Спосіб підвищення антигенних властивостей білкового компоненту с.dipнtнeriae

Корисна модель відноситься до медицини, а саме медичної мікробіології і може бути використана в технології одержання пероральних вакцинних препаратів. Всесвітня організація охорони здоров'я визначила приоритетний напрямком дослідження по заміні парентеральних вакцин на пероральні [1]. Непарентеральні способи вакцинації базуються на здатності антигенів проникати через слизові оболонки головним чином кишкового тракту. Застосування пероральних вакцин дозволяє забезпечити безперервність антигенного стимулу, що є обов'язковою умовою підтримування на високому рівні колективного імунітету проти інфекцій, керованих засобами специфічної профілактики. До того ж такий спосіб імунізації є найпростішим, фізіологічно адекватним і психологічно привабливим. Відомий спосіб [2] підвищення імуногенності шляхом експресії холерного токсин-антигену у химерний білок рослин. Відомий спосіб підвищення імуногенності нуклеопротеїнів вірусу гепатиту В шляхом ковалентного зв'язування аміногрупами цього білку із мікробним гаптеном. Така кон'югація дозволила підняти імуногенність вакцини та викликати індукцію антитіл до рівня 1:128 (при вакцинації тварин нативним білком титр антитіл не перевищував 1:32). Ця те хнологія не може бути використана для підвищення імуногенності інших вакцин (мікробних та вірусних), бо розрахована виключно на білок, що індукується в ядрі клітини вірусом гепатиту В. Крім того, пероральне використання такої вакцини неможливе, бо кишкові ферменти руйнують антиген. Недостатньо ефективний являється і сам метод кон'югації, оскільки титри антитіл до модифікованого антигену зростали лише в 4 рази. Найближчим до патентуємого способу є спосіб отримання водорозчинного ад'юванта [3]. Цей ад'ювавт містить фрагменти пептидоглікану та полісахариду із ацетилглюкозаміном, і ацилмурамовою кислотою. Остання замість ацетильної групи була модифікована бурштиновим чи фталевим ангідридами. Пептидоглікан вилучали із клітинної стінки мікроорганізмів роду Nocardia, та ацилювали 30-50% за масою пептидоглікану. Застосування такого способу дало можливість підвищити імуногенність мікробного антигену на 25-30% проти стандартної ін'єкційної вакцини. Титри специфічних антитіл зростали до 1:256-1:512 через два тижня після вакцинації. Отримання чистого пептидоглікана є коштовною процедурою, оскільки пов'язана з багатостадійною очисткою. Крім того, такі вакцини були повністю неефективними при пероральному застосуванні, бо руйнувалися кишковими ферментами; у зв'язку з тим, що ад'ювант не мав ковалентних зв'язків із антигеном, спостерігалася значна різниця між титром антитіл до ад'юванту (1:400) та титром антитіл до мікробного антигену (1:100). До відмінностей обох винаходів слід, насамперед, віднести застосування вказаних ангідридів для модифікації різних за хімічною природою антигенних комплексів: пептидоглікану - в аналогу, білкової субстанції - в корисній моделі. Крім того, у відомому винаході ацилюванню піддається антигенний комплекс, що застосовується в якості ад'юванта, а в заявленій моделі залишки органічних кислот у стр уктурі модифікованого антигену самі виступають ад'ювантннми сполуками. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб підвищення імуногенності білкового компоненту С. diphtheriaе, шляхом хімічної модифікації білкового компоненту вакцини бурштиновим ангідридом, що забезпечує максимальний титр специфічних нейтралізуючих антитіл у крові при пероральному застосуванні. Приклади здійснення корисної моделі Мікробну масу одержують з виробничого штаму PW - 8 варіант Вейсензее шляхом культивування бактерій С. diphtheriae на бульйоні Лінгуда з додаванням 0,3% глюкози або мальтози. Вирощування проводять при температурі 37°С продовж 36 годин, після чого мікробну масу відділяють від токсину за допомогою центрифугування (6000об/хв. протягом 30 хвилин). Одержаний осад (n-грам сирої маси) заливають етанолом (концентрація 96°) в об'ємі (2-4)n мл, витримують в холодильнику при температурі 4°С 24 години і центрифугують в зазначеному режимі. Мікробний осад заливають (2-10)n мл фізіологічним розчином, встановлюють рН 7,2-7,4, охолоджують до 4-6°С, залишають на 3-4 години, далі центрифугують (6000об/хв. протягом 30 хвилин). До одержаного осаду поступово додають 0,8% розчин етілендіамінтетpaацетату-Na2 (ЕДТА-Na2), одночасно розтирають у фар форовій ступці до одержання білої, тягучої маси. Витримують в холодильнику при температурі 4°-6°С 18 годин. Екстракт центрифугують при 6000об/хв. продовж 30 хвилин, після чого проводять діаліз проти дистильованої води при рН 7,2-7,5 та згущують ПЕГ-ом мм 15000 або сефадексом G 200 Superfine 1 до об'єму n мл. Екстракт ЕДТА переосаджують при рН 7,0. До складу виділених антигенних комплексів входять білки (75,3±3,4)%, ліпіди (23,3±4,1)% та вуглеводи (1,4±0,4)%. Готують водну суспензію соматичних антигенів, орієнтуючись на одержання необхідної концентрації їх для проведення перорального щеплення (5,0мг/л), доводять рН до 8,5-9,0 за допомогою 1,0% розчину гідроокису натрію чи 1,0% оцтової кислоти, встановлюють на спектрофотометрі (довжина хвилі 230нм) точний вміст білкової субстанції. Соматичний комплекс модифікують бурштиновим ангідридом по відношенню до вмісту білку. Імуногенні властивості одержаних комплексів визначають на кролях породи шиншила вагою 3,0-3,5кг. Створення грундімунітету у тварин проводять за схемою: дворазового введення антигену в дозі 5,0мг за годину до годування з добовим інтервалом протягом п'яти днів. Серологічне обстеження виконують через 7, 14 та 21 день після останнього щеплення за допомогою стандартного дифтерійного еритроцитарного діагностикума з титром 1:3200 (див. таблицю). Таблиця Титри протидифтерійних антитіл у сироватках крові тварин після щеплення їх сукцинильованим антигеном Процентне співвідношення модифікатора до антигену Доза День антигену (в спостереження мг) 1,0% 5,0 2,0% 5,0 3,0% 5,0 4,0% 5,0 5,0% 5,0 не модифікований антиген 15,0 7-й 14-й 21-й 7-й 14-й 21-й 7-й 14-й 21-й 7-й 14-й 21-й 7-й 14-й 21-й 7-й 14-й 21-й Кількість тварин 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 10 10 10 з них мали антитіла в титрах 1:101:40 1:801:160 1:3201:640 1:1280-1:2560 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 4 4 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 2 1 0 0 0 0 0 0 0 1 3 4 2 2 4 1 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 2 0 3 3 1 3 3 2 0 0 0 0 0 0 Одержані результати свідчать, що модифіковані антигени мають різну здатність обумовлювати розвиток гуморального імунітету. Застосування модифікатора в кількості 1,0% та менше, а також 5,0% та більше по відношенню до маси білкового компоненту не приводило до індукції титрів антитіл у тварин, тоді як ацилювання 2,0-4,0% від концентрації білкового компоненту приводило до індукції захисних титрів у крові перорально вакцинованих кролів до титру 1:2560 із збереженням його до 21 доби. Перелік посилань: 1. Научные исследования и разработки в области вакцин // Материалы 87-й Сессии исполнительного комитета Всемирной организации здравоохранения 21 ноября 1990 г. - 11 с. 2. United States Patent 6,395,964, May 28, 2002 C12N 005/04; C12N 015/82; C12N 015/87; A01H 005/00. Oral immunization with transgenic plants/ Arntzen; Charles J.; Mason; Hugh S.; Tariq; Haq A.; Clements; John D. The Texas A&M University System (College Station, TX); The Administrators of the Tulane Fund (New Orleans, LA) Appl. No.: 817906, August 4, 1997. 3. United States Patent 4,094,971 June 13, 1978. A61K 039/02. Immunological adjuvant agents active in aqueous solution Chedid; Louis A.; Audibert; Francoise Marguerite Agence Nationale de Valorisation de la Recherche Appl. No.: 717509 August 25, 1976.