Спосіб запобігання туберкульозу

Реферат: UA 116105 C2 (12) UA 116105 C2 Винахід стосується способу запобігання туберкульозу, який включає введення інактивованих мікобактерій, де мікобактерії періодично вводяться перорально, інтервал між дозами не перевищує 5 днів і кількість введених доз дорівнює як мінімум 5. UA 116105 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується галузі медичних препаратів, які застосовуються орально для запобігання туберкульозу. Зокрема, для затримання переходу латентної інфекції в активну інфекцію вказаної хвороби. Попередній рівень техніки Туберкульоз - це хронічна інфекційна хвороба, викликана бактеріями, які належать до групи Micobacterium tuberculosis-complex (MTB-C), яка включає у наш час бацили M. tuberculosis, M. bovis, M. microti і M. africanum, M. Tuberculosis, який є найважливішим і типовим представником, що стосується туберкульозу людини. Вказана хвороба насамперед вражає легені, хоча у деяких випадках вона може також розповсюджуватися до інших органів. Туберкульоз може бути фатальним, якщо не буде отримувати відповідного лікування. Згідно із звітом за 2011 рік Всесвітньої організації охорони здоров'я, кожен рік у світі реєструється 9 мільйонів нових випадків виявлення захворювання у людей і повідомляється про приблизно 1,7 мільйонів смертей. Також вважається, що у світі існує близько 2,500 мільйонів інфікованих людей і близько 100 мільйонів нових інфікованих з'являється щороку. Туберкульоз передається по повітрю так, що пацієнти із туберкульозною каверною у їх легенях є основним джерелом передачі цієї хвороби, як описано, наприклад, в J. Grosset, Studies in short-course chemotherapy for tuberculosis. Basis for short-course chemotherapy, Chest, 1981, 80, 719-720, і в J. Grosset Mycobacterium tuberculosis in the Extracellular Compartment: an Underestimated Adversary, Antimicrob. Agents Chemother., 2003, 47, 833-836. Як описано у вказаних роботах, пацієнти вивільняють шляхом кашляння або чхання велику кількість мікрокрапель, які можуть переносити бацили, які можуть входити в альвеолярний простір людини, яка їх вдихає. Після вдихання бацили піддаються фагоцитозу альвеолярними макрофагами і всередині цієї клітини бацили можуть рости до кількості, яка спричиняє руйнування клітини. Бацили піддаються знову фагоцитозу у міжклітинному просторі новими макрофагами, і цей процес повторюється доти, доки одного разу вони не вичерпуються, і інфекція утворюється у прикореневих лімфатичних вузлах, утворюється імунна відповідь, основана на клітинному імунітеті. Через приблизно 6 тижнів після інфікування, ріст бацил припиняється, хазяїн дає позитивний шкірний тест на туберкульоз, який характеризується реакцією гіперчутливості уповільненого типу (DTH), і в точках інфекції утворюється так званий казеозний некроз. Однією із основних характеристик інфекції туберкульозу є той факт, що M. tuberculosis здатний залишатися у тканині хазяїна роками у формі "латентної" туберкульозної інфекції без розвитку хвороби, але зберігаючи свою здатність породжувати активний туберкульоз. Цей латентний стан інфекції пов'язаний із початком так званого казеозного некрозу, який утворюється у первинних альвеолярних ураженнях і у оточуючій тканині легенів, приводячи до руйнування макрофагів, які містять бацили, які розмножуються, приводячи до щільного некротичного ураження. Природа цієї некротичної реакції достовірно не відома, але вона пов'язана із реакцією типу DTH. В основному імунна відповідь, яка дозволяє контролювати популяцію бацил, є імунною відповіддю клітинного типу, яка керована насамперед Th1 CD4, тобто він здатний викликати відповідь типу DTH і також ідентифікувати інфіковані макрофаги і активувати їх для руйнування у них бацил. Приблизно у 10 % інфікованих людей, вказаний щільний некроз пом'якшується, що є одним із важливих епізодів в інфекції туберкульозу, оскільки він починається тоді, коли інфекція переходить у активний туберкульоз, тобто у хворобу туберкульоз. У більшості випадків пом'якшення пов'язане із осушенням пом'якшеної тканини у напрямку бронхіального дерева, утворюючи туберкульозну каверну і бурхливий позаклітинний ріст бацил із входом кисню через отвір у бронхах. З кашлем цей пом'якшений казеум, повний бацил, розповсюджується у інші частини бронхів, легень і поза тілом. Фармакологічне лікування туберкульозу характеризується як тривала терапія, яка ускладнює суворе дотримання лікування, оскільки у той же час сприяє виникненню лікарської резистентності бактерій. Вважається, що найкраща стратегія у пригніченні туберкульозу основана на превентивному підході. Існуюча вакцина, яка вводиться парентерально, яка використовується в профілактичному лікуванні туберкульозу, основана на бактерії штаму, названого BCG (бацила КальметтаГерена), послабленого варіанту M. bovis. Однак, було помічено, що її ефективність падає протягом часу, і що вона не ефективна у попередженні хвороби у дорослих. Насправді 1 UA 116105 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вважається, що вона захищає тільки ніші розвитку фатальної туберкульозної хвороби (міліарного туберкульозу або туберкульозного менінгіту). Були розроблені інші профілактичні лікування туберкульозу, головним чином основані на інших штамах життєво ослаблених мікобактерій або на бактеріальних субодиницях. Крім того, профілактичні лікування туберкульозу, основані на інактивованих мікобактеріях, також були вивчені у сучасному стані техніки з метою отримання імунної відповіді, подібної імунній відповіді, отриманій за допомогою вакцини, основаної на послаблених мікобактеріях, тобто, таких, які продукують γ-інтерферон Th1. Таким чином, наприклад, стаття Opie et al., Protective inoculation against human tuberculosis with heat-killed tubercle bacilli, Am. J. Hyg., 1939, 29, 155-164 описує клінічні випробування, у яких п'ять доз бацил M. tuberculosis, інактивованих шляхом нагрівання, вводили внутрішньошкірно з метою створення захисту проти хвороби. Також стаття Agger et al., Specific acquired resistance in mice immunized with killed mycobacteria, Scand. J. Immunol., 2002, 56, 443-447 описує експериментальне дослідження з мишами, вакцинованими трьома введеними підшкірно дозами у 1000 мкг бацили M. tuberculosis, інактивованих нагріванням, із двотижневим інтервалом між кожною дозою, показуючи індукцію специфічного імунітету, основаного на Т-клітинах. Інші інактивовані мікобактерії були також тестовані на індукцію захисту від туберкульозу, як правило, парентерально. Наприклад, Gupta et al., Immunogenicity and protective efficacy of "Mycobacterium w" against Mycobacterium tuberculosis in mice Immunized with live versus heat-killed M. w by the aerosol or parenteral route, Infect. Immun., 2009, 77 (1), 223-231 описують, що вводили живі M. w мікобактерії або M. w мікобактерії, інактивовані нагріванням. M. w мікобактерії, інактивовані нагріванням, вводили підшкірно у вигляді одноразової дози і спостерігали імунну відповідь, основану на індукції Th1 клітин, які продукують інтерферон. Надзвичайно бажано надати ефективне профілактичне лікування, яке застосовується орально, оскільки такий шлях застосування значно полегшує застосування ліків і дотримування лікування. У цьому значенні існують документи сучасного стану техніки, які посилаються на оральне застосування бактерій інактивованих нагріванням мікобактерій, Mycobacteriumn vaccae, для забезпечення терапевтичної дії на активний туберкульоз, згідно із схемою лікування, об'єднаною із ліками звичайної хіміотерапії. На експериментальному рівні Hernandez-Pando et al., Orally administrated Mycobacterium vaccae modulates expression of immunoregulatory molecules in BALB/mice with pulmonary tuberculosis, Clin. Vaccine Immunol., 2008, 15 (11), 1730-1736, описують аналіз, проведений на мишах, яким вводили орального 5 доз по 0,1 мкг M. vaccae, інактивованих нагріванням, із 28денним інтервалом між кожним введенням, індукуючи інфікування M. tuberculosis внутрішньотрахеально через 23 години після першої дози. У вказаному дослідженні було підтверджено, що клітинна імунна відповідь була утворена збільшенням секреції Th1 клітин, в той час як гуморальний імунітет впав, як показано зменшенням клітин типу Th2 і фактора росту TGF-бета. Звичайно сучасний стан техніки пропонує, що бажаною є індукція Th1 із подальшою продукцією γ-інтерферону, у той час як Th2 відповідь, із подальшим виробництвом ІЛ-4, або відповідь Th3, яка веде до утворення регуляторних Т-клітин (Treg), можуть виконувати дію, яка індукує активний туберкульоз. Це описано, наприклад, у Kursar et al., Cutting Edge: Regulatory Т Cells prevent Efficient Clearance of Mycobacterium tuberculosis, J. Immunol., 2007, 178, 2661-2665, де утворення регуляторних Т-клітин (Treg) відносять до нездатності CD4 Т-клітин стерилізувати казеозні ураження і запобігати латентній інфекції у мишачій моделі експериментального туберкульозу. Вказана стаття пропонує, що розбалансування, яке дозволяє дисбаланс між Th1 відповіддю і Treg відповіддю на користь Treg відповіді, може бути причиною індукції активного туберкульозу. Беручи до уваги те, що було описано у сучасному стані техніки, продовжує залишатися необхідність пропозиції ефективного лікування туберкульозу, яку можна проводити орально для запобігання розвитку активного туберкульозу і подальшого встановлення патологічного стану хвороби як у неінфікованих осіб (профілактична дія), так і у осіб інфікованих M. tuberculosis, у яких інфекція знаходиться в латентному стані (терапевтична дія). Мета винаходу Метою даного винаходу є застосування інактивованих мікобактерій для приготування медичного препарату для орального застосування для запобігання туберкульозу. Опис креслень 2 UA 116105 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 1 демонструє час виживання, виражений у днях, поданий на осі X, і процент тварин, які вижили, представлений на осі Y. Контрольна Група представлена безперервною лінією, а тваринні Групи 1 представлені переривчастою лінією. Тваринні Групи 1 були піддані оральному лікуванню інактивованими мікобактеріями Mycobacterium tuberculosis до інфікування шляхом введення 5 доз вказаних бацил, одну кожні 48 годин, починаючи за 10 днів до інфікування. Графіки 1, 2, 3 і 4 відповідають тваринним Групам 1a, 1b, 1c і 1d, відповідно, яким були введені різні кількості препарату, відповідно, у розбавленнях 1:1, 1:10, 1:100 і 1:1000 (Приклад 1). Фігура 2 демонструє час виживання, виражений у днях, поданий на осі X, і процент тварин, які вижили, представлений на осі Y. На цій фігурі Контрольну Групу (безперервна лінія) порівнюють із Групою 2 (переривчаста лінія). Тваринні Групи 2 були піддані оральному лікуванню інактивованими мікобактеріями Mycobacterium tuberculosis після інфікування шляхом введення 5 доз вказаної бацили, кожні 48 годин, починаючи із 11 дня після інфікування. Графіки 5, 6, 7 і 8 відповідають тваринним Групам 2a, 2b, 2c і 2d, відповідно, яким були введені різні кількості препарату, згідно із розбавленнями 1:1, 1:10, 1:100 і 1:1000 (Приклад 1). Фігура 3 демонструє час виживання, виражений у днях, поданий на осі X, і процент тварин, які вижили, представлений на осі Y. На цій фігурі Контрольну Групу (безперервна лінія) порівнюють із тваринами Групи 1 (переривчаста лінія), які після інфікування були піддані оральному лікуванню інактивованими мікобактеріями M. bovis BCG. (Приклад 2). Фігура 4 демонструє час виживання, виражений у днях, поданий на осі X і процент тварин, які вижили, представлений на осі Y. На цій фігурі Контрольну Групу (безперервна лінія) порівнюють із тваринами Групи 1 (переривчаста лінія), які були піддані оральному лікуванню інактивованими мікобактеріями M. bovis BCG до інфікування (Приклад 3). Фігура 5 демонструє час виживання, виражений у днях, поданий на осі X, і процент тварин, які вижили, представлений на осі Y. На графіку 1 Контрольну Групу (безперервна лінія) порівнюють із Групою 1 (переривчаста лінія), яка була піддана лікуванню оральним введенням інактивованих мікобактерій Mycobacterium tuberculosis, яке почалося до інфікування. На графіку 2 Контрольну Групу (безперервна лінія) порівнюють із Групою 2 (переривчаста лінія), яка була піддана лікуванню оральним введенням інактивованих мікобактерій, яке почалося після інфікування, на графіку 2. (Приклад 4). Фігура 6 відображає проценти регуляторних Т-клітин із CD4+CD25+Foxp3+ фенотипом відносно всіх CD4+ Т-клітин для кожного лікування інактивованими мікобактеріями M. tuberculosis і контролю, на 3 тижні (графік 1) і на 4 тижні (графік 2) після інфікування. Вказаний процент регуляторних Т-клітин відображений на осі Y. Різні групи тварин представлені на осі X. Квадрати представляють нелікованих тварин (Контрольна Група), трикутники представляють тварин Групи 1, лікованих до інфікування (профілактична дія), і кола представляють тварин Групи 2, лікованих після інфікування (терапевтична дія). Безперервні горизонтальні лінії представляють середнє арифметичне кожної групи (Приклад 4). Фігура 7 демонструє час виживання, виражений у днях, поданих на осі X, і процент тварин, які вижили, представлений на осі Y. На графіку 1 Контрольну Групу (безперервна лінія) порівнюють із Групою 1 (переривчаста лінія), яка була піддана лікуванню оральним введенням інактивованих мікобактерій Mycobacterium kansasii, яке почалося до інфікування (профілактична дія). На графіку 2 Контрольну Групу (безперервна лінія) порівнюють із Групою 2 (переривчаста лінія), яка була піддана лікуванню оральним введенням інактивованих мікобактерій Mycobacterium kansasii, яке почалося після інфікування (терапевтична дія) (Приклад 5). Фігура 8 демонструє час виживання, виражений у днях, поданих на осі X і процент тварин, які вижили, представлений на осі Y. На графіку 1 Контрольну Групу (безперервна лінія) порівнюють із Групою 1 (переривчаста лінія), яка була піддана лікуванню оральним введенням інактивованих мікобактерій Mycobacterium fortuitum, яке починалося до інфікування (профілактична дія). На графіку 2 Контрольну Групу (безперервна лінія) порівнюють із Групою 2 (переривчаста лінія), яка була піддана лікуванню оральним введенням інактивованих мікобактерій Mycobacterium fortuitum, яке почалося після інфікування (терапевтична дія) (Приклад 6). Фігура 9 демонструє час виживання, виражений у днях, поданих на осі X, і процент тварин, які вижили, представлений на осі Y. Тварини були заражені і потім ліковані протитуберкульозним препаратом RIMSTAR. Після лікування RIMSTAR, Група 1 була піддана подальшому лікуванню, яке утворює толерантність, оральним введенням інактивованих мікобактерій Mycobacterium fortuitum (протирецидивна дія). Контрольну Групу (безперервна лінія, без лікування, яке утворює толерантність) порівнюють із Групою 1 (переривчаста лінія, із лікуванням, яке утворює толерантність). Періоди лікування лікуванням RIMSTAR (чорні прямокутники) і подальшим лікуванням, яке утворює толерантність (білі прямокутники) вказані 3 UA 116105 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на осі X (Приклад 7). Докладний опис винаходу Метою даного винаходу є застосування інактивованих мікобактерій для приготування медичного препарату для попередження туберкульозу, де: - інактивовані мікобактерії періодично вводять орально, - інтервал між дозами не перевищує 5 днів, і - кількість доз, які вводяться, становить не менше 5. Інакше мета даного винаходу може бути сформульована, як інактивовані мікобактерії для застосування для запобігання туберкульозу, де: - мікобактерії періодично вводять орально, - інтервал між дозами не перевищує 5 днів, і - кількість доз, які вводяться, становить не менше 5. Автори даного винаходу розробили нове превентивне лікування туберкульозу, яке основане на введенні інактивованих мікобактерій, використовуючи схему лікування мультидозами із обмеженим часовим інтервалом між введеннями. Автори спостерігали, що вказане превентивне лікування, застосоване до інфікування M. tuberculosis (профілактична дія) або після інфікування (терапевтична дія), здатне запобігти розвитку туберкульозу шляхом затримання розвитку інфекції із латентного стану у активний туберкульоз. Згідно із вказаним лікуванням, періодичне оральне введення мертвих бацил, переважно у низьких дозах і із зниженими інтервалами часу між дозами, індукує створення толерантності або відповіді, яка утворює толерантність, яке несподівано має позитивний ефект по затриманню інфікування M. tuberculosis, тобто по затриманню переходу латентної інфекції у активну інфекцію. Автори дійсно спостерігали, що таке лікування, застосоване як до, так і після інфікування M. tuberculosis, запускає відповідь, яка утворює толерантність, що характеризується збільшенням процента регуляторних Т-клітин (Treg). Використання винаходу фокусується на неінфікованих індивідуумах і індивідуумах, інфікованих M. tuberculosis, у яких інфекція знаходиться у латентному стані. Вважається, що у випадку неінфікованих індивідуумів, превентивне лікування має профілактичну дію, у той час як у випадку індивідуумів, інфікованих M. tuberculosis, вважається, що воно має терапевтичну дію. Особливий аспект цього другого випадку, тобто превентивне лікування із терапевтичною дією (яке стосується інфікованих M. tuberculosis, у яких інфекція знаходиться у латентному стані), складається із тих індивідуумів, у яких заздалегідь була розвинена активна форма туберкульозу, і у яких вказана хвороба потім припинилася, наприклад, за допомогою лікування відповідною протитуберкульозною терапією, туберкульоз внаслідок цього повернувся назад у латентний інфекційний стан. Цей особливий випадок превентивного лікування розглядається як такий, що має терапевтичну протирецидивну дію. Внаслідок цього, у випадку превентивного лікування із протирецидивною дією, індивідуумів звичайно заздалегідь піддавали фармакологічному лікуванню протитуберкульозними препаратами. Ці протитуберкульозні препарати добре відомі фахівцеві у даній галузі техніки, основними протитуберкульозними препаратами є, наприклад, ізоніазид, етамбутол, піразинамід, рифампіцин, стрептоміцин; і ці антитуберкульозні препарати другої лінії, які застосовуються у випадку виникнення стійкості, наприклад, тіоаміди, (серед інших - протіонамід, етіонамід), аміноглікозиди (серед інших - амікацин, канаміцин), серед інших - циклосерин, рифабутин, рифапентин, флюороквінолони (моксифлоксацин, левофлоксацин, офлоксацин), PAS, кларитроміцин, клофазимід, лінезолід або тіоридазин або їх суміші. "Превентивне лікування" звичайно розуміють як лікування, яке дозволяє застерегти індивідуума від хвороби. У цьому значенні, у контексті винаходу, превентивне лікування є таким лікуванням, яке здатне запобігати розвитку активного туберкульозу за допомогою затримання переходу латентної інфекції в активну інфекцію. "Створення стійкості" звичайно розуміється як інтенсивна індукція стійкості за допомогою біологічних або хімічних речовин, де термін "стійкість" означає стан низької специфічної відповіді на біологічну або хімічну речовину. Таким чином, у контексті винаходу вираз "індукція відповіді створення стійкості" розуміють як спосіб, за допомогою якого стан відсутності відповіді на специфічний антиген індукується у імунній системі хазяїна, приводячи до пригнічення хвороби. Схеми лікування, яке утворює толерантність, були описані в сучасному рівні техніки у контексті інших хвороб, таких, як, наприклад, атеросклероз. George et al., Suppression of early 4 UA 116105 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 atherosclerosis in LDL-receptor deficient mice by oral tolerance with h2-glycoprotein I, Cardiovasc. res., 2004, 62, 603-609, описують використання β2-глікопротеїну I для індукції оральної толерантності і пригнічення раннього атеросклерозу, і Harats et al., Oral tolerance with heat shock protein 65 attenuates Mycobacterium tuberculosis-induced and high-fat-diet-driven atherosclerotic lesions, J. Am. Cardiol., 2002, 40, 1333-1338, описують використання білка 65 теплового шоку для індукції оральної толерантності до атеросклеротичних пошкоджень. Інактивовані мікобактерії Рід мікобактерій належить до сімейства Mycobacteriaceae і утворюється аеробними бацилами. Всі бацили, які належать до роду мікобактерій, є частиною об'єкту даного винаходу, наприклад, серед інших види M. abscessus, M. africanum, M. aurum, M. avium, M. avium paratuberculosis, M. avium silvaticum, M. avium hominissuis, M. bovis, M. bovis BCG, M. chelonae, M. fortuitum, M. gastry, M. goodi, M. gordonae, M. immunogenum, M. haemophilum, M. habana, M. kansasii, M.lentiflavum, M. leprae, M. lepromatosis, M. lufu, M. mageritense, M. malmoense, M. marinum, M. massiliense, M.microti, M. monacense, M. mucogenicum, M. neoaurum, M. peregrinum, M. phlei, M. scrofulaceum, M.smegmatis, M.terrae, M. triviale, M. tuberculosis, M. microti, M. ulcerans, M. vaccae і M. xenopi. Мікобактерії мають багато антигенів спільних із M. tuberculosis і є внаслідок цього придатними для застосування у даному винаході. Стаття Stanford et аl., Mycobacteria and their world, Int. J. Mycobacteriol., 2012, 3-12, описує класифікацію різних груп антигенів у мікобактеріях і як вони розподілені і співпадають у різних видів сімейства Mycobacteriaceae. Інактивовані мікобактерії, які є частиною даного винаходу, є переважно: мікобактеріями групи, яка називається комплекс Mycobacterium tuberculosis (MTB-C), Mycobacterium fortuitum і Mycobacterium kansasii. Іншими словами, інактивовані мікобактерії переважно вибирають із групи, яка складається із M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum і M. microti, M. Bovis BСG, M. fortuitum і M. kansasii. Інактивовані мікобактерії переважніше вибирають із групи, яка складається із M. tuberculosis, M. bovis, M. Bovis BСG, M. fortuitum і M. kansasii. Інактивовані мікобактерії, які також називають як мертві мікобактерії, маються на увазі як такі мікобактерії, які були піддані фізичній або хімічній обробці, яка трансформує живі мікобактерії у форму, яка не може реплікуватися. У рамках даного винаходу придатними методами для інактивації мікобактерій є, наприклад, обробка формальдегідом, обробка радіацією або обробка нагріванням. Мета даного винаходу, інактивовані мікобактерії, переважно інактивують за допомогою процесу нагрівання. Придатний спосіб інактивації мікобактерій шляхом нагрівання включає, наприклад, вирощування штаму мікобактерій у придатному культуральному середовищі, оскільки вони добре відомі фахівцеві в даній галузі техніки, серед інших, таких, як агар Міддлбрука 7H10 або 7H11, середовище Сотона або середовище Проскауера-Бека. Середовище звичайно 5 9 підтримують до досягнення концентрації, яка становить приблизно між 1×10 і 1×10 одиниць утворення колоній (CFUs) на мл. Культуру потім інактивують нагріванням. Культуру переважно нагрівають при температурі між 70 °C і 90 °C. Період нагрівання переважно становить від 30 хвилин до 3 годин. Крім того, за допомогою використання автоклава культуру переважно нагрівають при температурі в 121 °C протягом 20 хвилин. Запобігання туберкульозу Вираз "запобігання туберкульозу" стосується запобігання вияву активного туберкульозу за допомогою процесу затримання розвитку інфекції із латентного стану в активний туберкульоз. Вказане запобігання може проводитися у неінфікованих індивідуумів і також у індивідуумів, інфікованих M. Tuberculosis, у яких інфекція знаходиться в латентному стані, або тому, що хвороба ще не розвинулася, або тому, що активна хвороба вже була розвинена і пізніше згасла, наприклад, завдяки лікуванню протитуберкульозними ліками. Автори даного винаходу розробили превентивне лікування туберкульозу, яке запобігає розвитку латентної інфекції, таким чином, що розвиток твердого казеозного ураження в розріджене ураження запобігається, і вияв активного туберкульозу внаслідок цього запобігається. Автори даного винаходу використали експериментальну модель, основану на використанні C3HeB/FeJ мишей, у яких може бути стимульована патологія легенів після інфікування M. Tuberculosis, аналогічна тій, що розвивається у людей. Утворення казеозного некрозу, який може бути розріджений у відповідь на інфікування M. 5 UA 116105 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Tuberculosis, на відміну від того, який виникає в інших тваринних моделях, у яких не розвивається вказаний некроз, спостерігається у вказаних тварин, як описано в статті Harper et al., Mouse model of necrotic tuberculosis granulomas develops hypoxic lesions, J. Infect. Dis., 2012, 205, 595-601. У випадку внутрішньовенного інфікування великою дозою, розвиток некрозу і уражень у вказаних тварин такий, що він може викликати 100 % смертність приблизно через чотири тижні після інфікування, як описано в статті Sissons et al., Multigenic control of tuberculosis resistance: analysis of а QTL on mouse chromosome 7 and its synergism with sst1. Genes Immun., 2009, 10, 3746. Без наміру бути зв'язаними якою-небудь теорією, автори даного винаходу вважають, що превентивна дія лікування об'єктом даного винаходу відбувається завдяки оральному введенню частих періодичних доз мертвих бацил, переважно низьких доз, завдяки схемі лікування, яка може збільшувати толерантність у суб'єктів, створюючи відповідь у якій переважно індукуються регуляторні Т-клітини (Tregs). Вказані клітини зв'язані із трансформуючим фактором росту бета (TGF-beta), тобто, який утворює толерантність або Th3 імунна відповідь генерується насамперед, на відміну від звичайних систем вакцинації, при яких виникає у основному Th1 імунна відповідь. Автори цього винаходу несподівано виявили, що індукція толерантності ефективна для зупинки розвитку інфекції M. tuberculosis, тобто переходу латентної інфекції в активну інфекцію. Щоб викликати цю відповідь, яка утворює толерантність, інактивовані мікобактерії повинні вводитися періодично і зі зменшеними годиними інтервалами між кожним введенням, тобто не більше ніж 5 днів; переважно інтервал між дозами становить не більше 3 днів; і переважніше, інтервал між дозами становить не більше 2 днів. Лікування по створенню толерантності також вимагає повторюваного введення інактивованих мікобактерій, кількість доз, які вводяться, дорівнює не менше 5; переважно кількість доз, які вводяться, дорівнює не менше 7; переважніше кількість доз, які вводяться, дорівнює не менше 9 і ще переважніше кількість доз, які вводяться, дорівнює не менше 14. При застосуванні даного винаходу вводиться імунологічно ефективна кількість інактивованих мікобактерій. Відомо, що доза, призначена для застосування, залежить від віку і ваги індивідуума, якому вводять мікобактерії. 3 10 Придатні дози звичайно містять в межах між 10 і 10 інактивованих мікобактерій, 3 8 4 8 переважно між 10 і 10 і переважніше між 10 і 10 . Для демонстрації превентивної терапевтичної дії на розрідження казеозного ураження схеми дозувань, які утворюють толерантність, яка є частиною даного винаходу, C3HeB/FeJ миші, які використовуються в моделі, описаній вище, були піддані протоколу лікування, за яким було введено орально від 5 до 14 доз інактивованих мікобактерій із інтервалом між дозами, який становить від 1 до 3 днів. Використана мишача модель, моделює превентивну терапію туберкульозу або, коли лікування проводиться до інфікування, як описано у Прикладах 1 і 3-6, або, коли лікування починають після інфікування M. tuberculosis, як описано у Прикладах 1, 2 і 4-6, але вказане лікування проводиться на ранніх стадіях (до 15 днів після інфікування, коли у тварин вже є ураження, які проявляються, але ураження все ще не розвинулися до зрідження і подальших ознак хвороби); або альтернативно, як описано у прикладі 7, лікування застосовується після інфікування, коли у тварин проявилися ураження і ураження зріджувались, але вказані ураження повернулися у форму невеликих уражень, характерних для латентної інфекції. Основуючись на результатах, отриманих в Прикладах, зроблено висновок, що оральне застосування інактивованих мікобактерій за схемами, які створюють толерантності як до, так і після інфікування M. Tuberculosis, збільшує виживаність тварин, оскільки індукція хвороби, тобто перехід латентної інфекції в активну інфекцію затримується. Таким чином, вважається, що використання інактивованих мікобактерій згідно із даним винаходом є придатним для запобігання туберкульозу. Склади Згідно із метою даного винаходу інактивовані мікобактерії застосовують орально. Вказані мікобактерії можуть застосовуватися у формі будь-якого фармацевтичного препарату, придатного для орального застосування, як добре відомо фахівцям у даній галузі техніки. Для орального застосування придатні, наприклад, таблетки, капсули, розчини, суспензії, зависі, порошки, гранули або спреї. Мікобактерії переважно застосовують у формі капсул або таблеток. Фармацевтичні препарати звичайно містять інактивовані мікобактерії і не менше одного 6 UA 116105 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фармацевтичного наповнювача. Препарати готують відповідно до загальноприйнятих способів, добре відомих фахівцеві у даній галузі техніки таких, як ті, які знаходять у довідниках з фармацевтичних технологій, таких, th як книга Remington The science and practice of Pharmacy, 20 edition, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 2000 [ISBN: 0-683-306472]. Серед фармацевтично прийнятних наповнювачів, які можуть бути включені у фармацевтичний препарат, знаходяться, наприклад, речовини, які запобігають злипанню, такі, як колоїдний кремнезем, триосновний фосфат кальцію, силікат кальцію, силікат магнію, трисилікат магнію або тальк; розріджувачі такі, як безводна лактоза, моногідрат лактози, фосфат кальцію, безводний гідрофосфат кальцію, кальцій гідрофосфат дигідрат, сульфат кальцію, карбонат кальцію, карбоксиметилцелюлоза кальцію, мікрокристалічна целюлоза або порошок целюлози, ацетат целюлоза, декстрати, декстрини, декстроза, фруктоза, пальмітостеарат гліцерину, каолін, лактитол, карбонат магнію, оксид магнію, малтитол, мальтодекстрини, мальтоза, поліметакрилати, прежелатинізований крохмаль, хлорид натрію, крохмаль, сахароза; мастильні речовини такі, як стеарат магнію, стеарат кальцію, пальмітостеарат гліцерину, полоксамери, оксид магнію, бензоат натрію, колоїдний кремнезем, лаурил сульфат натрію, стеарил фумарат натрію, стеаринова кислота, тальк або бегенат гліцерину; суспендуючі речовини, такі, як ксантанова камедь, камедь ціамопсису, альгінова кислота, бентоніт, карбомери, карбоксиметилцелюлоза натрію або кальцію, гідроксіетил целюлоза, гідроксипропілцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза, гідроксипропіл альгінат, мікрокристалічна целюлоза або порошок целюлози, колоїдний безводний кремнезем, декстрини, желатини, каолін, алюмосілікат магнію, мальтитол, повідон, ефіри сорбіту або трагакант; зв'язувальні речовини, такі, як трисилікат магнію, целюлоза крохмаль, декстрин, декстроза, полідекстроза, мальтоза, мальтодекстрин, етил целюлоза, метил целюлоза, поліметакрилати, тальк, повідон, стеаринова кислота або сахароза; дезагрегуючі речовини, такі, як низько заміщена гідроксипропілцелюлоза, триосновний фосфат кальцію, карбоксиметилцелюлоза натрію або кальцію, кроскармелоза натрію, кросповідон або метилцелюлоза; покривні речовини, такі, як хітозан, дибутилфталат, дибутилсебакат, діетилфталат, диметилфталат, етилцелюлоза, гідроксіетилцелюлоза, гідроксипропілцелюлоза, гіпромелоза, мальтодекстран, поліметакрилати, фталат полівінілацетату або триетилцетрат; диспергуючі речовини, такі, як полоксамери або ефіри сорбітану; підсолоджувачі такі, як аспартам, манітол, сорбітол, сахарин натрію, цикламат натрію, сахароза, декстроза, фруктоза, глюкоза, інулін, ізомальтоза, лактитол, мальтоза, мальтол, манітол, сукралоза, триалоза, ксиліт або тауматин; смакові добавки і ароматизатори, і/або їх суміші. Більш повний перелік наповнювачів, також як і їх фізико-хімічні характеристики і назви комерційних продуктів, під якими вони продаються, може бути знайдений у підручнику R.C. th Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical exсipients, 4 edition, Pharmaceutical Press, London, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9]. Наступні приклади прагнуть проілюструвати винахід, хоча вони не повинні бути інтерпретовані як такі, що лімітують його. Приклад 1. Оральне лікування інактивованими бацилами M. tuberculosis, яке утворює толерантність, що застосовується до або після інфікування (профілактична або терапевтична дія) Клінічний штам M. tuberculosis (TOL-3) із колекції штамів Unitat de Tuberculosi Experimental of Institute Germans Trias i Pujol, вирощений у рідкому середовищі Проскауер-Бека до досягнення 7 експонентної фази росту і концентрації в 1,7×10 одиниць утворення колоній (CFUs) на мл, був використаний для приготування інактивованих мікобактерій. Культура була інактивована при нагріванні при 75 °C протягом 2 годин і потім заморожена при 80 °C. Надалі вона була розбавлена 50:50 у 10 % розчині сахарози, упакована і ліофілізована в посудинах в об'ємах 0,5 мл. Ці посудини були потім відтворені 3 мл 5 бідистильованої води, у вигляді розбавлення 1:1, яке еквівалентне 4,25×10 CFUs. У аналізах, 0,3 мл продукту були застосовані як при цьому розбавленні 1:1, так і при 5 розбавленні 1:10, 1:100 і 1:1000. Ці застосування відповідають декільком дозам в 4,25×10 , 4 3 2 4,25×10 , 4,25×10 і 4,25×10 CFUs, відповідно. Ефективність інактивованих мікобактерій була проаналізована у 6-8 тижневих жіночих особин мишей C3HeB/FeJ, позбавлених специфічних патогенів. Миші були розділені на три групи по 6 тварин у кожній, і кожна із груп була піддана наступному протоколу створення толерантності. 1) Контрольна Група: Неліковані. 2) Група 1 (доінфекційне лікування): Ліковані орально примусовим годуванням 5 дозами 7 UA 116105 C2 5 10 продукту, які містять інактивовані мікобактерії, що вводяться кожні 48 годин, починаючи за 10 днів до інфікування. У кожній дозі був введений об'єм в 0,3 мл, і було проаналізовано всього чотири розбавлення, тобто 1:1, 1:10, 1:100 і 1:1000 (Групи 1а, 1b, 1c і 1d, відповідно). 3) Група 2 (постінфекційне лікування): Ліковані орально примусовим годуванням 5 дозами продукту, які містять інактивовані мікобактерії, що вводяться кожні 48 годин, починаючи із 11 дня після інфікування. У кожній дозі був введений об'єм в 0,3 мл, і було проаналізовано всього чотири розбавлення, тобто 1:1, 1:10, 1:100 і 1:1000 (Групи 2а, 2b, 2c і 2d, відповідно). Для інфікування був використаний вірулентний штам Mycobacterium tuberculosis (H 37Rv Pasteur), вирощений у середовищі Проскауер-Бека до напівлогарифмічної фази росту і який зберігався до використання в аліквотах по 1 мл при температурі -70 °C. 4 Миші були інфіковані внутрішньовенно, шляхом введення інокуляту із 2×10 життєздатних бацил. Тварин обстежували і зважували щодня, згідно із способом, описаним детально в Таблиці 1, до того, як стани тварин вимагали їх умертвіння. 8 UA 116105 C2 Таблиця 1 Вага Зовнішній вигляд Спостеріга ння ознак болю Відповідь на подразники Обстеження тварини Нормальна (немає втрати ваги, тварина росте як при нормі) Втрата ваги 15 % Тварина не п'є воду або не їсть їжу Нормальний Хутро у поганому стані Хутро у поганому стані і/або наявність очних або носових виділень Ненормальна поза Відсутність ознак (немає калічення членів або дивні звуки не спостерігаються) Спостерігання калічення членів або дивних звуків Нормальна (не агресивна, не коматозна) Дуже агресивна або коматозна Оцінка 0 1 2 3 0 1 2 3 0 3 0 3 0-2: норма. 3: збільшення частоти застосування протоколу спостерігання до 2 раз/день. Якщо оцінка 3 отримана більше ніж в одному положенні, усі оцінки 3 стають оцінками 4. Якщо одна або більше оцінок досягає значення 4, тварину умертвляють. 5 10 15 20 25 30 Отримані результати зображені графічно на фігурах 1 і 2, які демонструють ріст виживаності тварин після інфікування для різних експериментальних груп. Час виживання, виражений у днях, представлено на осі X, у той час як процент тих, які вижили, представлений на осі Y. На Фігурі 1 Контрольну Групу (безперервна лінія) порівнюють із тваринами Групи 1 (переривчаста лінія), які були проліковані до інфікування. Графіки 1, 2, 3 і 4 стосуються тварин Груп 1а, 1b, 1c і 1d, відповідно, яким були введені різні кількості продукту згідно із розбавленнями 1:1, 1:10, 1:100 і 1:1000. На Фігурі 2, Контрольну Групу (безперервна лінія) порівнюють із тваринами Групи 2 (переривчаста лінія), які були проліковані після інфікування. Графіки 5, 6, 7 і 8 стосуються тварин Груп 2а, 2b, 2c і 2d, відповідно, яким були введені різні кількості продукту згідно із розбавленнями 1:1, 1:10, 1:100 і 1:1000. Для оцінки результату лікування на виживаність тварин криві виживаності були порівняні за допомогою двох способів: аналізу по Мантелю-Коксу (або логарифмічний ранговий критерій, LR t) і критерію Gehan-Breslow-Wilcoxon (GBW t). У першому способі, передбачається, що ризик (смерті/одиниця від часу) є постійним протягом всього експерименту, у той час як другий спосіб приймає більше у розрахунок смерті у перші декілька днів (більш ранні смерті). Якщо ризик є постійним, аналіз Мантеля-Кокса має вищу статистичну потужність, але, якщо це не так, і існує група, яка знаходиться у більшому ризику, ніж інша, то придатнішим є критерій Gehan-BreslowWilcoxon. Статистично значущі відмінності стосовно контрольної групи спостерігаються у всіх випадках (p