Спосіб оцінки розвитку побічних ефектів пентоксифіліну

Спосіб оцінки розвитку побічних ефектів пентоксифіліну, який полягає у дослідженні біологічного матеріалу і визначенні біохімічних маркерів лейкоцитарного походження, який відрізняється тим, що додатково у біологічному матеріалі визначають показники перекисного окислення, а саме рівень дієнових кон югатів, кетодієнів і сполучених триєнів в нейтральних ліпідах, як біологічний матеріал використовують гомогенати тканин щурів, як біохімічні маркери лейкоцитарного походження визначають активність хімази, тоншу та/або еластази, судять про розвиток побічних ефектів пентоксифіліну за умов активації показників перекисного окислення по підвищенню активності хімази порівняно з контролем у серці, легенях або нирках, судять про розвиток побічних ефектів пентоксифіліну за умов відсутності активації показників перекисного окислення по підвищенню порівняно з контролем активності хімази та/або еластази в серці, тонша в печінці та нирках Винахід відноситься до галузі біохімії та може бути використаний в експериментальній біологи, медицині та ветеринари, зокрема для оцінки розвитку побічних ефектів пентоксифіліну (ПФ) Серед захворювань легень, серця, печінки та нирок, при яких використовують ПФ - мукобактеріальні інфекції, аутоімунні захворювання, алкогольний гепатит ПФ має антиоксидантні властивості, пригнічує активацію лейкоцитів, розвиток запальних процесів, які опосередковані участю таких медіаторів, як запальні цитокши ПФ суттєво знижує вазоконстрикторний ефект норадреналшу судин ПФ також позитивно впливає на ниркову мікроциркуляцію, функціонування нирок при нефритах Відомий спосіб контролю ефектів ПФ (van Crevel R , Vonk A G , Netea M G ei al Modulation of LPS-, PHA- and M tuberculosis-mediated cytokme production by pentoxifyllme and thahdomide // Eur Cytokme Netw- 2000- N4-P 574-579 ), який полягає у дослідженні у якості контрольних показників маркерів лейкоцитарного походження, а саме фактора некрозу пухлин-а, штерлейкшу (IL) 1(3 та штерферону-у в мононуклеарних клітинах крові Судять про зменшення інтенсивності прозапальних процесів за зниженням рівнів контрольних показників спосіб розрахований лише для оцінки прозапальних властивостей ПФ і тому не передбачає контролю розвитку його побічних ефектів Відомий спосіб контролю розвитку побічних ефектів пентоксифіліну (Differential effects of pentoxifyllme, a non-specific phosphodiesterase inhibitor, on the production of IL-10, IL-12 p40 and p35 subumts by munne peritoneal macrophages / J Marcmkiewicz, A Grabowska, R Lauterbach, M Bobek // Immunopharmacology- 2000- V 49, N3P 335-343 ) -прототип, який полягає у дослідженні біохімічних маркерів лейкоцитарного походження, а саме IL-10, IL-12 р40 в макрофагах in vitro, судять про розвиток запальних процесів за збільшенням рівня прозапального цитокіну IL-12 р40 і/або зниженням концентрації антизапального цитокіну IL-10 Недоліком відомого рішення є те, що цей Недоліком відомого рішення є те, що цей спосіб не передбачає контроль розвитку вазоконстрикторних та деструктивних ефектів ПФ та не розрахований для використання за умов дослідження сумісної патології внутрішніх органів В основу винаходу поставлена задача вибору об'єктивних і специфічних критеріїв оцінки розвитку побічних ефектів ПФ, вазоконстрикторних та деструктивних, що дозволить розробити схеми його призначення за умов сумісного перебігу патологи внутрішніх органів 00 ю 54811 Ця задача вирішується тим, що у способі оцінки розвитку побічних ефектів ПФ, який полягає у дослідженні біологічного матеріалу і визначенні біохімічних маркерів лейкоцитарного походження, згідно винаходу ВІДМІННИМИ ознаками є те, що додатково у біологічному матеріалі визначають показники перекидного окислення, а саме рівень дієнових кон'югатів (ДК), кетодієнів і сполучених триєнів (СТ) в нейтральних ліпідах (НЛ) У якості біологічного матеріалу використовують гомогенати тканин щурів У якості біохімічних маркерів лейкоцитарного походження визначають активність хімази, тоншу та/або еластази Судять про розвиток побічних ефектів пентоксифіліну за умов активації показників перекисного окислення по підвищенню активності хімази порівняно з контролем у серці, легенях або нирках Судять про розвиток побічних ефектів пентоксифіліну за умов відсутності активації показників перекидного окислення по підвищенню порівняно з контролем активності хімази га/або еластази в серці, тонша в печінці та нирках У якості критеріїв оцінки розвитку побічних ефектів ПФ додатково у біологічному матеріалі визначають показники перекисного окислення Це обумовлено тим, що активність перекисного окислення ЛІПІДІВ (ПОЛ) є неспецифічним показником стресової реакції, наслідком якого є розвиток патологічних процесів Активація ПОЛ у мембранах супроводжується виникненням в їх структурі лізоформ фосфоліпідів, альдегідів та кетонів, які порушують ЛІПІДНИЙ біслой, збільшується проникливість та текучість мембран В результаті порушується координація та специфічність мембранних процесів, розвиваються деструктивні процеси Вибір у якості показників перекисного окислення рівнів первинних продуктів ПОЛ (ДК) і вторинних (кетодієнів та СТ) дозволяє мати більш повну картину про стан розвитку окислювального стресу Вибір фракції НЛ для визначення рівня активації ПОЛ є цілком достатнім для встановлення інтенсивності вільнорадикальних процесів у КЛІТИНІ Вибір у якості біологічного матеріалу гомогенатів тканин щурів та визначення у якості біохімічних маркерів лейкоцитарного походження активності хімази, тоншу та/або еластази пов'язано з тим, що значні порушення в ДІЯЛЬНОСТІ легень, серцево-судинної системи, печінки та нирок, які спричинені окислювальним стресом, опосередковані участю базофілів/опасистих клітин, макрофагів і нейтрофілів За багато ефектів цих клітин ВІДПОВІДНІ протеолітичні ферменти, які в них знаходяться Опасисті клітини (ОК) і базофіли - поліфункцюнальні, вони містять різноманітні медіатори, такі як цитокши, протешази, гістамін і грають важливу роль у розвитку запальних і алергічних реакцій Хімаза є одним з основних протеолітичних ферментів ОК і їй належить основна роль у тканинному утворенні анпотензину II (All), розвитку гіпертрофії міокарда, ремоделюванні тканин серцево-судинної системи Хімаза - один з основних ферментів альтернативного, незалежного від ангіотензин-перетворюючого ферменту (АПФ) шляху утворення вазоконстрикторного пептиду АІІізАІ ОК, що містять хімазу, можуть бути включені також у тканинне ремоделювання, розвиток фіброзних змін при легеневій гіпертензії, розвитку гломерулонефриту В альтернативному шляху утворення All бере участь тонш, що каталізує розщеплення не тільки АІ, але й анпотензиногену Активація альтернативного шляху може спостерігатися в результаті навантаження, стресу, а серед ефектів All - збільшення окислювального стресу Вказують на участь альтернативного, тобто ЛПФнезалежного, шляху в утворенні АИ у щурів тільки при високих концентраціях АІ Активація альтернативного шляху має місце в серці і нирках і може призводити до реструктуризації цих органівмішеней із наступною органною дисфункцією Хімаза ОК є хемотаксическим чинником для нейтрофілів, еозинофілів і інших клітин, що приймають участь у розвитку запальних процесів Одним із цитокшів, який продукується ОК є фактор некрозу пухлин-а Припускають, що він може бути основним фактором, що регулює продукцію штерлейкіну-6 у лейкоцитах, які інфільтрують, і ІНІЦІЮЄ каскад цитокшів, відповідальних за індукцію молекул міжклітинної адгезм-1 і наступні нейтрофіл-опосередковані ушкодження Спроможність нейтрофілів ушкоджувати тканини обумовлена наявністю систем що генерують супероксид-анюн, і гідролітичних ферментів, які знаходяться в цитоплазматичних гранулах Серед найбільш деструктивних протеїваз нейтрофілів виділяють еластазу - сершову протешазу, що спроможна розщеплювати всі основні компоненти сполучної тканини (колагени, протеоглікани, еластин), також фібронектин, фібриноген/фібрин, фактори згортання крові, білки системи комплементу, імуноглобулши Підвищення активності еластази і деструкція еластичного каркасу органів і тканин є важливим патогенетичним чинником у розвитку багатьох захворювань Відзначають можливість розвитку кардюміопатм через афшність ДНК до еластази нейтрофілів Дослідження по запропонованому способу, які були проведені на експериментальних тваринах, а саме на щурах-самцях лінії Вістар в Інституті терапії АМН України показали, що окислювальний стрес, який викликано дією хлориду ртуті призводить до активації ПОЛ, а саме до підвищення рівнів ДК печінки та кетодієнів і СТ в НЛ печінки, серця, легень та нирок, крім того - до підвищення активності хімази, тоншу та еластази в серці, легенях, печінці і нирках Встановлено, що введення ПФ щурам в дозі 15мг на 100г ваги за умов активації окислювального стресу призводить до підвищення активності хімази порівняно з контролем у серці, легенях і нирках, а за умов відсутності активації ПОЛ - до підвищення порівняно з контролем активності хімази та/або еластази в серці, тонша в печінці та нирках Відтвореність - ступінь вірогідності відмінностей не перевищує 5% Запропонований спосіб здійснюють у такій ПОСЛІДОВНОСТІ 1 Досліджують біологічний матеріал, напри 54811 клад гомогенати печінки, серця, л е г е н ь т а нирок щурів, у одній частці якого визначають показники перекидного окислення У якості показників перекисного окислення визначають рівні ДК, кетодієнів і СТ в НЛ органів щурів Визначення рівнів цих показників ПОЛ проводять відомим методом, наприклад, спектрофотометричним - Д К за методом, принцип якого полягає в визначенні вмісту цих продуктів ПОЛ в фракції НЛ після проведення екстракції з використанням гептан-ізопропанольної суміші, за інтенсивністю поглинання Д К при довжині хвилі 232нм (описано Волчегорский Й Ф , Налимов А Г , Яровинский Б Г, Л и ф ш и ц Р И С о п о с т а в л е н и е различных подходов к о п р е д е л е н и ю продуктов перекисного окисления л и п и д о в в гептан-изопропанольных экстрактах крови// В о п р о с ы мед химии -1989 Т35, № 6 - С 127-131) - Кетодієни т а СТ за методом, принцип якого полягає в визначенні вмісту цих продуктів ПОЛ в фракції НЛ після проведення екстракції з використанням гептан-ізопропанольної суміші, при довжині хвилі 278нм (описано т а м же) 2 Другу частку біологічного матеріалу, а саме гомогенати т к а н и н печінки, серця, л е г е н ь т а нирок щурів, центрифугують Ю х в при 5000д на центрифузі т и п у PC -6 при 4 С і зберігають при необхідності за умов -20°С до аналізу активності хімази, т о н ш у т а еластази 3 С у д я т ь про розвиток побічних ефектів ПФ за умов активації показників перекисного окисл е н н я по підвищенню активності хімази порівняно з контролем у серці, легенях або нирках 4 С у д я т ь про розвиток побічних ефектів ПФ за умов відсутності активації показників перекисного окислення по підвищенню порівняно з контролем активності хімази та/або еластази в серці, т о н ш а в печінці т а нирках Можливість здійснення запропонованого способу підтверджується прикладами Приклад 1 Спосіб оцінки розвитку побічних ефектів ПФ у щурів за умов о к и с л ю в а л ь н о г о стресу, що викликано введенням хлориду ртуті Одній групі т в а р и н вводили хлорид ртуті (НдСЬ) у дозі 0,7мг на 100г ваги т і л а Згідно винаходу другій групі за 2 год до ін'єкції хлориду ртуті вводили ПФ у дозі 15мг на 100г ваги т і л а Контрольній групі т в а р и н вводили фізіологічний розчин у ВІДПОВІДНІЙ дозі Щурів декапітували через 2 год після ін'єкції хлориду ртуті Печінку перфузували охолодженим фізіологічним розчином Тканини легень, серця, печінки і нирок (500мг) гомогенизировали в 4мл фізіологічного розчину Досліджували показники ПОЛ (рівні ДК, кетодієнів і СТ в НЛ) відомими с п е к т р о ф о т о м е т р и ч ними методами, активність хімази, т о н ш у т а еластази ф е р м е н т а т и в н и м и методами, наприклад згідно Пат України № 34208 А М П К G 01 N 33/48, А 61 В 19/02, опубл 2001 - Бюл № 1 або Пат України № 32131 А М П К С 12 Q 1/38, G 01 N 33/49, опубл 2000 - Бюл № 7-11 т а Пат України № 3 7 6 4 7 А М П К С 12 Q 1/38, G 01 N 33/48, 33/49, опубл 2001 - Бюл № 4 Д л я оцінки активності еластази у якості субстрату використовували NSuccmyl-Ala-Ala-Val, а контрольними зразками служила еластаза активністю від 0,0005 до 0,5 Од/мл Результати дослідження Рівень Д К в ШІ становить у печінці - 22,20 ± 0,69 ДЕ/г т к а н и н и (9,16 ± 0,52 ДЕ/г у контролі) - вище порівняно з контролем, у серці - 29,85 ± 0,74 ДЕ/г т к а н и н и (17,03 ± 0,47 ДЕ/г у контролі) - вище порівняно з контролем, у легенях - 1 7 , 1 8 + 1 , 2 3 ДЕ/г т к а н и н и (11,66 + 1,41 ДЕ/г у контролі) - вище порівняно з контролем, у нирках - 22,36 + 0,98 ДЕ/г тканини (12,31 + 0,78 ДЕ/г у контролі) - вище порівняно з контролем, Рівень кетодієнів т а СТ в НЛ становить у печінці - 5,72 + 0,27 ДЕ/г т к а н и н и (2,54 + 0,14 ДЕ/г у контролі) - вище порівняно з контролем, у серці - 2 1 , 5 7 + 0,76 ДЕ/г т к а н и н и (8,62 + 0,73 ДЕ/г у контролі) - вище порівняно з контролем, у легенях - 6,71 + 0,37 ДЕ/г т к а н и н и (5,88 + 0,59 ДЕ/г у контролі) - не відрізняється від контролю, у нирках - 4,31 + 0,53 ДЕ/г т к а н и н и (2,40 + 0,20 ДЕ/г у контролі) - вище порівняно з контролем Вищевказані дані свідчать про активацію перекисного окислення т а наявність деструктивних процесів Визначають активність хімази у серці, легенях і нирках Таблиця 1 Вплив ПФ на активність хімази у щурів за о к и с л ю в а л ь н о г о стресу, який викликано введенням хлориду ртуті Контроль Легені Рк 8,41 +2,28 Ртуть 16,41 +5,02 >0,05 7,84 + 3,04 14,12 + 5,05 >0,05 Р' Серце Рк р' Ртуть + пентоксифілш 20,67 + 8,13 0,05 24,72+1,33 0,05 Пентоксифілін 20,18 + 5,59