Рекомбінантна плазмідна днк, що кодує препроінсулін людини і штам escherichia coli xl1 – blue / p insr- продуцент препроінсуліну

Винахід відноситься до галузі генної інженерії, мікробіології і медицини і може бути використаний для створення ліків. Інсулін - гормон підшлункової залози, нестача якого призводить до тяжкого захворювання - цукрового діабету. Тому протягом багатьох років вживаються спроби розробити високоефективні технології одержання інсуліну, Оскільки використання інсуліну тваринного походження дає цілий ряд побічних ефектів, вже понад 20 років проводяться роботи в галузі генної інженерії з метою біотехнологічного одержання людського гормону. Відомо, що інсулін синтезується у вигляді так званого препроінсуліну і має в собі лідерну послідовність і три дільниці, названі як А, В і С-ланцюги. Власне інсулін, як біологічно активна сполука, – це невеликий глобулярний білок, в якому А та В ланцюги пов'язані дисульфідними зв'язками. В процесі визрівання відбувається "вирізання" С-ланцюга, розташованого поміж А і В ланцюгами [Біохімія людини. Під ред P. Mappі. M.. Мир, т. 2, с. 249–250,1993]. Всі зусилля останніх 25-30 років спрямовані на вирішення двох завдань·у чому експресувати білок та яка конструкція препроінсуліну є оптимальною для біотехнологічного використання. Дилема при вирішенні першого завдання полягає в тому, щоб вибрати або інтра-, або екстрацелюлярний шлях продукції інсуліну. Було випробувано кожний з шляхів, однак принципової різниці, яка б давала незаперечну перевагу тому або іншому підходу віднайдено не було. Так, і той і інший варіант не давав переваг щодо стійкості до протеолізу [Shen S.–H. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81,4627–4631, 1984, Murby Μ. et al. Biotechnol Appl. Biochem. 14.336 – 346. 1991]. І хоча шлях одержання білка, що секретувався, скорочував число технологічних стадій одержання препроінсуліну, шлях через тільця включення при використанні як мікроорганізму продуцента Е. соІі, давав більший вихід Крім того, треба відзначити, що основний недолік при використанні останнього підходу – денатурації білка при його гиперпродукції, успішно вирішується для інсуліну. Друга проблема – проблема конструкції препроінсуліну. Спроби отримати міні-С-проінсулін, де Сланцюг було редуковано до декількох амінокислот, які б були місцем атаки для трипсину, не принесли задовільних результатів [Wetzel R Gene 16, 63–71, 1981]. Це, певно, пов'язано з тим, що С-дільниця полілептидного ланцюга потрібна для правильного замикання дисульфід них зв'язків між ланцюгами А і В. Тому як основну конструкцію в усіх наступних роботах було взято цілий препроінсулін людини. Повний препроінсулін був отриманий двома шляхами; через синтез кДНК[ВеІІ G.l, et aІ.. Nature 284, 26–32,1980] і шляхом хіміко-ферментативного синтезу [Brousseau R. Et aІ.. Gene 17,279–289, 1982; Овчинников Ю.А.і ін. Доп. АН СРСР270, 743–747, 1983]. Наступна проблема полягала в тому, яку технологію вибрати для отримання кінцевого продуктуінсуліну з його попередника. і якщо в процедурі розщеплення комплексу А, В і С - ланцюгів сумнівів не було (це обробка трапсином і карбоксипептидазою В), то стосовно відщеплення лідерної послідовності можна рухатися двома шляхами. Перший – нічого не змінюючи, скористатися унікальністю первинної структури препроінсуліну - наявністю метіоніну тільки поміж лідерною частиною і проінсуліном, за допомогою бром ціану розщепити поліпептидний ланцюг [McGregor W.C. Ann. Ν.Υ. Acad. Sci. 413.231,1983]. Основний недолік такого підходу – використання високотоксичної сполуки. Інший напрямок - створення штучного лінкеру поміж лідерною послідовністю і проінсуліном, який можна було б легко "розрізати", наприклад, трипсином. Найбільш близьким за технічною суттю і результатом, якого досягають, до запропонованого винаходу є рекомбінантна плазмідна ДНК, що містить трипсин-чутливу ділянку - аргінін між lgG-зв'язуючим доменом і проінсуліном [Jonasson P.et aІ.. Single-step trypsin cleavage of a fusion poteln to obtain human insulin and Its С peptide. Eur. J. Biochem 236, 656–661, 1996]. Необхідність введення igG-зв'язуючого домену продиктована основним завданням, поставленим авторами, - вдосконалення виділення інсуліну і пептиду С, який, за їхньою думкою, також має виражену біологічну активність. Найбільш близьким за технічною сутністю і результатом, що досягається, щодо запропонованого штаму є штам Е. СоІі 017, який продукує прелроінсулін людини [Niisson et aІ .. Integrated production of human insulin and Its c-peptide. J. Biotechnology 199.6. 48, 41–50]. Однак відома конструкція є складною, а технологія виділення і очистки інсуліну при використанні штаму Е. СоІі 017 досить дорога. Однозначної відповіді про доцільність такого ускладнення конструкції гібридного білку поки дати не можна. Завданням даного винаходу є створення плазміди, за допомогою якої синтезується гібридний білок, лідерний пептид якого зв'язаний з проінсуліном через залишок аргініну, що дозволить відмовитися від використання високотоксичної сполуки при одержанні інсуліну, скоротити число стадій і спростити процедуру його одержання. Другим завданням є створення штаму, який продукує препроінсулін з високим виходом. Поставлене завдання вирішується шляхом створення плазміди, названої нами plnsR, одержаної на основі плазміди рКК223–3, в якій проінсупін зв'язаний через аргінін з природною лідерною послідовністю і такою, що має нуклеотидну послідовність, наведену на фіг. 1. ФІг. 1 Ділянка нуклеотидної послідовності – плазміди plnsR, відповідної гену рекомбінантного білка препроінсуліну людини. Місце проведення точечної заміни підкреслене і виділене жирним шрифтом. Поставлене завдання вирішується також створенням штаму Е. coll XL1-BIue/plnsR-продуцента препроінсуліну, що характеризується наявністю рекомбінантної плазмідної ДНК plnsR. Приклад 1. Спосіб конструювання плазміди полягає в тому, що в плазміду рКК223–3 поміж сайтами рестрикції EcoRI і НІηdІІІ було вміщено к ДНК, яка кодує препроінсулін людини. Далі було проведено заміну триплету, який кодує метіонін на триплет, що кодує аргінін. З цією метою на першому етапі по сайтах рестрикції BamHI і НраІ, що входять в послідовність, яка кодує гібридний білок, проводили ферментативний гідроліз. Точечну заміну метіоніну на аргінін проводили з використанням таких олігонуклеотидів: 5'-gatcccgtgcgcmgtt-3' 5'-aacaaagcgcacgg-3' Після лігування по сайтах рестрикції ВатНІ і НраІ було проведено відбір плазмід, що містять точечні мутанти. Повну нуклеотидну послідовність плазміди, що кодує гібридний білок, наведено на фіг. 2. Фіг. 2. Нуклеотидна послідовність плазміди plnsR. Штам – продуцент Escherlchia coll XL1 - Blue/plnsR характеризується такими ознаками: Морфологічні ознаки. Клітини паличкоподібної форми, грамнегативні, не спороносні. Культуральні ознаки. Клітини добре ростуть нз простих живильних середовищах. На агарі "Дифко" клітини утворюють круглі гладкі колонії з рівними краями. При зростанні в рідкому живильному середовищі утворюють Інтенсивну рівну муть. ФІзико-хІмІчнІ ознаки. Клітини зростають в температурному діапазоні від 8°С до 40°С, оптимум рН від 6,8 до 7,0. Як джерела азоту, вуглецю і інших необхідних компонентів використовуються мінеральні солі, казеїн, пептон, дріжджовий автолізат і т.д. Стійкість до антибіотиків. Клітини виявляють стійкість до тетрацикліну і ампіциліну. Штам - продуцент E.coli XL1-BIue/plnsR віднізняється від штаму-реципієнта Е.соіІ XL1-Biue наявністю рекомбінантної плазмідної ДНК plnsR, яка надає додаткової тривалості до ампіциліну. Клітини Е. соІі ХL1-Blue/plnsR є продуцентом препроінсуліну. При індукції ізопропІлбета-Dтіогалактозидом відбувається інтенсивний синтез даного білка, що накопичується у вигляді тілець включення. Вихід препроінсуліну складає більше 30% від сумарного білка клітин. Приклад 2. Для одержання штаму - продуцента проводять трансформацію штаму E.colі XL-B1ue,·використовуючи одержану плазміну рІnsR, нуклеотидна послідовність якої представлена на фіг. 2. Відібрані клітини, що несуть плазміду InsR, є продуцентом препроінсуліну. На наступному етапі проводять вирощування біомаси в необхідній кількості. Для контролю за динамікою зростання культури проби періодично відбирають і контролюють. За декілька годин (в залежності від обсягу ферментера) до закінчення процесу наробки культури вносять індуктор. Процес виділення і очищення інсуліну проводять таким чином. Після завершення процесу ферментації суспензію клітин центрифугують. Відібрані клітини руйнують. Далі рекомбінантний білок піддається реакції сульфітолізу з утворенням рекомбінантного бІлка-Sсульфонату. Даний етап дозволяє стабілізувати білок і ефективно проводити його виділення і очищення за допомогою аніонообмінної хроматографії за рахунок з'явлення 6 негативно заряджених груп S-SO3. Після цього рекомбінантний бІлок-S-сульфонат піддають знесоленню на колонці з сефадексом G-25 і ренатурації в розбавленому розчині за допомогою 2-меркаптоетанолу. Очищений ренатурований рекомбінантний білок піддають трипсинолізу. Оскільки основними продуктами трипсинолізу є ді-Аrg-iнсулiн i Arg-інсулін, подальше перетворення їх в iнсулін проводять з використанням карбоксипептидази В. Таким чином ренатурований рекомбінантний білок може безпосередньо перетворюватися в iнсулін, минаючи стадію одержання проінсуліну. Саме це дозволяє позбутися в технологічній схемі стадії розщеплення рекомбінантного білка бромціаном, яка необхідна для одержання проінсуліну з нативного препроінсуліну. Вилучення з технологічної схеми стадії, пов'язаної з бромціаном, не тільки зменшує собівартість кінцевого продукту за рахунок безпосереднього скорочення числа стадій, але i значно знижує шкідливість даного виробництва. Крім того заміна хімічного розщеплення рекомбінантного білка на ферментативне є дуже вигідною, бо забезпечує більш високий вихід i якість кінцевого продукту. Після ферментативної обробки ренатурованого рекомбінантногo білка трипсином i карбоксипептидазою В, виділення i очищення iнсуліну проводять з використанням катіонообмінної хроматографії. Фракції з високим вмістом інсуліну об'єднують і концентрують на ультрафільтраційній установці. Завершальне очищення інсуліну проводять за допомогою гельфільтрації. Фракції з інсуліном лїофілізують. Біологічна активність одержаного інсуліну склала 29 Од/мг. Молекулярну масу одержаного інсуліну визначають за допомогою мас-спектрометрії. N-кІнцеву послідовність (9 кроків) отриманої субстанції визначали за допомогою методу Сенгера. Аналіз амінокислотних послідовностей показав наявність тільки двох поліпептидних ланцюгів, що належать інсуліну. Таким чином винахід, що пропонується, має такі переваги; по-перше, плазміда plnsR кодує синтез гібридного білка, в якому лідерний пептид і проінсулін з'єднані через залишок аргініну. По-друге, послідовність гібридного білка перебуває під сильним промотором, що забезпечує їй високий рівень експресії в штамі-продуценті. По-третє, вилучення стадії бромціанового гідролізу при одержанні інсуліну дозволить не тільки відмовитися від використання токсичної сполуки, але і скоротити технологічний ланцюжок, що, в свою чергу, призведе до зниження собівартості кінцевого продукту. По-четверте, конструкція, що пропонується, не містить на відміну від прототипу додаткової lgG-зв'язувальної послідовності.