Спосіб біологічної стимуляції остеогенного диференціювання мезенхімальних стовбурових клітин

Спосіб біологічної стимуляції остеогенного диференціювання мезенхімальних стовбурових 3 46095 субконфлуентної культури, після чого здійснюють об'єднання культивованих мезенхімальних стовбурових клітин з культивованими прогеніторними клітинами окістя в один культуральний флакон в співвідношенні 3:1 та культивують у поживному середовищі на протязі не менш 2-х тижнів зі зміною поживного середовища кожну 3 добу. Спосіб здійснюють наступним чином. Здійснюють експлантацію червоного кісткового мозку за загальноприйнятою методикою, під загальним знеболенням, через подовжній розріз завдовжки до 5см по зовнішній поверхні гомілки пошарово виділяють малогомілкову кістку та за допомогою вузького жолобуватого долота здійснюють вилучення ділянки малогомілкової кістки з надкісницею розміром 1x0,5см. Отриманий біоптат занурюють у середовище «Ігла» («Біолот», Росія), яке містить 2500од./мл пеніциліну та 2500мкг/мл стрептоміцину. Культуру мезенхімальних стовбурових клітин людини отримують з червоного кісткового мозку шляхом механічної дезагрегації, центрифугування, після чого їх засівають у культуральні флакони об'ємом 75см2 ("Costar", USA). Після первинного виділення мезенхімальні стовбурові клітини культивують в поживному середовищі DMEM/F12 1:1 ("Sigma", USA) з додаванням 20% ембріональної телячої сироватки ("Біолот", Росія), глютаміну ("Біолот", Росія), L-аскорбінової кислоти ("Sigma", USA) та основного фактору росту фібробластів ("Sigma", USA). Клітини культивують у СО2інкубаторі при температурі 37°С, 5% вмісті вуглекислого газу та 95% вологості. Зміну середовища здійснюють кожні 3 доби. Культивування продовжують до досягнення 70-80% клітинного моношару. Біоптат малогомілкової кістки вилучують з середовища «Ігла» («Біолот», Росія) та неодноразово промивають розчином PBS з додаванням 2500од./мл пеніциліну та 2500мкг/мл стрептоміцину. Поверхню чашки Петрі діаметром 35мм оброблюють розчином колагену І типу та занурюють кістковий біоптат. Культивування здійснюють в поживному середовищі DMEM/F12 1:1 ("Sigma", Комп’ютерна верстка А. Крулевський 4 USA) з додаванням 20% ембріональної телячої сироватки ("Біолот", Росія), глютаміну ("Біолот", Росія), L-аскорбінової кислоти ("Sigma", USA) та основного фактору росту фібробластів ("Sigma", USA). Клітини культивують у СО2-інкубаторі при температурі 37°С, 5% вміст вуглекислого газу та 95% вологості. Зміну середовища здійснюють кожні 3 доби до утворення субконфлуентної культури прогеніторних клітин окістя. Після досягнення в культуральних флаконах 70-80% моношару мезенхімальних стовбурових клітин та субконфлуентної культури прогеніторних клітин окістя у чашці Петрі, клітини пасирують розчином 0,25% трипсин/версена (1:3). Пасировані мезинхімальні стовбурові клітини та прогеніторні клітини окістя засівають разом в один культуральний флакон з поживним середовищем в співвідношенні 3:1 та культивують при температурі 37°С, 5% вмісті вуглекислого газу та 95% вологості на протязі 2-3-х тижнів. Зміну середовища здійснюють кожні 3 доби. Наприкінці 2-3-го тижня більш ніж 50% клітин набувають остеогенної направленості та усі клітини зберігають свою проліферативну здатність. Перевага способу біологічної стимуляції остеогенного диференціювання мезенхімальних стовбурових клітин полягає у тому, що клітинна культура після її остеогенної стимуляції зберігає свою проліферативну здатність та при трансплантації здатна створювати необхідну кількість клітин у реціпієнтному ложі та утворювати взаємозв'язки з остеогенно детермінованими клітинами, що в свою чергу створює передумови для утворення в реціпієнтному ложі кісткової тканини de novo з мезенхімальних стовбурових клітин, які були трансплантовані. Джерела інформації: 1. Beresford J.N., Joyner С.J., Devlin С., Triffitt J.T. The effects of dexamethasone and 1,25dihydroxyvitamin D3 on osteogenic differentiation of human marrow stromal cells in vitro // Arch Oral Biol. 1994. - Vol. 39, N11. - P. 941-947. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601