Спосіб визначення експресії індукованої форми синтази оксиду азоту (inos) в клітинах пухлин прямої кишки

Спосіб визначення експресії індукованої форми синтази оксиду азоту (iNOS) у клітинах пухлин прямої кишки шляхом фіксацГі тканини пухлини за допомогою формалінового фіксатора з наступним заключениям у парафін, використання реакції непрямої імунопстохімії для визначення експресії iNOS, визначення кількості iNOS-позитивних клітин пухлини, який відрізняється тим, що оцінку експресії iNOS проводять за допомогою системи комп'ютерного аналізу зображень, при цьому визначають об'ємну щільність розміщення iNOSпозитивних клітин пухлини (тис./мм3), середню площу цитоплазми клітин, яка містить iNOS (мкм3), середню концентрацію iNOS у клітинах пухлини (умовні одиниці) та вміст iNOS в одиниці об'єму пухлини (умовні одиниці на мм3). Корисна модель стосується медицини, а саме, онкології, і може бути використана для характеристики експресії індукованої форми синтази оксиду азоту (iNOS) в клітинах пухлин прямої кішки. Існує декілька способів характеристики експресії iNOS в клітинах пухлин, але вони базуються на суб'єктивній інтерпретації даних та занадто працеємкі, що не дозволяє залучити їх до практичної онкології для оцінки морфологічних властивостей пухлин. Відомий спосіб характеристики експресії' iNOS в клітинах пухлин, який полягає у фіксації' тканини пухлини за допомогою формалінового фіксатора з наступним заключениям у парафін, проведенні непрямої імуногістохімічної реакції для забарвлення тканини за допомогою антитіл до iNOS (Tadahiro Nozoe, Mitsuhiro Yasuda, Masayuki Honda et all. Immunohistochemical expression of cytokine induced nitric oxide synthase in colorectal carcinoma // Oncology reports. - 2002. - №9. - p.521-524). Спільними суттєвими ознаками аналога і корисної" моделі, що заявляється, є такі: - фіксація тканини пухлини за допомогою формалінового фіксатора з наступним заключениям у парафін, - використовування реакції непрямої імунопстохімії для визначення експресії iNOS. Цей спосіб є недостатньо ефективним, тому що підрахунок кількості клітин, що експресують iNOS, проводиться людиною, що може призводити до помилок; при цьому не здійснюється визначення інтенсивності експресії iNOS окремими клітинами. Найбільш близьким за технічною сутністю та результатом, що досягається, є спосіб, який полягає у фіксації тканини пухлини за допомогою формалінового фіксатора з наступним заключениям у парафін, проведенні непрямої імуногістохімічної реакції для забарвлення тканини за допомогою антитіл до iNOS та підрахуванні абсолютної і відносної кількості iNOS-позитивних клітин пухлини (Fabio Cianchi, Camillo Cortesmi, Ornella Fantappie et all. Inducible nitric oxide synthase expression in human colorectal cancer // American Journal of Pathology. - 2003. - Vol.162. - p.793-801.) Спільними суттєвими ознаками прототипу і корисної моделі, що заявляється, є такі: - фіксація тканини пухлини за допомогою формалінового фіксатора з наступним заключениям у парафін; - використовування реакції непрямої імунопстохімії для визначення експресії iNOS. - визначення кількості iNOS-позитивних клітин пухлини. 5175 Цей спосіб є недостатньо ефективним, тому, що аналіз зображення проводився людиною, а це приводить до суб'єктивних висновків. При аналізі результатів враховується лише відносна кількість клітин, що експресують iNOS та не здійснюється їх характеристика. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу визначення експресії індукованої форми синтази оксиду азоту (iNOS) в клітинах пухлин прямої кишки шляхом застосування системи комп'ютерного аналізу зображення для визначення додаткових кількісних показників, які характеризують експресію iNOS, що забезпечує підвищення точності та вірогідності оцінки морфологічних властивостей пухлин. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає фіксацію тканини пухлини за допомогою формалінового фіксатора з наступним заключениям у парафін, використання реакції непрямої імуногістохімп для визначення експресії iNOS, визначення кількості iNOS-позитивних клітин пухлини, новим є те, що оцінку експресії iNOS проводять за допомогою системи комп'ютерного аналізу зображень, при цьому визначають об'ємну ЩІЛЬНІСТЬ розміщення iNOS-позитивних клітин пухлини (тис./лш3), середню площу цитоплазми клітин, яка містить iNOS (мкм2), середню концентрацію iNOS в клітинах пухлини (умовні одиниці) та вміст iNOS в одиниці об'єму пухлини (умовні одиниці на мм3). Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому. Використання системи комп'ютерного аналізу зображення дозволяє з великою точністю підраховувати кількість клітин, що експресують iNOS, в одиниці об'єму пухлини. При цьому система фіксує тільки клітини, що експресують iNOS та ігнорує артефакти. Крім кількості клітин, що експресують iNOS, підраховується площа цитоплазми цих Комп'ютерна верстка Д. Шеверун клітин з iNOS, а також концентрація iNOS в клітинах пухлини та вміст iNOS в одиниці об'єму пухлини. Це дозволить ретельніше характеризувати морфологічні властивості пухлин, що допоможе індивідуалізувати лікування онкологічних хворих, прогнозувати чутливість пухлини до хіміотерапевтичних препаратів та променевої терапії, ризик метастазування, розвитку рецидивів, виживання пацієнтів. л Спосіб здійснюється таким чином Готують парафінові блоки. Проводять імуногістохімічну обробку препаратів за допомогою первинних антитіл до iNOS, а також вторинних антитіл до первинних антитіл, зв'язаних з молекулами флюоресцеїнізотіоцианату (FITC). Зображення, отримані на флюоресцентному мікроскопі (об'єктив 40х), вводять до системи комп'ютерного аналізу зображення. Розраховується об'ємна щільність розміщення iNOS-позитивних клітин пухлини, середня площа цитоплазми клітин, яка містить iNOS; концентрація iNOS в клітинах пухлини та вміст iNOS в одиниці об'єму пухлини. Приклад Хворий Блохін В.В. 1950р.н., був госпіталізований у Запорізький клінічний онкологічний диспансер з діагнозом "Рак середньо-ампулярного відділу прямої кишки T4N1M0, st 3, дг 2", історія хвороби №1569. Була проведена операція - накладення anus praetematuralis 3 пухлини взятий зразок препарату Після проведення дослідження отримані такі результати: експресія iNOS у пухлині - 40095клітин/мм3, середня площа цитоплазми клітин, яка містить iNOS - 14,96+1,02мкм2, середня концентрація iNOS в клітинах пухлини 0,122±0,006ОІФ, вміст iNOS в одиниці об'єму пухлини - 71519ОІФ/ММ 3 . Таким чином, зроблено висновок про високу точність запропонованої методики, що в подальшому дозволить індивіалізувати лікування хворих на рак прямої кишки. Підписне Тираж 37 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вуп Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601