Спосіб діагностики нейротоксичних ефектів

Винахід відноситься до медицини, а саме до токсикології. Нейротоксичність - одна з найсерйозніших токсикологічних проблем, оскільки пошкодження навіть невеликої кількості нейронів може мати непередбачувані наслідки для цілого організму. В силу унікальності характерних особливостей нервової системи (просторового розділення головної частини клітини та аксонів, незалежності нерва і глії, мієлінізації, синаптогенезу, нейротрансмісії) нейрони специфічно пошкоджуються нейротоксинами. Дослідження нейроспецифічних білків-маркерів клітинних та субклітинних елементів нервової тканини за патологій, пов'язаних з порушеннями у центральній нервовій системі (ЦНС), є досить актуальними, оскільки у багатьох випадках вони обумовлені змінами проникності гемато-енцефалічного бар'єру (ГЕБ) та ви ходом нейроспецифічних білків у кров'яне русло. У сироватці крові нейроспецифічні білки у нормі практично не виявляються. Підвищення їх вмісту може бути результатом деструкції тканини мозку, порушення стану центральних нейротрансміттерних систем та змін функціонування ГЕБ. Нейтральна молекула клітинної адгезії (N-CAM) є зручним нейроспецифічним маркером для дослідження нейротоксичних ефектів. Це інтегральний мембранний глікопротеїн, локалізований на зовнішній стороні нейрональної мембрани, що експресується нейронами та бере участь у контролюванні процесів нейритного росту та синаптогенезу, пластичності нервової системи, формуванні нейрональної мережі у процесі розвитку організму. У зв'язку з цим N-CAM може бути зручним маркером для дослідження ефектів нейротоксинів на клітинну міграцію, розпізнавання клітин для конкретної передачі сигналу. Відомо, що за патологічних станів, зокрема, захворювань бронхо-легеневої системи, має місце розвиток гіпоксії, яка призводить до підвищення рівня лейкотрієнів і виходу катіонів кальцію з кальціосом та лізосомальних ензимів у цитозоль. Подібний феномен є промотором інтенсифікації вільно-радикальних процесів і пошкодження субендотеліального матриксу не лише легеневої тканини, але й бар'єрів мозку, розвитку як загальної ендогенної інтоксикації, так і нейротоксичних ефектів. Сучасні методики визначення рівня ендогенної інтоксикації базуються на реєстрації в сироватці крові молекул середньої маси (МСМ), що є загальноприйнятими маркерами ендогенної інтоксикації [1] (прототип). Але наведені методики не дозволяють адекватно оцінити стан порушень саме в нервовій системі, оскільки накопичення в сироватці крові молекул середньої маси може бути проявом наявності будь-якого запального, деструктивного процесу, розвитку пухлин чи некрозу в організмі, що супроводжуються порушенням клітинних мембран. Тому виникає необхідність удосконалення способів діагностики розвитку токсичних явищ для диференціації саме нейротоксичних явищ. Основу винаходу становить задача удосконалення способу діагностики нейротоксичних ефектів, в якому в результаті використання рівня нейтральної молекули клітинної адгезії (N-CAM) в якості маркера ендотоксикозу, який визначають імунохімічним методом в сироватці крові, забезпечується можливість оцінки пошкодження саме в нервовій системі, зокрема, порушення гематоенцефалічного бар'єру, що забезпечує підвищення якості диференційної діагностики нейротоксичних станів, вірогідності отриманих результатів, завдяки чому можливе поліпшення діагностично-терапевтичної допомоги, контролю за ефективністю застосування медичних препаратів, запобігання ускладнень у хворих в медичних закладах України. Поставлена задача вирішується тим, що в способі діагностики нейротоксичних ефектів, який заключається в тому, що імунохімічно визначають вміст в сироватці крові маркерів ендотоксикозу, згідно винаходу в якості маркера використовують рівень нейтральної молекули клітинної адгезії (N-CAM). Таким чином, має місце причинно-наслідковий зв'язок між основними ознаками, що характеризують винахід, та те хнічним результатом, що досягається. В даному методичному підході вперше досягається можливість визначення нейроінтоксикації, ступеня пошкодження нервової тканини і, безпосередньо, мозкових стр уктур. Цим досягається підвищення специфічності оцінки природи ендотоксикозу, оскільки аналіз визначення загальновизнаних маркерів цього явища в системному кровообігу (при заборі крові із периферійної вени) - молекул середньої маси, показників вільно-радикальних процесів - не дозволяє визначити кореляцію між вираженістю патологічних змін у певному органі або системі та пошкодженням нервової тканини, оскільки підвищення рівня цих основних маркерів у сироватці крові відбувається за розвитку більшості запальних процесів, функціональних та дестр уктивних порушень в усі х органах і системах організму. Таким чином, за наявності патології запального або деструктивного характеру застосування існуючих методик не дозволяє адекватно оцінити ступінь пошкодження нервової тканини. У пропонованому способі цей недолік усувається, оскільки поява в кров'яному руслі нейроспецифічних білків і, перш за все, N-CAM є наслідком порушень нейрональних мембран. До того ж, оцінка ступеню нейротоксичного ефекту за рівнем накопичення NCAM дозволяє оцінити функціональний потенціал нервової тканини, прогнозувати характер подальшого розвитку нейротоксичних явищ, адекватно застосовувати медикаментозні засоби, контролювати ефективність їх застосування. Завдяки використанню пропонованого способу можливо покращити діагностику порушень в нервовій системі за різних патологічних станів, диференціювати ступінь деструктивних процесів в нейрональних мембранах, визначати наявність порушень в структурах мозку на ранніх стадіях, оскільки за нормальних станів N-CAM в сироватці крові не визначається або визначається в слідових кількостях, тобто, концентрація N-CAM в крові прямо пропорційна рівню пошкодження мозкових стр уктур. Даний спосіб малоінвазійний, зручний у використанні, характеризується відсутністю ризику ускладнень, тому рекомендується для застосування у практиці лікувально-профілактичних установ в Україні. Спосіб імунохімічної оцінки нейротоксичних ефектів полягає у наступному. Проводять забір периферичної венозної крові за уніфікованою методикою. Вміст (N-CAM) визначають методом конкурентного імунохімічного аналізу. Ступінь порушення гематоенцефалічного бар'єру діагностують за рівнем підвищення N-CAM. Приклад практичного використання. Для дослідження можливих нейротоксичних ефектів, наявних за розвитку бронхолегеневої патології, визначали рівень N-CAM у сироватці крові хворих на різні легеневі захворювання, які супроводжуються порушенням бронхіальної прохідності з подальшим розвитком ішемії та поглибленням дихальної недостатності (ДН): бронхіальну астму (БА)(n=24), хронічний необструктивний бронхіт (ХБ) (n=32), хронічний обструктивний бронхіт (ХОБ) (n=30), за яких бронхообструктивний синдром (БС) є домінуючим у клінічній картині захворювання, та гостр у пневмонію (ГП) (n=21), коли наявність БС приховане, але суттєво впливає на перебіг хвороби та ускладнення. Для контролю використовували сироватку крові донорів (n=20). Також визначали накопичення молекул середньої маси [2]. У результаті дослідження встановлено, що розвиток бронхолегеневої патології призводить до накопичення NCAM в сироватці крові, рівень якого залежав від нозології захворювання (табл. 1). Так, максимальна концентрація N-CAM виявлена у сироватці крові пацієнтів з ХОБ (середній рівень становив 8,96 мкг/г загального білка до 3,22 мкг/г загального білка у контрольній групі), потім хворих на ХБ (8,03 мкг/г загального білка), У хворих гострою пневмонією середній рівень N-CAM склав 6,40 мкг/г загального білка, бронхіальною астмою, відповідно, 5,675 мкг/г загального білка. Наявність N-CAM в сироватці крові свідчить про порушення резистентності гемато-енцефалічного бар'єру та вивільнення нейроспецифічних білків у кров'яне русло, що за певних умов може спричиняти аутоімунну агресію, зміни в сигнальній системі та спотворення клітинної відповіді на певний екстремальний стимул. Таблиця 1 Діапазон концентрацій N-CAM сироватки крові хворих на бронхолегеневі захворювання, мкг/г загального білка Хронічний Хронічний Бронхіальна Донори (контроль) Гостра пневмонія Групи необструктивний обструктивний астма n=20 n=21 бронхіт n=32 бронхіт n=30 n=24 Рівень 2,7-4,4 5,1-10,1 6,2-11,6 1,5-9,8 2,7-12 N-CAM Привертає увагу той факт, що у деяких хворих на гостру пневмонію концентрація N-САМ досягала 12 мкг/г загального білка, вірогідно, внаслідок впливу токсинів мікроорганізмів, які викликають паралітичне розширення стінок дрібних судин і зростання їх проникності з подальшим згущенням крові та зниженням об'єму циркулюючої рідини. Це може бути основною патогенетичною ланкою інфекційно-токсичного шоку і призводити до значних порушень перфузії органів, у першу чергу, легень, головного мозку, нирок. Можливе припущення, що значне накопичення N-CAM може служити негативною прогностичною ознакою прояву у таких хворих церебральних розладів із-за стазу крові в капілярах головного мозку та набряку його тканин. При визначенні ступеня накопичення в сироватці крові хворих одного з основних маркерів ендогенної інтоксикації - молекул середньої маси (МСМ) встановлено, що рівень МСМ у хвори х на бронхіальну астму перевищує контроль на 32%, хронічний необструктивний бронхіт - на 85%, гостру пневмонію - на 87%, хронічний обструктивний бронхіт - на 114%. Порівняння отриманих даних щодо концентрацій N-CAM та МС М вказує на неспецифічність оцінки токсичних ефектів за допомогою визначення МСМ, оскільки нейротоксичний ефект за різних патологічних станів може бути нижчим за загальнотоксичний або перевищувати його (зокрема, за розвитку бронхолегеневих захворювань). Таким чином, зважаючи на важливість оцінки нейротоксичних ефектів, що супроводжують розвиток захворювань, зокрема, бронхолегеневих, пропонується використання визначення рівня N-CAM у сироватці крові як маркера в діагностиці та прогнозуванні розвитку нейротоксичних явищ. Список літератури 1. Количественный метод определения среднемолекулярных пептидов в сыворотке крови больных с хронической почечной недостаточностью. / Салихова Н.Н., Ахмеджанов Р.И., Мухамадиева Ш.Г., Сахибов А.Д. // Лаб.дело. - 1989. - № 3. - С. 48-52. - (прототип). 2. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. et all. Protein masurement with the Folin phenol reagent // Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - P. 265-269.