Спосіб біотехнії штучного відтворення далекосхідної кефалі пиленгаса

Изобретение относится к области морского и пресноводного рыбоводства, в частности к биотехники получения в искусственных условиях оплодотворенной икры и спермы кефали - пиленгаса от производителей, выращенных в прудовых условиях. Известен способ формирования маточного стада дальневосточного пиленгаса в Северном Приазовье [1]. Однако процент выхода икры кефали-пиленгаса от производителей, выращенных в неволе с помощью этого способа относительно невелик. Известен также способ воспроизводства дальневосточной кефали пиленгаса суть которого заключается в том, что самкам вводят ацетонированный гипофиз сазана начиная со стадии желткового ооцита ежесуточно в дозе от 1 до 3 мг/кг массы рыбы до наступления фазы начала формирования жировых капель в ооците, а затем ацетонированный гипофиз сазана и хорио-гонический гонадотролин вводят совместно через каждые 12 ч в дозах 1,5-10 мг/кг массы рыбы и 2,5-10 тыс. м. е, соответственно, а по достижении ооцитом фаз формирования от 10 до 5 жировых капель инъецирование прекращают. Это способ позволяет получить икру от большого количества самок с высоким процентом оплодотворения от маточного стада пиленгаса. Однако, как показала практика, он громоздок, т. к. требует проведения большого количества инъецирований. Инъецирование необходимо проводить в два этапа двумя гормонами (большое количество гормонов), постоянно осуществлять контроль на первом этапе инъецирования. В связи с этим возникла задача упростить способ за счет сокращения количества инъекций и расхода препаратов. Эту задачу удалось решить путем создания самкам экологических условий среды в пределах от 19 до 22°С и введения гипофиза собственного вида начиная со стадии желткового ооцита дважды через 12-24 часа, при этом первое инъецирование составляет 5 мг/кг, а второе-10 мг/кг до овуляции. Способ осуществляется следующим образом. При температуре воды (19-22°С) на грани окончания нереста, производителей отбирают, определяют пол и состояние зрелости яичников у самок и семенников у самцов. Самцов берут с появлением каплей спермы. Критерием отбора самок является диаметр зрелых ооцитов. У"самое берут пробу икры и рассчитывают среднее значение диаметра ооцитов по вариационному ряду. Диапазон среднего диаметра ооцитов для отбора самок выбирают 590-655 мкм. В ооцитах должны полностью закончены процессы желткообразования с упругой оболочкой округлой или слабоэлипсоидальной формы. Отобранных самок и самцов отсаживают в бассейн с температурой воды 19-22°С. Затем готовят гипофизарную суспензию и вводят самкам гипофиз собственного вида (пиленгаса) 5 мг/кг массы рыбы (первая инъекция), через 12-24 часа' вводят вторую инъекцию этой же гипофизарной суспензии в количестве 10 мг/кг. Инъецирование проводят в один этап. Всего для одной самки используют 15 мг/кг веса (массы) ацетонированного гипофиза. Длительность периода созревания самок от желткового ооцита до полной овуляции составляет 33-44 часа. После созревания самок икру сливают в таз и оплодотворяют полусухим методом, закладывают в аппараты для инкубации. Процент оплодотворения достигает 60-80%, только при двухразовом инъецировании гипофизами собственного вида без дополнительного введения гонадотропина (ХГ)Пример 1. Производителей - зрелых самцов для гормонального стимулирования отбирают из специальных садков при температуре воды 20°С, у которых выделяется небольшое количество спермы и отсаживают в бассейн. У самок берут небольшую порцию икры с помощью щупа и помещают в чашку Петри с физиологическим раствором (0,8%-ный раствор хлорида натрия). Под бинокулярным микроскопом (МБС-1) определяют зрелость ооцитов, измеряют 50 яйцеклеток, составляют вариационные ряды и рассчитывают среднее значение диаметра ооцитов. Отбирают самок для дальнейшей работы с ооцитами диаметром 590 мкм и помещают их в бассейн с температурой воды 20°С к уже отобранным трем самцам. Одну самку сразу же инъецируют. Для этого готовят суспензию гипофизов от собственного вида из расчета 10-20 мг гипофиза и растворяют в 1 мл физраствора. Суспенаию гипофиза вводят внутримышечно шприцем объемом в 1-2 см3 под первым спинным плавником. Первая доза составляет 5 мг/кг массы самки, через 12 часов вводят вторую дозу, которая составляет 10 мг/кг. Обычно начиная со второй дозы инъецирования самок ведут постоянный контроль за изменениями в ооцитах. Выделяют следующие фазы развития: желтковый ооцит-ж, начало укрупнения жировых капель нжк, более 10 жировых капель - 10 жк, 5-10 жк, 2-4 жк, 1 жк гомогенизация и гидратация желтка - ГОМ, зрелаяяйцеклетка-ЗЯ. Фазы развития яйцеклетка достигает в конце первых суток. Размеры ооцитов увеличиваются до 600 мкм. Все остальные фазы проходят после второго инъецирования в 21-32 часа. Поэтому через 15-20 часов после второго инъецирования обязательно нужно проверить самку на зрелость ооцитов для того, чтобы не пропустить начало овуляции ооцитов. На фазе ЗЯ при легком надавливании На брюхо из гениталия выделяются зрелые икринки. Это свидетельствует об окончании овуляции, которая может длиться 2-3 часа после гомогенизации желтка. Далее икру отцеживают и осеменяют спермой в морской воде соленостью 2123%. Осеменение ведут "полусухим способом" в течение 5-10 мин. После окончания оплодотворенную икру промывают аэрированной морской водой в течение 15 мин. Результаты оплодотворения определяют спустя 1 час на этапе дробления 2-4 бластомера. Для этого отбирают по 100 икринок и под микроскопом (МБС-1) при увеличении 8x2 или 8x4 в камере Богорова просчитывают полностью делящиеся количество делящих яйцеклеток, что составляет до 70%. Пример 2. В условиях, аналогичных примеру 1 стимулируют половое созревание самки пиленгаса со средним размером ооцитов 665 мкм той же дозой, что и в первом случае. Оплодотворение достигало до 85%. Пример 3. В условиях аналогичных примеру 1 инъецируют самку с диаметром ооцитов 655 мкм, первая инъекция 3 мг/кг, а через 24 часа вторая - 5 мг/кг. Икра достигается зрелости через 48 часов. Оплодотворение яйцеклеток составляет 22%. Пример 4. В условиях аналогичных примеру 1, самок с диаметром ооцитов 637 мкм инъецируют при первой гипофизарной инъекции 10 мг/кг, вторая гипофизарная инъекция - 15 мг/кг. Созревание икринок происходит через 35 часов. Оболочки икринок не упругие, легко прокалываются, что указывает на передозировку. Оплодотворение яйцеклеток достигает до 40%. Примеры выполнения способа подтверждают его более простое использование и высокую эффективность, процент оплодотворения яйцеклеток достигает 70-85%. При этом значительно уменьшаются затраты на приобретение гормональных препаратов при их замене, снижается стоимость. Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить икру генеративно-высококачественную с высоким процентом оплодотворения яйцеклеток от маточного стада пиленгаса, выращиваемого в прудах со значительно меньшим количеством расхода АГП-15 мг/кг.