Виділений фрагмент днк, що кодує білок gp350 ebv або усічений варіант gp350 ebv, вектор, клітина-хазяїн, трансформована вектором, спосіб одержання білка gp350, гомогенний білок gp350 ebv, фармацевтична композиц

1 Выделенный фрагмент ДНК, кодирующий белок gp350 EBV или усеченный вариант др350 EBV, претерпевший делецию в трансмембранной области, что приводит к образованию секретируемого продукта, или делецию трансмембранной области и остального С-конца и/или делецию сигнального фрагмента, причем указанный фрагмент ДНК содержит мутацию одного или нескольких участков сплайсинга, что предотвращает образование мРНК-транскрипта др220 2 Фрагмент ДНК по п 1, отличающийся тем, что указанная мутация одного или нескольких участков сплайсинга представляет собой мутацию донорного участка сплайсинга 3 Фрагмент ДНК по п 1, отличающийся тем, что указанная мутация одного или нескольких участков сплайсинга представляет собой мутацию акцепторного участка сплайсинга 4 Фрагмент ДНК по п 1, отличающийся тем, что указанная мутация одного или нескольких участков сплайсинга представляет собой мутацию и донорного, и акцепторного участков сплайсинга 5 Фрагмент ДНК по п 4, отличающийся тем, что в нем, по крайней мере, один нативный нуклеотид, кодирующий серии в кодоне 501 последовательности, кодирующей белок gp350 EBV, заменен ненативным нуклеотидом, и в котором, по крайней мере, один нативный нуклеотид, кодирующий глицин в кодоне 698 указанной последовательности, заменен ненативным нуклеотидом 6 Фрагмент ДНК по п 1, отличающийся тем, что ДНК кодирует усеченный вариант gp350 EBV, претерпевший делецию, по крайней мере, 8 аминокислот в трансмембранной области, что приводит к образованию секретируемого продукта 7 Фрагмент ДНК по п 6, отличающийся тем, что указанная мутация одного или нескольких участков сплайсинга представляет собой мутацию донорного участка сплайсинга 8 Фрагмент ДНК по п 6, отличающийся тем, что указанная мутация одного или нескольких участков сплайсинга представляет собой мутацию акцепторного участка сплайсинга 9 Фрагмент ДНК по п 1, отличающийся тем, что указанный фрагмент кодирует фрагмент белка gp350 EBV, состоящий из (a) кодонов 19-862 аминокислот, (b) кодонов 1-862 аминокислот, (c) кодонов 19-862 и 882-907 аминокислот и (d) кодонов 1-862 и 882-907 аминокислот 10 Вектор, содержащий фрагмент ДНК, охарактеризованный в любом из пунктов 1, 3, 5, 6, 7, 8 или 9 11 Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п 10 12 Способ получения белка др350, предусматривающий культивирование клетки-хозяина, охарактеризованной в п 11, в подходящей культуральной среде и выделение указанного белка др350 из указанной клетки 13 Гомогенный белок др350 EBV, кодируемый фрагментом ДНК, претерпевшим делецию в участке, кодирующем трансмембранный домен, или в О го о 47403 участках, кодирующих трансмембранный домен и остальной С-конец, и содержащий нефункциональный сайт сплайсинга таким образом, что gp350 EBV экспрессируется в растворимой форме и в отсутствие др220 EBV 14 Белок др350 EBV по п 13, отличающийся тем, что в указанном белке делеция в трансмембранной области включает делецию от Sers6o до Alassi последовательности, представленной в п 5 15 Фармацевтическая композиция, содержащая гомогенный белок gp350 EBV, охарактеризованный в п 13, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем 16 Способ профилактического лечения связанного с EBV заболевания или состояния, предусматривающий введение пациенту фармацевтической композиции, охарактеризованной в п 15, в количестве, достаточном для стимуляции иммунного ответа у указанного пациента 17 Композиция, содержащая гомогенный др350 EBV, выделенный из культуральной среды клеткихозяина, которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду белок gp350 EBV, кодируемый фрагментом ДНК, претерпевшим делецию в участке, кодирующем трансмембранный домен, или в участках, кодирующих трансмембранный домен и остальной С-конец, и содержащий нефункциональный сайт сплайсинга таким образом, что gp350 EBV экспрессируется в растворимой форме и в отсутствие др220 EBV, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем 18 Способ профилактического лечения связанного с EBV заболевания или состояния, предусматривающий введение пациенту фармацевтической композиции, охарактеризованной в п 17, в количестве, достаточном для стимуляции иммунного ответа у указанного пациента Вирус Эпштейна-Барра (Epstem-Barr = EBV), член группы герпесвирусов, вызывает у людей инфекционный мононуклеоз Это заболевание поражает более чем 90% населения Аналитики здравоохранения оценивают потери, связанные с этим заболеванием в Соединенных Штатах, в 100 миллионов долларов ежегодно Этот вирус распространяется преимущественно капельным путем со слюной индивидуумов, распространяющих этот вирус Дети, инфицированные EBV, в большинстве случаев асимптотичны или у них очень слабые симптомы, тогда как у подростков или у взрослых при инфицировании развиваются типичные инфекционные мононуклеозы, характеризующиеся лихорадкой, фарингитами и аденопатией У людей, которые были инфицированы, анти-EBV антитела сохраняются в течение всей остальной жизни, и поэтому они имеют иммунитет к последующим инфекциям В настоящее время не существует коммерчески доступных EBV вакцин которые вызовут иммунную реакцию и выработают иммунитет Два из наиболее важных антигенных EBV протеинов являются гликопротеинами др350/300 и др220/200, которые образуют часть оболочки вирусной мембраны и позволяют вирусным частицам связываться с мишеневыми клетками человека и проникать в них за счет взаимодействия с протеином клеточных мембран, CD21 См Nemerow, J Virology 61 1416 (1987) Они были давно отмечены как кандидаты для субъединичных вакцин, но трудности в получении антигенно активного протеина, выделенного из природных источников, и низкие выходы гликопротеинов при получении их из рекомбинантных источников затруднят и попытки исследователей и разработку вакцин В литературе указано, что эти протеины имеют различные интервалы молекулярных весов (350 или 300 килодальтон /кД/ для одного из протеинов и 220 или 200 килодальтон для другого протеина) Здесь протеин др350 или 300 именуется как др350, а протеин 220 или 200 здесь обозначается как протеин др220 В целом оба эти протеина здесь обозначают как др350/220 протеин (протеины) Помимо своих инфекционных характеристик, было показано, что EBV трансформирует лимфоциты в быстро делящиеся клетки, и поэтому косвенным образом связан с различными лимфомами, включая лимфому Burkitts или оральную волосистую лейкоплакию EBV были также обнаружены в образцах тканей от индивидуумов с назофарингеальными опухолями По всему миру насчитывается порядка 80000 случаев рака носоглотки, и он превалирует у этнических китайцев Разработка живой, ослабленной вакцины для EBV была и остается серьезной проблемой Из-за потенциального онкогенного характера, связанного с EBV, исследователи возражали против использования подходов, связанных с живыми вакцинами Это изобретение позволяет преодолеть проблемы, связанные с живыми вакцинами, за счет создания способов и композиций для субъединичных вакцин, которые не требуют использования потенциально онкогенных живых вирусов Субъединичная вакцина представляет собой один или более из антигенных протеинов из вируса, Альтернативно сплайсированный, отдельный ген кодирует др350/220 протеины и приводит к созданию др350 и др220 мРНК транскриптов, причем неизвестны природные варианты сайтов сплайсинга гена др350/200 Генные продукты двух продуктов экспрессии представляют собой др350 и др220 протеины Открытая считывающая рамка для др350/220 ДНК последовательности составляет 2721 пару оснований (Ьр) Вся считывающая рамка кодирует 907 аминокислот др350 См патент США № 4707358, выданный Kieff (1987) Сплайсированный вариант считывающей рамки охватывает 2130 оснований и транслирует в др220 протеин последовательность 710 аминокислот Теоретический молекулярный вес др350 протеина и др220 протеина составляет 95 кД и 70 кД, соответственно Измеренные молекулярные 47403 веса экспрессированных gp350 протеина и др220 протеина варьируются, но составляют примерно 350 килодальтон и 220 килодальтон, соответственно Интенсивное гликозилирование протеинов ответственно за различия между предсказанным и реальным молекулярными весами В каждой из отдельных клеток оба протеина, др350 и др220, продуцируются в молярном отношении от около 6 1 до 1 1 Так, например, в клетках В95-8, которые устойчиво инфицированы EBV, это отношение, по-видимому, варьируется, но иногда достигает значений 6 1 См Miller, Proc Natl Acad Sci 69 383(1972) Аналогично, рекомбинантное получение этих гликопротеинов поэтому обычно приводит к смеси др350 и др220 протеинов До сих пор др350/220 протеины экспрессировали в клетки крысиного гипофиза, в клетки яичников китайского хомяка VERO, почек африканской зеленой обезьяны, а также в дрожжевые клетки См Whang, J Virol 61 1796 (1982), Motz, Gene 44 353 (1986) и Emmi Virology 166 387 (1988) Система экспрессии вируса бычьей папилломы была использована для получения др350/220 протеинов в мышиных фибробластных клетках См Madej, Vaccine 10 777 (1992) Лабораторные и вакцинные штаммы вакцинного вируса также были использованы для экспрессии др350/220 протеинов Модифицированные рекомбинантные варианты EBV gp350/220 ДНК и протеин известны специалистам Более конкретно, были сконструированы рекомбинантные усеченные конструкции др350/220 гена, не содержащие соединяющих с мембраной последовательностей Такие конструкции все еще продуцируют смесь двух др350 и др220, но делеция участка связывания с мембраной допускает секрецию протеина См Fmerty, J Gen Virology 73 449 (1992) и Madej J Vaccine 10 777 (1992) Кроме того, были также получены различные рекомбинантно полученные рестрикционные фрагменты и протеины слияния, содержащие различные др350/220 последовательности, и они были экспрессированы в Е coh См ЕР патентную публикацию 0173254, опубликованную 24 июля 1991 г Соответственно, исследования EBV, касающиеся др350/220 до настоящего времени были сфокусированы на получении эффективной экспрессии нативной др350/220 последовательности или на модифицированной последовательности, не содержащей трансмембранного домена, что приводило к получению смеси двух альтернативно сплайсированных вариантов нативного, или не содержащего трансмембранного домена протеина, или на получении последовательностей эпитопного фрагмента в р-галактозидазных протеинах слияния Известны частично очищенные препараты др350/220 См Fmerty, J Gen Virology 73 449 (1992) (рекомбинантно получены, частично очищены) Что касается нативного др350/220 протеина, то в большинстве случаев процесс очистки протеинов приводит к инактивированию антигенности протеина, что делает неприемлемым его использование в субъединичной вакцине Однако, высокой степени очистки препараты антигенно активного др350 протеина из нативных (т е не рекомбинантных) источников, все-таки были получены, как сообщалось в литературе См David, J Immunol Methods 108 231 (1988) Кроме того, вирус рекомбинантной вакцины, экспрессирующий др350/220 протеин, был использован для вакцинации хлопчатникового тамарина против индуцированной EBV лимфомы См J Med Virology 25 189 (1988), Mackett, EMBO J 4 3229 (1985) и Mackett, VACCINES 86, pp 293 (Lerner RA, Chanock RM, Brown F Eds 1986, Cold Spring Harbor Laboratory) Однако, до сих пор не была сконструирована вирусная др350/220 ДНК последовательность с тем, чтобы обеспечить экспрессию отдельно одного или другого сплайсированного варианта гена, что обеспечило бы продуцирование чистого др350 или др220 протеина Не были также сконструированы рекомбинантные или мутантные вирусы, которые экспрессировали бы тот или иной из др350 и др220 протеинов Обычно сплайсинговые сайты облегчают процессинг пре-мРНК молекул в мРНК В вирусе полиомы сайты сплайсинга необходимы для эффективного накопления последующих мРНК Изменение 3' и 5' сплайсинговых сайтов в транскриптах вируса полиомы снижает или полностью блокирует накопление мРНК См Treisman Nature 292 595 (1981) В вирусе SV40 иссекаемые интроны облегчают транспорт мРНК из ядер и мРНК стабилизацию в ядрах, и так как эти интрон/экзон соединяющие последовательности облегчают связывание мелких ядер, RNP частиц, считают, что пресплайсированная мРНК может оказаться не в состоянии нужным образом включаться в схему процессинга Было показано, что точечные мутации по сайтам сплайсинга экзон/интрон уменьшают расщепление экзон/интрон и могут нарушить пре-мРНК про-цессинг, ядерный транспорт и стабильность См Ryu, J Virology 63 4386 (1989) и Gross, Nature 286 634(1960) Поэтому до настоящего изобретения влияние модификации сайтов сплайсинга на функциональную экспрессию и антигенную активность протеинов, кодируемых EBV gp350/220 последовательностью, было совершенно неизвестно и непредсказуемо Дополнительная известная по данному вопросу литература включает следующее EBV биология и заболевание в общем плане приведены в обзоре Straus, Annal of Int Med 118 45 (1993) Описание EBV BLLFI открытой считывающей рамки приведено у Baer, Nature 310 207 (1984) Описание ДНК и аминокислотных последовательностей др350/220 вируса Эпштейн-Барра приведены в статье Beisel, J Virology 54 665 (1985) и Biggin, EMBO J 3 1083 (1984) и в патентах США № 4707358, выданных Kieff et al (1987) Сравнение ДНК последовательностей, кодирующих др350/220 в вирусах Эпштейн-Барра типов А и В раскрыто у Lee, Virology 195 578 (1993) Моноклональные антитела, которые демонстрируют нейтрализующую активность против др350/220 гликопротеина EBV, раскрыты у Thorley-Lawson, Proc Natl Acad Sci 77 5307 (1980) И, наконец, сайты сплайсинга для консенсусных последовательностей для донорных и акцепторных сайтов сплайсинга раскрыты у Mount, Nucleic Acids Res 10 459 (1982) В одном аспекте настоящего изобретения 47403 предложены нонсплайсинговые варианты EBV др350/220 ДНК последовательности ДНК последовательности настоящего изобретения могут включать выделенную ДНК последовательность, которая кодирует экспрессию гомогенного др350 протеина ДНК последовательность, кодирующая др350 протеин, характеризуется как последовательность, содержащая идентичную или практически идентичную нуклеотидной последовательности на фиг 1, где нативные нуклеотидные последовательности донорных и акцепторных сайтов сплайсинга заменены на ненативные нуклеотиды и их фрагменты ДНК последовательность может включать 5' и 3' не кодирующие последовательности, фланкирующие кодирующую последовательность и далее включать аминотерминальную сигнальную последовательность Фиг 1 иллюстрирует некодирующие последовательности и указывает конец предполагаемой сигнальной последовательности звездочкой Однако, очевидно, что ДНК последовательности настоящего изобретения могут не содержать некоторые или все из этих фланкирующих последовательностей или сигнальных последовательностей ДНК последовательности нон-сплайсинговых вариантов настоящего изобретения получают за счет введения мутаций в представленную на фиг 1 ДНК последовательность в донорных и акцепторных сплайсинговых сайтах гена, кодирующего др350/ 220/ Это исключает продуцирование др220 протеина, так что продуцируется только др350 протеин Соответственно, другой аспект изобретения включает гомогенные др350 протеины и способы получения протеинов за счет экспрессии нонсплайсинговых вариантов EBV др350/220 ДНК последовательности в клетках соответствующих прокариотных или эукариотных хозяев Что касается терминов, используемых в отношении др350 протеинов, гомогенность означает полное или практически полное отсутствие др220 протеина Мы отмечаем, что гомогенный др350 протеин, рекомбинантно полученный в клетках млекопитающих или насекомых, насколько нам известно, никогда не упоминался до сих пор в научной литературе В еще одном аспекте предложены гомогенные др350 протеины, содержащие дополнительные делеции, в секретируемом продукте Такие делеции включают либо удаление трансмембранного участка, либо удаление трансмембранного участка и остального С-конца др350 Такие дополнительно модифицированные ДНК последовательности и кодируемые ими протеины составляют еще один аспект изобретения Предложена также рекомбинантная ДНК молекула, содержащая векторную ДНК и ДНК последовательность, кодирующую гомогенный др350 протеин ДНК молекула обеспечивает др350 последовательность, оперативно связанную с подходящей регуляторной последовательностью, способной управлять репликацией и экспрессией гомогенного др350 в клетках выбранного хозяина Клетки хозяина, трансформированные такими ДНК молекулами, для использования при экспрессии рекомбинантных гомогенных др350, также предос 8 тавлены в этом изобретении ДНК молекулы и трансформированные клетки хозяев в настоящем изобретении используют в другом аспекте изобретения, в новом способе получения рекомбинантного гомогенного др350 протеина или его фрагментов В этом способе клеточную линию, трансформированную ДНК последовательностью, кодирующей гомогенный др350 протеин или его фрагмент (или описанную выше рекомбинантную молекулу ДНК), оперативно связанную с подходящей регуляторной или контролирующей экспрессию последовательностью, способной контролировать экспрессию протеина, культивируют в соответствующих условиях, обеспечивающих экспрессию рекомбинантной ДНК Затем экс-прессированные протеины собирают из клеток хозяина или культуральной среды с помощью обычных средств В качестве клеток хозяина в этом способе можно использовать ряд известных клеток, в настоящее время предпочтительны клетки млекопитающих и клетки насекомых ДНК последовательности и протеины настоящего изобретения можно использовать при получении терапевтических и иммуногенных соединений, содержащих EBV антигенные детерминанты Такие соединения находят применение в субъединичных вакцинах для профилактики, лечения и предотвращения таких заболеваний, связяанных с EBV, как мононуклеоз, лимфома Буркетта и карцинома носоглотки Соответственно, в еще одном аспекте настоящего изобретения представлены такие терапевтические и / или иммуногенные фармацевтические композиции для предотвращения и лечения таких связанных с EBV состояний и заболеваний у человека, как инфекционный мононуклеоз, лимфома Буркетта и карцинома носоглотки Такие терапевтические и/или иммуногенные фармацевтические композиции включают иммуногенно индуцирующее эффективное количество одного или более из гомогенных др350 протеинов настоящего изобретения в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, таким, как гидроксид алюминия, физиологический раствор или фосфатный буферированный физиологический раствор, как это известно специалистам Под "иммуногенно индуцирующим" подразумевают количество, которого достаточно для стимулирования у млекопитающего продуцирования антител к EBV В другом варианте, активный ингредиент можно вводить в форме содержащих липосомы агрегатов Для профилактического применения такие фармацевтические композиции могут быть выполнены в форме субъединичных вакцин для введения людям Пациентов можно вакцинировать дозой, достаточной для стимулирования образования у пациента антител, и повторно вакцинировать спустя шесть месяцев или год В следующем аспекте изобретения предложен способ лечения связанных с EBV заболеваний и состояний за счет введения пациенту, в частности человеку, иммуногенно индуцирующего терапевтически эффективного количества гомогенного др350 протеина в подходящем фармацевтическом носителе Еще одним способом изобретения яв 47403 ляется способ стимуляции иммунной реакции против EBV за счет введения пациенту иммуногенно индуцирующего эффективного количества гомогенного др350 протеина в подходящем фармацевтическом носителе Фиг 1 иллюстрирует ДНК и аминокислотную последовательность др350/220 (из Beisel, J Virology 54 665 (1985)) Указаны донорные и акцепторные сплайсинговые сайты Трансмембранный участок обозначен горизонтальными стрелками, а звездочкой (*) отмечен конец предположительной сигнальной последовательности Нумерация нуклеотидов представлена слева, нумерация аминокислот - справа Фиг 2 иллюстрирует конструирование др350 делеции и сайт-направленных мутантов Плазмидные карты, обозначенные как pMDTM и pMSTOP, представляют примеры нонсплайсинговых вариантов др350/220 настоящего изобретения На фиг2А линейная модель др350 протеина представлена примерно в масштабе с кодирующим клоном, BLLF1 (изображен внизу) На протеине указаны N-терминальная сигнальная последовательность (SS) и трансмембранный домен (ТМ), а на диаграмме гена изображены важные рестрикционные сайты др350 ген был клонирован в два сегмента, Hmdlll/Bfal BLSH1 фрагмент и BanT/HmdllT BLSH2 фрагмент SCYT создают, используя полимеразную цепную реакцию, начиная с указанного участка BLLF1 Фиг2В иллюстрирует схему клонирования для pDTM, pSTOP, pMDTM и pMSTOP (плазмиды не в масштабе) Подробности схемы клонирования приведены в примерах 1 и 2 На плазмидных картах отмечены соответствующие рестрикционные сайты, используемые векторы клонирования и др350 генные фрагменты Мутации сайтов сплайсинга в pMDTM и pMSTOP отмечены звездочками ФигЗ иллюстрирует результаты иммуноосаждения гомогенного др350 протеина из pMDTM клонов в анализе SDS-PAGE Позитивные контрольные клетки (GH3U19), секретирующие усеченную форму др350/220 протеина, негативные контрольные клетки (рЕЕ14) и некоторые pMDTM клоны метаболически помечены 35 S метионином в течение 5,5 часа, гомогенный др350 протеин был иммуноосажден из надосадочных жидкостей тканевых культур Для каждого типа клеток образцы надосадочных жидкостей тканевых культур (S) и осажденные gp350/220 (Ip) обрабатывали электрофоретически на 5% SDS-PAGE (электрофорез в поли-акриламидном геле) Слева представлены маркеры молекулярных весов Фиг 4 представляет результаты Норзернблоттинга протеина из pMDTM клонов, экспрессированных в СНО клетках, как указано в примере 3, 4 Раскрыты композиции и способы, включающие клонированные EBV ДНК последовательности, кодирующие нон-сплайсинговые варианты др350 протеина Как было указано, такие нонсплайсинговые варианты здесь обозначаются как гомогенные др350 протеины Обычно, если др350/220 ген экспрессируется в клетках млекопитающих, вырабатываются два генных продукта, др350 и др220, за счет РНК сплайсинга гена Настоящее изобретение дает возможность получать 10 только один генный продукт, др350 Настоящее изобретение включает удаление нескольких или всех РНК сплайсинговых сайтовых сигналов в др350 гене и экспрессию гена в клетки подходящего хозяина Мутации др350/220 гена вводят для предотвращения продуцирования 220 кД версии протеина, когда др350/220 экспрессируют в клетках млекопитающих В результате получают мРНК транскрипты, кодирующие только др350 Исключение др220 экспрессии за счет использования др350/220 нон-сплайсингового варианта др350/220 гена приводит к усиленному продуцированию др350 по сравнению с др220 Продуцирование др220 не существенно для продуцирования эффективной анти-EBV вакцины, так как др350 содержит все потенциально антигенные сайты, находящиеся надр220 Поэтому в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает ДНК последовательность, кодирующую полипептидную последовательность практически такую же, что и др350, за исключением того, что кодон донорного сплайсингового сайта, кодирующий аминокислоту 501, и кодон акцепторного сплайсингового сайта, кодирующий аминокислоту 698, были модифицированы за счет замены нативных нуклеотидов ненативными нуклеотидами Предпочтительно, нативные нуклеотиды заменять ненативными нуклеотидами таким образом, чтобы аминокислотные последовательности оставались такими же Так например, нативные нуклеотиды AAGT в донорном сплайсинговом сайте (нуклеотиды 1500 - 1504) и нативные нуклеотиды А и Т, фланкирующие GG акцепторный сплайсинговый сайт (нуклеотиды 2091 и 2094), заменяют нуклеотидами GTCA и Т и А, соответственно Соответственно, в результате такой замены в донорном сайте глутамин в положении аминокислоты 500 и серии в положении 501 остаются теми же Аналогично, в результате модификации в акцепторном сайте треонин в положении аминокислоты 697 и глицин в положении 698 остаются теми же Аналогично, замещения отличаются от тех, которые были приведены в качестве примера, могут быть легко осуществлены специалистами, как более подробно указано далее Поэтому в одном из аспектов настоящее изобретение включает гомогенные др350 протеины Гомогенные др350 протеины отличаются далее тем, что имеют аминокислотную последовательность, практически такую же, что представлена на фиг 1, с аминокислоты 1 до 907, с аминокислоты 1 до 862 или с аминокислоты 1 до 907, исключая аминокислоты 863 - 881, причем каждая может содержать или не содержать N-терминальную сигнальную последовательность из 18 аминокислот Кроме того, предложены аналоги гомогенных др350 протеинов и они включают мутанты, в которых существуют вариации в аминокислотных последовательностях, которые сохраняют агтигенную активность, и, предпочтительно, гомологичны на, по крайней мере, 80%, более предпочтительно 90% и еще более предпочтительно на 95% с соответствующим участком гомогенных др350 протеинов Примеры включают протеины и полипептиды с небольшими аминокислотными вариациями в 11 47403 12 аминокислотной последовательности, представпротеин или протеины охватывает генные проленной на фиг 1, в частности, с заменами консердукты нон-сплайсинговых вариантов, необязавативных аминокислот» Консервативными заметельно содержащих дополнительные делеции или нами являются те, которые имеют место внутри мутации, такие, как С-терминальные делеции и / семейства аминокислот, которые родственны по или трансмембранные модификации, также описвоим боковым цепям Генетически кодируемые сываемые здесь Термин "др220 протеин" отноаминокислоты обычно делятся на 4 семейства (1) сится к альтернативно сплайсированному кислотные = аспартат, глутамат, (2) основные = др350/220 продукту с молекулярным весом прилизин, аргинин, гистидин, (3) неполярные = аламерно 220 кДс Сайты сплайсинга в др350/220 геннин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фениланом продукте были определены за счет сравнения ланин, метионин, триптофан, и (4) незаряженные др350/220 гена с консенсусными донорными и полярные = глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, акцепторными сплайсинговыми последовательносерии, треонин, тирозин Фенилаланин, триптофан стями, основанными на других генах, преимущеи тирозин иногда классифицируют как ароматичественно из эука-риотных организмов Консенсусские аминокислоты Так например, разумно предные последовательности выявленные Mount, положить, что отдельная замена лейцина или Nucleic Acids Res 10 459 (1982) при изучении сайаналогичное консервативное замещение аминотов сплайсинга в других генах, имеют вид кислот структурно родственными аминокислотами А А Донор: ' A G / G * T * ~ A G T не окажет значительного влияния на антигенную С G активность или функциональность т с А к ц е п т о р : — Ы ~~ A*G*/Q Настоящее изобретение предлагает преимуС Т щество более простого выделения др350 Так как Звездочки у оснований сверху обозначадр350 и др220 отличаются сходными биохимичеют основания, которые появляются в 100% всех скими свойствами, др220 часто выделяется сосайтов сплайсинга (высоко консервативны) Повместно с др350 при очистке препаратов Клеточложения с двумя основаниями или одним основаная экспрессия только нон-сплайсингового нием представляют консервативные положения варианта др350/220 гена упрощает выделение Знак / указывает реальный сайт сплайсинга протеина Это снижает стоимость получения В др350/220 гене донорныи сайт сплайсинга др350 Настоящее изобретение также делает борасположен после нуклеотида 1051, а акцепторлее простым получение биохимических характеный сайт сплайсинга после нуклеотида 2092, как ристик исходного материала для выделения видно из ДНК последовательности (Biggin EMBO др350 Благодаря наличию только одного вида J 3 1083 (1984)) гена gp350/220 (Используемая анализ содержания протеина и анализ аминокисздесь нумерация и нумерация на фиг 1 соответстлотной последовательности можно осуществлять вует нумерации у Biggin) Сайт сплайсинга распобез учета присутствия второго вида ложен в соответствующем участке гена в штамме Настоящее изобретение дополнительно предEBV типа В (донорныи сплаисинговыи сайт после лагает преимущество усиленного продуцирования А-1501 и акцепторный сплаисинговыи сайт после др350 протеина Предотвращение сплайсинга G2029) Настоящее изобретение охватывает комподр350 гена смещает продуцирование клеткой двух зиции, полученные с использованием сайтов продуктов (др350 и др220) на продуцирование сплайсинга либо А, либо В штаммов или других только др350 В некоторых клетках, как было оцеEBV штаммов для получения отдельного вида нено, концентрации др220 составляют 30 - 100% мРНК из др350/220 гена ДНК последовательность от др350 концентрации типа А из вируса из штамма В95-8 была использоПри исключении сплайсинга гена продуцирована в примерах, хотя в той же степени можно вание др350 повышается за счет отсутствия происпользовать ДНК последовательность штамма дуцирования др22 типа В, так как транслированные генные продукты ДНК последовательность др350/220 гена опиштаммов типа А и В идентичны В В штамме отсана Beisel, J Virology 54 665 (1985) и Biggin, сутствуют аминокислоты 507 - 520 и 570 - 576 EMBO J 3 1083 (1984) и представлена на фиг 1 Штамм типа А используют благодаря тому, что он Ген представляет считывающую рамку из 2721 содержит все возможные др350 антигенные сайоснований, кодирующую 907 аминокислот и опреты В другом варианте можно использовать EBV деляющий продукт первичной трансляции около др350/220, содержащий штамм-специфические 95 кД Различие между предсказанным и реальпоследовательности в соответствии с имеющиминым значениями связано с интенсивным гликозися здесь указаниями, что будут продуцироваться лированием протеина 591 основание (кодируют EBV штамм-специфические гомогенные др350 197 аминокислот) удалены в результате сплайсинпротеины, обладающие иммуногенными свойстга для исключения продуцирования др22 Кажувами, специфичными для конкретного штамма, и щийся молекулярный вес др350/220 генного пропоэтому пригодные для использования в иммунодукта может также меняться в зависимости от генных и / или терапевтических композициях для типа используемой измерительной системы, утипредотвращения или лечения заболеваний, свялизации сайтов гликозилирования и различных занных со штамм-специфическими EBV В таблитипов клеток, различий в посттрансляционном це 1 представлены дикого типа нуклеотидные и процессинге или селективной генной мутации аминокислотные последовательности для доИзмеряемые величины варьируются для продукнорного и акцепторного сайтов сплайсинга тов различных вариантов нон-сплайсинговых сайтов др350/220 гена, но термин "гомогенный др350 Чтобы предотвратить РНК сплайсинг п 14 13 47403 gp350/220 гена, в последовательность нуклеиновых кислот др350/220 гена вводят мутации для їабяіща 1 замены соответствующих пар оснований сайта Акцептор Донор сплайсинга РНК Для придания нефункциональноДикого типа последовав ель носта сти сайту сплайсинга, предпочтительно, по крайСплайсинг Сплайсинг ней мере, одно из оснований, выбранных из двух АСА G/GT СЙА A/GT fhr Gly Glu Sersoi высоко консервативных оснований, ограничиваюі і Консервативные изменения І Ь щих донорный сайт или акцепторный сайт, следущданокислоз! ет заменить неконсервативными основаниями, Ala S e r ksn Ma более предпочтительно, по крайней мере, два Gly T h r Asp Gly высоко консервативных основания следует мутиSer Gin Thr ровать в неконсервативные основания Другие TCG TCT ex.: GAC ЙСЙ. консервативные основания, на расстоянии более Дар Thrsoi S e r Ser«g двух оснований от сайта сплайсинга, также можно заменить неконсервативными основаниями сайта Хотя один из аспектов настоящего изосплайсинга для дальнейшего ухудшения распобретения включает неспецифический вариант знавания сайта сплайсинга Как донорный, так и др350/220, могут оказаться желательными и доакцепторный сайты можно изменить, чтобы наруполнительные мутации др350/220 кодирующей шить механизм сплайсинга Предпочтительно, последовательности Для получения растворимых чтобы как донор, так и акцептор содержали, по гомогенных др350/220 протеинов ("растворимые крайней мере, по одному изменению в каждом, в протеины" либо свободны в растворе, либо ассоодном из четырех высоко консервативных полоциированы с мембраной, но не интегрированы с жений оснований сайта сплайсинга, и более предмембраной), например, чтобы избежать проблем почтительно, по крайней мере, по два изменения в клеточной токсичности, возникающей при экспресдвух из четырех высоко консервативных положесии полной длины др350 в качестве интегрального ний оснований сайта сплайсинга Если один из мембранного протеина, соединяющий с мембрасайтов сплайсинга не может быть подвергнут муной участок (известный также как трансмембрантации из-за желания сохранить дикого типа аминый участок) др350 модифицируют за счет деленокислотную последовательность, тогда предпочции всей или части его кодирующей ДНК тительно вводить, по крайней мере, две мутации в последовательности Соединяющий с мембраной другой сайт сплайсинга участок др350/220 включает аминокислоты 861 (метионин) до 881 (аланин) См Beisel, J Virology Мутации по др350/220 сайтам сплайсинга мо54 665 (1985) Предпочтительно, чтобы, по крайгут вводить изменения в аминокислотную посленей мере, 8 аминокислот трансмембранного учадовательность экспрессируемого впоследствии стка были подвергнуты делеции, более предпочдр350 протеина Предпочтительно, чтобы такие тительно, чтобы были подвергнуты делеции 12 изменения были бы замещениями консервативаминокислот, и наиболее предпочтительно, чтобы ных аминокислот Консервативные замещения в были подвергнуты делеции от 12 до 18 аминокисаминокислотной последовательности, в противолот Соответственно, в другом аспекте в настояположность неконсервативным изменениям в щем изобретении предложены нон-сплайсинговые аминокислотной последовательности, помогут варианты др350/220 ДНК и/или др350 гомогенные сохранить антигенные сайты Изменения консерпротеины, которые дополнительно содержат, по вативных амнокислот можно осуществлять до тех крайней мере, одну делецию в трансмембранном пор, пока изменение основания (или изменения участке др350/220 ДНК и/или др350 гомогенном оснований) не приведут к подходящим измененипротеине, что приводит к экспрессии растворимоям в инвариантных донорных / акцепторных осного гомогенного др350 протеина ваниях Так например, Gly может заменить Sersoi в донорном сплайсинговом сайте, используя любой Помимо делеции всего или части трансмемGly-специфический кодон отличный от GGU (исбранного домена нон-сплайсингового др350/220 пользование GGU сохраняет G нуклеотид и не варианта, можно также подвергнуть делеции цеприведет к желательной замене GT в сигнале ликом или частично, как здесь описано, Ссплайсинга) Аналогично, в акцепторном сплайтерминальную последовательность, следующую синговом сайте замена Gly698 на Ala будет консерпосле трансмембранного домена, включающую вативным изменением, но так как все Ala кодоны аминокислоты 881 - 907, в соответствии с настояначинаются с высоко консервативного G нуклеощим изобретением Таким образом, в еще одном тида, это не может привести к нужной замене Хоаспекте настоящее изобретение включает нонтя пролин также может быть изменением консерсплайсинговые варианты др350/220 ДНК и/или вативной аминокислоты, пролин не следует гомогенный протеин, дополнительно модифицииспользовать для замены дикого типа аминокисрованные за счет делеции всей или части кодилоты, так как это приведет к модификации третичрующей ДНК, и / или аминокислотной последованой структуры протеина, и за счет этого замаскительности, содержащей трансмембранный участок рует один или более из др350 антигенных сайтов др350/220 и даже дополнительно модифицироВ таблице 1 представлены приемлемые консерваванной за счет делеции остальной Стивные аминокислотные замещения в дикого типа терминальной ДНК и/или аминокислотной послепоследовательностях Внизу таблицы 1 представдовательности др350/220 лен пример мутации с консервативными изменеСоответственно, другой аспект настоящего ниями аминокислот изобретения включает нон-сплайсинговые вариen 8 16 15 47403 анты ДНК последовательностей, кодирующих гоEBV gp350, содержащие или не содержащие помогенные др350 протеины настоящего изобретеследовательности, кодирующие С-концы и / или ния участок, соединяющий с мембраной pBR322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетраТакие ДНК последовательности включают циклину, которые можно использовать в качестве ДНК последовательность, представленную на маркеров См Bolivar, Gene 2 95 (1977) Обычно фиг 1, кодирующую аминокислоты 1 - 907, и далее используемые последовательности контроля эксвключают нуклеотидные замещения, о которых прессии, то есть промоторы для инициирования шла речь, для удаления донорных и акцепторных транскрипции и необязательно оператор или энсайтов сплайсинга Такие ДНК последовательнохансер, включают бета-лактамазную и Іас промости необязательно включают усеченные ДНК поторные системы (см Chang, Nature 198 1056 следовательности, в которых нуклеотиды, коди(1977)), триптофано-вую промоторную систему рующие целиком или часть трансмембранного (см Goeddel, Nucleic Acids Res 8 4057 (1980)) и домена и С-конца, включающие аминокислоты 861 лямбда-производный PL промотор и N-генный - 907, подвергаются делеции, и варианты делерибосомный сайт связывания (см Shimatake, ции, в которых нуклеотиды, кодирующие целиком Nature 292 128 (1981)) Однако, можно использоили часть трансмембранного домена, включающевать любую доступную промоторную систему или го аминокислоты 861 - 881, подвергаются делесистему контроля за экспрессией, если только она ции ДНК последовательности настоящего изосовместима с клетками прокариотного хозяина бретения, кодирующие гомогенные др350 Другие примеры клеток хозяев, плазмид и вектопротеины, могут также включать ДНК, способные к ров экспрессии раскрыты в патенте США, выдангибридизации в условиях соответствующей жестном Itakura (1982) под № 4356270, 4431739 выкости, или которые могут быть способны к гибриданном Riggs (1984) и 440859, выданном Rutter дизации в таких условиях, но без разрушения ге(1984) нетического кода, для выделения ДНК последовательности, представленной на фиг 1 В качестве клеток-хозяев можно также исСоответственно, ДНК последовательности напользовать клетки насекомых, используя экспресстоящего изобретения могут содержать модифисию клеток насекомых В случае экспрессии в кации в не кодирующих последовательностях, клетках насекомых, обычно компоненты системы сигнальные последовательности или кодирующие экспрессии включают вектор переноса, обычно последовательности, на основе аллельных варибактериальную плазмиду, которая содержит и антов или преднамеренных модификаций фрагмент бакуловирусного генома, и удобный рестрикционный сайт для встраивания гетеролоЭти нон-сплайсинговые варианты др350/220 гичных генов или генов, которые нужно экспрессиДНК последовательностей, как здесь раскрыто, ровать, дикого типа бакуловирусы с последоваможно сконструировать, используя хорошо изтельностью, гомологичной бакуловирусвестные специалистам способы Модифицированспецифичному фрагменту в векторе переноса (это ные ДНК последовательности настоящего изобрепозволяет обеспечить гомологичную рекомбинатения можно экспрессировать рекомбинантно, цию гетерологичного гена в бакуловирусный геиспользуя известные способы для получения гоном), и соответствующие клетки насекомогомогенных др350 протеинов настоящего изобретехозяина и ростовую среду ния Такие рекомбинантные протеины можно выделить и включить в фармацевтические В настоящее время наиболее часто исполькомпозиции для профилактического лечения и зуемым вектором переноса для встраивания чупредотвращения заболеваний, связанных с EBV жеродных генов в AcNPV является рАс373 Было также сконструировано множество других вектоНон-сплайсинговые варианты др350/220 ДНК ров/ известных специалистам Они включают, нанастоящего изобретения можно экспрессировать пример, pVL985 (который изменяет полиэдринорекомбинантно в различные типы клеток, испольвый стартовый кодон с ATG на АТТ, и который зуя соответствующие системы контроля за эксвводит BamHI сайт клонирования на 32 пары оспрессией, которые известны специалистам Поднований в прямом направлении от АТТ, см ходящие клетки, известные и доступные Luckow and Summers, Virology 17 31 (1989) специалистам, включают (но не ограничиваются ими) такие дрожжевые клетки, как Saccharomyces Плазмида обычно содержит также полиэдриcerevisiae, такие бактериальные клетки, как Е coh новый сигнал по-лиаденилирования (Miller et al и Bacillus subtihs, и такие клетки млекопитающих, (1988) Ann Rev Microbiol , 42 177) и прокариоткак GH3, СНО, NSO, MDCK и С-127 клетки Вектоный ген устойчивости к ампициллину (amp) и исры, которые используют с этими типами клеток, точник репликации для отбора и размножения в Е выбирают на основе их совместимости с типом coh клеток и используемой системой векторного конБакуловирусные векторы переноса обычно троля Клетки и векторы, которые обеспечивают содержат бакуло-вирусный промотор Бакуловиэкспрессию секретированных продуктов др350/220 русный промотор представляет собой любую ДНК гена, являются предпочтительными Так наприпоследовательность, способную связывать бакумер, Е coh трансформируют, используя производлови-русную РНК полимеразу и инициировать в ные pBR322, которая была модифицирована с прямом направлении (5' до 3') транскрипцию кодииспользованием обычной методики так, чтобы она рующей последовательности (то есть структурносодержала ДНК последовательности для экспресго гена) в мРНК Промотор должен содержать учасии целевого протеина, в этом случае нонсток инициирования транскрипции, который сплайсинговые вариантные последовательности обычно расположен проксимально по отношению 18 17 47403 к 5' концу кодирующей последовательности Этот энзимом (энзимами) в стандартных условиях, в участок инициирования транскрипции обычно частности в тех, которые обычно указываются включает сайт связывания с РНК полимеразой и изготовителями рестрикционных энзимов с Для сайт инициирования транскрипции Бакуловирусразделения по размерам расщепленных фрагменный вектор переноса может также содержать втотов можно использовать электрофорез на полиакрой домен, называемый энхансером, который, риламидном или агарозном геле, используя станесли присутствует, обычно расположен дистально дартные методики и затуплять концы фрагментов, по отношению к структурному гену Экспрессия за счет обработки фрагментом Кленова Е coh может быть либо регулируемой, либо конструкполимеразы 1 в присутствии четырех деоксинуктивной Для технологии экспрессии в клетках налеотидныхтрифосфатов Обработка S1 нуклеазой секомых см ЕР патентную публикацию 155476 гидро-лизует любые одноцепочечные участки Синтетические олиго-нуклеотиды можно получить, В качестве клеток-хозяев можно также исиспользуя, например, диэтилфосфо-амидитный пользовать дрожжи, например, Saccharomyces способ, известный специалистам См патент США cervisiae Можно при этом использовать различ№ 4415732 (1983) Лигирование можно осущестные штаммы Аналогично, известны плазмидные вить, используя Т4 ДНК лигазу в стандартных усвекторы, пригодные для экспрессии в дрожжи такловиях и температурах, и правильность лигироваже, как промоторы и системы контроля за эксния подтвердить, трансформируя Е coh или COS прессией См , например, Myanohara, Proc Natl клетки лигирующей смесью Удачные трансфорAcad Sci, 80 1 (1983) (PHO5 промотор), ЕР паманты отбирают по устойчивости к ампициллину, тентную публикацию 012873 (лидерные последотетрациклину или другим антибиотикам, или исвательности), Kurtz, Мої Cell Biol 6 142 (1986), пользуя другие известные специалистам маркеры Ito, J Bactenol 153 163 (1983) и Hmnen, Proc Natl Acad Sci 75 1929 (1979) (процедуры трансТакие рекомбинантные ДНК методики полноформации и подходящие векторы) стью раскрыты в соответствующей литературе См Естественно, можно использовать эукариотные клетки из многоклеточных организмов в качеSambrook, MOLECULAR CLONING A стве клеток-хозяев для экспрессии генов, кодиLABORATORY MANUAL, 2D ED, (1989), DNA рующих протеины и полипептиды, CLONING, Vol 1 and 11 (DN Glover ed 1985), представляющие интерес Подходящие клеточные OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (MG Gait ed линии хозяев включают VERO и HeLa клетки, 1984), NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (BD Hames клетки яичника китайского хомяка (СНО) Векторы ed 1984), TRANSCRIPTION AND TRANSLATION экспрессии, совместимые с такими клетками, так(BD Hames 1984), ANIMAL CELL CULTURE (Rl же доступны, и обычно включают промоторы и Freshney ed 1986), В Perbal, A PRACTICAL GUIDE последовательности контроля за экспрессиTO MOLECULAR CLONING (1984), GENE ей.такие, как например, ранние и поздние промоTRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS торы из SV40 (см Fiers, Nature 273 113 (1978)) и (JH Miller ed 1987 Cold Spring Harbor Laboratory), промоторы из вируса полиомы, аденовируса 2, Scopes PROTEIN PURIFICATION PRINCIPLES вируса бычьей папилломы или вируса птичьей AND PRACTICE, 2nd ed, (1987 Spnnger-Verlag NY) саркомы Примеры клеток-хозяев, промоторов, and HANDBOOK OF EXPERIMENTAL селектируемых маркеров и методики также расIMMUNOLOGY Vols 1 -1V (DM Weired 1986) крыты в патентах США 5122469, выданном Mather Все указанные публикации включены сюда со (1992), 4399216, выданном Axel (1983), 4634665, ссылками выданном Axel (1987), 4713339, выданном Соответственно, в следующем аспекте изоLevmson (1987), 4656134, выданном Rmgold бретение включает векторы, содержащие нон(1987), 4822736, выданном Kellems (1989) и сплайсинговые варианты др350/220 ДНК последо4874702, выданном Fiers (1989) вательностей и клетки-хозяев, и далее включает способ получения нон-сплайсингового варианта Трансформацию подходящих клеток-хозяев др350/220 протеина за счет культивирования клеосуществляют, используя стандартные методики, ток указанного хозяина, содержащих вектор, котосоответствующие конкретным клеткам, такие, как рый несет нон-сплайсинговый вариант др350/220 СаСЬ обработка для прокариотов, как указано в ДНК последовательности оперативно связанный с статье Cohen Proc Natl Acad Sci 69 2110 (1972) и последовательностью, контролирующей экспресСаРСч осаждение для клеток млекопитающих, как сию в условиях культивирования, которые обеспераскрыто у Graham, Virology 52 546 (1978) чивают экспрессию гомогенного др350 протеина Трансформацию дрожжей можно осуществить, как описано у Hsiao, Proc Natl Acad Sci 76 3829 Экспрессированный гомогенный др350 выде(1979) или как описано у Klebe, Gene 25 333 ляют из клеток и составляющих культуральной (1983) Конструирование подходящих векторов, среды, используя такие обычные методики очистсодержащих нон-сплайсинговые варианты др350 ки гликопротеинов, как ультрафильтрацию, элекпоследовательности (с дополнительными модитрофорез в свободном потоке, гельфикациями (или без них), раскрытыми здесь и фильтрационную хроматографию, афинную хроприводящими к делеции С-конца и / или связыматографию, SDS-PAGE, дифференциальное вающего с мембраной участка) осуществляют, NH4SO4 осаждение, пектиновые колонки, ионообиспользуя обычные методики лигирования и рестменные колонки и гидрофобные колонки (но не рикции, хорошо теперь известные специалистам ограничиваясь имиї), хорошо известные специаСайт-специфическое ДНК расщепление осущестлистам Небольшие количества препаратов др350 вляют, обрабатывая подходящим рестрикционным наиболее легко выделять, используя SDS-PAGE 20 19 47403 или пектиновые афинные колонки и такие неи трансмембранного участка до С-конца для созбольшие количества препаратов для использовадания pDTM и pSTOP ния в экспериментах по вакцинации, или экспериГен др350/220 из EBV В95-8штамма (Miller et ментах по иммунной реакции наиболее легко al, 1972) доступен в BamHI библиотеке, как открыочищать, используя жидкостную хроматографию тая считывающая рамка под названием BLLF1 Для крупномасштабного производства коммерче(Baer, Nature, 310 207, 1984) Для создания нужной ски значимых количеств др350 для использования конструкции (см представленную на фиг2В диав вакцинных композициях предпочтительны сочеграмму) др350/220 ген клонируют в две части 1) 1 тания ультрафильтрации, гель-фильтрации, ионBLSH1, 2 3kb Hmdlll/Bfal 3 фрагмент и 2) BLSH2, 1 ного обмена и хроматографии гидрофобных взаи337bp Banl/ Hmdlll 5 фрагмент (фиг2А), Эти модействий фрагменты клонируют в Staging векторы с тем, чтобы можно было осуществить делеции СОчищенные гомогенные др350 протеины натерминальных цитоплазмических и / или трансстоящего изобретения можно использовать в темембрано-кодирующих доменов Так как Bfal сайт рапевтических и / или иммуногенных композициях находится у 5' конца участка, кодирующего др350 для предотвращения и лечения состояний, святрансмембранный (ТМ) домен, его используют занных с EBV, и таких заболеваний, как инфекцидля конструирования делеции ТМ домена и делеонный мононуклеоз, лимфома Burkett и карцинома ции ТМ домена со вместно с делециями приленосоглотки Такие фармацевтические композиции гающего С-конца Используя Bfal, оказывается включают иммуногенно-индуцирующее количество возможным осуществлять делеции, оставляя одного или более из гомогенных др350 протеинов только две аминокислоты ТМ участка (таблица 2) настоящего изобретения в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, например, такой 1 Конструирование pDTM из pSTG1 и pSTG3 системой, представляющей адьювант / антиген, Плазмида pDTM состоит из последовательнокак квасцы Можно использовать и такие другие сти др350/220 нуклеиновых кислот, в которой отсистемы, представляющие адьювант/антиген, как сутствует весь ТМ кодирующий участок Эту конMF59 (Chiron Corp), QS-21 (Cambridge Biotech струкцию создают, используя два Staging вектора Corp), 3-DMPL (З-Деацил-монофосфорил липид А pSTG1 и pSTG3 PCR продукт из 450bp, SYCT, 3-Deacyl-Monophosphoryl Lipid A) (Ribi - Immune который вводит Bfal сайт в 3' конец ТМ участка, Chem Research, Inc), клинической степени чистополучают, используя BLLF1 клона мишеневую ты адьювант Фреунда (IFA), фузогенные липосопоследовательность (фиг 2) мы, водорастворимые полимеры или Iscoms (имВ качестве PCR праймеров используют слемуно-стимулирующие комплексы) Другие дующее примеры фармацевтически приемлемых носитеBfal лей или растворов включают гидроксид алюминия, физиологический раствор или фосфатный ПраЙЖф 1: GG АТС СТА GAC TGC GCC ТТТ AGG CGT А буферированный физиологический раствор Эти BLLF1: ... GAC 1GC GCC ТТТ AGG CGT A.. композиции можно вводить системно, предпочтий.А.. ... Asp Cys Ala Phe Arg Arg ... тельно, подкожно или внутримышечно в форме f Конец ТМ участка приемлемых растворов для подкожного или внутримышечного введения Инокуляцию можно также ПраЙмер 2: GGA ТСС ТСТ GTT ССТ ХСТ GCT CCA GTG осуществить за счет нанесения царапин на поBLLfl: ... ... TCI GTT ССТ ТСТ GCT CCA GTG верхность или за счет инокуляции в полости тела Bfal сайт праймера 1 используют для клониПриготовление таких растворов, обладающих за рования Bfal / Xmal фрагмента SCYT в pSTG1 счет подбора рН изотоничностью, стабильностью Праймер 2 соответствует участку вне др350/220 и т д , известно специалистам Дозовый режим открытой считывающей рамки с 3' стороны гена определяют лечащие врачи с учетом таких фактоSCYT PCR фрагмент вырезают за счет Bfal и Xmal ров, как физическое состояние, вес, пол, питание, для получения фрагмента в 136 пар оснований, серьезность состояния, время введения и других который клонируют в рМТП вектор (Spaete and клинических факторов, которые могут повлиять на Mocarski, 1985) наряду со вторым фрагментом, эффект лекарства Примеры доз составляют инBLSH1 Hmdlll/Bfal фрагментом, для создания тервал от около 1мкг до около ЮООмкг протеина pSTG1 Секвенирование по Bfal сайту показывает, что был делетирован весь ТМ аминокислотный В практике способа лечения настоящего изокодирующий участок за исключением аминов кибретения имму-нологически-индуцирующее эфслот Met и Leu (см табл 2) Третий BLLF1 фрагфективное количество гомогенного др350 протеимент, BLSH2, клонируют в рМТ11 для создания на вводят пациенту, нуждающемуся в pSTG3 Banl/Xbal олигонуклеотидный линкер из 16 терапевтическом или профилактическом лечении пар оснований вне др350/220 гена, кодирующей Иммуногенно-индуцирующее эффективное колипоследовательности, используют для клонировачество композиции настоящего изобретения сония BLSH2 Banl/Hmdlll фрагмента в pSTG3 2,4 ставляет величину в интервале от около 1мкг до Hmdlll/Xmal pSTGI фрагмент клонируют в рЕЕ14 около 1мг на вводимую дозу Количество вводивектор (Celltech, England) вместе с 0,3 Xbal/Hmdlll мых доз может варьироваться в зависимости от pSTG3 фрагментом для завершения pDTM конствышеуказанных факторов Далее изобретение рукции описывается в следующих примерах без ограни2 Конструирование pSTOP, используя векточения его объема ры pSTG2 и pSTG3 Пример 1 Плазмида pSTOP содержит др350/220 ген, в Делеция др350/220 трансмембранного участка 47403 21 котором отсутствует ТМ участок и Стерминальный цитоплазмический участок, соседствующий с ТМ участком Для создания этой конструкции создают Bfal/EcoRI олигонуклеотидный линкер из 16 пар оснований со стоп кодонами (подчеркнуты) в трех рамках, следующих за Bfal липким концом, как показано далее TAT.AGA CEA GTC TAG G А ТСТ GAT CAG АТС СТЇ ДА 5' свисающий конец (ТА) верхней последовательности является липким концом для Bfal рестрикционного сайта, а 5' свисающий конец (ТТАА) нижней последовательности является EcoRI липким концом Этот 16Ьр линкер используют для клонирования фрагмента BLSH1 Hmdlll/Bfal в рМТИ, для создания pSTG2 2,3 kb pSTG2 Hmdill/EcoRI фрагмент и pSTG3 0,3 kb Xbal/Hmdlll фрагмент клонируют в рЕЕ14 для создания pSTOP 3 Сравнение дикого типа, pDTM и pSTOP последовательностей на ТМ участке Олигонуклеотидная последовательность и транслированная аминокислотная последовательность дикого типа, pSTOP и pDTM 3' концы др350 ДНК и аминокислотные последовательности представлены далее в таблице 2 Стрелками указаны начало и конец дикого типа трансмембранного домена (ТМ) Только две аминокислоты из трансмембранного домена сохраняются в pDTM и pSTOP Mets6i и Leus62 (см также фиг1) Следует отметить, что стоп кодон следует непосредственно за Leus62 в pSTOP В pDTM прежнее положение делетированного мембранного участка отмечено как "ТМ" (В таблице указаны нативные аминокислоты) Таблица 2 3 ' к о а е ц gp35Q д и к о г о топта ...ААС СТС ТСС ATG СТА поспедоеатзльности GTA . . . A a n Leu S e r Met Leu 3 f i 2 Val CTG.. .GTC АШ GCG GRC L e u . . .Val TGC GCC Met Ala A s p 8 e 3 Cys * Ala t TH с т а р т т к о н е ц 3 ' к о н е ц рЁТОР .ACC СТС ТСС ATG СТА -ЙЭП Leu Ser Met 3' TAG ACT AGT K T &GG... Стоп кои е ц pDTM .. ACC СТС ТСС ATG СТА GAC TGC GCC... ...Asn Leu Ser Met Leu 3 « Азр8эг Суз Ala... A Пример 2 Удаление gp350/220 гена донорного и акцепторного сплайсинговых сайтов для создания pMDTM и pMSTOP Для получения гомогенного продуцирования др350 протеина заменяют высоко консервативные и консервативные основания сплайсингового сайта др350/220 гена Четыре основания заменяют в донорном сплайсинговом сайте, включая высоко консервативную GT пару, которая находится в 100% всех сплайсинговых сайтов Два консерва 22 тивных основания донорного сайта, АА, заменяют на GT Два высоко консервативных (инвариантных) основания донорного сплайсингового сайта заменяют с GT на СА У акцепторного сплайсингового сайта, только высоко консервативные основания сплайсингового сайта заменяют для сохранения аминокислотной последовательности Вторые консервативные основания акцепторного сплайсингового сайта заменяют, как указано в таблице З В таблице 3 суммированы изменения оснований в донорном и акцепторном сплайсинговых сайтах др350/220 гена Таблица 3 Изменения сайта сплайсинга EBV др350/220 гена Донорный спдайсинговый сайг; Донор Дикий тип: GAA А і G Glu Sersoi мутант: GAG* Т*С*А* Glu Акцепторный сплайсинговый сайт: Акцептор ип: АСА G і G£ Thr Glyese Акцептор мутант: ДСТ* GOT* Thr Изменения оснований за счет мутагенеза на основе олиго-нуклеотидов отмечены в мутантных последовательностях звездочками Реальные сайты сплайсинга указаны стрелками, и представлены кодируемые аминокислоты Ни одна из этих аминокислотных последовательностей не изменяется в результате нуклеотидных замещений Нуклеотидные замещения в дикого типа др350/220 ДНК последовательностях донорного сплайсингового сайта и акцепторного сплайсингового сайта осуществляют, используя мутагенез, опосредствованный олигонуклеотидами Для осуществления мутаций используют модифицированный фаговый вектор М13ТАС по способу Zoller, М Е and Smith, M (1983) Methods of Enzymol 100 468 BamHI/Xhol фрагменты gp350/220 нуклеотидной последовательности клонируют в полилинкер плазмиды М13ТАС, используя Asp718 и BamHI рестрикционные сайты на полилинкере, объединенном с 19 Ьр олигонуклеотидным линкером, содержащим Asp718 и Xhol липкие концы Для мутагенеза используют M13DTM и M13STOP примера 1 (фиг 2В) Для использования в мутагенезе создают два 42-мерных олигонуклеотида, РгДонорі и РгАкцепторі Каждый из них конструируют таким образом, чтобы он был комплементарен др350/220 генным последовательностям центрированно либо по донорному, либо по акцепторному сайтам Единственным участком олигонуклеотидов, которые не были комплементарны др350/220 гену, были основания, представляющие целевые мутации Олиго-нуклеотиды после мутагенеза имеют следующий вид 2 3 Праймер: EBV: 4 7 4 0 3 GGT CAT GTC GGG GSC CTT TG }A CTC TOT GCC GTT GTC CCA TGS GGT CAT GTC GGG GGC CTT ЛС T TTC TGT GCC GTT GTC CCA TGG РгЛкцепторі Праймер: CTG TGT TAT ATT TTC ACC TC EBV; CTG TGT TAT ATT TTC ACC AC С АЙТ TGG GTG AGC GGA GGT TAS \C TGT TGG GTG AGC Ш GGT TAG Последовательность олигонуклеотидов после мутагенеза помечена как "праймер", тогда как ДНК последовательность, связывающая сплайсинговые сайты др350/220 гена, помечена как "EBV" Основания, которые изменены в результате мутагенеза, отмечены звездочками Штриховая линия указывает положение сплайсинга Олигонуклеотидные РгДонорі и РгАкцепторі гидролизуют до получения одноцепочечных клонов M13-DTM и M13-STOP Голоэнзим Т4ДНК полимеразы используют для получения двухцепочечной ДНК и этой двухцепочечной ДНК трансформируют Е coh Используя вектор М13ТАС, любой из клонов, который содержит целевую мутацию, можно идентифицировать по изменению цвета с белого на синий в присутствии Xgal и изотиопропилгалактата Синие бляшки отбирают и выращивают, и ДНК последовательности за соединениями сплайсинга используют для окончательной идентификации мутантных клонов, помеченных как M13-MDTM и M13-MSTOP После идентификации клонов, содержащих целевые мутации, фрагменты BamHI/Xhol вырезают из M13-MDTM и M13-MSTOP и лиги-руют обратно в pDTM и pSTOP основные цепи для создания конструкций pMDTM и pMSTOP, соответственно Эти конструкции переносят в СНО клетки для экспрессии нон-сплайсинговых вариантов др350/220 ДНК последовательностей, как указано в примере 3 Пример 3 Экспрессия др350 в СНО клетки 1 Трансфекция др350/220 генной конструкции ОДИН ИЗ способов получения с высокими выходами гомогенного др350 протеина настоящего изобретения из клеток млекопитающих включает конструирование клеток, содержащих множественные копии гетерологичной др350 последовательности Гетерологичная ДНК последовательность оперативно связана с амплифицируемым маркером, в этом примере геном глутаминсинтетазы, для которого клетки можно амплифицировать, используя метионинсульфоксимин Векторы pMDTM и pMSTOP, полученные в примере 2, трансфектируют в СНО клетки, как будет указано далее по способу Crockett, Bio/Technology 8 662 (1990) и как указано в Celltech Instruction Manual для системы амплификации гена глутаминсинтетазы (1992) СНО-К1 клетки (АТСС CCR61) поддерживают в не содержащей глутамина ЕМЕМ (Eagles минимальная поддерживающая среда), дополненной 10% сывороткой плода теленка, 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, MEM (модифицированная среда Eagle's) несущественными аминокислотами, и 1 мМ пируватом натрия (все получены от JRH Biosciences) Среду дополняют 2 4 также 60 мг/мл глутаминовой кислоты, 60 мг/мл аспарагина, 7 мг/мл аденозина, 7 мг/мл гуанозина, 7 мг/мл цитидина, 7 мг/мл уридина и 2,4 мг/мл тимидина ( все от Сигмы) Этот препарат среды используют для трансфекции (причем, в случае отклонений от этого рецепта имеют место указания) За день до трансфекции 10-см чашки засевают 3 х 106 СНО-К1 клетками В день трансфекции клетки промывают 10 мл среды, не содержащей сыворотки (для каждой чашки) Плазмидную ДНК (из pMDTM и pMSTOP плазмид) вносят за счет СаРО4 осаждения, используя обычные методики 10 мкг осадка каждой плазмиднои ДНК инкубируют с СНО-К1 клетками плюс 2 мл не содержащей сыворотки среды при 37°С в течение 4,5 часа Осуществляют тройной эксперимент для каждой из четырех плазмид-ных трансфекции Затем клетки встряхивают в течение 1,5 минут с 15% глицерином в физиологическом pacTBopef буферированном HEPES После промывания не содержащей сыворотки средой, ее заменяют на содержащую сыворотку среду, и клетки инкубируют в течение 24 часов На следующий день эту среду заменяют на среду, содержащую 10% диализованную бычью сыворотку (JRH Biosciences) и амплифицируют, добавляя 25 мкМ метионинсульфоксимина (Сигма) Среду, содержащую метионинсульфоксимин обновляют каждые 3 - 5 дней до тех пор, пока амплифицированные клоны не оказываются достаточно большими для того, чтобы их можно было собрать, то есть примерно спустя 1 3 - 1 4 дней Клоны собирают, соскребая колонии с чашек стерильным устройством для пипеттирования на 200 мкл, и переносят в одну из ячеек пластины с 96 ячейками в среду без метионинсульфоксимина Через 1 - 2 дня эту среду заменяют на среду с добавлением 25 мкМ метионинсульфоксимина, Спустя 4 дня собирают надосадочные жидкости и анализируют на содержание целевых протеинов в ELISA анализе СНО клетки также трансфектируют рЕЕ14 контрольным вектором отдельно (который не содержит EBV последовательностей) и 24 клона СНО-рЕЕ14 также собирают и переносят на пластины для контролен (Контрольные клоны идентифицируют на основании выживания в метионинсульфоксимине) 2 ELISA анализ После трансфекции 241 клон CHO-pMDTM и 158 клонов CHO-pMSTOP собирают и выращивают Надосадочные жидкости этих клонов тестируют на предмет получения др350 протеина 96ячеичные пластины покрывают афинноочищенными кроличьими анти-др350/220 антителами (антитела MDP1, подарок от Andrew Morgan), разбавленными 1 2000 в 50 мМ натрийборатном буфере, рН 9 Пластины инкубируют в течение 3 4 часов и трижды промывают PBS + 0,05% Твин 20, используя Nunc Immuno Washer После того, как блоты высушивают, пластины блокируют, инкубируя с 2% BSA в PBS + 0,01% Thimerosal при 37°С в течение получаса, и снова промывают Надосадочные жидкости с трансфектированных клеток и контрольных клеток помещают в ячейки и инкубируют в течение 2 часов при 37°С Затем пластины инкубируют с определенным ранее ан 25 26 кипятят в течение 5 минут и обрабатывают на 5% SDS-PAGE Иммуноосадки сравнивают с образцами геля надосадочных жидкостей тканевых культур, смешанных 1 1 с протеиновым образцовым буфером Гель высушивают и авторадиографируют на Hyperfilm p-Max (Amersham) На фигЗ представлены результаты авторадиографического исследования результатов SDSPAGE анализа радиоиммуноосажден-ных образцов В качестве контроля используют клеточную линию GH3U19 (подарок Elliot Keiff, Whang et al , 1987) Клетки GH3U19 секретируют усеченную форму протеина др350/220, не содержащую трансмембранного и С-терминального цитоплазмического домена Для негативного контроля клетки СНО трансфектируют только одним вектором рЕЕ14 и селектируют с помощью метионинсульфоксимина параллельно с pMDTM трансфекци-ей На фигЗ надосадочные жидкости ("S") представлены в нечетных полосах, чередующихся с иммуноосажденными ("Ip"), представленными в четных полосах В контрольной полосе 2, осаждение из GH3U19 контрольных клеток приводит к получению двух интенсивных протеиновых полос на примерно 220 и 350 кД, что демонстрирует продуцирование усеченных сплайсинговых вариантов др350 и др220 протеинов в соотношении около 1 1 Как и ожидалось, эти иммуноосажденные полосы концентрированы по сравнению с надосадочными жидкостями радиомеченых тканевых культур (не подвергавшиеся иммуноосаждению образцы) в полосе 1 Кроме того, как и ожидалось не наблюдается полос в негативном контроле (полоса 4), так как вектор рЕЕ14 не содержит ни одной из др350/220 конструкций 47403 тителом, мышиным моноклональным антителом против др350/220 (антитело № С65221М, Biodesign International) при 1 мг/мл разбавлении в PBS промывочном буфере при 37°С в течение 1 часа После промывки пластины инкубируют с вторым антителом, фрагментами козьего F(ab)2, коньюгированными с пероксидазой хрена, направленными против мышиных иммуноглобулинов (адсорбированный Ig человека, Biosource International), 0,7 мкг/мл в PBS + 0,05% BSA и 0,01% Thimerosal при 37°С в течение 1 часа Пластины промывают и проявляют, используя ABTS (Pierce Chemicals), растворенный в Stable Peroxide Substrate Buffer (Pierce Chemicals) в течение 0,5 часа при комнатной температуре Реакцию останавливают 1% SDS и пластины считывают на 405 и 650 нм, используя считывающее устройство Molecular Devices Vmax ELISA 24 pMDTM и 18 pMSTOP колоний были тестированы как положительные в отношении секретирования др350 Колонии, которые давали наиболее интенсивные ELISA сигналы, перенесли на пластины с 24 ячейками для размножения и дополнительного анализа за счет Вестернблоттинга и анализа радиоиммуноосаждения 3 Вестернблоттинг и анализ радиоиммуноосаждения В начальном скринировании надосадочные жидкости тканевых культур из pMDTM трансфекций анализируют на активность в Вестернблоттинге Надосадочные жидкости СНО клеток очищают на 5% SDS-PAGE гелях, переносят на нитроцеллюлозу после ночии зондируют анти-др350 антителами Семь pMDTM клонов оказываются позитивными для др350 в Вестернблоттинг-анализе pMDTM клоны, которые оказываются положительными в Ве-сшернблоттинге, далее тестируют с помощью радиоиммуноосажде-ния на предмет присутствия др220 Выбранные трансформированные pMDTM клетки, рЕЕ14 контрольные и СНЗД19 контрольные клетки (описанные далее) выращивают в течение ночи в пластинах с 6 ячейками так, чтобы они были примерно на три четверти конфлюэнтны на день эксперимента Каждая ячейка содержит приблизительно 5 х 106 клеток Для введения метки среду из каждой ячейки удаляют и заменяют 0,7 мл MEM, не содержащей метионина (10% сыворотки плода теленка) + 100 мкКюри35ЗЭ-метиони-на Клетки инкубируют в течение 5,5 часа при 37°С, а затем обрабатывают в микроцентрифуге при скорости 4000 об/мин в течение 5 минут Гомогенный др350 протеин в надосадочной жидкости иммуноосаждают, добавляя 10 мкл Sepharose-Protem А (Сигма) в 50% суспензии и 20 мкл моноклональных анти-др350/220 (антитела № С65221М, 100 мкг/мл, Biodesign International) в течение ночи при встряхивании при 4°С Затем смесь осаждают при 2000 об/мин 2 минуты при комнатной температуре в микроцентрифуге, промывают четыре раза небольшими объемами буферированного фосфатом физиологического раствора После последней промывки всю жидкость удаляют из осадка и заменяют 50 мкл протеинового гель-образцового буфера Образцы, содержащие осажденный иммунокомплекс SDS-PAGE анализ иммуноосаждений из надосадочных жидкостей pMDTM клонов в полосах 6, 8 и 10 приводит к появлению отдельной интенсивной полосы примерно на 350 кД, аналогичной более высокомолекулярным образцам в GH3U19 контрольной полосе 2 Однако, в противоположность GH3U19 контрольной полосе дополнительная интенсивная полоса примерно на 220 кД отсутствует в полосах 6, 8 и 10, хотя в полосе 8 наблюдается очень слабая полоска, смещенная в область несколько более низких молекулярных весов Это может представлять продукт разложения, совместно осажденный клеточный продукт или незначительное количество др220 протеина, образующегося из-за неправильной трансляции или актов мутаций, которые возвращают исключенные донорный и акцепторный сплайсинговые сайты в нативный нуклеотид или аминокислотные последовательности Интенсивные отдельные полосы на примерно 350 кД были обнаружены в пяти других тестированных MDTM репликатах (данные не представлены) Непохоже, что полное отсутствие полосы на 220 кД в полосах 6 и 10 связано с неэффективным осаждением из MDTM надосадочных жидкостей, ос так как в S-меченой GH3U19 контрольной полосе (2) полоса на 220 кД отчетливо визуализируется Кроме того, дополнительный анализ с использованием pDTM конструкций примера 1, которые 27 47403 содержат дикого типа сайты сплайсинга, приводит к получению двух интенсивных полос на 350 и 220 кД Поэтому, эти результаты демонстрируют тот факт, что делеция сайтов сплайсинга приводит к продуцированию др350 протеина без одновременного продуцирования др220 протеина Этот гомогенный др350 протеин, экспрессированный в СНО клеточные линии, или в другие клеточные линии млекопитающих, можно получить в еще более крупных масштабах, и гомогенный др350 протеин можно выделить и очистить от кондиционной среды из клеточной линии, используя способы, известные специалистам, включая такие методики, как лектин-афинная хроматография, ВЭЖХ с обращенной фазой, скоростная ВЭЖХ, гель-фильтрация и т д См David, J Immuno Methods 108 231 (1988) и Madej, Vaccine 10 777 (1992) 4 Нозернблоттинг pMDTM протеина В этом эксперименте с помощью Нозернблоттинга показано, что клетки MDTM-1 продуцируют др350 РНК, но не др220 РНК, подтверждая, тем самым, на другом уровне, что мутации сплайсингового сайта предотвращают продуцирование др220 ДНК зонды, комплементарные др350,были получены из pDTM, см пример 1 Матрицу зонда gp350/220, XP464, выделяют в виде 464 Ьр Xhol/Pstl pDTM фрагмента ХР464 распознает как др350, так и др220 Для получения др350специфического зонда AN537, pDTM разрезают за счет Ncol и Ndel, выделяют два перекрывающихся фрагмента 580 Ьр, и полученную смесь разрезают Xmnl для исключения одного примесного фрагмента, и за счет Alul до получения 537 bp Alul/Ndel фрагмента внутри др350/220 сплайсингового сайта AN537 специфичен для участка, сплайсированно-го из др220 и, таким образом, специфичного для др350 месседжа ДНК зонды метят 32P-dCTP ник-трансляцией (Amersham), используя ДНК фрагменты ХР464 и AN537 Целую клеточную РНК получают практически в соответствии со способом Chomczyunski and Sacchi, Anal Biochem , 162 156-59(1987) Среду из двух Т-250 склянок каждой СНО-рЕЕ14 (в качестве негативной контрольной линии, см пример 1), CHO-MDTM и CHO-DTM-7 клеток, 90% конфлюэнтных, отсасывают и клетки подвергают лизису и соскабливают в денатурирующий буфер (10 мл гуанидинтиоцианата, 25 мМ цитрата натрия, рН 7,05 саркозила, 100 мМ 2-меркаптоэтанола) Каждые 10 мл лизата дополняют 1 мл 2М ацетата натрия, рН 4, 10 мл насыщенного фенола, рН 4,5 и 2 мл смеси хлороформ / изоаминоловый спирт, полученный лизат инкубируют на льду 15 минут, вращают при 10000 g в течение 20 минут при 4°С и верхнюю водную фазу удаляют РНК осаждают из водной фазы, добавляя один объем изопропанола при 20°С в течение 1 часа, осаждают при 4°С, снова суспендируют в денатурирующем буфере и снова осаждают РНК осадок промывают 1Х в 70% этаноле, сушат в Speed-Vac и снова суспендируют в DEPC-обработанной воде DTM-7 и MDTM-1 полные клеточные РНК денатурируют при 65°С в течение 15 минут в 15% формамиде и 6% формальдегиде, обрабатывают 28 на 1% агароза / 6,6% формальдегидных гелях и переносят на нитроцеллюлозу за счет капиллярных взаимодействий, затем зондируют мечеными ХР464 и AN537 ДНК зоны денатурируют за счет кипячения в течение 5 минут, гибридизуют в 5Х SSPE при 65°С в течение ночи и нитроцеллюлозу промывают в условиях высокой жесткости Авторадиографию осуществляют, используя Bio-Rad фосфоимеджер Нозернблоттинг полных клеточных РНК из CHO-MDTM клеток демонстрирует эффективность сплайсинговых мутаций по предотвращению продуцирования др220-специфических РНК др350специ-фический зонд, AN537, связан только с одним из видов РНК в MDTM-1 и DTM-7 клетках (фиг 4, полосы 1 и 2), как и ожидалось для др-350специфического зонда Зонд ХР464, который специфичен как для др350, так и для др220 РНК, распознает два вида в DTM-7 и отдельную более высокомолекулярную полосу в MDTM-1 (фиг 4, полосы 4 и 3), как и ожидалось, если сплайсинговые мутации предотвращают продуцирование др220 месседжа в MDTM-1 Даже если MDTM-1 полосы перегружены для др350-специфической РНК, не наблюдается видимой др220 РНК Причина для различий в кажущейся подвижности др350 месседжа в MDTM-1 по сравнению с DTM-7 полосой неизвестна Виды MDTM-1 перегружены по сравнению с DTM-7, что может повлиять на миграцию в геле Кроме того, др350 месседж выходит вблизи к интенсивной рибосомнои РНК полосе на геле, что может нарушить кажущийся молекулярный вес В любом случае наличие отдельных видов, комплементарных др350 ДНК последовательностям, дает возможность предположить, что этот сигнал представляет др350 мРНК Таким образом, мутации в донорном и акцепторном сайтах сплайсинга эффективны для предотвращения продуцирования др220 мРНК по данным Нозернблоттинга Этот результат в дальнейшем подтвержден за счет радиоиммуноосаждения, используя моноклональные антитела специфичные для др350/220, а также за счет Вестернблоттинга MDTM-1 и DTM-7 надосадочных жидкостей Пример 4 Тестирование гомогенных др350 протеинов на иммуногенную активность Очищенные гомогенные др350 протеины вводят в соответствующие носители для введения и вводят мышам следующим образом 2х адьювант-носитель концентрат приготавливают, смешивая Pluronic L121 и сквалан в 0,4% (объем/объем) Твин 80 в буферированном фосфатом физиологическом растворе с (Thr1) MDP в соответствии со способом David, J Immunol Methods 108 231 (1988) и Allison, J Immunol Methods 95 157(1986) Состав для введения приготавливают, добавляя равные объемы протеина и адьювантаносителя в день введения Содержание протеина должно быть в интервале от 5 мкг до 50 мкг на дозу Мышей штамма BALB/c иммунизуют тремя по 0,1 мл внутримышечными инъекциями в 0, 21 и 42 день Кровь от пре-иммунизованных последовательно на 10 день после каждой инъекции отби 47403 30 29 рают из ретроорбитального синуса (A) Длинна 6 аминокислот Уровни антител в сыворотке определяют в (B) Тип аминокислота анализе ELISA по способу примера 3 EBV ней(C) Топология линейная трализующие антитела в сыворотке подсчитывают (и) Тип молекулы протеин по их способности ингибировать трансформацию (xi) Описание последовательности SEQ ID лимфоцитов крови спинного мозга плода у EBV ин N0 3 витро по способу Moss, J Virol 17 233 (1972) и Asp Cye Ala Fh* ^ 3 ^ S De Schryver, Int J Cancer 13 353(1974) 5 X Соответственно Новозеландским белым кро(2) Информация для последовательности SEQ ликам инокулируют внутримышечно пять доз проIDNO 4 теина, эмульгированного в указанном ранее адь(і) Характеристика последовательности юванте в 0, 21, 42, 63 и 84 дни Дозы должны быть (A) Длинна 27 пар оснований в интервале от около 5 мкг до 50 мкг на инокуля(B) Тип нуклеиновая кислота цию Сыворотку получают через две недели после (C) Вид цепочки одинарная последней дозы и тестируют по титрам антител к (D) Топология неизвестна антигену, для перекрестно-реактивного антитела к (м) Тип молекулы олигомерная ДНК вирусному др350/220 из В95-8 клеток и для ин (xi) Описание последовательности SEQ ID витро EBV-нейтрализующей активности по спосоNO 4 бам Emim, Virology 166 387(1988) GGATCCTCTG ТТССТТСПЗС TCCACTG Так как способности EBV gp350/220 протеина (2) Информация для последовательности SEQ индуцировать защитный иммунитет против EBV IDNO 5 инфекции на модели животных уже были установ(і) Характеристика последовательности лены, см Epstein, Clm Exp Immunol 63 485 (A) Длинна 21 пар оснований (1986), ожидаются аналогичные позитивные ре(B) Тип' нуклеиновая кислота зультаты от введения композиции гомогенного (C) Вид цепочки одинарная др350 протеина (D) Топология неизвестна Раскрытия всех приводимых здесь публикаций (м) Тип молекулы олигомерная ДНК включены сюда по ссылкам, Подробное описание (xi) Описание последовательности SEQ ID приведено только для большей ясности и понимаNO 5 ния и никоим образом не является ограничивающим объем изобретения, в который входят все TCTGTTCCTT CTGCTCCROT О модификации, которые будут очевидны специали(2) Информация для последовательности SEQ стам IDNO 6 Описание последовательностей (і) Характеристика последовательности (1) Общая информация (A) Длинна 16 пар оснований (1) Заявитель Spaete Richard and Jackman, (B) Тип нуклеиновая кислота Winthrop, T (C) Вид цепочки одинарная (и) Название изобретения Нон-сплайсинговые (D) Топология неизвестна варианты gp350/220 (м) Тип молекулы олигомерная ДНК (їм) Количество последовательностей 19 (xi) Описание последовательности SEQ ID (2) Информация для последовательности SEQ NO 6 IDNO 1 TATAGACTAG TCTAGG (і) Характеристика последовательности (2) Информация для последовательности SEQ (A) Длинна 27 пар оснований IDNO 7 (B) Тип нуклеиновая кислота (і) Характеристика последовательности (C) Вид цепочки одинарная (A) Длинна 18 пар оснований (D) Топология неизвестна (B) Тип нуклеиновая кислота (и) Тип молекулы олигомерная ДНК (C) Вид цепочки одинарная (xi) Описание последовательности SEQ ID (D) Топология неизвестна N0 1 (м) Тип молекулы олигомерная ДНК GGATCCTAGA CTGCGCCrTT AGGCGTA (xi) Описание последовательности SEQ ID (2) Информация для последовательности SEQ NO 7 IDNO 2 ATCTGATCAG А Т С С Г Г А А (і) Характеристика последовательности (2) Информация для последовательности SEO (A) Длинна 19 пар оснований IDNO 8 (B) Тип нуклеиновая кислота (і) Характеристика последовательности (C) Вид цепочки одинарная (A) Длинна 39пар оснований (D) Топология неизвестна (B) Тип нуклеиновая кислота (м) Тип молекулы олигомерная ДНК (C) Вид цепочки одинарная (xi) Описание последовательности SEQ ID (D) Топология неизвестна N0 2 (м) Тип молекулы олигомерная ДНК G C G G C TTAGGCGTA ATCCT (xi) Описание последовательности SEQ ID (2) Информация для последовательности SEQ NO 8 IDNO 3 ARCCTCTCCA TGCTAGTACT GGTCATGGO3 GACTGCGCC (і) Характеристика последовательности (2) Информация для последовательности SEQ 47403 31 ID NO 9 (і) Хараісгеристика последовательности (A) Длинна 13 аминокислот (B) Тип аминокислота (C) Топология линейная (м) Тип молекулы протеин (xi) Описание последовательности SEQ Ю N0 9 Asn Leu Ser Met Leu Val Leu Val Мес Ala Азр Cys Ala 1 5 10 (2) Информация для последовательности SEQ ID NO 10 (1) Характеристика последовательности (A) Длинна 30 пар оснований (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Вид цепочки одинарная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы олигомерная ДНК (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 10 ААССТСТССД. TGCTATAGAC TAGTTCTAGG (2) Информация для последовательности SEQ IDNO 11 (і) Характеристика последовательности (A) Длинна 5 аминокислот (B) Тип аминокислота (C) Топология линейная (м) Тип молекулы протеин (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 11 Asn lev Ser Met Leu I 5 (2) Информация для последовательности SEQ IDNO 12 (і) Характеристика последовательности (A) Длинна 24 пары оснований (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Вид цепочки одинарная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы олигомерная ДНК (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 12 ААССТСТССА TGCTJU3ACTG CGCC Leu Ser Нес Leu^bspmCys GGTCATCTCO GGGGCCTTTG ACTCTGTGCC СТТСТСССДТ GG (2) Информация для последовательности SEQ IDNO 15 (і) Характеристика последовательности (A) Длинна 24 пары оснований (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Вид цепочки одинарная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы олигомерная ДНК (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 15 GGTCATGTCG GGGGCCTTAC GTTGTCCCAT (2) Информация для последовательности SEQ IDNO 16 (і) Характеристика последовательности (A) Длинна 42 пар оснований (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Вид цепочки одинарная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы олигомерная ДНК (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 16 CTGTCTTATA ТТТТСАССТС CAGTTGGGTG AGCGGAGGTT AG (2) Информация для последовательности SEQ IDNO 17 (і) Характеристика последовательности (A) Длинна 42 пар оснований (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Вид цепочки одинарная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы олигомерная ДНК (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 17 CTGTCTTATA ТПТСАССАС CTGTTGGGTG AGCGGAGGTT AG (2) Информация для последовательности SEQ IDNO 13 (і) Характеристика последовательности (A) Длинна 8 аминокислот (B) Тип аминокислота (C) Топология линейная (м) Тип молекулы протеин (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 13 Asn 32 (і) Характеристика последовательности (A) Длинна 24 пары оснований (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Вид цепочки одинарная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы олигомерная ДНК (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 14 Ala (2) Информация для последовательности SEQ IDNO 14 (2) Информация для последовательности SEQ IDNO 18 (і) Характеристика последовательности (A) Длинна 3833 пар оснований (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Вид цепочки двойная (D) Топология неизвестна (м) Тип молекулы кДНК (їх) Характеристика (A) Имя/ключ CDS (B) Локализация 1014 3734 (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 18 33 34 47403 ТСП ЛАТ TTC AGC GTA AAS АСА САД ATG СТС SST AAT GAG ATA OAT ATT OAUTFetiATA AATGAAACBC GCTGGTCAGa TSTTAAAACT ТССТСССАСД TTTTCCTGAG 6Й GCTCcrareT A S C A A АОТСАМОАД AATACTGTAU соои1Е«тот'мкюЕ«лтд 1 іїійіи*т«тм/в:„ііїЗС8м*іт SOTH i m « *даютед»ю»вжій»ссїс»сс«;іі:«; * s sirljst I dy ГЬгРгяТЬгРґоДаиА І aTlir^rProSri Ргод І аучі TatШ РЮІІІҐІ»cAart I nThrSif РҐОШРГа Ч а. М[ І! і ('«liiaxf ітоїсштиїЖ(ссютагасс*іШі*а^тсет«:і:теж тяелмікжсигдес WPirTM» д-ТИ. ProHsnliIgTbrSwProThfІяйІjtys-TbrSarPraTJifSerWijfat riirTbrPra1iM-PriiB5iiAa«.TItrSerffoHirl.su!;iilfsTlarStfPro?!1 ґ S80 IH і IMWKKIACCKIWIMSMTOOC^MOSMТЖЙАШЙДССС^ &;4!йоITbir'hrtrtlhi-prBlin^HtiirSyPrntinttiCi|lyiTlir58ifraiiiritrAlsjfniHirtltrPraftrPfII«MWaTii^iIjPral-ifVol«i)«Ialla-Str 6Л FIG.1 ^ FIG.1A 39 47403 40 *ar rrf MG 5 a ! !tStrj r > 1 H l iI I l Ti i;ііігLnSI)Cjі№rS«PfдТІіґРгаУаSVnIIhіS« - 2 ^ S l»sf « l|5I tVo ttaVo l!l> LjsS І ї С Ь4) TCTSt*KiS1CC**ffiOE№CB«3;WA1 Sffin ThrSljClilraiisTlir'i-teMi 5 Ip S Ip S Ip S Ip S Ip •ліяасначхихіжаягм іда£длмеііоеад*іія&ідаіжсіс*ждаісс***саа*т і І sits* ІЛІГІКРГЙ ! nAtofroSsrtl )Є laljsBif М »Vq !ff uliifVn! DirStrT!it( І )вІ JLJSA! c*sis "Я 11І5Г+1 їїжміиоіассссііоСАаіїиамкісіїкмїідамАйиїЖйідсмі^таіКіАїа» і SwSulys mlrg»fWi-gIrpIlir№(7hj-5t 1>і.Ргоїо!Іл!7^гА!й!аЛ1и7І»-їаІЯґвао ProProThrSerG lnf4s/irgPhe5c AsnLcaSe «60 ЙКІЄТО; «ЙВІ вдиій:іії:ї№мішїї*стіи:гаітк«Етм;їіі;к:т*с»ї««тдсеЇ ішїї* FIG.1C ЛІЯ»Х77 ІВДКЇСАлСАНиЯМЇII А г г ІССИІДШ т і к и ш ш г ] тситегв 1 2 3 4 5 6 7 8 3 10 і;Аішсвд^ і ТСКТСАСЄІ тої ПМГ І [ т і ас дах№сапсікіййісі7е*сш№іаж*кпеісагпоміс*ажіш:7і;7Ш^ 05СП№ІИСІ««6№ї1«7«Г*7Т«МІ*1С*СЖ*ІЄ№«ЙІОС!Є*«ІМ! ВИ 1 ] 1 prAN557 РГХР464 FIG.1D соон EXTHACEU-ULAfi SLLF1 Валі НйісіШ ХпнЦ BLSH2 BLSH1 SCYT Bfet Xmal Г FIG.-2A BLSH1 BLSH1 рЄЕН рЕЕ14 -*—9P35O ^—gp220 41 47403 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 42