Штам bovinae herpesvirus-1 “bhv-1/cow/kharkiv/2009″ для виробництва вакцин і діагностикумів

Штам bovinae herpesvirus "BHV1/cow/Kharkiv/2009" для виробництва вакцин і діагностикумів, який зберігається за номером 61 в колекції штамів мікроорганізмів лабораторії вірусології ННЦ "Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини" НААНУ: рід Varicellavirus, вид Bovinae herpesvirus-1, родина Herpesviridae. (19) (21) u201011492 (22) 27.09.2010 (24) 25.06.2011 (46) 25.06.2011, Бюл.№ 12, 2011 р. (72) СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, КУЧЕРЯВЕНКО РОМАН ОЛЕКСІЙОВИЧ, КУЧЕРЯВЕНКО ВІКТОРІЯ ВІКТОРІВНА, СТЕЦЕНКО ВОЛОДИМИР ІВАНОВИЧ, ТРИЗНА ЛАРИСА ПЕТРІВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ" 3 60431 4°С активність вірусу знижується через 30-40 діб на один lg. Розчин формаліну 1:500 інактивує вірус через 24 години, 1:4000 - через 46, 1:5000 - через 96 годин. Чутливий до жиророзчинників: ацетон, ефір, хлороформ і етиловий спирт інактивують його повністю. Патогенні властивості. Циркуляцію штаму зареєстровано серед великої рогатої худоби в скотарському господарстві Харківської області в 2009 році. Штам патогенний для великої рогатої худоби незалежно від статі та віку, передається аерогенно, статевим і контактним шляхом. Збудник є високо патогенним для великої рогатої худоби, викликає як у дорослих тварин, так і у телят спочатку гостре захворювання, яке пізніше переходить в хронічне. Антигенні властивості. В організмі теляти утворює віруснейтралізуючі, комплементзв'язуючі та преципітуючі антитіла. Імуногенність за даними епізоотологічних спостережень є високою: титри в РНГА в сироватках крові перехворілих тварин становлять у корів 1:256-1:1024, у телят 1:64-1:256 (польові спостереження в епізоотичному осередку). Біотехнологічні властивості. Стандартні для первинних і перещеплюваних клітинних культур. Основні умови зберігання. Заморожування за температури нижче 20°С, ліофілізація. Підтримання штаму проводять шляхом репродукції на чутливих культурах клітин. Штам проявляє характерні ознаки збудника інфекційного ринотрахеїту. Вірус нешкідливий в інактивований вакцині. Стабільність властивостей штаму дозволяє використовувати його при виробництві інактивованих вакцин і діагностичних антигенів. Використання штаму «BHV1/cow/Kharkiv/2009» для виготовлення діагностикумів з метою виявлення вірусу інфекційного ринотрахеїту в реакції імунофлуоресценції ілюструється наступним прикладом. Приклад. Для отримання специфічного флуоресціюючого імуноглобуліну (ФІТЦ-кон'югату) культивування вірусу ІРТ штаму «BHV1/cow/Kharkiv/2009» здійснювали у моношарових культурах перещеплюваних клітин нирки вівці або трахеї теляти, які вирощували в суміші рівних об'ємів середовища 199 та Ігла з додаванням 10 % сироватки ВРХ в бутлях з використанням ролерного апарату. Для інкубування моношару клітин 3 штам «BHV-1/cow/Kharkiv/2009» в об'ємі 5 см з 3 3 титром 7 lg ТЦД 50/ см розводили в 300 см підтримуючого середовища й вносили у 3 дм бутлю. Збір вірусної біомаси проводили на стадії внутрішньоклітинної локалізації вірусу шляхом збільшення концентрації в одиниці об'єму. При цьому підтримуюче середовище зливали, залишаючи в бутлі Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 4 одну десяту попереднього об'єму. Бутлі двічі заморожували та відтаювали (за температури мінус 20°С і 37°С). Отриманий таким чином вірус піддавали додатковому концентруванню і очищенню за допомогою ультрацентрифугування в градієнті щільності сахарози 15-53 % і використовували для чотирьох кратної імунізації лабораторних тварин 3 (кроликів або курей) в об'ємі 1 см з додаванням 70 % масляного ад'юванту (Montanide ISA70). Отримані сироватки мали титр нейтралізуючих антитіл 7,8-8,7 log2. Для виділення гамаглобулінової фракції використовували сульфатноамонійний метод. Сироватку розводили рівним об'ємом дистильованої води. Насичений розчин сірчанокислого амонію (75 %) по краплям додавали в сироватку, яка була розміщена на магнітній 3 мішалці (з розрахунку: на 100 см сироватки необ3 хідно взяти 115 см сульфату амонію) і залишали на одну добу за температури 4°С. Потім центрифугували при 3000 об/хв впродовж 30 хвилин. Надосадкову рідину зливали, а осад розчиняли в забуференому фізіологічному розчині (ЗФР), об'єм якого становив половину від початкової кількості сироватки. Повторне висолювання проводили таким же чином. Центрифугували при 5000 об/хв впродовж 20 хвилин. Осад ресуспендували в 10 3 см ЗФР, ретельно перемішуючи до отримання гомогенної суміші. Отриманий об'єм розчиненого глобуліну вносили в колонку з сефадексом марки G-25 або G-50 і проводили елюцію з 5 об'ємами ЗФР. Отримані глобуліни мітили ФІТЦем. Приєднання ФІТЦу до білку проводили з розрахунку 2,0 мг ФІТЦа на кожні 100 мг білку. ФІТЦ розчиняли в карбонатно-бікарбонатному буфері (виготовленому завчасно з рН 9,0-9,5) і по краплям додавали в розчин глобуліну, ставили в темне місце на дві години за температури 22°С. Потім на спектрофотометрі визначали співвідношення флюорохром - білок (F/P). Якщо показник F/P дорівнював трьом одиницям і нижче, а відсоток білку становив від 0,5 % до 1,0 %, то цей білок використовували для подальшої роботи, а за інших умов проводили розділення на фракції за допомогою гель-хроматографії на сефадексі марки G-50 або Toyopearl 650M. Очистку кон'югату від надлишків фарбника проводили на колонках з сефадексом марки G-25. Специфічність і активність флуоресціюючого імуноглобуліну до штаму «BHV1/cow/Kharkiv/2009» вірусу ІРТ визначали в реакції імунофлуоресценції за фарбуючим титром і в реакції гасіння флуоресценції. Таким чином, стабільність властивостей штаму дозволяє використовувати його при виробництві інактивованих вакцин і діагностичних антигенів. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601