Спосіб виділення днк/рнк із біологічного матеріалу

УКРАЇНА МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ (із) U A (11)48849 (із) А (51)6 A61B10/00.G01 N33/00 ОПИС ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД видається під відповідальність власника патенту (54) СПОСІБ ВИДІЛЕННЯ ДНК/РНК ІЗ БІОЛОГІЧНОГО МАТЕРІАЛУ (21)2002010106 (22) 03 01 2002 (24)15 08 2002 (46) 15 08 2002, Бюл № 8, 2002 р (72) Мавров Іван Іванович, Білозоров Олексій Павлович, Федець Ольга Іванівна, Мілютіна Олена Винахід належить до медицини, а більш конкретно - до молекулярної біологи і може бути використаний для виділення ДНК/РНК з біологічного та КЛІНІЧНОГО матеріалу Відомо, ЩО сучасні молекулярно-біологічні дослідження нерозривно пов'язані з методами, заснованими на ампліфікації нуклеїнових кислот Для якісного проведення процесу ампліфікації нуклеїнових кислот, необхідні прості методи виділення ДНК із зразків Головні критерії при виборі методу, є простота та швидкість, в комбінації з отриманням досить високої КІЛЬКОСТІ ДНК, водночас з успішним усуненням можливої присутності інгібіторів ампліфікації Існує ряд методів для виділення ДНК/РНК До них належать методи фенольно-хлороформної депротеїнізацм, травлення протеїназою К кип'ятіння зразків, детергентна обробка, метод із застосуванням гуанідинізотюціанату разом із силікагелем (Маниатис Т, Фрич Е Е, Сэмбрук Дж / Методы генетической инженерии Молекулярное клонирование // Под ред А А Баєва - М "Мир", 1984 -480 с ) До недоліків детергентного методу та кип'ятіння зараховується вірогідність високого проценту інгібіторів, в препаратах, метод травлення за допомогою протеїнази К є досить коштовний, при застосуванні фенольно-хлороформної екстракції має місце велика вірогідність втрати нуклеїнової кислоти на етапах відмивки (Greenfield L , White T J / Sample preparation methods 1993 - P 1 2 2 137 In D N Persmg et al Diagnostic molecular microbiology prynciple and applications American Society of Microbiology 1997 -35 -No 10 -P 26282633) Порівняно з описаними методами, метод із застосуванням гуанідинізотюціанату та силікагелю Йосипівна, Рудік Світлана Кар'ягдиївна, Тимохша Ніна Василівна (73) ІНСТИТУТ ДЕРМАТОЛОГІЇ ТА ВЕНЕРОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ дає можливість отримати достатньо ЯКІСНІ препарати з відносно невеликим ризиком втрати ДНК на етапах відмивки Цей метод рекомендовано для виділення ДНК/РНК для подальшого використання препаратів в діагностичній та науководослідницькій ДІЯЛЬНОСТІ (Boman J , Gaydos С , Qumn Т С / Molecular diagnosis of Chlamydia pneumomae infection//J Clm Microbiol -1999 -68 - P 3791 - 3799) Метод виділення ДНК/РНК із застосуванням гуанідинізотюціанату га силікагелю є найбільш близьким до способу, що заявляється, тому його обрано в якості прототипу При застосуванні прототипу в якості сорбенту нуклеїнових кислот використовують силікагель Проте, в деяких випадках, коли КІЛЬКІСТЬ матеріалу мала, має місце часткова втрата ДНК, що може в подальшому, наприклад при застосуванні препарату в полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР), привести до хибнонегативного результату (Wilson Р А , J Fipps, D Samuel, Saunders N A / Developement of symplifned pohmerase chain reaction-enzyme immuneassay for the detection of Chlamydia pneumomae infection // J Appl Bactenol -1996 -80 431 -438) В основу винаходу покладено задачу покращення якості виділеної ДНК із запобіганням її втрати Задача, яка покладена в основу винаходу вирішується тим, що у відомому способі виділення ДНК/РНК, який включає використання сорбенту, згідно з винаходом, в якості сорбенту використовують цеоліт NaX Ознаками винаходу, що відрізняють його від прототипу - застосування силікагелю - є використання як сорбенту нуклеїнових кислот цеоліт NaX Виділення ДНК методом гуанідинізотюцюнатцеолітної сорбції проводили згідно с протоколом ^00 00 48849 До ЮОмкл фізіологічного розчину, що містив у собі досліджуваний матеріал, додавали ЗООмкл 6М гуанідинізотюцюнату і 5мкл водної суспензії цеоліту Зразки шкубували 1 0 - 1 5 хвилин при кімнатній температурі, періодично струшуючи на вортексі Центрифугували 30с при 11000об/хв Супернатант відкидали До преципітату додавали 150мкл 4М гуанідинізотюціанату, вортексували, та центрифугували 30с при 11000об/хв Супернатант відкидали До осадку добавляли 700мкл відмиваючого розчину (50% етілового спирту, 0.05М NaCI та 0,01 TnsHCI) Вортексували та центрифугували 30с при 11000об/мин Супернатант відкидали Процедуру промивки повторювали ДВІЧІ Зразки підсушували в термостаті при 45 - 55°С протягом 5 хвилин До преципітату додавали 50мкл деюнізованої води, вортексували Інкубували 5 хвилин при температурі 45 - 55°С, центрифугували 15 - 30с при 11000об/хв Супернатант, що містив ДНК, переносили до окремої пробірки та використовували в ПЛР Приготування водної суспензії цеоліту NaX 60г цеоліту NaX розтирали в 500мл бідистильованої води, відстоювали Юхв, відбирали 400мл супернатанту, додавали до нього бООмкл концентрованої НСІ, відстоювали 24 години, зли вали супернатант Осадок зважували в ЮОмл ЬЬО та автоклавували Наявність причинно-наслідкового зв'язку між істотними ознаками і досягнутими технічними результатами, підтверджується даними експериментального дослідження, яке показало, що введення нового сорбенту покращує якість препаратів ДНК та запобігає и втрату під час обробки зразку Для визначення спроможності цеоліту NaX впливати на якість ДНК, що виділяються з КЛІНІЧНИХ зразків, препарати нуклеїнових кислот, одержані із застосуванням прототипу, а також нового сорбенту, аналізували методом ПЛР ДНК виділяли двома способами з урогенітальних зішкрябів, одержані препарати в подальшому використовували для ПЛР ПЛР проводили з використанням трьох пар праймерів, підібраних для ампліфікації фрагментів ДНК Chlamydia trachomatis, Herpes Simplex Virus II типу, Cytomegalovirus Ампліфікацію та реєстрацію результатів проводили згідно з рекомендованими умовами (Уніфікація лабораторних методів дослідження в діагностиці ЗПСШ, МОЗ України, 2000) У таблиці 1 наведено результати ПЛР, отримані на КЛІНІЧНИХ зразках, ДНК з яких було виділено методом-прототипом та новим методом Таблиця 1 Результати ПЛР на препаратах ДНК, отриманих із застосуванням різних сорбентів Тип інфекції, що виявлязагальна КІЛЬється в ПЛР КІСТЬ зразків Chlamydia trachomatis Herper simplex virus II типу Cytomegalovirus 51 КІЛЬКІСТЬ обстежених зразків виділення на силікагелі ПОЗИТИВНІ негативні 12 37** 14 37 37 12 23*** 14 22* 24 6 17* 6 18 Примітка КІЛЬКІСТЬ * відповідає КІЛЬКОСТІ інгі бованих зразків Отримані результати свідчать про те, що введення цеоліту NaX до складу реактивів для виділення ДНК/РНК позитивно впливає на якість отриманих препаратів виділення на цеоліті NaX негативні ПОЗИТИВНІ КІЛЬКІСТЬ ПОЗИТИВНИХ ре зультатів ПЛР при застосуванні нового способу виділення збільшується, що можна пояснити кращою сорбуючою властивістю цеоліту NaX Структура цеоліту NaX сприяє надійнішому зв'язуванню на його поверхні молекул ДНК, так що на етапах відмивки зменшується ризик втрати ДНК КІЛЬКІСТЬ інгібованих зразків при застосуванні цеоліту менша, ніж при застосуванні силікагелю Можна припустити, що низькомолекулярні речовини, серед яких можуть бути присутні інгібітори ПЛР, сорбуються на пористій структурі цеоліту NaX і, отже, концентрація їх у препаратах виділеної ДНК зменшується Таким чином, запропонований спосіб дозволяє отримати більш ЯКІСНІ препарати ДНК, запобігаючи и втрату ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71