Спосіб виявлення субкапсулярних лімфоцитів у тимусі ссавців і птахів

Спосіб виявлення субкапсулярних лімфоцитів у тимусі ссавців і птахів, що включає фіксацію дослідного матеріалу, заливку в парафін, виготовлення парафінових зрізів, їх депарафінування та виготовлення постійних ГІСТОХІМІЧНИХ препаратів, який відрізняється тим, що для виготовлення постійних ГІСТОХІМІЧНИХ препаратів використовується постановка ГІСТОХІМІЧНОЇ реакції на фосфомоноестеразу з утворенням нерозчинного осаду сульфіду свинцю чорно-коричневого кольору, який локалізується в ділянках з підвищеною активністю ферменту - кислої фосфомоноестерази, що свідчить про наявність даного ферменту Винахід відноситься до біологи та ветеринарної медицини, а саме до лабораторної діагностики функціональних порушень міграції претимічних попередників Т-клітин в тимус ссавців та птахів Лімфоідні клітини Т-ряду, які дійшли до певного ступеня зрілості, мають достатньо високу рухливість, щоб подолати адгезивну взаємодію та мігрувати з кісткового мозку Циркулюючи з кров'ю по судинному руслу тимуса, ці клітини реагують позитивним хемотаксисом на сигнал, що виходить з клітин тимуса (макрофагів, лімфоцитів і відросчастих епітелюцитів), потрапляють в його епітеліальний компартамент, долаючи гемато-тимічний бар'єр Частина з цих клітин затримується на стадії ПТЛ (претимічні лімфоцити) та формує резерв для регенерації органу, без якого були б неможливі репараційні процеси в ньому Місцем локалізації цих клітин є субкапсулярна зона часточок тимуса значна трудомісткість та складність отримання і очищення лектину у випадку використання методів препаративної біохімії при застосуванні вітчизняної сировини В основу винаходу поставлено задачу удосконалити спосіб виявлення субкапсулярних лімфоцитів тимуса, шляхом заміни обробки препарату пектином арахісу постановкою ГІСТОХІМІЧНОЇ реакції із солями металів, що приводить до утворення нерозчинного забарвленого осаду Перевага даного способу полягає в тому, що використання розчинів солей металів не потребує використання пектинів, їхньої очистки та дає чітку, стійку картину параметрів та локалізації субкапсулярних лімфоцитів тимуса Суть способу полягає в тому, що для виявлення субкапсулярних лімфоцитів у тимусі ссавців і птахів та виготовлення постійних ГІСТОХІМІЧНИХ препаратів використовується постановка ГІСТОХІМІЧНОЇ реакції на фосфомоноестеразу з утворенням нерозчинного осаду сульфіду свинцю чорнокоричневого кольору, який локалізується в ділянках з підвищенною активністю ферменту, що свідчить про наявність ферменту - кислої фосфомоноестерази Кисла фосфомоноестераза є пдролазою, тобто ферментом, який здійснює каталітичну дію при участі води та діє на естерази Цей фермент належить до класу пдролаз, підкласу пдролаз фосфомоноефірів та має систематичну назву фосфопдролаза моноефірів ортофосфорної кислоти (КФ 3 1 32) (АИ Кононский, 1976) Як інкубаційне середовище використовують Одним з найбільш поширених способів виявлення лімфоцитів субкапсулярної зони в тимусі є спосіб лектинної ГІСТОХІМІЇ Лімфоцити субкапсулярної зони (зовнішнього шару кори тимуса) визначаються за допомогою лектину арахіса Суть цього способу полягає в фіксації дослідного матеріалу в суміші Буена, заливці в парафін, виготовленні парафінових зрізів, їх депарафінуванні та обробці зрізів пектином арахісу та виготовленні постійних ГІСТОХІМІЧНИХ препаратів (А Д Луцик, ЕС Детюк, М,Д Луцик Лектины в гистохимии - Львов «Выша школа», 1989 - 24-36, 67) Недоліком цього методу, як взагалі методів роботи з пектинами, є висока вартість імпортних препаратів для проведення дослідження, а також СО со Ю 53473 ацетатний буфер, в якому розчинені гліцерофосфат натрію і нітрат свинцю При каталітичній дії кислої фосфомоноестерази відбувається гідроліз гліцерофосфату з утворенням дипдрофосфату натрію, який, в свою чергу, вступає в реакцію з нітратом свинцю з утворенням дипдрофосфату свинцю При обробці реагентом - сульфідом амонію в місцях локалізації ферменту утворюється осад сульфіду свинцю чорно-коричневого кольору Спосіб здійснюють таким чином проводять фіксацію дослідного матеріалу в 10% розчині нейтрального формаліну з подальшою заливкою в парафін Після ЧОГО ВИГОТОВЛЯЮТЬ парафінові зрізи, депарафінують їх, поміщають в інкубаційне середовище на 24 год при 37°С Інкубаційне середовище складається з ацетатного буферу, в якому розчинені гліцерофосфат натрію і нітрат свинцю При каталітичній дії кислої фосфомоноестерази відбувається гідроліз гліцерофосфату з утворенням дипдрофосфату натрію, який, в свою чергу, вступає в реакцію з нітратом свинцю з утворенням дипдрофосфату свинцю Зрізи промивають у дистильованій воді, переносять у розчин оцтової кислоти на 2хв, сполоскують у дистильованій воді і переносять в розчин сульфіду амонію на 2хв Піс ля проведення обробки гістозрізів сульфідом амонію, як реагентом, локалізацію ферменту визначають за локалізацією осаду сульфіду свинцю чорно-коричневого кольору і виготовлюють ПОСТІЙНІ ГІСТОЛОГІЧНІ препарати Інтенсивність ГІСТОХІМІЧНОЇ реакції на постійних препаратах оцінюється за допомогою мікроскопи При постановці ГІСТОХІМІЧНИХ реакцій на кислу фосфатазу ділянки підвищеної ферментативної активності чітко обмежені субкапсулярною зоною Нерозчинний осад сульфіду свинцю локалізується чітко по периметру часточок тимуса В окремих випадках, при наявності дифузії продуктів реакції, кисла фосфатаза розташована у вигляді осаду не тільки в лімфоцитах, але і в МІЖКЛІТИННИХ просторах, але її розташування завжди обмежене субкапсулярною зоною Виключення становить певна ферментативна активність кислої фосфатази в місцях розташування тимічних тілець Було досліджено ЗО проб тканин тимуса великої рогатої худоби симентальської та чорно-рябої породи та 20 курей породи легорн різних вікових груп Результати дослідження доводять, що спосіб дозволяє чітко виявляти КІЛЬКІСТЬ, розміри та морфологічні показники епітеліальних клітин тмура ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24