Рекомбінантна клітина mycobacterium bovis як вакцина

Реферат: Винахід стосується рекомбінантної клітини Mycobacterium bovis штаму Danish підтипу Prague, яка є уреаза-дефіцитною клітиною і яка містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що містить домен з поліпептиду, одержаного від бактерій Mycobacterium, який є антигеном Ag85B або Ag85A, здатний викликати імунну відповідь, та домен виходу з фаголізосоми бактерій роду Listeria, одержаний з лістеріолізину (Нlу) бактерії Listeria monocytogenes, для застосування як вакцини для утворення Т-клітин, які продукують IL-17. UA 113282 C2 (12) UA 113282 C2 UA 113282 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Опис Цей винахід стосується рекомбінантної клітини Mycobacterium для застосування в ролі вакцини. Щороку від туберкульозу (TB) помирає до 2 мільйонів людей (1). Єдиною доступною протитуберкульозною вакциною є вакцинний штам Mycobacterium bovis (бацила КальметтаГерена (BCG)), яка була використана в організмі людини в перший раз в 1921 році (2). До теперішнього часу було введено 4 мільярди доз БЦЖ, що робить її найбільш широко застосовуваною вакциною для людини в усьому світі (3). Тим не менш, ми все ще далекі від досягнення викорінення туберкульозу. Вакцинація БЦЖ запобігає захворюванню немовлят на туберкульозний менінгіт та міліарний туберкульоз (4). Проте захист від інших форм туберкульозу, зокрема, туберкульозу легень у підлітків і дорослих, є неповним, що підкреслюється мета-аналізом, який показує ефективність захисту у дорослих на рівні 0-80 % (5). Таким чином, вкрай необхідними є нові протитуберкульозні вакцини. Наразі, нові стратегії вакцинації проти туберкульозу в клінічних випробуваннях передбачають використання рекомбінантної БЦЖ, що замінює канонічну БЦЖ, та субодиничних вакцин і вакцин на основі вірусних векторів, що не розмножуються, для бустингу праймування БЦЖ (6) (7). Ідентифікування імунологічних механізмів, що лежать в основі захисту, може полегшити раціональну розробку нових стратегій вакцинації для профілактики туберкульозу. Більше того, ця стратегія може виявити біомаркери, що є показовими для захисного імунітету, які могли б виявити сурогатні кінцеві точки клінічного результату в клінічних випробуваннях ефективності протитуберкульозної вакцини і тим самим знизити їх тривалість, а також полегшити випробування більшої кількості вакцин-кандидатів у паралельних випробуваннях. Для визначення таких біомаркерів були розпочаті спостережні дослідження із зосередженням уваги на новоінфікованих здорових контактерах із хворими на туберкульоз і на БЦЖ-вакцинованих немовлятах (8). Незважаючи на широкомасштабні дослідження імунної реакції проти туберкульозу, головні елементи захисної імунологічної пам'яті досі залишаються нез'ясованими. Після вакцинації БЦЖ антиген-специфічні CD4 Т-клітини пам'яті важко виявити унаслідок малої кількості імунодомінантних антигенів. Наразі, основу найбільш широко застосовуваних біомаркерів становить підвищена частота CD4 Т-клітин, що продукують IFN-γ. З'являється все більше даних, що ставлять під сумнів значення IFN-γ як кореляту захисту при туберкульозі (9, 10). Безсумнівно, IFN-γ відіграє важливу роль у захисті від MTB (мікобактерії туберкульозу) (11), але визначення лише IFN-γ більше не може вважатись надійним маркером захисного імунітету. Опис рекомбінантного штаму БЦЖ, що експресує домен уникнення фаголізосом, наведений у WO99/101496, вміст якої включений до цього опису шляхом посилання. Згаданий домен уникнення фаголізосом надає штаму можливості уникнення фагосоми інфікованих клітин-хазяїв шляхом перфорації мембрани фагосоми. Для того, щоб забезпечити кислий діапазон рН для фагосом з метою оптимальної активності уникнення фаголізосом, був розроблений рекомбінантний штам, дефіцитний з уреази. Цей штам є розкритим в заявці WO2004/094469, зміст якої включений до цього опису. + Рекомбінантний штам ΔureC Hly rBCG (rBCG), що експресує мембрано-перфорувальний лістеріолізин (Hly) Listeria monocytogenes і є позбавленим уреази C, індукує чудовий захист від аерогенного інфікування MTB порівняно з батьківським BCG (pBCG) в доклінічній моделі (12). Ця генно-інженерна вакцинна конструкція успішно довела безпечність і імуногенність у фазі I клінічних випробувань (заявка на патент США № 61/384,375, зміст якої включений до цього опису шляхом посилання). У цьому дослідженні показано, що rBCG і pBCG індукують явно виражену Th1-імунну відповідь, тоді як лише rBCG додатково викликає глибоку Th17-відповідь. Спостерігався також більш ранній рекрутинг антиген-специфічних Т-лімфоцитів до легень при MTB-інфікуванні rBCGвакцинованих мишей. Ці Т-клітини продукували велику кількість Th1 цитокінів після повторної стимуляції. Набагато краща захисна ефективність rBCG явно залежала від IL-17. Підвищене продукування IL-17 після rBCG-, але не pBCG-вакцинації, було також виявлено у здорових волонтерів на фазі I клінічних випробувань. Результати, одержані винахідниками, визначають загальний імунологічний шлях як маркер для поліпшених стратегій вакцинації проти туберкульозу та інших захворювань. Предметом цього винаходу є рекомбінантна клітина Mycobacterium, яка містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка кодує гібридний поліпептид, що містить: (a) домен, здатний викликати імунну відповідь, та (b) домен уникнення фаголізосом, для застосування в ролі вакцини для спричинення Th17-імунної відповіді. Іншим аспектом цього винаходу є спосіб спричинення Th17-імунної відповіді у суб'єкта, що 1 UA 113282 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 потребує цього, який включає введення згаданому суб'єкту молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка кодує гібридний поліпептид, що містить: (a) домен, здатний викликати імунну відповідь, та (b) домен уникнення фаголізосом. За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, згадана вакцина являє собою живу рекомбінантну клітину Mycobacterium, яка містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка кодує гібридний поліпептид, що містить (a) домен, здатний викликати імунну відповідь, та (b) домен уникнення фаголізосом. Згаданий домен, здатний викликати імунну відповідь, за варіантом, якому віддається перевага, являє собою імуногенний пептид або поліпептид патогену чи його імуногенний фрагмент. За іншим варіантом здійснення цього винаходу згадана вакцина являє собою вакцину, основу якої становить інактивована необроблена клітина патогену або клітинна фракція. Згаданою клітиною Mycobacterium за варіантом, якому віддається перевага, є клітина M. bovis, клітина M. tuberculosis, зокрема атенуйована клітина M. tuberculosis або інших Mycobacteria, наприклад, M. microti, M. smegmatis, M. canettii, M. marinum або M. fortuitum. За варіантом, якому віддається більша перевага, згадана клітина являє собою рекомбінантну клітину M. bovis (BCG), зокрема, рекомбінантну клітину M. bovis штаму Danish підтипу Prague (43). За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається особлива перевага, згадана вакцина являє собою рекомбінантну клітину Mycobacterium, дефіцитну з уреази. За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається особлива перевага, послідовність ureC клітини Mycobacterium є інактивованою (ΔUrec), наприклад, шляхом конструювання вектора-самогубця, який містить ген ureC, зруйнований геном селекційного маркера, трансформування клітинимішені згаданим вектором і скринінгу для віднаходження позитивних на селекційний маркер клітин, які мають негативний з уреази фенотип. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, згадана клітина являє собою рекомбінантну клітину BCG штаму Danish підтипу + + Prague, яка характеризується як rBCG ΔUrec: Hly : Hyg . Згаданий домен, здатний викликати імунну відповідь, за варіантом, якому віддається перевага, вибраний з-посеред імуногенних пептидів або поліпептидів від M. bovis, M. tuberculosis або M. leprae чи їх імуногенних фрагментів, які мають довжину щонайменше 6 амінокислот, за варіантом, якому віддається перевага, щонайменше 8 амінокислот, за варіантом, якому віддається найбільша перевага, щонайменше 9 амінокислот і, наприклад, до 20 амінокислот. Конкретними прикладами прийнятних антигенів є Ag85B (p30) від M. tuberculosis, Ag85B (α-антиген) від М. bovis БЦЖ, Ag85A від M. tuberculosis та ESAT-6 від M. tuberculosis та їхні фрагменти. За іншими варіантами здійснення цього винаходу, згаданий домен, здатний викликати імунну відповідь, вибраний з немікобактеріальних поліпептидів. Вакцина за цим винаходом є придатною для спричинення Th17-імунної відповіді у ссавця, зокрема людини. Вакцину, за варіантом, якому віддається перевага, вводять людині в дозі 5 5 приблизно 1-1010 клітин, за варіантом, якому віддається перевага, приблизно 2-810 клітин. Вакцину, за варіантом, якому віддається перевага, вводять у вигляді разової дози, наприклад, шляхом ін'єкції. Перевага віддається підшкірному введенню. Крім того, перевага віддається введенню вакцини без ад'юванта. Згадана вакцина за варіантом, якому віддається перевага, являє собою вакцину проти мікобактеріальних інфекційних захворювань, таких як проказа або туберкульоз, зокрема, легеневих мікобактеріальних інфекційних захворювань, конкретніше, туберкульозу легенів. Крім того, згадана вакцина може бути вакциною проти раку сечового міхура або аутоімунного розладу, наприклад, аутоімунного захворювання шкіри, такого як нейродерміт або псоріаз. Згадана вакцина може призначатисьдля спричинення Th17-імунної відповіді у суб'єкта, що не має імунологічного захисту проти Mycobacterium, наприклад, у людини, якій заздалегідь не вводили імуногенного штаму Mycobacterium, або у людини, яку заздалегідь не імунізували вакциною на основі Mycobacterium, наприклад, BCG. Прикладами таких суб'єктів є, наприклад, новонароджені або діти, наприклад, віком до 8 років, наприклад, в районах, ендемічних з мікобактеріальних інфекційних захворювань, таких як туберкульоз, або особи, які знаходяться під загрозою в неендемічних районах. За альтернативним варіантом, згадана вакцина може бути введена суб'єкту, наприклад, людині, якій заздалегідь вводили імуногенний штам Mycobacterium, або людині, яка заздалегідь була імунізована BCG. За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається особлива перевага, згадану вакцину використовують для спричинення комбінованої Th17- і Th1-імунної відповіді. За цим винаходом Th17-імунну відповідь викликають у вакцинованого суб'єкта. Визначення Th17-імунної відповіді, за варіантом, якому віддається перевага, здійснюють в біологічному зразку, відібраному у згаданого суб'єкта, при цьому згаданий зразок містить клітини імунної 2 UA 113282 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 системи, зокрема, Т-клітини і/або NK-клітин, конкретніше, антиген-специфічні Т-клітини, такі як CD4 Т-клітини. Згаданий зразок може бути біологічною рідиною організму або зразком тканини, наприклад, зразком крові, сироватки або плазми чи зразком легень або селезінки. Методи відбору зразків є добре відомими в цій галузі. Для визначення Th17-імунної відповіді, перевага віддається повторному стимулюванню імуногеном імунних клітин, присутніх у зразку суб'єкта, призначеному для аналізу, та визначенню експресії цитокінів згаданими клітинами. Клітинами, призначеними для аналізу, за варіантом, якому віддається перевага, є антиген-специфічні Т-клітини, за варіантом, якому віддається більша перевага, CD4 Т-клітини. Згаданий імуноген для повторного стимулювання відповідає імуногену, присутньому у вакцині (ефективність якого має бути визначена). Імуноген може бути присутнім або у формі, ідентичній формі, присутній у вакцині, або в іншій формі. Наприклад, у разі, коли вакцина містить імуногенний поліпептид, імуноген на етапі повторного стимулювання може включати імуногенний фрагмент згаданого поліпептиду або навпаки. За варіантом, якому віддається перевага, імуноген, який застосовують на етапі повторного стимулювання, являє собою очищений поліпептид або пептид. Для того, щоб перевірити ефективність протитуберкульозних вакцин, зокрема, живої протитуберкульозної вакцини, як описано вище, згаданим імуногеном, за варіантом, якому віддається перевага, може бути мікобактеріальний антиген, вибраний, наприклад, з-посеред PPD (Очищений протеїновий дериват), який являє собою гліцериновий екстракт мікобактерій, або Ag85A і Ag85B, а також інших мікобактеріальних антигенів та їхніх імуногенних фрагментів (наприклад, як описано вище). Визначення Th17-відповіді за цим винаходом може включати в себе визначення клітин, пов'язаних із Th17-відповіддю, наприклад, клітин, що продукують IL-17, за допомогою поверхневих маркерів і цитокінів, присутніх в та/або секретованих згаданими клітинами. Прикладами поверхневих маркерів є CD4, CD8, IL-23R, CCR4 та/або CCR6. Прикладами цитокінів, присутніх в та/або секретованих такими клітинами, є IL-17, IL-21, IL-22, IL-23, IFN-γ та їх комбінації. За варіантом, якому віддається перевага, згаданим цитокіном є IL-17. Такі клітини можуть бути визначені цитологічними методами, наприклад, методом сортування клітин із використанням імунологічних реагентів виявлення, таких як антитіла, специфічні до поверхневоклітинних маркерів та/або цитокіни, які можуть нести маркування, наприклад, флуоресцентну групу. За варіантом, якому віддається більша перевага, клітинами, пов'язаними з Th17-імунною відповіддю є, наприклад, CD4 Т-клітини, які продукують і, можливо, секретують IL-17. За іншим варіантом здійснення цього винаходу визначення Th17-імунної відповіді включає в себе визначення цитокіну, який секретується клітинами, пов'язаними з Th17-імунною відповіддю, наприклад, IL-17. Згаданий цитокін може бути визначений імунологічними методами з використанням відповідних антитіл, наприклад, антитіл проти IL-17. За варіантом, якому віддається перевага, викликається комбінована Th17- і Th1-імунна відповідь. Th1-імунна відповідь може бути визначена шляхом визначення клітин, пов'язаних з Th1-відповіддю, за допомогою поверхневих маркерів і цитокінів, присутніх в та/або секретованих згаданими клітинами. Прикладами поверхнево-клітинних маркерів є CD4, CD8, CCR5 і CD62low. Прикладами цитокінів, присутніх в та/або секретованих такими клітинами, є IFN-γ, IL-22 і IL-23 та їх комбінації. Такі клітини можуть бути визначені цитологічними методами, наприклад, методом сортування клітин з використанням імунологічних реагентів виявлення, таких як антитіла, специфічні до поверхнево-клітинних маркерів, та/або цитокіни, які можуть нести маркування, наприклад, флуоресцентну групу. За іншим варіантом здійснення цього винаходу визначення Th1-імунної відповіді включає визначення цитокіну, який секретується клітинами, пов'язаними з Th1-імунною відповіддю, наприклад, IFN-γ, IL-22 та/або IL-23. Згаданий цитокін може бути визначений імунологічними методами з використанням відповідних антитіл, наприклад, антитіл проти IFN-γ, IL-22 та/або IL23. За варіантом, якому віддається перевага, Th17- і, можливо, Th1-імунну відповідь визначають у відповідний час після вакцинації. Наприклад, згадана імунна відповідь може бути визначена через 20-50 днів, зокрема, через 25-35 днів після вакцинації. Нижче цей винахід докладніше описаний за допомогою наведених нижче Фігур і Прикладів. Підписи до Фігур Фіг. 1: MTB-навантаження у мишей дикого типу. Підшкірна імунізація захищає від інфікування MTB впродовж 90 днів після імунізації. (A). Бактеріальні навантаження на вакциновані і невакциновані групи на 7 день після інфікування. (B) є порівнянними. Визначення КУО (CFU) в легенях і селезінці після аерозольного інфікування у дозі 400 КУО MTB. Серцева 3 UA 113282 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 частка легень (приблизно 71/10 цілого органа) або половина селезінки була гомогенізована; решта матеріалу була використана для in vitro рестимуляційних аналізів. Статистичну значущість визначали за критерієм Манна-Уїтні з двосторонніми значеннями P. *, Р