Вірусологічне живильне середовище “геосгідролізин” для культивування клітин ссавців і птахів

Предполагаемое изобретение относится к биологии и может быть использовано в ветеринарной и медицинской вирусологии для культивирования клеток млекопитающих и птиц in vitro. Известны синтетические питательные среды 199 (Morgan, Morton, Parker, 1950); среда Игла (Eagle, 1955), которые признаны универсальными, пригодными для культивирования самых различных тканей. Среды готовят на сбалансированном солевом растворе Эрла или Хенкса. В состав среды 199 входит более 60 компонентов, в состав среды Игла - 30 (аминокислоты, витамины, глюкоза, минеральные соли, составные части нуклеиновых кислот и другие вещества). Недостатком указанных сред является сложность изготовления, дефицит многих биологически активных соединений. Известны среды биологического происхождения. К ним относятся среды, составленные на основе белковых гидролизатов: 0,5% раствор гидролизат лактальбумина в растворе Хенкса (ГЛА), получаемый при ферментативном гидролизе белков молока (Melnik, Riorgan, 1952); ферментативный гидролизат мышечной ткани крупного рогатого скота ФГМ (Сергеев В.А., Собко Ю.А., 1990); гемогидролизат - продукт ферментативного гидролиза сгустков крови крупного рогатого скота (Буденная Г.Н. и др., 1981); питательные среды из белкового концентрата, приготовленные из вторичного продукта мясного производства (Доценко В.В. и др., 1996). ПРОТОТИП. Наиболее широкое распространение из указанных питательных сред имеет 0,5% раствор гидролизат лактальбу-мина в растворе Хенкса. Недостатком указанной среды является то, что она применяется главным образом при культивировании первично-трипсинизированных клеток с ограниченным периодом жизни, например, почки обезьяны, и других. Кроме того, исследования многих авторов (Витакер, 1976; Сперанская И.Д., Миронова Л.А. и др., 1981) свидетельствуют о большой нестандартности ГЛА. Различные партии гидролизат лактальбумина могут различаться по цвету, содержанию аминокислот, питательной ценности. Было отмечено, что при использовании некоторых партий клетки хуже растут и даже утрачивают способность прикрепляться к стеклу, имеет место токсичность некоторых партий ГЛА. Задачей изобретения является создание такой питательной среды, которая по своим физико-химическим свойствам (pH, осмолярность, РО2), содержанию питательных веществ была бы максимально сходна со средой, в которой клетки существуют in vivo. Для этого в известный сбалансированный физиологический раствор Женкса или Эрла вводят плазмозамещающие растворы геоссен и гидролизин при следующем соотношении компонентов, мас.%: Геоссен 5-15 Гидролизин 5 Сбалансированный физиологический раствор Остальное до 100%. Технология получения новой питательной среды - геосгидролизина включает отдельное приготовление составных компонентов и затем их последовательное соединение. Сбалансированный физиологический раствор Хенкса или Эрла готовят согласно общепринятым правилам (О.Г. Анджапаридзе и др., 1962). Геоссен используют как готовый фармакопейный препарат N2 р. 75.933.4. Гидролизин получают путем кислотного гидролиза фибринных сгустков крови крупного рогатого скота. Препарат отвечает требованиям фармстатьи 42-631-83. Геосгидролизин подвергают стерилизующей фильтрации и расфасовке в стеклянные флаконы вместимостью 450 мл. Питательная среда геосгидролизин представляет собой прозрачную жидкость от красно-оранжевого до красно-малинового цвета, имеющую активность (pH) 7,0 - 7,2. При взбалтывании образуется устойчивая пена, характерная для белковых растворов. Геосгидролизин применяют: как ростовую среду при получении первично-трипсинизированных или перевиваемых культур клеток; как поддерживающую среду при проведении вирусологических экспериментов. Эффективность среды геосгидролизин по сравнению с 0,5% раствором гидролизат лактальбумина иллюстрируют следующие примеры: Пример 1. Первично-трипсинизированные клетки фибробластов куриного эмбриона получают согласно общепринятым методикам (Джон Пол, 1963; Дьяконов Л.П, и др., 1980). В питательную среду геосгидролизин вводят 10% сыворотки крови крупного рогатого скота; пенициллин натриевую или калиевую соль 100 - 200 ед./мл. Суспензию клеток, которая получена после дезагрегации ткани раствором трипсина, вносят в питательную среду, создавая посевную концентрацию 500-600 тыс. клеток в 1 мл. Монослой выполняется через 16 - 18 ч. Наблюдается устойчивая способность клеток к субкультивированию в течение 4-5 пассажей с коэффициентом рассева 1 : 2. При использовании среды Игла или 0,5% раствора гидролизат лактальбумина в среде Хенкса монослой выполняется через 30 - 48 часов. На питательных средах 0,5% раствора гидролизат лактальбумина в среде Хенкса, а также Игла куриные фибробласты не поддаются субкультивированию (Дьяконов Л.П. и др., 1980). Пример 2. Клетки перевиваемого штамма почки теленка (ПТ) выращивают в виде монослойной культуры. Клетки отделяют от стекла 0,02% раствором версена и вносят в среду геосгидролизин, содержащую 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотики, коэффициент рассева 1:4-1:6. Монослой выполняется через 5-6 суток. Фаза стабильного роста -в течение 10-14 дней. Штамм ПТ культивируется более 100 пассажей. Перевиваемая культура ПТ способна к неограниченному периоду жизни на среде геосгидролизин. Для культивирования перевиваемых штаммов на питательной среде 0,5% раствор гидролизат лактальбумина в растворе Хенкса добавляют синтетические питательные среды, например, Игла. Пример 3. Геосгидролизин используют как поддерживающую среду при вирусологических исследованиях: а) Проводят заражение монослойной культуры фибробластов куриного эмбриона авиреовирусом штамм СП - 73. В качестве поддерживающей среды используют геосгидролизин. Начало цитопатогенного действия вируса установлено через 12 ч, полное разрушение монослоя наступает через 24 ч. В контроле (питательная среда 0,5% раствор гидролизат лактальбумина в растворе Хенкса и Игла) цитопатогенное действие вируса развивается медленно и только через 48 - 60 ч наступает полное разрушение монослоя. 6) Проводят заражение монослойной культуры перевиваемых клеток почки телят (ПТ), прошедшей более 100 пассажей на среде геосгидролизина: вирусом инфекционного ринстрахеита крупного рогатого скота, штамм "Молдавский"; вирусом оспы - вакцины; вирусом болезни Ньюкасла, штамм Ла - Сота. Полная деструкция монослоя происходит через 24 - 48 ч. Культура ПТ, выращиваемая на среде геосгидролизин, является чувствительной моделью при вирусологических исследованиях. ЛИТЕРАТУРА 1. Анджапаридзе О.Г., Гаривлов В.И., Семенов Б.Ф., Степанова Л.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях. - М., 1962, ст. 16-19. 2. Буденная Г.Н., Шамгина Л.К., Кураш Т.П. Опыт получения и применения отечественных питательных сред. Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. (Тезисы докладов второй всесоюзной конференции). (Москва, 19-21 ноября 1981). - М., 1981, ст. 136-137. 3. Витакер А. Среда для культивирования клеток млекопитающих. В кн. Новые методы культуры животных тканей. - М., "Мир", 1976. 4. Джон Пол. Культура клеток и тканей. Медгиз, 1963, ст. 222 - 224. • 5. Доценко В.В. Питательные бактериологические среды из сухого белкового концентрата при производстве сухих биологических препаратов. Дис. канд. вет. наук. - Харьков, 1996. - 136 с. - (ИЭКВМ). 6. Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., ПоаЯЯ! ков A.A., Денисенко Г.Д., Панкова Г.Е., Толобова М.Т., Калмыкова Т.П. Культура клеток и ткани. Учебно-методическое пособие. Ставрополь, 1980. 7. Сергеев В.А., Собко Ю.А. Культуры клеток в ветеринарии и биотехнологии. - К., "Урожай", 1990, ст. 38 39. 8. Сперанская И.Д., Миронова Л.Л., Данилова Э.Б., Голубева E.H., Грачев В.П. Влияние состава гидролизата лактальбумина на качество питательных сред, Научные основы технологии промышленного производства биологических препаратов (Тезисы докладов второй всесоюзной конференции). (Москва, 19-21 ноября 1981). - М., 1981, ст. 134 -136. 9. Eagle Н. Nutrition needs of mammalian cells in tissue culture. Science. 1955. 122, 3168,50. 10. Morgan J., Morton H., Parker R., Nutrition of animal cells in tissue culture. 1. Initial studies on a synthetics medium. Proc. Soc. exp. Biol. Med., 1950, 73, 1.1. 11. Melnick J., Riorgan J. Poliomyelitis viruses in tissue culture. IV protein - free nutrient media in stationary and roller tube culture. Proc. Soc. exp. Biol. Med., 1952,81,1, 208. 12. Инструкция по применению геоссе-на Heossenum. Одобрена фармакологическим комитетом МЗ СССР вместо инструкции, утвержденной 27 ноября 1972 года. Регистрационный номер 75 933 / 4. 13. Фармакопейная статья 42-631-89. Раствор гидролизина, осветленный. Инструкция по применению гидролизина. Утверждена начальником управления по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники 19 июля 1984. Регистрационный номер раствора гидролизина 70 / 367 / 24.