Спосіб створення біологічного трансплантату на основі індукованих в остеогенному напрямку мезенхімальних стовбурових клітин собак in vitro

Спосіб отримання біологічного трансплантату на основі індукованих в остеогенному напрямку мезенхімальних стовбурових клітин собак in vitro, 3 49229 моделі, для індукції направленої диференціації Мезенхімально стовбурових клітини (МСК) до DMEM додають 5мМ -гліцерофосфату, 10-8М дексаметазону, а іммобілізацію клітин здійснюють в 14%-му желатиновому матриксі. Таким чином запропонований спосіб дає змогу: провести направлену диференціацію in vitro МСК собак в остеогенному напрямку та здійснити іммобілізацію Індукованих в остеогенному напрямку МСК собак у біологічний матрикс. Спосіб отримання біологічного трансплантату на основі індукованих в остеогенному напрямку мезенхімальних стовбурових клітин собак in vitro, полягає в культивуванні МСК кісткового мозку собак при посадковій концентрації 10тис. клітин на см2 культурального посуду в DMEM, доповненому 15%-ми ембріональної сироватки теляти, 10мкл/см3 антибіотика-антимікотика (вміст СО2=5%, t=37 С). Через 24 год. після постановки на культивування необхідно замінити культуральне середовище на індукційне: DMEM (вміст глюкози 4,5гр/л), в яке додавали 10%-ів ембріональної сироватки теляти, 50мкг/см3 аскорбінової кислоти, 5мМ -гліцерофосфату, 10-8М дексаметазону та антибіотик для пригнічення розвитку мікрофлори. Заміну індукційного середовища здійснювати кожних три дні. На 14-20 день культивування повинна відбутись зміна морфології клітин. Гістохімічним аналізом за допомогою барвника алізаринового Комп’ютерна верстка О. Рябко 4 червоного можна підтвердити позаклітинне відкладення солей кальцію. За допомогою розчину трипсин/ЕДТА (0,5/0,2%) зняти клітинний моношар. Суспензію клітин розпіпетувати, перенести в центрифужну пробірку та відцентрифугувати при 300g протягом 5хв. Злити надосадову рідину, а до клітинного осаду додати культуральне середовище (DMEM, доповнене 15%-ми ембріональної сироватки теляти, 10мкл/см3 антибіотика-антимікотика) в об'ємі 1см3. Здійснити підрахунок клітин в камері Горяєва. ВмІстиме пробірки повторно відцентрифугувати при 300g протягом 5хв., злити надосадову рідину. Іммобілізацію клітин здійснити з допомогою 14%-го желатинового матриксу, який готують наступним чином: до культурального середовища об'ємом 10см3 (DMEM, доповнене 15%-ми ембріональної сироватки теляти та антибіотиком) поступово внести 1,4г желатину (gelatin from bovine skin, type В), розмішуючи при цьому на магнітній мішалці (t=35-40°С) до повного розчинення гранул желатину. Приготовлену суспензію профільтрувати через нітроцелюлозний фільтр з діаметром пор 0,22мкм. До клітинного осаду додати желатиновий матрикс (t=35-38°С) з розрахунку 1см3 матриксу на 4млн. клітин, та розпіпетувати до утворення однорідної суспензії. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601