або метилпреднісолон і циклоспорин; або пропонованих згідно з даним винаходом, або їх стероїдами, такими як нреднісон або метилпредніскладних ефірів, солей або амідів, спосіб застосусолон, циклоспорин і азатіоприн; або стероїдами, вання, час застосування, швидкість екскреції конктакими як преднісон або метилпреднісолон, цикретної застосовуваної сполуки з організму, тривалоспорин і мофетил мікофенолату. Застос ування лість лікування, інші лікарські засоби, сполуки і/або антитіл людини може привести до зниження рівня матеріали, які застосовуються у комбінації з конкстероїдів до помірного або до швидкого виведення ретними застосовуваними композиціями, вік, стероїдів. стать, вагу, стан, загальний стан здоров'я та попеВ іншому варіанті здійснення винаходу запроредню історію хвороби пацієнта, який проходить поновані моноклональні антитіла людини можуть лікування, і подібні фактори, добре відомі в обласбути застосовані для лікування або запобігання ті медицини. відторгнення трансплантату за схемою дводозової Лікар або ветеринар, який є середнім фахіввнутрішньовенної інфузії (приблизно 20мг на одну цем у даній області техніки, може легко визначити дозу у день трансплантації і приблизно 20мг на і призначити ефективну кількість необхідної фарчетвертий день після трансплантації). Таке застомацевтичної композиції. Наприклад, лікар або весування може бути поєднане з імуносупресивним теринар зміг би почати з доз запропонованих спотерапевтичним засобом, наприклад, як це розкрилук, які застосовуються у фармацевтичній то ви ще. Наприклад, 1г мофетилу мікофенолату композиції, на рівнях, нижчих від необхідного для можна ввести перорально перед операційним досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і втр учанням і 500мг метилпреднісолону на час ввіпоступово підвищувати дозування, доки не буде дного наркозу. Циклоспорин може бути введений досягнуто бажаного терапевтичного ефекту. Вз ана другий день після трансплантації, а введення галі, придатна денна доза запропонованих компомофетилу мікофенолату може бути подовжене у зицій буде тією кількістю сполуки, яка є найнижчою кількості 1г після трансплантації. Стероїди можуть дозою, здатною забезпечити бажаний терапевтичбути зведені до 20мг преднісону перорально на ний ефект. Така ефективна доза залежатиме, вз ачетвертий післяопераційний день. галі, від описаних вище факторів. Переважно, щоб В ще одному варіанті здійснення винаходу з авведення було внутрішньовенним, внутрішньом'япропоновані моноклональні антитіла людини мозовим, внутрішньочеревним або підшкірним і, пежуть бути застосовані для лікування або запобіреважно, у проксимальному відносно мішені місці. гання відторгнення трансплантату за схемою Хоча запропоновану сполуку можна застосовувати дводозової індуктивної терапії, причому перша окремо, переважним варіантом є застосування у доза 1мг/кг вводиться за 1 годину до операційного вигляді фармацевтичного препарату (композиції). втр учання, а друга доза вводиться через 4 дні пісДозування може бути визначено або відрегуль оля трансплантації. Таке застосування може бути вано шляхом вимірювання кількості циркулюючих поєднане з імуносупресивним терапевтичним замоноклональних антитіл людини проти CD25 у собом, наприклад, як це розкрито вище. різні моменти часу після введення у біологічний Запропоновані моноклональні антитіла людизразок з використанням антиідіотипічних антитіл, ни можуть бути застосовані для запобігання відтомішенями для яких є антитіла проти CD25. ргнення трансплантату довгостроковою терапією, Запропоновані моноклональні антитіла людинаприклад, введенням дози в межах від 10 до ни можуть бути застосовані для запобігання відто150мг, наприклад, від 20 до 40мг, на тижневій або ргнення трансплантату індуктивним лікуванням, місячній базі, наприклад, 3-8-тижневі введення, за тобто короткостроковою терапією для разового якими необов'зково йде одне або більше місячних або множинного застосування перед трансплантавведень. Довгострокова терапія дозволяє зменшицією і на дуже ранній фазі після трансплантації, ти або уникнути терапії на базі циклоспорину. наприклад, незадовго до трансплантації і до 3 міТерапевтичні композиції на основі антитіл мосяців після трансплантації. жуть бути введені з використанням медичних приВ одному з варіантів здійснення винаходу застроїв, відомих у даній області техніки. Наприклад, пропоновані моноклональні антитіла людини мов переважному варіанті здійснення винаходу з ажуть, наприклад, бути застосовані для запобігання пропонована терапевтична композиція може бути відторгнення трансплантату в загальних дозах від введена з допомогою безголкового підшкірного приблизно 20 до 100мг, наприклад, введені у вишприца, такого як пристрої, описані в US гляді 15 або 20-міліграмових внутрішньовенних 5,399,163; US 5,383,851; US 5,312,335; US інфузій, причому перша доза вводиться перед 5,064,413; US 4,941,880; US 4,790,824; або US операцією, а наступні дози вводяться на протязі 4,596,556. Приклади добре відомих імплантатів і перших 10 днів після операції. В альтернативному модулів, які корисні для введення в даному винаваріанті здійснення винаходу дози можуть бути ході, включають: US 4,487,603, в якому розк ритий 59 90082 60 імплантований мікроінфузійний насос для розподіпідлягає лікуванню, і можуть бути визначені фахілу лікарського засобу з контрольованою швидкісвцями в даній області техніки. тю; US 4,486,194, в якому розкритий терапевтич"Терапевтично ефективна доза" для запобіний пристрій для введення лікарських засобів гання відторгнення трансплантату переважно змечерез шкіру; US 4,447,233, в якому розкритий інншить число й тяжкість приступів відторгнення фузійний насос для доставки лікарського засобу з трансплантату на ранніх стадіях. точною швидкістю інфузії; US 4,447,224, в якому "Терапевтично ефективна доза" для лікування розкритий імплантований інфузійний пристрій зі ревматоїдного поліартриту переважно приведе до змінним потоком для безперервної доставки лікарпопереднього визначення покращення ACR20 у ських засобів; US 4,439,196, в якому розкрита оспацієнтів, більш переважно до попереднього вимотична система доставки лікарських засобів, яка значення покращення ACR50 і навіть ще більш має багатокамерні відділення; і US 4,475,196, в переважно до попереднього визначення покраякому розкрита осмотична система доставки ліщення ARC70. карських засобів. Багато інших подібних імплантаПопереднє визначення покращення ACR20 тів, систем доставки і модулів відомі фахівцям у визначається як: даній області техніки. 20% покращення: показника больових відчутУ деяких варіантах запропоновані моноклонатів у суглобах (TCJ) і показника припухлості суглольні антитіла людини можуть бути включені до бів (SWJ) лікарської форми таким чином, щоб забезпечити і 20% покращення у 3 з 5 наступних оцінок: належний розподіл антитіл in vivo. Наприклад, геоцінка болю у пацієнта (VAS), оцінка загального матоенцефалічний бар'єр (ВВВ) виключає застостану пацієнта (VAS), загальна оцінка терапевта сування багатьох високогідрофільних сполук. Для (VAS), самооцінка пацієнтом своє недієздатності того, щоб забезпечити подолання запропоновани(HAQ), реагент гострої фази (CRP або ESR). ми терапевтичними сполуками гематоенцефалічACR50 і ACR70 визначаються таким же чином ного бар'єру (якщо це бажано), вони можуть вклюз покращенням відповідно 50% і 70%. Більш чатися до складу лікарської форми, наприклад, у детально див. Felson et al. в American College of ліпосомах. Щодо методів одержання ліпосом, див., Rheumatology Preliminary Definition of Improvement наприклад, US 4,522,811; US 5,374,548 і US in Rheumatoid Arthritis (Американський коледж ре5,399,331. Ліпосоми можуть містити одну або бівматології. Попереднє визначення покращення у льше складових, які селективно транспортуються у ревматоїдному поліартриті); Arthritis Rheumatism специфічні клітини або органи, і, таким чином, п о(Ревматоїдний поліартрит); (1995) 38: 727-735. силюють цільову доставку лікарського засобу В альтернативному варіанті здійснення вина(див., наприклад, V.V. Ranade (1989) J. Clin. ходу терапевтично ефективна доза для лікування Pharmacol. 29:685). Приклади направляючих скларевматоїдного поліартриту може бути виміряна дових включають фолат або біотин (див., наприDAS (показником активності протікання захворюклад, US 5,416,016, виданий Low et al.); манносиди вання), включаючи DAS28 і, що більш переважно, (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. DAS56, як це визначено EULAR. Commun. 153:1038); антитіла (P.G. Bloeman et al. "Терапевтично ефективна доза" для лікування (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) псоріазу переважно приведе до PASI50, більш Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); поверхневопереважно до PASI75, і навіть більш переважно до активний протеїновий А-рецептор (Briscoe et al. PASI90 у пацієнтів або до отримання оцінки зага(1995) Am. J. Physiol. 1233:134), різні види яких льного зниження захворювання, що порівнює можуть містити запропоновані лікарськи форми, а ефект поліпшення після лікування лікарськими також компоненти винайдених молекул; р120 засобами при порівнянні із станом під час підгото(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); див. вки до лікування. PASI (площа, уражена псоріазом, також K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS і індекс тяжкості) являє собою систему показників, Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) що використовується для оцінювання площі й тяжImmunomethods 4:273. В одному з варіантів здійскості захворювання. PASI50 визначений як 50% нення винаходу запропоновані терапевтичні спопокращення показнику. Таким же чином PASI75 і луки включені до складу лікарської форми в ліпоPASI90 визначені відповідно як 75% і 90% поксомах; в більш переважному варіанті ліпосоми ращення показника. включають направляючу складову. У найбільш "Терапевтично ефективна доза" для лікування переважному варіанті терапевтичні сполуки у лізлоякісних пухлин може бути виміряна на базі посомах доставляються ін'єкцією ударної дози до об'єктивної реакції злоякісної пухлини, яка може місця, що є проксимальним відносно до бажаної бути повною або частковою. Повна реакція (CR) ділянки, наприклад, до місця запалення або інфевизначається як відсутність клінічних, радіологічкції або місця розташування злоякісної пухлини. них або інших свідчень захворювання. Часткова Композиція має бути рідкою до такого ступеню, реакція (PR) є результатом зменшення загального який був забезпечив її використання з допомогою розміру злоякісної пухлини більше, ніж на 50%. шприца. Вона повинна бути стійкою в умовах виСередній час розвитку є мірою, що характеризує робництва і зберігання і повинна бути захищена тривалість об'єктивної реакції злоякісної пухлини. від забруднення мікроорганізмами, наприклад, "Терапевтично ефективна доза" для лікування бактеріями і грибками. злоякісних пухлин може також бути виміряна її Ефективні дози і схеми прийому лікарських заздатністю стабілізувати розвиток хвороби. Здатсобів для запропонованих моноклональних антитіл ність сполуки інгібувати рак може бути оцінена у людини залежать від захворювання або стану, що системі моделі тварини, яка прогнозує ефектив