Штам escherichia coli к12 “inv” sbb – продуцент рекомбінантної неактивної субодиниці в дифтерійного токсину corynebacterium diphtheriae

Корисна модель належить до галузі біотехнології, а саме до розробки імунохімічної тест-системи для виявлення антитіл до окремих субодиниць дифтерійного токсину в сироватці крові та в крові людини і може бути використана для одержання рекомбінантного антигену Corynebacterium diphtheriae - неактивної субодиниці В дифтерійного токсину. Відома система для отримання рекомбінантних фрагментів дифтерійного токсину на основі штаму Escherichia coli [CA 1327329, А61К39/44, 1994]. Така система дозволяє отримувати субодиницю В дифтерійного токсину, але суттєвим її недоліком є індукція експресії, що відбувається при швидкому нагріванні бактеріальної культури до 60°С протягом 45 секунд та експресія цільового продукту, що відбувається при температурі 42°С, такі умови надзвичайно складно забезпечити при експресії в великих об'ємах. Також в даному патенті немає відомостей про можливість афінного очищення цільового продукту, що має важливе значення для отримання електрофоретично чистої субодиниці В. В основу корисної моделі поставлена задача одержати штам – продуцент рекомбінантної неактивної субодиниці В дифтерійного токсину шля хом використання генноінженерних методів, який дозволяв би одержувати продукт придатний для імунохімічних досліджень в якості антигена Corynebacterium diphtheriae із мінімальними затратами часу, ресурсів та з високим виходом цільового продукту. Поставлена задача вирішена шляхом одерження штаму - продуцента рекомбінантної неактивної субодиниці В дифтерійного токсину на основі штаму Escherichia coli Rosetta (DE3) шляхом трансформації штаму прототипу генетичною конструкцією, що має нуклеотидну послідовність частини гену дифтерійного токсину, яка кодує амінокислотну послідовність довжиною 340 залишків, що являє собою неактивну субодиницю В дифтерійного токсину та полігістидиновий таг, який забезпечує можливість металафінного виділення рекомбінантної субодиниці. На Фіг.1 представлена амінокислотна послідовність рекомбінантної субодиниці В, що продукується штамом Escherichia coli K12 "inv" sbB. На Фіг. 2 наведено амінокислотну послідовність, що відповідає амінокіслотній послідовності дифтерійного токсину згідно [1]. В результаті роботи з застосуванням генноінженерних підходів штам Escherichia coli Rosetta (DE3) набув здатності продукувати рекомбінантну неактивну субодиницю В дифтерійного токсину. Культурально-морфологічні характеристики. Культура Escherichia coli добре росте на рідких поживних середовищах на основі дріжджового екстракту та гідролізату казеїну. На поживних середовищах за температури 37°С час відтворення у log-фазі для Е.соlі становить близько 22 хвилин. Фізіолого-біохімічні характеристики. Оптимальна для росту температура складає 30-37°С та рН близько 7,0. Маркерні характеристики. Штам є хлорамфінікол та канаміцин резестентним. Біотехнологічна характеристика. Штам продукує рекомбінантну неактивну субодиницю В дифтерійного токсину, гібридизовану з полігістидиновим тагом, що спрощує процедуру виділення білка в чистому вигляді, методом металоафінної хроматографії. Вихід продукту складає близько 15мг цільового білка на 1л клітинної суспензії. Штам-продуцент було одержано шляхом транформації вихідного штаму Escherichia coli Rosetta (DE3) плазмідним вектором із послідовністю, що кодує ділянку гену субодиниці В дифтерійного токсину. Оскільки вихідний штам є загальнодоступним, процедура депозитування не проводилась. Продуктивність одержаного штаму складає близько 15мг цільового білка на 1л клітинної суспензії. Продукт може бути виділений у електрофоретично чистому вигляді методом металоафінної хроматографії (електрофореграму, на якій показано чистоту виділення цільового продукту, наведено на Фіг.3). Таким чином, одержано штам-продуцент рекомбінантної неактивної субодиниці В дифтерійного токсину, що може бути використано як антиген Corynebacterium diphtheriae при розробці імунохімічної тест-системи для виявлення антитіл до окремих субодиниць дифтерійного токсину в сироватці крові та в крові людини. Список посилань 1. Lawrence Greenfield, Michael J. Bjorn, Glenn Horn, Darlene Fong, Gregory A. Buck, R. John Collier, and Donald A. Kaplan. Nucleotide Sequence of the Structural Gene for Diphtheria Toxin Carried by Corynebacteriophage В //PNAS. -1983. -Vol.80, N22. -P.6853-6857.