Спосіб ідентифікації особи

Спосіб ідентифікації особи шляхом геномної дактилоскопії методом полімеразної ланцюгової реакції, що включає виділення ДНК із кісткової тканини трупа, який відрізняється тим, що використовують лізуючий буфер з додатковим включенням 1 % лаурилсаркозилу Na, при цьому екстракцію ДНК досліджуваного об'єкта проводять за температури 65°С протягом 50 - 60 хв , а потім інкубацію за температури 37°С протягом 2-х діб Винахід відноситься до області судової медицини і може бути використаний при ідентифікації особи по залишкам біологічного походження Ідентифікація особи здійснюється шляхом геномної дактилоскопії з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), при цьому, ДНК ВІДІЛЛЮТЬ з кісткової тканини з застосуванням лізуючих агентів Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є метод виділення ДНК з кісткової тканини з використанням лізуючого буфера, який складається з Ю т М Трису, рН 8 0, ЮОтМ NaCI, 50тМ ЕДТА, рН 8 0, 0 5% SDS [1] Наважка кістки масою 2 - Зг, одержану за допомогою механічного гомогенізатора, або з застосуванням рідкого азоту, переносили в конічну в пробірку з додаванням З Омл свіже виготовленого лізуючого буфера, з додаванням ЮООмкл протеїнази К (концентрація 20мг/мл) Інкубували за температурою 56°С на протязі ночі, для повного лізісу кісткової тканини Зразок м'яко перемішували, 3 Омл розчину переносили у іншу пробірку і додавали до її вмісту 5 Омл суміші фенол / хлороформ / ізоаміловий спирт у співвідношенні 25 24 1, м'яко перемішували і центрифугували за максимальними обертами Процедуру повторювали ДВІЧІ Надосадну рідину відбирали і переносили у верхній резервуар колонки "Центрікон - 100" Центріфугували 20 хвилин при ЮООд до концентрування ДНК до об'єму 10 - 20мкл при кімнатній температурі Після центрифугування відкидали вміст нижнього резервуару У верхній резервуар колонки "Центрікон 100", де концентрується розчин ДНК об'ємом 10 20мкл, додавали 2мл ТЕ-буфера та повторювали фільтрування 2 рази Профільтрували розчин ДІЖ З рази через мембрану "Центрікон - 100" (сконцентрувавши ДНК до об'єму 10 - 20мкл) Зразок зберігали при температурі - 20°С Залежно від сумарного об'єму реакційної суміші ПЛР (від 7,5МКЛ ДО 50МКЛ) вибирали КІЛЬКІСТЬ отриманої ДНК для проведення реакції ампліфікації Однак, застосування вказаного вище метода для виділення ДНК із кісткової тканини має декілька недоліків лізується не вся маса препарату, а и частина, що в подальшому може обумовити недостатній вихід ДНК, необхідний для типування, вказаний метод потребує застосування таких отруйних ХІМІЧНИХ реактивів, як фенол, також потребує застосування досить коштовного приладдя типа "Центрікон - 100", або установки для ультрафільтрації В основу винаходу поставлена задача вдосконалення способу ідентифікації особи шляхом виділення ДНК із кісткової тканини, що є фрагментом геномної дактилоскопії методом ПЛР, що дозволить підвищити вірогідність ідентифікації Поставлена задача вирішується тим, що, згідно винаходу, на першому етапі геномної дактилоскопії - виділенні ДНК використовують лізуючий буфер з додатковим включенням 1% лаурілсаркозилу Na, при цьому екстракцію ДНК досліджуваного об'єкта проводять за температурою 65°С на протязі 50 - бОхвил, а потім - інкубацію за температурою 37°С на протязі 2-х діб Спосіб здійснюється наступним чином Із фра (О ю СО Ю 53564 гмента трубчастої кістки одержували кісткову стружку за допомогою дрібного терпуга, потім 300 Омг одержаної маси переносили в 2 Омл епендорф і додавали 1 5мл 0 5М ЕДТА рН 8 0 Інкубували за кімнатною температурою на протязі 12 годин, центрифугували при ЗОООоб/хвил, надосадну рідину видаляли До одержаного осаду додавали 800 Омкл лізуючого буфера Склад лізуючого буфера 0 5М ЕДТА рН 8 0 1% лаурілсаркозил Na 0 5мг/мл протеїнази К Інкубували за температурою 65°С на протязі 1 години, потім за 37°С на протязі двох діб Після чого спостерігався повний лізис тканини Після інкубації обробляли три рази сумішшю хлороформ / ізоаміловий спирт у співвідношенні 24 1 для інактивації протеїнази К та інших білків Потім до водно-сольового шару додавали 1 / 3 об'єму 8М ацетату амонія Інкубували у холодильнику на протязі ЗОхвил Цетрифугували при 14000об/хвил на протязі 25хвил Супернатант переносили у чисті пробірки і осаджували ДНК рівним об'ємом ізопропанола Промивали 70% етиловим спиртом на протязі 5хвил, центифугували при 14000об/хвил, супернатант зливали, повторювали процедуру декілька разів, далі одержаний осад висушували за кімнатною температурою Розчинювали в 100 Омкл ТЕ-буфера, проводили додаткову очистку Chelex-100 ("Bio-Rad", США) додавали Chelex100 до кінцевої концентрації 5% і Інкубували ЗОхвил при 56°С Проби ДНК зберігали при температурі 4 °С Якість виділеної ДНК визначали за результатами ампліфікації з використанням метода ПЛР з трьома парами праймерів, котрі ГОМОЛОГІЧНІ таким локусам генома людини локус Amel (статева хромосома), локус HUMvWA (хромосома 12р 12-pter), локус HUMLPL (хромосома 8р 22) Ампліфікацію ДНК проводили згідно Protocol II PCR Methods and Applications, 1991, v I, №2 на термоциклері "Терцик" ("ДНК-технология", Росія) І термоциклері РТС-200 ("MJ Research", США) Для ампліфікації використовували набори "Promega" (США) і "Тапотили" (Росія) Ампліфіковані фрагменти ДНК розподіляли в 4% агарозних і 10% поліакриламідних гелях, фарбували етідієм бромидом і сріблом - ВІДПОВІДНО Документували ампліфіковані фрагменти, використовуючи систему для відеодокументацм "Image Master YDS" ("Amersham pharmacia biotech", США) Таким чином, за рахунок використання лізуючих агентів без механічного впливу на ДНК змінюється склад лізуючого буфера, що дозволяє виключити застосування сильних руйнуючих впливів на кісткову тканину для визволення ДНК з клітин, в результаті чого ДНК деградує, а також в результаті зміни температурних і часових режимів інкубації на тривалу і м'яку інкубацію відбувається повний лізис клітин і повне відділення ДНК від білків та інших молекул, додаткова очистка одержаного розчину ДНК Chelex-100 ("Bio-Rad", США) дозволяє видалити інгібітори ПЛР Приклад конкретного використання способу Випадок з практики СМЕ У відділення був доставлений скелетований труп невідомого чоловіка у ВІЦІ 25 - ЗО років При дослідженні фрагментів ребер, взятих від трупа, були виявлені антиген А та ізогемагглютенш а-В, однак категорично висловитися про групову належність бюматеріала не було можливим через сильну забрудненість Розглянувши матеріали уголовного діла з приводу зникнення гр Г, прокуратура призначила генотипоскопічну експертизу, на рішення якої поставлене питання про біологічну спорідненість громадянки Ш відносно чоловіка, скелетований труп якого було знайдено (встановлення материнства) При проведенні геномної дактилоскопії методом ПЛР виділяли ДНК запропонованим способом з фрагментів трубчастих кісток, які належали скелетованому трупу невідомого чоловіка При порівняльному аналізі ДНК, виділеної із крові гр Ш , і ДНК, виділеної із фрагмента трубчастої кістки, були виявлені загальні аллелі за 10 локусами, що дозволило з вірогідністю 99,97% припустити материнство гр Ш по відношенню до чоловіка, скелетований труп якого було знайдено В порівнянні з прототипом запропоноване технічне рішення дозволяє за рахунок молекулярногенетичних досліджень ДНК фрагментів трубчастих кісток трупа методом ПЛР підвищити ступінь вірогідності способу ідентифікації особи практично до 100% Література 1 Antonio Alonso, Simim Andelmovic, Edwin Huffine / DNA Typing from Skeletal Remains Evaluation of Multiplex and Megaplex STR Systems on DNA Isolated from Bone and Teeth Samples/ /Profiles in DNA - 2001 - V 4 №3 - P 3 - 8 TOB "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24