Поліпептид, спосіб одержання поліпептиду (варіанти),фрагмент днк (варіанти), експресуючий вектор (варіанти), штам e.coli, лінія клітин (варіанти), білок, фармацевтична композиція (варіанти)

Настоящее изобретение относится к новому белку, названному Компонентом В. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому белку, получаемому из мочи; к получению этого белка из мочи; к его синтезу посредством техники рекомбинантных ДНК с использованием геномной ДНК или кДНК, кодирующей указанный новый белок; а также к фармацевтической композиции, содержащей этот белок; и ее использованию в терапевтических целях. Новый белок имеет относительную низкую молекулярную массу и полипептидную природу, и может быть выделен в процессе экстракции и очистки производных мочи. Для этого, мочу человека обрабатывают адсорбирующими материалами, такими, как каолин, затем подвергают фильтрации, ионообменной хроматографии, и высокоразрешающей хроматографии, предпочтительно в соответствии с нижеописанной техникой; и после лиофилизации получают соединение в виде белого аморфного порошка, который в обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления (ОФ-ЖХВД) перемещается как один пик, и который имеет молекулярную массу около 9кДа, как было показано с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с дедецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), проводимого в восстанавливающих условиях. Этот белок был назван Компонентом В. Аминокислотная последовательность Компонента В представлена ниже как SEQ ID № 1. Настоящее изобретение относится к получению нового белка, названного Компонентом В, способом, предусматривающим выделение сырой фракции самого соединения из диализованного концентрата мочи после ее обработки адсорбирующим агентом и очистки с помощью ионообменной хроматографии и высокоразрешающей хроматографии, как описано ниже. Предпочтительно, если белок настоящего изобретения экстрагируют из мочи человека, поскольку она существуе т в больших количества х, а поэтому может быть использована в промышленном производстве. Более конкретно, настоящее изобретение относится к полипептиду, имеющему последовательность SEQ ID № 1, к его солям, функциональным производным, предшественникам, активным фракциям, а также к их активным мутантам, т.е., к другим белкам или полипептидам, в которых одна или несколько аминокислот были удалены, замещены другими аминокислотами, или добавлены в целях получения полипептидов или белков, имеющих активность, аналогичную активности Компонента В: кроме того, настоящее изобретение также относится к гибридным белкам, т.е., полипептидам, содержащим Компонент В или его мутацию, лигированный с другим белком, и имеющим более продолжительное время полужизни в физиологических жидкостях в организме. Поэтому, Компонент В кокет быть подвергнут слиянию с другим белком, например, таким, как иммуноглобулин. Термин "соли", используемый в настоящем описании, означает соли карбоксильных групп и соли функциональных аминогрупп соединении, синтезируемые известными способами. Соли карбоксильных групп могут быть неорганическими солями, например, такими, как соли натрия, калия, и кальция, а также солями, образованными органическими основаниями, такими, как амины, например, триэтиламин, аргинин, или лизин. Соли аминогрупп могут представлять собой соли, образованные неорганическими кислотами, такими, как соляная кислота, и органическими кислотами, такими, как уксусная кислота. Термин "функциональные производные", используемый в настоящем описании, относится к производным, которые могут быть получены из функциональных групп, присутствующи х на боковых цепях аминокислотных остатков или на концевых N – или С-группах, в соответствия с известными методами; и которые входят в объем настоящего изобретения в том случае, если они являются фармацевтически приемлемыми, т.е., обладают активностью, аналогичной активности белка, или не наделяют фармацевтические композиции, содержащие указанные производные, токсическими свойствами. Примерами таких производных являются, например, сложные эфиры или алифатические амиды карбоксильных групп, и N-ацильные производные свободных аминогрупп, О-ацильные производные свободных гидроксильных групп, а также производные, образованные ацильными группами, например, алканоильными или ароильними группами. Термин "предшественники" означает соединения, которые в организме человека или животного превращаются в Компонент В. Термин "активные фракции" белка настоящего изобретения означает любой фрагмент или предшественник полипептидной цепи самого соединения, взятый отдельно или в комбинации со связанными с ним родственными молекулами или остатками, например, остатками сахароз или фосфатов, или агрегаты полипептидной молекулы, при условии, что такие фрагменты или предшественники как лекарственные средства обладают активностью, аналогичной активности Компонента В. Настоящее изобретение также относится к смеси полипептидов и производных, определенных выше. Во втором варианте своего осуществления, настоящее изобретениe относится к способу получения Компонента В, предусматривающему выделение сырой фракции из диализованного концентрата мочи, после его обработки адсорбирующим агентом и очистки с помощью ионообменной хроматографии и высокоразрешающей хроматографии. Компонент В предпочтительно получают способом, проиллюстрированным на рис. 1, и включающим в себя следующие стадии: а) адсорбция мочи при кислотном рН на каолине, и ее экстракция аммиаком; в) элюирование фракции (а) на смоле Вiо Rex 70 с использованием аммиака; с) элюирование фракции (в) на DEAE-Сефарозной смоле с использованием ацетатного буфера; d) элюирование фракции (с) на СМ-Сефарозной смоле с использованием ацетатного буфера; е) элюирование фракции (d) на С18-смоле (ВЭЖХ) с использованием смеси ацетатного буфера и ацетонитрила; f) элюирование фракции (е) на DЕ-52-смоле с использованием ацетатного буфера; g) элюирование фракции (f) на D-Zhephyr-смоле с использованием ацетатного буфера; h) элюирование фракции (g) на C18-смоле (ВЭЖХ) с использованием смеси водной трифторуксусной кислоты и ацетонитрила. i) элюирование фракции (h) на D-Zhepgyr-смоле с использованием ацетатного буфера. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантным ДНК-молекулам, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид настоящего изобретения, его активные мутанты, или гибридные белки; а также к содержащим их векторам экспрессии; к клеткам-хозяевам, трансформированным этими векторами; и к способу получения указанным полипептидов, их активных мутантов, или гибридных белков, путем культивирования указанных трансформированных клеток в соответствующей культуральной среде. Термін "рекомбинантные ДНК-молекулы" относится к геномной ДНК, кДНК, синтетической ДНК, и к комбинациям. В частности, настоящее изобретение относится к нулкотидным последовательностям, проиллюстрированным в SEQ ID № 2 и SEQ ID № 3, соответственно. SEQ ID № 2 представляет собой геномную ДНК-последовательность, кодирующую Компонент В. На рис. 2 показана рестрикционная карта транскрипционной единицы Компонента В; SEQ ID № 3 представляет собой кДНК-последовательность, кодирующую Компонент В; На рис. 8 показана полная кДНК-последовательность, кодирующая Компонент В, в которой указаны сайты рестрикции. Клонирование Компонента В может быть осуществлено различными способами. В одном из таких способов, получают олигонуклеотид или смесь нуклеотидов, последовательность которых, выведенную всходя из последовательности Компонента В или его фрагмента, используют в качестве зонда для клонирования кДНК или геномной ДНК, кодирующей Компонент В. SEQ ID № 4 представляет собой аминокислотные последовательности, кодируемые геномной ДНК (SEQ ID № 2) и кДНК (SEQ ID № 3). Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным ДНК-молекулам, которые гибридизируются с ДНК-последовательностью, кодирующей Компонент В или его фрагмент. Нужный ген может содержать или не содержать природные интроны, и может быть получен, например, путем экстракции из соответствующи х клеток с последующей очисткой известными методами. Соответствующие препараты ДНК, как человеческая геномная ДНК, разрезают подходящими способами, предпочтительно с использованием рестриктирующих ферментов, и полученные таким образом фрагменты вводят в соответствующие рекомбинантные векторы для создания библиотеки ДНК. Указанные векторы могут быть отобраны с помощью синтетических олигонуклеотидных зондов в целях идентификации последовательности, кодирующей Компонент В настоящего изобретения. В соответствии с настоящим изобретением, геномную ДНК Компонента В выделяют и клонируют. С другой стороны, из клеток, экспрессирующи х Компонент В, может быть выделена соответствующая мРНК и использована для продуцирования комплентарной ДНК (кДНК) известными методами. Эта кДНК, после превращения в двойную спираль, может быть введена в соответствующий вектор, который затем используют для трансформации подходящей клетки-хозяина. После этого, культуры отбирают с использованием соответствующего зонда в целях получения кДНК, кодирующей целевые последовательности. После выделения нужного клона, кДНК подвергают, в основном, таким ее манипуляциям, что и геномную ДНК. кДНК не содержат интроны. Из-за вырожденности генетического кода, могут быть использованы различные кодоны, кодирующие конкретную аминокислоту, так, чтобы продуцировался один или несколько олигонуклеотидов, каждый из которых способен кодировать фрагменты Компонента В. Однако, лишь один член этого пула имеет нуклеотидную последовательность, идентичную последовательности данного гена. Присутствие это го члена в пуле и его способность гибридизироватъся с ДНК также в присутствии други х членов пула позволяет использовать группу нефракционированных олигонуклеотидов таким же образом, как один олигонуклеотид, который должен быть использован для клонирования гена, кодирующего целевой пептид. Альтернативно, единственный нуклеотид, содержащий последовательность, относительно которой можно теоретически с наиболее высокой степенью вероятности предположить, что она способна кодировать генные фрагменты Компонента В (согласно описанию, приведенному в "rules for Hu use of codons" (правила использования кодонов") – Zathe R. Et al., Molec.Bid., 183:1 - 12 (1985)), позволяет идентифицировать комплементарную ДНК, кодирующую Компонент В или в его фрагмент. Способы гибридизации нуклеиновых кислот известны и описаны в литературе (см., например, Maniatis T. et al., Molecular Cloning: a Zaboratory Manual, Cold. Spring Harbor Press, Cold. Spring Harbor, ny, 1982); Haymes B.T. et al., Nucleic Acid Hybridization; a Practical Approach, LRL Press, Oxford, England, (1985)). Гибридизация с использованием указанного зонда или группы нуклеотидных зондов позволяет идентифицировать в геномной или кДНК-библиотеке ДНК-последовательности, способные к такой гибридизации, которые после последующего анализа, подтверждали свою способность кодировать полипептид настоящего изобретения (т.е., Компонент В). Олигонуклеотид, содержащий такую комплементарную последовательность, может быть синтезирован и использован в качестве зонда для идентификации и выделения гена полипептида настоящего изобретения т.е., Компонента В (Маниатис и др., см. выше). После того, как соответствующий олигонуклеотид, специфичный для Компонента В, будет отобран в соответствии с вы шеописанным методом, он может быть синтезирован и гибридизирован с ДНК, или, предпочтительно, с кДНК, происходящей от клеток, способных экспрессировать нужный ген, предпочтительно, после обогащения источника кДНК нужными последовательностями, например, путем экстракции РНК из клеток, продуцирующи х высокие уровни нужного гена, и последующего превращения этой РНК в соответствующую кДНК с использованием обратной транскриптазы. Альтернативно, могут быть синтезированы подходящие олигонуклеотиды, специфичные для Компонента В, и затем использованы в качестве праймеров для амплификации кДНК-фрагментов Компонента В с помощью PACE-PCR (M.A. Innit et al., OCR Protocols A Yuide to Methods and Application, Academic Press, 1990). В частности, в соответствии с настоящим изобретением, сначала, для идентификации наиболее подходящего источника для мРНК Компонента В, осуществляли поиск соответствующи х тканей человека и клеточных линий. Для этого скринировали ткани человека, происходящие из головного мозга, почек, печени, легких, сердца, поджелудочной железы, плаценты, селезенки, яичек, тимуса, и матки, а также клеточные линии эпителиоидной карциномы, промиелоцитарного лейкоза, аденокарциномы молочной железы, лимфомы Беркита и миеломы. Скрининг осуществляли с помощью чувствительного анализа, основанного на полимеразно-цепной реакции с использованием обратной транскриптазы (RT-PCR). Наилучшим источником мРНК оказались ткани матки человека. Из этой ткани, с использованием метода быстрой амплификации, называемого "быстрой 3’- и 5’амплификацией кДНК-концов" получали кДНК-лоны Компонента В. Затем, ДНК-молекулы, кодирующие Компонент В, и полученные вышеуказанным методом, вводят в экспрессирующие векторы с использованием известной техники (Маниатис и др., см. выше). Двухспиральную кДНК лигируют в плазмидные векторы с помощью, например, метода, в котором используются синтетические ДНК-адапторы, или с помощью метода, в котором проводится "связывание по тупым концам". Для экспрессии целевого белка, экспрессирующий вектор должен также включать в себя специфические нуклеотидные последовательности, содержащие информацию, необходимую для регулирования транскрипции и трансляции ДНК, кодирующей нужный белок, так, чтобы могли осуществляться экспрессия нужного гена и продуцирование белка. Сначала, для того, чтобы осуществлялась транскрипция нужного гена, перед этим геном должен быть помещен промотор, который может распознаваться РНК-полимеразой, и с которым эта полимераза связывается, способствуя, тем самым инициации транскрипции. Многие из известных промоторов, "работающих" с различной степенью эффективности (сильные промоторы и слабые промоторы), подразделяются на промоторы, используемые в прокариотических клетках, и на промоторы, используемые в эукариотических клетках. Промоторы, которые используются в настоящем изобретении, могут быть конститутивными (нерегулируемыми) промоторами, например, такими, как промотор int лямбда-бактериофага, промотор ВIа гена b-лактамазы в рBR322, и промотор CAT гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы pPR325, и т.п., или индуцибельными промоторами, например, такими, как промоторы прокариотов, например, правый и левый главные промоторы лямбда-бактериофага (ΡΙ и Рr), промоторы, trp, rec A, iac Z, Iac I, ompF и gaI E.Coli или гибридный промотор trp-lac, и т.п. Ylic B.R., J.Ind.Microbiol., 1:277 – 282 (1987)). Для гарантии эффективной трансляции мРНК, необходимо, чтобы вместе с сильными промоторами, способными к продуцированию очень больших количеств мРНК, обеспечивающих высокие уровни экспрессии гена в прокариотических клетках, использовались также сайты связывания с рибосомами. В качестве примера могут служить последовательности Shine-Dalgano (SD), помещенные на соответствующем расстоянии от инициирующего кодона. Для эукариотических клеток-хозяев могут быть использованы различные последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию, в зависимости от природы конкретного хозяина. Эти последовательности могут происходить от вирусных источников, таких, как аденовирус, вирус папиломы, обезьяний вирус или т.п., где сигналы регуляции ассоциируются со специфическим геном, имеющим высокий уровень экспрессии. В качестве примеров могут служить промотор ТК вируса герпеса, промотор вируса SV 40, промотор гена ga14 дрожжей, и т.п. Сигналы инициация транскрипции могут быть выбраны таким образом, чтобы при индуцировавши супрессии или активации можно было соответствующим образом модулировать экспрессию генов. Затем ДНК-молекулу, содержащую н уклеотидную последовательность, кодирующую Компонент В настоящего изобретения, вместе с сигнальными последовательностями, регулирующими транскрипцию и трансляцию, вводят в вектор, который способен интегрировать последовательности целевого гена в хромосоме клетки-хозяина. Клетки, несущие в свои х хромосомах введенную ДНК, могут быть отобраны путем введения одного или нескольких маркеров, позволяющих выбрать клетки, которые содержат экспрессирующий вектор. Такие маркеры могут сообщать клеткам, например, резистентность к антибиотикам или к тяжелым металлам (таким, как медь). Селективный ген может быть непосредственно связан с ДНК-последовательностями, которые должны быть экспрессированы, или он может быть введен в саму клетку путем констрасфекции. Для осуществления более высокой степени экспрессии гена, может оказаться необходимым также присутствие други х элементов. Такими элементами могут быть, например, энхансеры транскрипции, сигналы терминации транскрипции, и интроны. Экспрессирующие векторы, которые содержат такие элементы описаны Okayama H., Mol. Cell Biol. 3: 280 (1983). При выборе конкретного плазмидного или вирусного вектора долены учитываться следующие факторы: легкость обнаружения клеток, содержащих данный вектор, т.е., эти клетки долены быть легко отделены от клеток, не содержащих этого вектора; число копий векторов, которые Желательно получить в данном конкретном хозяине; и возможность или невозможность перенесения вектора среди различных клеток-хозяев. Предпочтительными прокариотическими векторами являются плазмиды, способные реплицироваться в E.Coli, например, такие, как pBR322, CoIEI, PS C101, pACYC 184 и т.п. (Maniatis T. и др., см. выше), плазмиды Bacillus, например, такие как pC194, pC221, pT127, и т.п. (Yrycsan T.M. The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, 307-329 (1982)), плазмиды Strepfomyces, например, такие, как pIJ101 (Kendall K.J. et al., J.Bacteriol. 169:4177 – 83), плазмиды Peseudomonas (John J.F. et al, Re v. lufect. Dis. 8:693 – 704 (1986)) (lgaki K.Ipn. I.Bacteriol. 33:729 – 742). Предпочтительными эукариотическими векторами являются например, ВРV, SV40, бакуловирус, и т.п., или их производные. Указанные векторы известны специалистам (Bosfcin D. Et al., Miami Wint Symp. 19:265 – 274) (Broach J.R. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Zife Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor, NY, 455 – 470 (1981) (Broach J.R., Cell 28:203 – 204 (1982)) (Bollon D.P. et al., J. Clin. Hemafol. Oncd. 10:39 – 48 (1980)) (Maniatis T. Cell Biology. A Cpmprehensive Treafise vol. 3: Yene Expression, Acad. Press, NY, 563 – 608 (1980)). Полученный энслрессирующий вектор вводят в соответствующую хозяйскую клетку стандартными методами, такими, как трансформация, трансакция, липофекция, конъюгация, слияние протопластов, электропорация, осаждение фосфатом кальция, прямое микроинъецирование, и т.п. В целях настоящего изобретения могут быть использованы прокариотические или эукариотические клетки-хозяева. Предпочтительными прокариоташ являются бактерии, такие, как E.coli, Bacillus, Streptomyces, pseudomonas, salmonella, serratia и т.п. Особенно предпочтительной является Е.coli, например, штамм 294 Е.coli Κ12 (АТСС 314446), или Ε.coli Χ1776 (АТСС 31537), Е.coli W3110 (F, лямбда, АТСС 27325). Предпочтительными эукариотическими клетками-хозяевами являются клетки млекопитающих, например, клетки человека, обезьяны, мыши, или хомяка (СНО, клетки яичника китайского хомячка), поскольку эти клетки обеспечивают посттрансляционную модификацию белковых молекул, например, правильную укладку и гликозилирование в нужных положениях. В целях настоящего изобретения могут быть также использованы дрожжевые клетки. Благодаря имеющейся в настоящее время различной технике рекомбинантных ДНК, в которой используются последовательности сильных промоторов и большое число копий плазмид, нужный белок может быть продуцирован и в дрожжах. После введения вектора в хозяйские клетки, эти клетки культивируют в среде, способствующей селективному росту клеток, содержащих указанный вектор. Экспрессия клонированной ДНК-последовательности обеспечивает продуцирование Компонента В, его мутанта или фрагмента. Продуцированный таким образом белок выделяют иди очищают традиционными методами, например, путем экстракции, осаждения, хроматографии, электрофореза, и т.п., или путем аффинной хроматографии с использованием антител против Компонента В, иммобилизованных на колонке с гелем. Компонент В может быть также продуцирован как белок, секретируемый из молока трансгенных млекопитающих. В еще одном своем варианте, настоящее изобретения относится к использованию Компонента В, его солей, функциональных производных, предшественников, или активных фракций в качестве лекарственного средства. В частности, Компонент В обладает противоспалительными, антиокагулирующими, и противоопухолевыми свойствами. Кроме того, Компонент В может быть использован для лечения патологий, связанных с изменением уровней TGF-альфа (фактора роста Т-клеток), например, поведенческих и гормональных растройств, антигенеза, и т.п. На практике, было показано, что Компонент В ингибирует связывание TGF-альфа с его рецептором с константой аффинности, составляющей Кi = 0,77 х 10-10Μ, и измеренной путем вытеснения I125 - TGF-альфа из его рецептора, полученного из мембраны клеток А 431. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически активное количество Компонента В в комбинации с фармацевтически приемлемыми наполнителями или разбавителями. Такие композиции могут быть получены для перрального, ректального, интраназального, и предпочтительно для парентерального введения. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, Компонент В может быть использован для местного применения. Композиции настоящего изобретения могут быть также изготовлены в виде форм с пролонгированным высвобождением, например, в виде подкожных имплантатов, полученных на основе липосом или микрокапсул сополомеров молочной и гликолевой кислот. Другие варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения на конкретных примерах. Пример 1 Способ получения компонента В из мочи человека Получение и очистка компонента В из мочи человека полностью проиллюстрированы на ряс. 1. а) Стадия 1 К исходному материалу, представляющему собой мочу человека, добавляли соляную кислоту до те х пор, пока рН не становился равным 3,0. После декантирования осадка, к моче (10г/1л исходной мочи) добавляли каолин. Полученную суспензию оставляли на 16 часов, а затем центрифугировали. После удаления супернатанта, каолин экстрагировали аммиаком 2М при рН = 11,0. рН аммиачного элюата доводили до 8,0 и концентрировали с помощью мембранной ультрафильтрации (отрезок 1000Да). Всю эту процедуру осуществляли при температуре 4°С. Стадия 2 К раствору стадии (а) добавляли уксусную кислоту до тех пор, пока рН не становился равным 4,0, а затем добавляли смолу Bio Rex 70, предварительно уравновешенную в ацетатном буфере при рН = 4,0. Полученный раствор оставляли для перемешивания на 4 часа, а затем фильтровали на фильтре-прессе. Адсорбированный материал элюировали из смолы Вiо Rex 70 с использованием аммиака при рН = 9,0. Хроматографический элюат концентрировали с помощью мембранной ультрафильтрации (отрезок 1000Да). Всю эту процедуру осуществляли при температуре 4°С. с) Стадия 3 Материал стадия (в), уравновешенный в ацетатном буфере, при рН = 5,6, адсорбировали на ионообменной смоле, подобной DЕАE-Сефарозе, предварительно уравновешенной при рН = 5,6. После адсорбции, элюированне осуществляли с использованием аммоний-ацетатного буфера 0,5Μ при рН = 5,6. Затем хроматографический элюат концентрировали с помощью мембранной ультрафильтрации (отрезок 1000Да). Всю эту процедур у осуществляли при 4°С. d) Стадия 4 Материал стадии (с) уравновешивали в ацетатном буфере при рН = 4,5 и адсорбировали на ионообменной смоле, подобной СМ-Сефарозе и предварительно уравновешенной при рН = 4,5. После завершения адсорбции, элюирование осуществляли аммоний-ацетатным буфером 0,15Μ при рН = 4,5. Хроматографический элюат концентрировали с помощью мембранной ультрафильтрации (отрезок 1000Да). Всю эту процедуру осуществляй при температуре 4°С. е) Стадия 5 Материал стадии (d) очищали при температуре 25°С с помощью обращенно-фазозой жидкостной хроматографии высокого разрешения на смоле C18, уравновешенное в аммоний-ацетатном буфере 0,05М при рН = 5,6. Адсорбированный материал элюировали из смолы с использованием раствора ацетата аммония, содержащего 30% (об/об) ацетонитрил. Хроматографический элюат концентрировали путем дистилляции (4°C) в вакууме. f) Стадия 6 Материал стадии (е) очищали с использованием ионообменной сколы, подобной DЕ-52, и уравновешенной в аммоний-ацетатном буфере 0,02Μ при рН = 5,6. Элюирование адсорбированного материала осуществляли с использованием 0,25Μ буфера. Концентрирование осуществляли с помощью мембранной ультрафильтрации (отрезок 1000Да). Всю эту процедуру проводили при температуре 4°С. g) Стадия 7 Материал стадии (f) очи щали на колонке, предварительно упакованной ионообменной смолой, подобной DZephyr (отвержденной с помощью Sepracor), и уравновешенной при рН = 6,2 в 20мM буферном растворе ацетата натрия (буфер А). Элюирование абсорбированного материала осуществляли градиентом от 100% буфера А до 100% буферного раствора ацетата натрия, содержащего 1Μ NaСІ (при рН = 6,2). h) Стадия 8 Материал стации (g) очищали с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого разрешения на смоле C18 при температуре 25°С. После завершения адсорбции, элюирование осуществляли линейным градиентом смеси водного раствора 0,1% трифторукcycнoй кислоты и ацетонитрила, подкисленного 0,1% трифтороуксусной кислотой. Хроматографический элюат концентрировали путем дистилляции (45°С) в вакууме и лиофилизовали. i) Стадия 9 Повторяли стадию 7. В результате этой процедуры получали конечный продукт, компонент В, в виде аморфного белого порошка. Пример 2 Аналитическая характеризация Компонента В В целях определения основных физико-химических характеристик Компонента В, полученный очищенный материал из мочи человека подвергали следующей аналитической обработке. а) Аминокислотная последовательность Аминокислотную последовательность Компонента В определяли в соответствии с методом Эдмана. Анализ осуществляли с использованием секвенатора Applied Biosystem, модель 477А в соответствии с инструкцией изготовителя. Указанный анализ дает возможность идентифицировать аминокислотною последовательность Компонента В с 81 аминокислотным остатками, приведенными в SEQ ID № 1. в) Определение молекулярной массы Анализ осуществляли с помощью масс-спектроскопии электронным ударом (МС-ЭД), в результате чего было установлено, что молекулярная масса составляет 8937,9Да. Этот анализ выявил пять дисульфидных мостиков и остаток в 80Да, относящийся к группе SO4, связанной с Тyr (39). Пример 3 Выделение геномной ДНК Компонента В человека Библиотека геномной ДНК человека в лямбда-фаговом векторе ЕМВL-3 SP6/T7 поставлялась фирмой Ciontech (кат. № HL 1067, J.Zot № 1221). Геномную ДНК экстрагировали из плаценты человека и частично переваривали ферментом Sau ЗА. Перед клонированием в BamHI-сайт вектора ЕМВ-3 Sp6/T7, ДНК-фрагменты выделяли с использованием градиента сахарозы, с получением фрагментов размером от 8 до 22Кb. Среда для культивирования Клетки Е.coli К802, поставляемые ширмой Clontech (кат. № С1004-1) культивировали в LB-среде, дополненной 10мМ MgSO 4 и 0,2% мальтозой (среда для культивирования). Фаговую библиотеку разводили в 0,1Μ NаСІ, 8мМ МgSО4 , 50мМ Трис-СІ (рН 7,5) и 0,01% ;желатине (SМ). ДНК-библиотеку культивировали на LB-чашках с 1,5% агаром. Верхняя агароза для культивирования библиотеки содержала 0,136М NаСl, 0,6% агарозу, и 1% триптон (Merck кат. № 7213). Реагенты для гибридизации 20 χ SSC Гибридизирующий раствор Раствор А для промывки (HRP-олигонуклеотиды) Раствор В для промывки (32р-олиго СВЕХ4L) Система детекции 3M NaCI, 0,3 Μ цитрат натрия, pH 7 5 χ SSС, 0,02% SDS, 0,1% N-лауроилсаркозин, 0,5 блокирующий реагент (Boehringer кат. № 1096176). 3 х SSС, 0,1% SDS, мочевина, при различных концентрациях, в зависимости от типа зонда (см. ниже). 1 х $SС, 0,1% SDS Гибриды HRP-олиго/ДНК обнаруживали с помощью ECL-набора и экспонировали с пленкой (Hyperfilm ECL от фирмы Amersham, кат. № PPM 2106 и 2104, соответственно). 32 р-Олигозондированные фильтры обнаруживали путем экспонирования с пленкой b-mах (Hyperfilm b-max, Amersham, кат. № PRN10). Олигонуклеотиды Олигонуклеотиды синтезировали с помощью автоматического синтезатора ДНК (Applied Biiosystem мод. 392). Олигонуклеитиды очищали с помощью кассет ОРС (Applied Biiosystem кат. № 400771) или с помощью электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле (ПΑΑΓ). Олигонуклеотиды СВ1, СВ2 и CBEX2L, используемые в качестве зондов, модифицировали с помощью аминомодификатора ММТ-С12 (Clontech кат. № 5206-1) в процедуре последнего цикла синтеза. Пероксидазу хрена (HRP, Boehrunger кат. № 814393) конъюгировали с модифицированным олигонуклеотидом в соответствии с описанием М. S. Urdea (Inc. Ас. Res. 16, 4937, 1988), используя 1,4фенилендиизотиоцианат (Aldrich, кат. № 25855-5) в качестве гомобифункционального кросслинкера. HRР-Олигонуклеотидные зонды очищали с помощью анионообменной хроматографии высокого разрешения (ВЖХР) на колонке с Nucleopac РА-100 (Dionex кат. № 043010). Затем осуществляли элюирование 20мМ буферным раствором фосфата натрия при рН = 6,0 к линейным градиентом хлорида натрия (от 0,2Μ до 1,0 М) в течение 30 минут. Очищенные HRP-олигонуклеотиды концентрировали с помощью Centricon 10, промывали фосфатнобуферным раствором (РВS), и хранили в темноте при 4°С. Концентрацию НRР-олигонулкотида вычисляли при OН400 (Е 403 = 89,5см -1 х мМ-1). Затем синтезировали следующие олигонуклеотиды: Титрование библиотеки Геномную ДНК-библиотеку человека титровали в соответствий со стандартными процедурами (F, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology) путем инфицирования 0,3мл культуры клеток Е.соli К802, выдержанной в течение ночи, различными разведениями библиотеки, в пределах от 2 х 10-3 до 2 х 10-7. Смесь клеток библиотеки инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем в течение 10 минут смесь инкубировали при 37°С. Инфицированные клетки смешивали с 4 миллилитрами верхней агарозы, предварительно нагретой при температуре 50°С, а затем выливали в 10см-планшеты с агаром, предварительно нагретом при 37°С. Эти планшеты инкубировали в течение ночи при температуре 37°С. Число бляшек подсчитывали в каждом планшете. Планшеты с дубликатами культуры получали для каждого титра библиотеки. Как это ожидалось, титр геномной ДНК-библиотеки составлял 5 х 109БОЕ/мл. Скринирование библиотеки Плетки E.coli K802 культивировали в течение ночи при температуре 37°С. 0,6 мл клеточной культуры инфицировали аликвотой библиотеки (6 х 104БОЕ), суспендированной в СМ Инфицирование и культивирование осуществляли вышеописанным способом, за исключением того, что использовали 9мл верхней агарозы и 15смпланшеты. Полуконфлюэнтные бляшки переносили на найлоновую мембрану Hybond N+ (Amersham) в соответствии с инструкцией руководства фирмы Amersham. Блотированные ДНК денатурировали путем наложения фильтров, колониями, кверху, на фильтровальную бумагу, пропитанную 1,5М-хлоридом натрия и 0,5М-гидроксидом натрия, на 7 минут. Затем блотированные ДНК нейтрализовали путем наложения фильтров на фильтровальную бумагу, пропитанную нейтрализующим раствором (1,5Μ NаСІ, 0,5Μ Трис-СІ (pН 7,2), 1мМ ЭДТА)) (в каждом случае, 2 х·3 мин). Фильтры промывали в 2 х SSС и осушали воздухом. ДНК закрепляли на мембране путем наложения фильтров на фильтровальную бумагу, погруженную в 0,4 Μ NаОН, на 20 минут. После этого фильтры промывали в 5 х SSC в течение одной минуты, а затем хранили в полиэтиленовом мешке при 4°С вплоть до гибридизации. Человеческую геномную ДНК-библиотеку (1 х 106 клонов) скринировали с высокой плотностью, с использованием олигонуклеотидных зондов HRР-СВ2. Затем были выбраны 20 положительных клонов. Шесть положительных клонов повторно скринировали с использованием олигонуклеотидного зонда HRР-СВ1 и олигонуклеотидного зонда HRP-СВ2. Три клона, обозначенные 4D, 12Β и 15, были подтверждены как положительные в отношении гена компонента В. Гибридизация Фильтры предварительно инкубировали в течение 30 минут при 42°С в гибридизирующем растворе, а затем гибридизировали с использованием соответствующего олигонуклеотидного зонда HRP (5нг/мл олигонуклеотидной части в гибридизирущем растворе), при температуре 42°С в течение 45 минут, и наконец, дважды промывали (по 15 минут каждый) при температуре 42°С в прорывающем растворе, содержащем мочевину в соответствующей концентрации (см. ниже). Затем фильтры промывали в 2 х SSС при комнатной температуре, а гибридизированные бляшки обнаруживали с помощью ECL-реагентов и экспонировали с пленкой Hyperfilm в течение 60 минут. Для минимизации неспецифической гибридизации с E.coli и ДНК лямбда-фага были экспериментально определены условия промывки для HRP-олигозондированных фильтров. Серийные разведения в пределах от 500 до 15 аттомолей целевой ДНК были нанесены пятнами на мембрану Hybond N + в присутствии ДНК лямбдафага (10нг). ДНК лямбда-фага и ДНК E.coli (10нг каждая) были использованы в качестве негативного контроля. После этого получали несколько полосок и использовали их в экспериментах для гибридизации с использованием 5нг/мл олигонуклеотидного зонда. Промывку осуществляли с использованием промывочного раствора А, содержащего 0%, 9%, 18%, 27%% и 36%-ную мочевину. 182% и 27% мочевина оказалась эффективной для СВ1 и СВ2, соответственно. Фильтры, гибридизированные с использованием CBEX2L, промывки промывочным раствором А, содержащим 18% мочевину. Гибридизацию с использованием 32Р-олинонуклеотида СВЕХ4 осуществляли при 50°С, а фильтры промывали в промывочном растворе В при температуре 45°С. Субскринирование бляшек Позитивные колонны собирали в Пастеровскую пипетку и переносили в сосуд, содержащий Iмл СМ + 1 каплю хлороформа. После 2-часовой инкубации при встряхивания при комнатной температуре, суспензия фага хранилась при 4°С. Разведение 10-3 суспензии фага наносили на 10см-платы и рескринировали на двух повторяющи хся фильтрах с двумя олигозондами, т.е. один используется в первом скрининге, а другой соответствует примыкающему району компонента В. Независимые клоны, позитивные с обоими зондами, были отобраны и ресуспендированы как указано выше. Приготовление фаговых стоков Позитивные клоны были размножены инфекцией клеток Е.coli K802 и выращиванием на 15см-агаровых платах. После инкубации в срезе ОN при 37°, сливающийся лизат был собран с агаровых плат с использованием 10мл SМ. Были добавлены несколько капель хлороформа, клеточный дебрис удален центрифугированием при 3000об/мин в течение 5мин при 4°С и прозрачный супернатант, содержащий фаг, был перенесен в 50%% глицерин, разлит на части и заморожен при -80°С. Экстракция фаговой ДНК 2 х 109 клеток Ε.coli Κ802 были инфицированы отобранным фаговым клоном (соотношение клетка/фаг 4:1) и выращены в 100мл жидкой культуральной среды ΟN при 37°С. В конце инкубации осуществлялся полный лизис клеток добавлением к культуре хлороформа 5мкл/мл. Фаговая ДНК экстрагировалась с помощью Quiagen по инструкции изготовителя. Секвенирование фаговой ДНК Фаговая ДНК была секвенирована с помощью циклического секвенирующего набора от Applied Biosystem (cat. № 401388) с автоматическим секвенатором ДНК (Applied Biosystem мод. 373А). ДІЖ фага экстрагировали из кленов 4D, 12В и 15, и секвенировали циклами. Праймеры для секвенирования подбирали либо исходя из аминокислотной последовательности Компонента В (CBF1, СBF2, СBР1, СВР2), либо исходя из данных секвенирования кДНК или геномной ДНК. Данные секвенирования указывали на три клона, содержащих полную длину гена Компонента В. Анализ рестрикции фаговой ДНК Фаговую ДНК подвергали однократному или многократному перевариванию рестриктирующим ферментом. ДНК-фрагменты разделяли с помощью электрофореза на 0,6% агарозном геле, а затем блотировали на мембрану Hybond N+. Фильтры повторно зондировали с использованием олигонуклеотидов CВEX2L , СВ2, и CBEX4L, соответствующи х экзонам 1, 2 и 3, соответственно. Субклонирование гена Компонента В в pbluescript 11 SK. Рестрикционный анализ клона 4D Компонента В, проведенный с использованием ферментов EcoR1, Xho1 и Sfi1, и Саузернблот-анализ, проведенный с использованием олигонуклеотидных зондов, специфичных для трех зкзонов Компонента В, обнаруживали наличие полного гена Компонента В, содержащего 5,2Кb EcoR1-фермент (Рис. 5). Фаговую ДНК экстрагировали из клона 4D и переваривали ферментом ЕсоR1. Полученные ДНК-фрагменты разделяли с помощью электрофореза на агарозном геле. 5,2Кb-фрагент очищали с помощью Quaex (qiacen, кат. № 20020) и лигировали в EсоR1-линеаризованный pBluescript 11 КС (Strafagene кат. № 212207). Штамм E.coli XLIBlue (Strafagene кат. № 200268) трансформировали с использованием лигирующей смеси, а трансформированные клетки отбирали на Ар/Тс-ча шках. Как показал рестрикционный анализ с использованием фермента EcoR1, был выделен один клон, содержащий нужную плазмиду, который был назван рВS СВ4D. Затем осуществляли рестрикционный анализ с использованием Sma1, Kpn1, Hind111, Sfi1, Acc1, Not1, Sa11, Xho1, EcoR1, Cla1, Hinc11, Hind11, Sca1, Bg1 11, Aat2, Nco1, Nhe1, Hpa1 и Mlu1. Кроме того, осуществляли Саузерн-блот-анализ с использованием олигонуклеотидных зондов, специфичных для Компонента В и плазмиды рВS CB4D после однократного и двойного переваривания. На рис. 6 показана рестрикционная карта плазмиды рВS CB4D. На рис. 4 показана рестрикционная карта гена Компонента В. Ген Компонента В содержит 3 экзона, разделенные друг от др уга двумя нитронами. Эти экзоны фланкнрованы соответствующими сайтами. Экзон 1, имеющий длину 84п.о., содержит 26 нулеотидов нетранслированной мРНК, и последовательность, кодирующую 19 аминокислот предполагаемого сигнального пептида. Этот экзон отделен от экзона 2 интроном, длина которого составляет 410п.о. Экзон 2, имеющий длину 120п.о., кодирует 3 аминокислоты предполагаемого сигнального пептида и 37 аминокислот зрелого белка. Этот экзон отделен от экзона 3 интроном, длина которого составляет около 550п.о. Экзон 3, имеющий длину 326п.о., кодирует С-концевые 44 аминокислоты Компонента В, и содержит 192 нуклеотида нетранслируемой мРНК, которая имеет сигнал полиаденилирования (ТАТААА), расположенный на расстоянии 14п.о.("вверх по течению") от сайта 3’-процессинга, к концу которого добавляется роlyА-хвост. В частности, было установлено, что в трех геномных клонах, последовательность, кодирующая сигнальный пептид, содержит кодон Lеu в положении 11 предполагаемого сигнального пептида. Было установлено, что аминокислотная последовательность Компонента В, продуцированная геномным геном, идентичная последовательности, экспериментально определенной методом расщепления по Эдману. Анализ последовательности, расположенной перед экзоном 1, выявил промоторную область (Рис. 3), содержащую ТАТА-блок (в-28), и различные, расположенные "вверх по течению" элементы промотора и энхансеры, включая GC-богатый участок в-58, АР-1-сайт в-83, АР-2-сайт в-360, и несколько Е-блоков, ТАТА-блок является предпочтительным сайтом связывания для инициации транскрипции фактора TF111. GC-богатый участок представляет собой сайт связывания для sр-1, главного фактора транскрипции, участвующего в транскрипции широкого ряда генов (Transcription and Splicing, B.D. Hames & D.M. Clover Sas., IRL Press, 1988). АР-1-сайт является сайтом связывания для АР-1, комплекса факторов транскрипции, образованного c-fcs и cjun. АР-1-сайт присутствует в нескольких генах, ответственных за рост и дифференцировку клеток. АР-1 является одним из нескольких cis-элементов, опосредующих отве тную реакцию по отношению к активаторам протеинкиназы С (The hormonal control of genetranscriotion P. Cohen & J.G. Foulkes End Elteirir, 1991). АР-2-сайт является мишенью для АР-2, фактора транскрипции, активированного РМА и сАМР (itidem). Е-блоки являются обобщающие последовательностями, обнаруженными в нескольких энхансерных областях, и играют важную роль для определения тканеспецифической экспрессии генов, Ε-блок содержит последовательность CANNТG, где два основания, расположенные в середине, могут меняться для каждого конкретного Е-блока. (R.E. Lingston Current Opinion Cell Biol. 1989; 1, 1081 – 1087). Промотор Компонента Б содержит потенциальный восприимчивый элемент для рецептора фактора глюкокортикоидной реакции (GΡЕ) что указывает на то, что ген Компонента В может быть индуцирован глюкокортикоидами. Субклонирование гена Компонента В в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих Известно, что продуцирование rec-белков в клетках млекопитающих может быть увеличено благодаря присутствию нитронов. Геномная ДНК Компонента В может быть экспрессирована в клетках млекопитающих. Для этого, 1364п.о. - фрагмент, простирающийся от +50 до +1413 гена Компонента В, вырезали из плазмиды pBS СВ4D путем переваривания ферментами Pvu 11 и Nar 1. На рис. 2 показана рестрикционная карта транскриптона Компонента В, где Pvu 11- и Nar 1-сайты расположены по концам. Полный ген Компонента В восстанавливали путем датирования этого фрагмента с синтетическим олигонуклеотидом, воспроизводящим 5’конец гена, фланкированного соответствующим рестрикционным сайтом для последующего клонирования гена в эукариотической зкспресирующей плазмиде. Пример 4 Выделение кДНК-клонов Компонента В Для получения частичных кДНК-клонов, соответствующи х 5’- и 3’-концам мРНК Компонента В использовали способ быстрой амплификации кДНК-концов, описанной Frohman et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85; 8998. Частичные клоны содержат перекрывающуюся ДНК-последовательность, а поэтому, они могут быть использованы для конструирования полной кДНК-последовательности Компонента В. Схема, иллюстрирующая общую стратегию для PAGE-клонированля, показана на рис. 7. В 3’-PAGE, ДНК-последовательность второго экзона гена Компонента В использовали для конструирования генного специфического праймера СКСВ1 (5’-TCAACTCCTACACCTCCAACC AC-3’) (SEQ ID № 21). Синтез кДНК инициировали от poly А-конца poly А+ РНК матки человека с использованием в качестве праймера одигонуклеотид 5-CGCCAGGCGTCGACTGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’ (seq id№ 24), называемый адапторным праймером АР. кДнк использовали в качестве матрицы для полимеразно-цепной реакции (PCR), где в качестве праймеров использовали СКСВ1 и АР, которые продуцировали фрагмент, имеющий приблизительно 450п.о., и соответствующий 3’-концу кДНК Компонента В. В 5’-PAGE, из ДНК-последовательности 450п.о. 3’-РАСЕ-фрагмента конструировали праймер СКСВ7 (5’CGTCAGAGAGGAGGTC-3) (SEQ ID № 22), который использовали в качестве праймера для синтеза кДНК из poly А± РНК матки человека. После очистки в целях удаления мРНК и праймера СКСВ7, конец олигодезоксицитидана добавляли к 3’-концу кДНК. Эту кДНК с "хвостом" использовали в качестве матрицы в PCR, где в качестве праймеров служили "гнездовой" праймер СКСВ2 (5’-АССGТСАССАGCGTGGТС-З’) (SEQ ІD № 23) и "якорный" праймер (ACP, 5’-CTACTACTACTAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’) (SEQ ID № 25), или смесь АСР и унйверсального праймера амплификации (UAP, 5’-CTACTACTACTAGGCCACGCGTCGACTAGTAC3’) (SEQ ID № 26). СКСВ2 гибридизировали с 3’-концов последовательности второго экзона, а АСР гибридизировали с олигодезоксицитидиновым "хвостом". В результате получали фрагмент приблизительно в 230п.о., который содержал ДНК-последовательность, соответствующую 5’-концу иРНК Компонента В. Используемые общие схемы эксперимента (например, электрофорез в полиакриламидном геле, осаждение этанолом, лигирование, и переваривание рестриктирующими эндонуклеазами), бактериальные культуральные среды (например, LB), и химические растворы (например, фенол) подробно описаны Sambrook er al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, если это не указано особо. Процедуры 3 RACE-клонирозания З’ RACE - система для быстрой амплификации кДНК-концов была закуплена у Life Technologies, Inc., Yrand Island, NY, Pol y А+-РНК матки человека закупали у Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, C A. Синтез первой нити кДНК осуществляли с использованием протокола и реагентов, составляемых вместе с 3’-RACE-системой. Для этого, 1мкл (1мкг) роly А+-РНК матки объединяли с 1мкл 10мкМ раствора АР и 12мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (ДЕРС), и полученную смесь нагревали 10 минут до 65°С. После охлаждения смеси на льду, реакционные компоненты добавляли так, чтобы конечная композиция имела приблизительно следующий состав: 20мМ Трис-КСІ (рН 8,4, 50мМ КСІ, 2,5мМ КСІ, 2,5мМ МgСl2, 100мкг-мл альбумина бычьей сыворотки, 500нМ АР, 500мкМ каждого из dATP, dСТР, dGTP и dТТР, и 50нг/мкл РНК, в объеме 19мкл). Реакционную смесь нагревали до 42°С, а затем добавляли 1мкл (20ед) обратной транскриптазы Super Script. После 30-минутного инкубирования при 42°С, реакционную смесь охлаждали на льду, и добавляли 1мкл (2ед.) РНКазы II. Затеы проводили РНКаза ІІ-переваривание в течение 10минут при 42°С. Полученную реакционную смесь хранили при 20°С вплоть до осуществления РСR. Для осуществления PCR, были получены четное идентичные смеси (40мкл), каждая из которых имела следующий состав: 1мкл poly А± к ДНК матки в 40мМ КСІ, 70мМ Трис-HCl (рН 8,8) 0,1% Тритон X-100, 1мМ MgСl2, 0,25мкМ СКСВ1, и 0,5мкМ АР. Реагенты из 3’-RACE-системы не использовалась для РСR. CKCB1- и АРпраймеры синтезировали на олигонуклеотидном синтезаторе модели 392 (Applied Biosystems, Inc.). После разблокирования, лиофилизации, и ресуспендирования в DEPC-обработанной воде, измеряли оптическую плотность каждого раствора при длине волны 260нм. Исходя из измерений оптической плотности, в DЕРСобработанной воде приготавливали 10мкМ-раствор каждого из олигонуклеотидов. Неочищенные олигонуклеотидные растворы использовали для РСR-реакции без дополнительной очистки. Концентрацию неочищенного АР, который давал результаты, идентичные результатам, полученым с использованием 3’ RACEсистемы, определяли экспериментально: 0,4мкМ неочищенного АР эквивалентны 0,2мкМ АР, закупленного у Life Technologies для PCR-реакции. 40мкл РСR-реакционной смеси нагревали в термоячейке до температуры 94°С, а затей к каждой смеси добавляли 10мкл смеси, содержащей следующие компоненты: 1,25ед. ДНК-полимеразы AmpliTag (Perlin Elmer Cefus, Norwalk, CT), 40мМ KCl, 70мМ Трис-НСl (pH 8,8), 0,1% Тритон-Х-100, 1мМ MgCl2, и 1мМ каждого из dATP, dTTP, dGTP и dCTP. Конечная концентрация каждого реагента в РСР составляла приблизительно 1мкл кДНК матки на 50мкл, 1,25ед. ДНК-полимеразы AmpliTag на 50мкл; 40мМ KCl, 70мМ Трис-НСl (pH 8,8), 0,1% Тритон-Х-100, 1мМ MgCl2, и 0,2мМ СКСВ1, 0,4мкМ АР, 0,2 каждого из dATP, dTTP, dGTP и dCTP. После завершения 5-минутного инкубирования при 94°С, осуществляли программу термоциклической PCR "Touchdown" в соответствии с описанием Don R.H., Cox P.T., Wainwright B.J., Baker K, & Maffick J.S. (1991) Nucl. Acids Res. 19, 4008, варьируя температуру о тжига от 73°С до 63°С. После PCR-ампилификации, четыре реакционных смеси объединяли, и ДНК-продукты фракционировали по размерах с помощью электрофореза на 5% полиакриламидном геле. ДНК-продукт, имеющий длину приблизительно 450п.о., вырезали из геля, и очищали путем электроэлюирования в диализной трубке. Элюат экстрагировали смесью фенола и хлороформа (50:50, об/об), осаждали этанолом, осушали, и ресуспендировади в 10мкл стерильной воды. Вследствие независимой от матрицы концевой трансферазной активности ДНК-полимеразы Tag, и ее в высокой степени избирательности по отношению dATP (Clark J.M. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 9677, и Mole S.E., Iggo R.D. & Lae D.P. (1989) Nucl. Acids Res. 17, 3319), очищенный РСR-фрагмент в 450п.о., имел, как и ожидалось, один дезоксиаденозиновый остаток у каждого 3’-конца. Для субклонирования и характеризации РСRфрагмента, получали "Т-вектор рBIuescriptSK (Stratagene, La Jolla, СА) в соответствии с описанием Marcguk и др., (1991) Nucl. Acids Res. 19, 1154. Плазмиду pBIuescript (20мкг) переваривали рестриктирующей эндонуклеазой EcoRV, а затем очищали путем экстракции смесью (50:50, об/об) фенола и хлороформа. После осаждения этанолом, ДНК обрабатывали 9 единицами Таg-ДНК-полимеразы в течение 2 часов при 70°С в 50мкл реакции, содержащей 50мМ КСІ, 10мМ Трис-НСl (рН 9,0), 0,1% Тритон-X-100, 1,5мМ МgCl2, и 2мМ dTTP. После этого вектор снова очищали путем экстракции фенолом и хлороформом (50:50, об/об), и осаждали этанолом. Результатом этой процедуры было добавление одиночного дезокситимидинового остатка к каждому 3’-концу, что позволяло использовать этот вектор для инсерции ДНК-фрагментов, синтезированных посредством Таg-ДНКполимеразы. Нефосфорилированный PCR-фрагмент в 450п.о. вставляли в Т-вектор посредством реакции с ДНК-дигазой Т4 New England Biolabs, Beverly, MA), используя условия, рекомендуемые изготовителем. Лигирующую реакционную смесь инкубировали приблизительно 72 часа при 16°С, а затем использовали для трансформации компетентных клеток ХLІ-Вlue Е.coli (Stratagene, La Yolla, CA), Трансформированные клетки высеивали на LВагар, содержащий 50мкг/мл ампицилина. Перед посевом клеток, на поверхность агара каждой чашки наносили путем распыления 100мкл 2% Х-gаI (Life Technologies Inc., Yrand Island, NY), и 40мкл 100мМ ІРТG (Life Technologies, Inc., Yrand Island, NY) и оставляли для осушки. После инкубирования в течение ночи при 37°С, были видны колонии, окрашенные голубым пигментом, и неокрашенные колонии (белые). Из культур с 12 белыми колониями выделяли плазмидную ДНК. Все 12 изолятов содержали вставку в 450п.о. Для последующего анализа выбирали 5 клонов: ЗСВ4, 3CB6, ЗСВ7, ЗСВ8 и ЗСВ9. Анализ ДНК-последовательности проводили с использованием секвеназного набора "Sequenase version 2,0" (United States Biochemical, Cleveland, Ohio). Процедура 5’-RACE-клонирования 5’-RACE-систему для быстрой амплификации кДНК-концов закупали y Life Technologies, Inc., Yrand Island, NY Poly А+ РНК матки человека закупали у Clontech Laboratories, Palo alto, CA. Эксперименты по 5’-RACEклонированию осуществляли с использованием протокола и реагентов, поставляемых вместе с 5’-RACE системой, за исключением того, что: (а) СКСВ7-, АСР- и U АР-праймеры синтезировали на олигонуклеотидном синтезаторе модели 392, Applied Biosystem, Inc., и использовали как описано для 3’-RACE-клонирования; и (в) термоциклическую программу PCR "Fouchdown", описанную для 3’-RACE-клонирования использовали для кДНКамплификации. Первую нить кДНК синтезировали следующим образом: 1мкл (1мкг) poly А+ РНК матки объединяли с 0,5мкл 10мМ раствора СКСВ7 и 13,5мкл DЕРС-обработанной воды, и полученную смесь нагревали при 70°С в течение 10 минут. После охлаждения смеси на льду, добавляли реакционные компоненты, так, чтобы конечный состав приблизительно содержал: 20нМ ТРИС-HCl (рН 8,4) 50мМ КСl, 3мМ МgCI2, 10мМ DТТ, 200мМ СКСВ7, 400мкМ каждого из dATP, dCTP, dGTP, и dTTP, и 40нг/мкл РНК, в объеме 24мкл. Реакционную смесь нагревали до 42°С, и добавляли 1мкл (220ед), обратной транснриптазы, Superscript ІІ. После 30-минутного инкубирования при 42°C, и 15-минутного инкубирования при 70°C, реакционную смесь помещали в условия 55°С, и добавляли 1мкл (2ед). РНказы II. Переваривание РНКазой II осуществляли в течение 10 минут при температуре 55°C. кДНК отделяли от неключенных dNTPs, CKCB7, и белков с использованием Ylassmax DNA Iaolation Spin Cartridge (входящего в 5’-RАСЕ-систему). В частности, 120мкл раствора для связывания (6Μ NaI) добавляли к реакционной смеси первой нити, и кДHК NаI раствор переносили в центрифужную пробирку GIASS МАХ. После центрифугирования при 13000 х g в течение 20сек., добавляли 0,4мл холодного (4°С) промывочного буфера. Затем центрифуговали еще 20сек. при 13000 х g. Эту стадию повторяли еще два раза. После двухкратной промывки 400мкл холодного (4°С) 70% этанола, кДНК элюировали путем добавления в центрифужную пробирку 50мкл стерилизованной дистиллированной воды, после чего центрифугировали еще 20 секунд при 13000 х g. Гомополимерный "хвост" добавляли к 3’-концу кДНК с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (ТdТ) и dСТР. Эту реакцию осуществляли в PCR-совместимом буфере. 10мкл очищено кДНК объединяли с 7,5мкл DЕРС-обработанной воды, 2,5мкл 10 х реакционного буфера, 1,5мкл 25мМ раствора МgСl2, и 2,5мкл 2мМ раствора dCTP. Реакционную смесь инкубировали в течение 2 - 3 минут при 94°С. После охлаждения в течение 1 минуты на льду, добавляли 1мкл TdT (10ед./мкл). Конечная смесь имела следующий состав: 10мкл кДНК в 20мМ Трнс-НСl (рН 8,4), 50мМ КСl, 1,5мМ МgСl2, 200мкМ dСТР, 0,4ед./мкл ТdТ. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 минут при 37°C, а затем в течение 10 минут при 70°С для инактивации TdT. Для осуществления РСR, были приготовлены четыре различные реакционные смеси, имеющие следующие конечные концентрации праймера (на 50мкл): 1. 400нМ АСР 2. 800нМ АСР 3. 360нМ UАР и 40нМ АСР (UАР:АСР = 9:1) 4. 720нМ UАР и 80нМ АСР (UАР:АСР = 9:1). Конечные концентрации (на 50мкл) остальных компонентов во всех четырех реакциях были идентичными: 5мкл poly А+ оС-концевой кДНК в 20мМ ТрисНСІ (рН 8,4); 50мМ КСl: 1,5мМ МоСІ2: 400нМ СКСВ2, и 200мкМ каждого из dATP, dCTP, dGТР и dTTP. Компоненты, включая АСР- и UΑΡ-праймеры, смешивали в первоначальном объеме 45мкл и нагревали до °С в термоячейке. Затем к каждой реакции добавляли 5мкл смеси 1,25ед. ДНК-полимеразы AmpliTag (Perkin Elmer Cetus, Morwalk, CT) в 20мМ Трис-НСl (рН 8,4) с доведением конечного объема до 50мкл. Для амплификации 5'-кДНК-фрагмента использовали программу термоциклической PCR "Gouchdown". После PCR-амплификации, все четыре реакционные смеси объединяли, и ДНК-продукты фракционировали по размерам с помощью электрофореза на 8% полиакриламидном геле. ДНК-продукт составляющий примерно 230п.о. вырезали из геля, очищали, и субклонировали в "Т-вектор", как было описано выше для 3’-RACEфрагмента в 450п.о. Для дальнейшего анализа выделяли 5 клонов: 5СВ2, 5СВЗ, 6СВ5, 5СВ6, 5СВ11. Анализ ДНК-последовательности осуществляли с использованием секвеназного набора "Sequenase version 2,0" (United State Biochemical, Cleveland, Ohio). На рис. 8 показана полная кДНК-последовательность Компонента В, собранная из RACE-клонов 5СВЗ и ЗСВ7, в которой указывается рестрикционные сайты. Анализ первичных структур кДНК-последовательности клонов 5СВЗ, 5СВ6, 5СВ11 и ЗСВ4, ЗСВ7, ЗСВ9 показал полное соответствие этих последовательностей экзону Компонента В (геномный клон 48 Примера 3). Хотя настоящее изобретение описано выше на конкретных примерах его осуществления, однако, специалистам в данной области очевидно, что в него могут быть внесены различные изменения модификации, не выходящие за рамки существа и объема нижеследующей формулы изобретения. Надписи к рисункам Рис. 1. Рабочая схема для очистки Компонента В из мочи. Рис. 2. Рестрикционная карта геномного транскриптона Компонента В. (геномная ДНК указанного компонента В показана в SEQ ID № 2). Стрелками показаны сайты сплайсинга. Рис. 3. Последовательность области промотора Компонента В (область промотора указанного Компонента В показана в SEQ ID № 2), Сайты связывания для факторов транскрипции АР-1, АР-2, Sр-1 и Ε-блоков указываются. Показаны также ТАТА-блок, и GРЕ. Рис. 4. Рестрикционная карта гена Компонента В. Выведенная мРНК показана строкой ниже геномного гена: области обведенные в рамку обозначают последовательность, кодирующую белок. Рис. 5. Рестрикционная карта вставки клона 4D. Рис. 6. Рестрикционная карта плазмиды pBSCB4D. Рис. 7. Общая схема, используемая для RАСЕ-клонирования ДНК-последовательности Компонента В. Рис. 8. Полная кДНК-последовательность Компонента В, в которой указаны сайты рестрикции (кДНК указанного Компонента В представлена в SEQ ID № 3).