Спосіб визначення активності фосфодіестерази в біологічному матеріалі

Изобретение относится к физической химии и криобиохимии и может найти применение при изучении механизмов замораживания-оттаивания, при консервировании сыворотки и клеток крови, тканей и органов. Известен способ определения активности эстеразы в замороженном биологическом материале, согласно которому в биологический материал вводят нефлуоресцирующее вещество - флуоресцеиндиацетат замораживают и определяют интенсивность флуоресценции образующегося флуоресцеина, по которой судят об активности эстеразы. Однако этот способ вообще не позволяет определять активность фосфодиэстеразы [1]. Наиболее близким к заявляемому является способ определения активности фосфодиэстеразы, основанный на расщеплении АМФ змеиным ядом до аденозинами фосфата при инкубации в течение, 10 мин при 37 оС. Активность фермента о пределяют Методом Фиске-Суббароу на спектрофотометре при 660 нм [2]. Недостатком способа является то, что он не позволяет определять активность фосфодиэстеразы непосредственно в замороженном биологическом материале, В основу изобретения поставлена задача создания такого способа определения активности фосфодиэстеразы в биологическом материале, в котором использование нового реактива позволяло бы проводить исследования' объекта в замороженном состоянии. В результате станет возможным исследование процессов, происходящих в замороженных органах, тканях и клетках, а также определение качества замороженных пищевых продуктов. Для решения этой задачи в способе определения активности фосфодиэстеразы в биологическом материале путем физико-химического анализа пробы, согласно изобретению, в него перед замораживанием вводит умбеллиферон в конечной концентраций 10-6-10-7 М и по снижению интенсивности флуоресценции умбеллиферона определяют активность фосфодиэстеразы. Применение умбеллиферона позволяет определять активность фосфодиэстеразы в замороженном биологическом материале. Способ осуществляют следующим образом. В биологический материал (суспензия клеток, гомогенат клеток тканей и органов) вводят субстрат реакции циклический аденозин-3), 5 монофосфат и умбеллиферон в концентрации 10-10 М. Пробы замораживают и определяют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 350±1 и максимуме длины волны флуоресценции 442 ±1 мМ. Интенсивность флуоресценции находится в обратной зависимости от количества расщепленного субстрата. Из таблицы 1 следует, что оптимальными концентрациями являются 10-6-10-7 М. При концентрации 10-5 М присутствует нерастворимый осадок умбеллиферона, а при концентрации 10-8 М чувствительность способа существенно снижается, что не позволяет достоверно судить о ходе реакции. Способ иллюстрируется следующим примером. Измерение флуоресценции проводили на спектрофлуориметре HItachi-MPF-LA (Япония) в кварцевых кюветах объемом 3 мол. В качестве среды инкубации использовали 3 мл солевой среды, содержащей 5 мМ МgСІ2 и 40 мМ NaCI. В этот объём вносили 50 мкл биологического материала, 50 мкл цАМФ (конечная концентрация 10-6 M) и сразу замораживали в парах жидкого азота до -10°С. После этого измеряли интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 350 нм и максимуме длины волны флуоресценции 442 нм. Данная величина интенсивности флуоресценции служила в качестве контроля фосфодиэстеразной реакции. Через 24 часа хранения при -10°С определяли интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 350 нм и максимуме длины волны флуоресценции 442 нм. Эту операцию повторяли дважды через 24 часа хранения при -10°С. В случае осуществления фосфодиэстеразной реакции при комнатной температуре (+20°С) по такой же схеме, она полностью завершалась через 20 мин инкубации. Полученные данные приведены в таблице 2.