Спосіб одержання антигену mycoplasma gallisepticum для тест-системи іфа

Спосіб одержання антигену Mycoplasma gallisepticum для тест-системи ІФА, що включає зараження штамом Mycoplasma gallisepticum, культивування протягом 5 діб, відбір культури, центрифугування, який відрізняється тим, що використовують для накопичення мікоплазм первинно-трипсинізовану культуру фібробластів (ФЕК) та триразове заморожування-відтавання для одержання антигену. (19) (21) u200807381 (22) 28.05.2008 (24) 10.11.2008 (46) 10.11.2008, Бюл.№ 21, 2008 р. (72) СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, UA, ОБУХОВСЬКА ОЛЬГА ВАЛЕРІЇВНА, UA, ЗАРЕМБА ІРИНА АНДРІЇВНА, UA, ГЛЄБОВА КАТЕРИН А ВАЛЕРІЇВНА, U A, СТЕГНІЙ МАРИНА ЮРІЇВН А, U A, ЗАРЕМБА ОЛЕКСАНДР ВАСИЛЬОВИЧ, UA, АНТОНОВ ВАЛЕНТИН СЕРГІЙОВИЧ, UA, МИ ХАЙЛОВА СВІТЛАН А АН АТОЛІЇВНА, U A, РУДЕНКО ОЛЕНА ПЕТРІВНА, U A 3 36918 Спосіб одержання антигену Mycoplasma gallisepticum для тест-системи ІФА, що включає зараження штамом Mycoplasma gallisepticum S6 первинно-трипсинізованої культури курячих фібробластів (ФЕК), культивування впродовж 5 діб, відбір культуральної рідини та зняття моношару із подальшим трьох разовим заморожуванням - відтаванням. Відібрану суспензію очищують від клітинного детриту центрифугуванням за 5тис.об/хв впродовж 15хв. Супернатант відбирають та використовують у якості антигену. Приклад 1 При постановці ІФА із експериментальною серією антигену, виготовленою за способом, що заявляється встановлено, що екстинція позитивних контрольних мікоплазменних сироваток перевищувала екстинцію негативної контрольної сироватки в середньому у 2,3 рази при використанні антигену навіть у найменшій концентрації (1мкг/см 3). Результати контролю активності антигену з штаму Mycoplasma gallisepticum S6 в ІФА з позитивними та негативною сироваткою відображені в табл. 1 Приклад 2 При постановці ІФА із експериментальною серією антигену, виготовленою за заявленою методикою, встановлено, що екстинція гетерологічних сироваток перевищує екстинцію 4 негативної в середньому у 1,5, тоді як гомологічної (позитивної контрольної) - у 2,3 рази. Це свідчить про високу специфічність отриманого антигену. Результати контролю специфічності антигену з музейного штаму Mycoplasma gallisepticum S6 із гомо- та гетерологічними сироватками відображені в табл. 2 Приклад 3 Для культивування штаму Mycoplasma gallisepticum S6 з подальшим отриманням антигену в 0,5-літровий культуральний флакон з моношаром культури клітин ФЕК вносили мікоплазму, витримували впродовж 20 хвилин -«контакт» і додавали підтримуюче поживне культуральне середовище, яке складається з рівних об'ємів середовищ Ігла і 199, та 2% сироватки крові ВРХ. Культуральні флакони витримували в термостаті за температурою 37 - 38°С. Кожну добу шля хом мікроскопії перевіряли вплив мікоплазм на моношар клітин. Після ураження 70-80% моношару, його знімали зі скла та піддавали триразовому заморожуваннювідтаванню для руйнування клітинної оболонки та отримання антигену. Спосіб, що заявляється дозволяє отримати високоспецифічний та активний антиген Mycoplasma gallisepticum для тест-систем ІФА. Таблиця 1 А В С 1мкг/см 3 0,593±0,002 0,542±0,007 0,254±0,001 2мкг/см 3 0,639±0,033 0,613±0,002 0,257±0,008 Розведення антигену 3мкг/см 3 4мкг/см 3 0,658±0,053 0,678±0,016 0,598±0,004 0,614±0,029 0,274±0,001 0,282±0,004 5мкг/см 3 0,723±0,050 0,680±0,001 0,290±0,012 10мкг/см 3 0,724±0,001 0,714±0,001 0,289±0,001 Примітки: 1. А - позитивна сироватка Mycoplasma gallisepticum S6 серія 01.07; 2. В - позитивна сироватка Mycoplasma gallisepticum S6 серія 02.07; 3. С - негативна сироватка; Таблиця 2 А В С D 1мкг/см 3 0,593±0,002 0,254±0,001 0,384±0,012 0,441±0,010 2мкг/см 3 0,639±0,033 0,267±0,008 0,390±0,008 0,448±0,022 Розведення антигену 3мкг/см 3 4мкг/см 3 0,658±0,053 0,678±0,016 0,274±0,001 0,282±0,004 0,443±0,007 0,444±0,016 0,451±0,010 0,472±0,013 5мкг/см 3 0,723±0,050 0,290±0,012 0,449±0,008 0,474±0,011 10мкг/см 3 0,724±0,001 0,289±0,001 0,451±0,003 0,478±0,012 Примітки: 1. А - позитивна сироватка Mycoplasma gallisepticum S6 2. В - негативна сироватка; 3. С - позитивна сироватка щодо інфекційної бурсальної хвороби птиці; 4. D - позитивна сироватка щодо інфекційного бронхіту курей Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601