Клітина бактерій mycobacterium bovis, яка є уреазодефіцитною, та застосування даної клітини для виготовлення живої вакцини проти туберкульозу

1. Клітина бактерій Mycobacterium bovis, яка є уреазодефіцитною і містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка кодує гібридний поліпептид, що містить (а) щонайменше один домен поліпептиду, здатний викликати імунну реакцію у ссавця, та (b) домен виходу з фаголізосоми, причому домен, здатний викликати імунну реакцію у ссавця, походить від поліпептиду бактерій роду Mycobacterium. 2. Клітина за п. 1, яка відрізняється тим, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше одну субодиницю клітинної уреази, є інактивованою. 3. Клітина за п. 2, яка відрізняється тим, що інактивованою є принаймні послідовність, що кодує субодиницю С клітинної уреази. 4. Клітина за п. 1, яка відрізняється тим, що згаданим доменом виходу з фаголізосоми є домен виходу з фаголізосоми бактерій роду Listeria. 5. Клітина за п. 1, яка відрізняється тим, що згаданий домен виходу з фаголізосоми кодується молекулою нуклеїнової кислоти, вибраної з групи, яку складають: (a) нуклеотидна послідовність, що включає нуклеотиди 211-1722, як показано у послідовності № 1, (b) нуклеотидна послідовність, що кодує ту саму амінокислотну послідовність, що і послідовність з (а), і (c) нуклеотидна послідовність, гібридизована за суворих умов із послідовністю з (а) або (b). 6. Клітина за п. 1, яка відрізняється тим, що доменом, здатним викликати імунну реакцію, є пептид або поліпептид, здатний викликати реакцію CD8 Т-лімфоцитів, рестриктованих класом І МНС. 7. Клітина за п. 6, яка відрізняється тим, що домен, здатний викликати імунну реакцію, вибраний з групи, яку складають антигени бактерій роду Mycobacterium: Ag85B (M. tuberculosis), Ag85B (Μ. bovis), Ag85A (M. tuberculosis) і ESAT-6 (M. tuberculosis) або їхні імуногенні фрагменти. 8. Клітина за п. 7, яка відрізняється тим, що доменом, здатним викликати імунну реакцію, є антиген Ag85B або його імуногенний фрагмент. UA (21) a200510351 (22) 23.04.2004 (24) 12.07.2010 (86) PCT/EP04/04345, 23.04.2004 (31) 60/464,644 (32) 23.04.2003 (33) US (46) 12.07.2010, Бюл.№ 13, 2010 р. (72) ГРОДЕ ЛЕАНДЕР, DE, КАУФМАНН ШТЕФАН Х.Е., DE, РАУПАХ БЕРБЕЛЬ, DE, ХЕСС ЮРГЕН, DE (73) МАКС-ПЛАНК-ГЕЗЕЛЬШАФТ ЦУР ФЬОРДЕРУНГ ДЕР ВІССЕНШАФТЕН АЙ.ЕФ., DE (56) WO A 9910496, 04.03.1999. HESS J ET AL: "Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin strains secreting listeriolysin of lysteria monocytogenes" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 95, 1 April 1998 (1998-0401), pages 5299-5304, XP002090837 ISSN: 00278424. REYRAT JEAN-MARC ET AL: "Urease activity does not contribute dramatically to persistence of Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin" INFECTION AND IMMUNITY, vol. 64, no. 9, 1996, pages 3934-3936, XP002296077 ISSN: 0019-9567. REYRAT JEAN-MARC ET AL: "The urease locus of Mycobacterium tuberculosis and its utilization for the demonstration of allelic exchange in Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 92, no. 19, 1995, pages 8768-8772, XP002296078 ISSN: 00278424. CLEMENS ET AL.: "Purification, charaterizstion and genetic analysis of Mycobacterium tuberculosis urease, a potentially critical determinant of hostpathogen interaction" J. BACTERIOLOGY, vol. 177, no. 19, 1995, pages 5644-5652, XP002296079. GULERIA I ET AL: "Auxotrophic vaccines for tuberculosis" NATURE MEDICINE, NATURE PUBLISHING, CO, US, vol. 2, no. 3, March 1996 (1996-03), pages 334-337, XP002177578 ISSN: 1078-8956. 2 (19) 1 3 91180 4 9. Клітина за п. 1, яка відрізняється тим, що гіб20. Спосіб одержання живої вакцини, який включає ридному поліпептиду передує послідовність сигоб'єднання клітини за п. 1 або п. 14 у фармацевтинального пептиду. чно ефективній кількості з фармацевтично прийня10. Клітина за п. 1, яка відрізняється тим, що між тними розріджувачами, носіями і ад'ювантами. доменом, що викликає імунну реакцію, і доменом 21. Спосіб одержання клітини бактерій виходу з фаголізосоми знаходиться пептидний Mycobacterium bovis за п. 1, який включає стадії: лінкер. (і) підготовку уреазадефіцитної бактеріальної клі11. Клітина за п. 1, яка відрізняється тим, що згатини; дана молекула нуклеїнової кислоти є конструктив(іі) введення до згаданої бактеріальної клітини но зв'язаною з регуляторною послідовністю ексмолекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка пресії. кодує гібридний поліпептид, що містить (а) що12. Клітина за п. 11, яка відрізняється тим, що найменше один домен поліпептиду, де згаданий згадана регуляторна послідовність експресії є акдомен є здатним до викликання імунної реакції у тивною у згаданій клітині. ссавця, і (b) домен виходу з фаголізосоми, і 13. Клітина за п. 1, яка відрізняється тим, що зга(ііі) культивування клітини, яка була одержана за дана молекула нуклеїнової кислоти розміщена на стадією (іі), за відповідних умов. векторі. 22. Спосіб одержання клітини бактерій 14. Клітина бактерій Mycobacterium bovis, яка є Mycobacterium bovis за п. 14, який включає стадії: уреазодефіцитною і містить щонайменше одну (і) підготовку уреазадефіцитної бактеріальної клімолекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що тини; кодує пептид або поліпептид виходу з фаголізосо(іі) введення до згаданої бактеріальної клітини ми, а також щонайменше одну молекулу рекомбімолекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка нантної нуклеїнової кислоти, що кодує пептид або кодує пептид або поліпептид виходу з фаголізосополіпептид, здатний викликати імунну реакцію у ми; ссавця, який походить від поліпептиду бактерій (ііі) введення до згаданої бактеріальної клітини роду Mycobacterium. молекули щонайменше однієї молекули рекомбі15. Клітина за п. 1 або п. 14, яка є здатною до екснантної нуклеїнової кислоти, яка кодує пептид або пресії щонайменше однієї згаданої молекули реполіпептид, здатний до викликання імунної реакції комбінантної нуклеїнової кислоти. у ссавця, і 16. Клітина за п. 15, яка є здатною до секретуван(іv) культивування клітини, одержаної на стадії (ііі), ня поліпептиду, що кодується згаданою щонаймеза відповідних умов. нше однією молекулою нуклеїнової кислоти. 23. Застосування клітини бактерій Mycobacterium 17. Клітина за п. 1 або п. 16, тривалість внутрішbovis будь-яким із пп. 1-17 для виготовлення живої ньоклітинної персистенції якої у інфікованих маквакцини, що застосовується як вакцина проти турофагах дорівнює або є меншою за тривалість беркульозу. внутрішньоклітинної персистенції нативної клітини 24. Застосування за п. 23 для виготовлення вакбактерій роду Mycobacterium. цини для імунодефіцитних суб'єктів. 18. Фармацевтична композиція, що містить як ак25. Застосування за п. 24 для виготовлення вактивний агент клітину за п. 1 або п. 14, факультатицини для суб'єктів, що страждають на ВІЛвно разом із фармацевтично прийнятними розріінфекцію. джувачами, носіями і ад'ювантами. 26. Застосування за п. 23 для виготовлення вак19. Композиція за п. 18, яка є живою вакциною, цини для застосування у ветеринарії. придатною для введення на поверхню слизових оболонок або парентеральним шляхом. Цей винахід має відношення до нових рекомбінантних вакцин, що забезпечують захисний імунітет, зокрема, проти туберкульозу. Туберкульоз (ТВ), що спричинюється Mycobacterium tuberculosis, залишається значною глобальною проблемою. За оцінками, одна третина населення світу є інфікованою М. tuberculosis (Кочі (Kochi), 1991). У багатьох країнах єдиним заходом у боротьбі з ТВ є вакцинація штамом збудника туберкульозу, бактерією (М. bovis) Кальметта-Герена (Calmette-Guerin) (BCG (БЦЖ)). Загальна ефективність вакцинації БЦЖ проти туберкульозу становить, однак, приблизно 50% з коливаннями у надзвичайно широкому діапазоні, у межах від 0% до 80% за даними різних клінічних випробувань (Роуч (Roche) та інші, 1995). Таким чином, БЦЖ слід поліпшувати, наприклад, методами генної інженерії, для одержання вакцини для кращої боротьби з ТВ (Маррі (Murray), 1996; Хесс (Hess), Кауфман (Kaufmann), 1993). Широко розповсюджена поява штамів М. tuberculosis із множинною лікарською стійкістю додатково підкреслює нагальну потребу у нових протитуберкульозних вакцинах (Грейндж (Grange), 1996). Μ. tuberculosis належить до групи внутрішньоклітинних бактерій, які розмножуються у фагосомних вакуолях спочиваючих макрофагів, унаслідок чого захист від туберкульозу залежить від імунітету, опосередкованого Т-клітинами (Кауфман (Kaufmann), 1993). Декілька досліджень на мишах і людях показали, однак, що мікобактерії стимулюють антигенспецифічні CD4 (хелперні) і CD8 (супресорні і цитотоксичні) Т-лімфоцити, рестриктовані класом II або класом І головного комплексу гістосумісності (МНС (ГКГС)), відповідно (Кауфман (Kaufmann), 1993). 5 91180 6 Важлива роль хелперних Т-лімфоцитів, рестлізосоми до цитозолю макрофагоподібних клітин риктованих класом І МНС, була переконливо пролінії J774 (Білецкі (Bielecki) та інші, 1991; Генчев (Gentschev) та інші, 1995; Хесс (Hess), Кауфман демонстрована нездатністю 2-мікроглобулін (Kaufmann), 1997). ( 2m)-дефіцитних мишей до боротьби з експериWO 99/101496 та робота Хесс (Hess) та інших ментальним інфікуванням М. tuberculosis (Флінн (1998) розкривають рекомбінантні штами (Flynn) та інші, 1993). Оскільки у цих мишей відсуMycobacterium bovis, які секретують біологічно тні гени класу І МНС, функціональні CD8 Тактивні гібридні білки лістеріолізину. На декількох лімфоцити розвиватись не можуть. У протилежмодельних тваринах було показано, що ці штами ність до інфекції М. tuberculosis, 2m-дефіцитні М. bovis є ефективними вакцинами проти ТВ. миші є здатними до контролювання певних інфекЗа цим винаходом, Hly експресують уреазаційних доз вакцинного штаму БЦЖ (Флінн (Flynn) дефіцитні штами БЦЖ. Ці уреазадефіцитні штами та інші, 1993; Лейдл (Ladel) та інші, 1995). Більше БЦЖ демонструють підвищену активність Hly у того, вакцинація 2m-дефіцитних мишей БЦЖ пофагосомах і, у свою чергу, поліпшують утворення довжувала строк виживаності після подальшого пор у ендосомних мембранах, наслідком чого є інфікування М. tuberculosis, у той час як імунізовані забезпечення чудового імунологічного захисту. На БЦЖ миші лінії C57BL/6 були стійкими до туберкудодаток до цього, уреазадефіцитні штами БЦЖльозу (Флінн (Flynn) та інші, 1993). Така диференHly є залученими до апоптозних процесів, які моційована CD8 Т-лімфоцитарна залежність між М. жуть додавати свій внесок до посиленого імунного tuberculosis і БЦЖ може пояснюватись таким чизахисту. Таким чином, уреазадефіцитні штами ном: антигени М. tuberculosis мають кращий досБЦЖ ще більше поліпшують вакцинний потенціал. туп до цитоплазми, аніж антигени БЦЖ, наслідком Окрім того, подив викликало встановлення того, чого є більш інтенсивна презентація класу І МНС що уреазадефіцитні штами БЦЖ демонструють (Хесс (Hess), Кауфман (Kaufmann), 1993). Унасліпідвищений профіль нешкідливості, порівняно з док цього, Μ. tuberculosis викликає більш ефективбатьківськими штамами БЦЖ і, унаслідок цього, є ну реакцію CD8 Т-лімфоцитів. Ця ідея нещодавно особливо придатними для вакцинації імунодефібула підтримана підвищеною презентацією класу І цитних пацієнтів. МНС стороннім антигеном, яєчним білком, шляхом Першим аспектом цього винаходу є бактеріаодночасного інфікування антиген-презентуючих льна клітина, зокрема, клітина бактерій роду клітин (АРС) М. tuberculosis, а не БЦЖ (МадзаккаMycobacterium, що є уреазадефіцитною і містить ро (Mazzaccaro), 1996). молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка Секретовані білки М. tuberculosis являють сокодує гібридний поліпептид, що містить (а) щобою цінне джерело антигенів для презентації кланайменше один домен поліпептиду, де згаданий су І МНС. Нещодавно рекомбінантна вакцина, що домен поліпептиду є здатним до викликання імункодує секретований антиген Ag85A, викликала у ної реакції у ссавця, та (b) домен виходу з фаголімишей реакцію CD8 Т-лімфоцитів, рестриктованих зосоми. За варіантом, якому віддають перевагу, класом І МНС, що може сприяти захисту проти ТВ згадана клітина є здатною до експресії молекули (Хайген (Huygen) та інші, 1996). Взагалі, накопинуклеїнової кислоти за цим винаходом. За варіанчуються дані на користь того, що імунізація секретом, якому віддають більшу перевагу, згадана клітованими білковими антигенами М. tuberculosis тина є здатною до секретування гібридного полізабезпечує деякий захист морських свинок та мипептиду та/або надання його у формі, придатній шей проти ТВ (Хорвіц (Horwitz) та інші, 1995; Андля розпізнавання антигенами, рестриктованими дерсен (Andersen), 1994). Важливою метою у розкласом І МНС. робці поліпшених протитуберкульозних вакцин на Бактеріальна клітина за цим винаходом є уреоснові БЦЖ, таким чином, є підвищення доступноазадефіцитною клітиною, наприклад, грамнегативсті секретованих БЦЖ-специфічних антигенів до ною або грампозитивною бактеріальною клітиною, цитоплазми інфікованих АРС. Подальша цілеспза варіантом, якому віддають перевагу, клітиною рямована доставка пептидів, що є похідними цих бактерій роду Mycobacterium. Недостатність уреасекретованих білків, до шляхів презентації класу І зи може забезпечуватись частковою або повною МНС, може потенціювати вже існуючу БЦЖінактивацією однієї або декількох клітинних молеспецифічну імунну реакцію для запобігання ТВ. кул нуклеїнової кислоти, яка кодує субодиницю Вихід L. monocytogenes із фаголізосоми являє уреази, зокрема, ureA, що кодує субодиницю уреасобою унікальний механізм полегшення презентази А, ureB, яка кодує субодиницю уреази В та/або ції антигенів бактерій роду Listeria класу І МНС ureС, яка кодує субодиницю уреази С. Послідов(Берч (Berche) та інші, 1987; Портной (Portnoy) та ності ureA, ureB і ureC у мікобактерій, зокрема, у інші, 1998). Лістеріолізин (Hly), поротвірний сульфМ. bovis і М. tuberculosis, та білки, які ними кодугідрил-активований цитолізин, є незамінним для ються, описані у роботі Рейрат (Reyrat) та інших виділення мікроорганізмів L. monocytogenes із фа(1995) і у роботі Клеменс (Clemens) та інших голізосомної вакуолі до цитозолю клітин-хазяїв (1995), які включено до цього опису шляхом поси(Гайард (Gaillard) та інші, 1987; Портной (Portnoy) лання. та інші, 1988). Ця функція виходу була нещодавно За варіантом, якому віддають перевагу, уреаперенесена до Bacillus subtilis і до атенуйованих задефілитний бактеріальний штам одержують штамів Salmonella ssp. (Білецкі (Bielecki) та інші, шляхом делецій та/або інсерцій одного або декіль1991; Генчев (Gentschev) та інші, 1995; Хесс кох нуклеотидів до послідовностей нуклеїнових (Hess), Кауфман (Kaufmann), 1997). Результатом кислот, які кодують субодиниці уреази, та/або до експресії Hly аспорогенним мутантним штамом В. послідовностей, що регулюють їх експресію. Деsubtilis або Salmonella ssp. є вихід бактерій з фаго 7 91180 8 леції та/або інсерції можна одержати шляхом гогени вірусу грипу, наприклад, нуклеопротеїн вірусу мологічної рекомбінації, інсерції транспозону або грипу (Мацуі (Matsui) та інші, 1995; Фу (Fu) та інші, іншими придатними методами. 1997) або ретровірусні антигени, наприклад, антиЗа варіантом здійснення, якому віддають осогени ВІЛ, наприклад, антигени ВІЛ-1 р17, р24, RT і бливу перевагу, послідовність ureС інактивується, Env (Харрер (Наrrеr), 1996; Хаас (Haas), 1996). наприклад, шляхом конструювання вектораКонкретними прикладами прийнятних паразитар"самовбивці", що містить ген ureС, зруйнований них антигенів є плазмодійні антигени, наприклад, геном селекційного маркера, трансформування антиген печінкової стадії (LSA-1), циркумспорозоїклітини-мішені згаданим вектором і відбирання тний білок (CS або алельні варіанти ср26 чи ср29), клітин, позитивних за селекційним маркером, що близький до тромбоспондину безіменний білок мають уреазанегативний фенотип, як описано (TRAP), треонін- і аспарагін-збагачений білок споРейрат (Reyrat) та іншими (1995). розоїтів (STARP) Plasmodium falciparum (Айдо Клітиною за цим винаходом, за варіантом, (Aidoo) та інші, 1995) і антигени бактерій роду якому віддають перевагу, є клітина М. bovis, клітиToxoplasma, наприклад, р30 Toxoplasma gondii на М. tuberculosis, зокрема, клітина атенуйованого (Хан (Khan), 1991; Булов (Bulow), Бутройд штаму М. tuberculosis або інших мікобактерій, на(Boothroyd), 1991). Конкретними прикладами приприклад, М. microti, Μ. smegmatis, Μ. canettii, Μ. йнятних бактеріальних антигенів є антигени бактеmarinum, Μ. fortuitum або інших мікобактерій, як рій роду Legionella, наприклад, головний секретоописано Рейрат (Reyrat) та іншими (1995). рний білок Legionella pneumophila (Блендер Клітина бактерій роду Mycobacterium за цим (Blander), Хорвіц (Horwitz), 1991). винаходом містить молекулу рекомбінантної нукЗгаданий імуногенний домен є здатним до вилеїнової кислоти, наприклад, молекулу нуклеїнової кликання імунної реакції у ссавця. Ця імунна реаккислоти з Послідовністю № 1. Ця молекула нуклеїція може бути імунною реакцією, опосередкованою нової кислоти містить кодувальну послідовність В-клітинами. Однак за варіантом, якому віддають сигнального пептиду (нуклеотиди 1-120), послідоперевагу, згаданий імуногенний домен є здатним вність, що кодує імуногенний домен (нуклеотиди до викликання імунної реакції, опосередкованої Т121-153), кодувальну послідовність пептидного клітинами, за варіантом, якому віддають більшу лінкера (нуклеотиди 154-210), послідовність, що перевагу, CD8 Т-лімфоцитами, рестриктованими кодує домен виходу з фаголізосоми (нуклеотиди класом І МНС. 211-1722), додаткову кодувальну послідовність Згаданий домен, здатний до викликання імунпептидного лінкера (нуклеотиди 1723-1800) і посної реакції, за варіантом, якому віддають більшу лідовність, що кодує довільний пептид (нуклеотиперевагу, вибирають з числа імуногенних пептидів ди 1801-1870). Відповідна амінокислотна послідоабо поліпептидів М. bovis або М. tuberculosis чи з вність представлена Послідовністю № 2. числа їхніх імуногенних фрагментів. Конкретними Згадана нуклеїнова кислота містить щонаймеприкладами прийнятних антигенів є Ag85B (р30) нше один імуногенний домен поліпептиду. ЗгадаМ. tuberculosis (Харт (Harth) та інші, 1996), Ag85B ний імуногенний домен можна одержати від бакте( -антиген) БЦЖ (М. bovis) (Мацуо (Matsuo) та інрій роду Micobacterium, за варіантом, якому ші, 1988), Ag85A Μ. tuberculosis (Хайген (Huygen) віддають перевагу, Mycobacterium tuberculosis або та інші, 1996) і ESAT-6 М. tuberculosis (Соренсен Mycobacterium bovis. Довжина цього домену ста(Sorensen), 1996; Харбо (Harboe), 1996; Андерсен новить щонайменше 6, за варіантом, якому відда(Andersen) та інші, 1995). За варіантом, якому відють перевагу, щонайменше 8 амінокислот. Згададають більшу перевагу, згаданий імуногенний доний імуногенний домен, за варіантом, якому мен одержують з антигену Ag85B. За варіантом, віддають перевагу, є частиною нативного поліпепякому віддають найбільшу перевагу, згаданий імутиду бактерій роду Mycobacterium. Однак, за обсяногенний домен включає послідовності від аміногом цього винаходу, це також є модифікований кислоти 41 до амінокислоти 51 у Послідовності № імуногенний домен, який одержують із нативного 2. імуногенного домену шляхом заміни, видалення Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти та/або додання однієї або декількох амінокислот. за цим винаходом додатково містить домен вихоЗгаданий імуногенний домен не обмежується, ду з фаголізосоми, тобто домен поліпептиду, який однак, антигенами бактерій роду Mycobacterium і забезпечує вихід гібридного поліпептиду з фаголіможе вибиратись з групи, що включає автоантигезосоми до цитозолю клітин ссавців. За варіантом, ни, пухлинні антигени і патогенні антигени, наприякому віддають перевагу, згаданим доменом виклад, вірус-специфічні антигени, паразитарні антиходу з фаголізосоми є домен виходу з фаголізогени, бактеріальні антигени у цілому і їхні соми бактерій роду Listeria, описаний у патенті імуногенні фрагменти. Конкретними прикладами США № 5,733,151, який включено до цього опису прийнятних пухлинних антигенів є людські пухлиншляхом посилання. За варіантом, якому віддають ні антигени, наприклад, продукт пухлиносупресорбільшу перевагу, згаданий домен виходу з фаголіного гена р53 (Хаубьєрс (Houbiers) та інші, 1993), і зосоми одержують від мікроорганізму L. меланоцит-диференціювальні антигени, наприmonocytogenes. За варіантом, якому віддають клад, Melan-A/MART-1 і gp100 (Ван Елзас (van найбільшу перевагу, згаданий домен виходу з фаElsas) та інші, 1996). Конкретними прикладами голізосоми кодується молекулою нуклеїнової кисприйнятних вірус-специфічних антигенів є людські лоти, вибраною з групи, яка включає: (а) нуклеопухлинні вірус-специфічні антигени, наприклад, тидну послідовність, що містить нуклеотиди 211антигени людського вірусу папіломи, наприклад, 1722, як показано у Послідовності № 1, (b) нуклеоантигени Е6 і Е7 (Бош (Bosch) та інші, 1991), антитидну послідовність, яка кодує таку саму амінокис 9 91180 10 лотну послідовність, що і послідовність з (а), і (с) геному клітин-прокаріотів. За варіантом, якому нуклеотидну послідовність, гібридизовану за сувовіддають перевагу, згаданий рекомбінантний векрих умов із послідовністю з (а) або (b). тор несе молекулу нуклеїнової кислоти за цим Окрім нуклеотидної послідовності, яка предвинаходом, конструктивно зв'язану з регуляторною ставлена у Послідовності № 1, цей винахід вклюпослідовністю експресії. Згадана регуляторна посчає також послідовності нуклеїнової кислоти, гіблідовність експресії являє собою, за варіантом, ридизовані з вищезгаданою послідовністю. Термін якому віддають перевагу, регуляторну послідов"гібридизація" у цьому винаході застосовують за ність експресії, активну у мікобактерій, зокрема, у визначенням, наведеним у довіднику Сембрук М. bovis. Згаданий вектор може бути позахромо(Sambrook) та інші (Molecular Cloning. A laboratory сомним вектором або вектором, придатним для manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), інтеграції до хромосоми. Приклади таких векторів 1.101-1.104). За цим винаходом, термін "гібридиє відомими фахівцю у цій галузі і наводяться, назація" застосовують у тому разі, коли позитивний приклад, у згаданому вище довіднику Сембрук сигнал гібридизації все ще спостерігається після (Sambrook) та інших. За додатковим аспектом цього винаходу, пропромивання впродовж 1 год у 1 SSC (стандартний понується уреазадефіцитна бактеріальна клітина, цитратний фізіологічний розчин) і 0,1% SDS (донаприклад, клітина бактерій роду Mycobacterium, децилсульфат натрію) при температурі 55°С, за за варіантом, якому віддають перевагу, клітина М. варіантом, якому віддають перевагу, при темпераbovis, що містить щонайменше одну молекулу нуктурі 62°С і, за варіантом, якому віддають найбільлеїнової кислоти, що кодує пептид або поліпептид шу перевагу, при температурі 68°С, зокрема, виходу з фаголізосоми. Навіть у тому разі, коли впродовж 1 год у 0,2 SSC і 0,1% SDS при темпепептид або поліпептид виходу з фаголізосоми не ратурі 55°С, за варіантом, якому віддають перевагібридизується з антигеном, спостерігається негу, при температурі 62°С і, за варіантом, якому сподіване поліпшення імуногенних властивостей. віддають найбільшу перевагу, при температурі Рекомбінантна бактеріальна клітина, що про68°С. Послідовністю, яка за таких умов промиванпонується за згаданим додатковим аспектом цього ня гібридизується з нуклеотидною послідовністю, винаходу, може містити щонайменше одну додатщо відповідає Послідовності № 1, є нуклеотидна кову молекулу рекомбінантної, наприклад, гетеропослідовність, якій віддають перевагу за цим виналогічної, нуклеїнової кислоти, що кодує пептид або ходом, що кодує домен виходу з фаголізосоми. поліпептид, здатний викликати імунну відповідь у Нуклеотидна послідовність, що кодує домен ссавця. Згаданий додатковий імуногенний пептид виходу з фаголізосоми, як описано вище, може або поліпептид може бути вибраний з-посеред безпосередньо одержуватись від бактерій роду антигенів бактерій роду Mycobacterium або, у шиListeria або з будь-якого рекомбінантного джерела, ршому значенні, з-посеред аутоантигенів, пухлиннаприклад, клітини рекомбінантної Е. coli, що місних антигенів, патогенних антигенів або їхніх імутить відповідну молекулу нуклеїнової кислоти бакногенних фрагментів. Молекула нуклеїнової терій роду Listeria або її варіант, як описано вище. кислоти, що кодує додатковий пептид або поліпепЗа варіантом, якому віддають перевагу, молетид, може розміщуватись на тому самому векторі, кула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує що і гібридний ген. Однак вона може також розмігібридний поліпептид, містить послідовність, що щуватись, наприклад, на іншій плазміді, незалежкодує сигнальний пептид. За варіантом, якому відно від згаданого гібридного гена або інтегруватись дають більшу перевагу, згадана сигнальна послідо хромосоми. довність є сигнальною послідовністю, що є активНесподівано було встановлено, що тривалість ною у мікобактеріях, за варіантом, якому віддають внутрішньоклітинної персистенції клітини бактерій перевагу, у М. bovis, наприклад, нативна сигнальроду Mycobacterium за цим винаходом в інфікована послідовність М. bovis. Прикладом, якому відних клітинах, наприклад, макрофагах, дорівнює дають перевагу, прийнятної сигнальної послідовабо є меншою за тривалість внутрішньоклітинної ності є нуклеотидна послідовність, що кодує персистенції відповідної нативної клітини бактерій сигнальний пептид Ag85B, який представлено у роду Mycobacterium, що не містить згаданої молеПослідовності № 1 нуклеотидами з 1 до 120. На кули рекомбінантної нуклеїнової кислоти. додаток до цього, за варіантом, якому віддають Цей винахід має також відношення до фармаперевагу, між згаданим імуногенним доменом і цевтичної композиції, до складу якої, як активний доменом виходу з фаголізосоми повинен знаходиагент, входить клітина, визначена вище, факультись пептидний лінкер. За варіантом, якому віддатативно разом із фармацевтично прийнятними ють перевагу, довжина згаданого пептидного лінрозріджувачами, носіями і ад'ювантами. За варіанкера становить від 5 амінокислот до 50 том, якому віддають перевагу, згадана композиція амінокислот. За варіантом, якому віддають більшу являє собою живу вакцину, придатну для введенперевагу, послідовність, що кодує лінкер, предстаня ссавцю, за варіантом, якому віддають перевагу, влена у Послідовності № 1 нуклеотидами від 154 людині. Фактично вибраний шлях вакцинації заледо 210 або це може бути послідовність, яка відпожить від вибору вакцинного вектора. Введення відає згаданій у відношенні виродження генетичможе здійснюватись разовою дозою або повторюного коду. ватись через певні проміжки часу. Відповідна доза Нуклеїнова кислота може розміщуватись на залежить від різних параметрів, таких, наприклад, рекомбінантному векторі. За варіантом, якому відяк сам вакцинний вектор або шлях введення. Модають перевагу, згаданим рекомбінантним вектоже бути вибраний парентеральний шлях введення ром є прокаріотний вектор, тобто вектор, що міс(наприклад, підшкірний, внутрішньошкірний, внуттить елементи для реплікації або/та інтеграції до 11 91180 12 рішньом'язовий, внутрішньовенний або внутрішяк вакцина проти лістеріозу, паратуберкульозу або ньоочеревинний) або введення на поверхню слитуберкульозу великої рогатої худоби. зової оболонки (наприклад, очної, інтраназальної, Винахід буде додатково ілюструватись наверотової, шлункової, кишкової, ректальної, вагінаденими нижче фігурами та лістингами послідовнольної або сечових шляхів). стей. На додаток до цього, цей винахід стосується Фіг. 1: показує захисний потенціал rBCG ureC способу одержання рекомбінантної бактеріальної Hly на аерозольній моделі туберкульозу мишей. клітини, як визначено вище. За першим аспектом, Мишей лінії BALB/c імунізували внутрішньовенним цей спосіб включає стадії (і) надання уреазадефішляхом 1 106 колонієтвірних одиниць rBCG ureC цитної бактеріальної клітини, зокрема, клітини бакHly, BCG P ureC або нативною БЦЖ "Pasteur". Четерій роду Mycobacterium, (ii) введення молекули рез 120 днів після вакцинації тварин піддавали рекомбінантної нуклеїнової кислоти до згаданої контрольному зараженню H37Rv (200 мікроорганібактеріальної клітини, де згадана молекула нуклезмів/легені) аерозольним шляхом. Бактеріальне їнової кислоти кодує гібридний поліпептид, що навантаження інфікованих органів (селезінка та містить (а) щонайменше один домен поліпептиду, легені) оцінювали через 30 днів, 60 днів і 90 днів де згаданий домен є здатним до викликання імунпісля контрольного зараження. Кожен стовпчик ної реакції у ссавця, і (b) домен виходу з фаголізопредставляє 10 тварин. соми, і (ііі) культивування клітини, яка була одерФіг. 2: показує кількість мікроорганізмів у легежана за стадією (іі), за відповідних умов. За нях (Фіг. 2а) або у селезінці (Фіг. 2b). Мишей лінії варіантом, якому віддають перевагу, одержують Rag1-/- інфікували батьківським штамом БЦЖ (wt) клітину, що є здатною до експресії згаданої молеабо штамом rBCG ureC Hly (urea-hly). Бактеріалькули нуклеїнової кислоти. За варіантом, якому відне навантаження інфікованого органа оцінювали дають більшу перевагу, згаданою клітиною є клічерез 30 днів, 60 днів і 90 днів після інфікування. тина М. bovis. Фіг. 3: показує коефіцієнт виживаності SCIDЗа додатковим аспектом, цей спосіб включає мишей (мишей, що страждають на тяжкий комбістадії (і) надання уреазадефіцитної бактеріальної нований імунодефіцит), інфікованих БЦЖ "Pasteur" клітини, зокрема, клітини бактерій роду і rBCG delta ureC Hly. Mycobacterium, (іі) введення молекули рекомбінанПослідовність № 1: показує нуклеотидну постної нуклеїнової кислоти до згаданої бактеріальної лідовність молекули нуклеїнової кислоти за цим клітини, де згадана молекула нуклеїнової кислоти винаходом. кодує пептид або поліпептид виходу з фаголізосоПослідовність № 2: показує відповідну аміноми, і (ііі) культивування клітини, яка була одержана кислотну послідовність молекули нуклеїнової кисза стадією (іі), за відповідних умов. лоти Послідовності № 1. У разі потреби, спосіб за цим винаходом Приклад 1. Одержання уреазадефіцитних включає введення до згаданої бактеріальної кліштамів BCG Hlv і випробування на мишачій моделі тини щонайменше однієї додаткової молекули 1. Інактивація уреазної активності BCG delta рекомбінантної нуклеїнової кислоти, де згадана ureC. додаткова молекула рекомбінантної нуклеїнової Для поліпшення захисного потенціалу штаму кислоти кодує пептид або поліпептид, здатний до БЦЖ, що містить білок Hly (rBCG-Hly), уреазну викликання імунної реакції у ссавця. активність ліквідували. І, нарешті, цей винахід має відношення до Для одержання уреазадефіцитного мутанта, способу одержання живої вакцини, що включає Рейрат (Reyrat) та інші конструювали вектороб'єднання згаданих рекомбінантних клітин у фа"самовбивцю", що містить ген ureC, зруйнований рмацевтично ефективній кількості з фармацевтичмаркером канаміцину (ген aph). Два мікрограми но прийнятними розріджувачами, носіями та/або цієї генно-інженерної конструкції переводили у ад'ювантами. лінійну форму за допомогою SacI, і шляхом електУнаслідок високого рівня нешкідливості уреаропорації вводили БЦЖ (М. bovis). Канаміцинорезадефіцитних бактеріальних клітин, який було зистентні трансформанти відбирали за уреазапродемонстровано на двох різних тваринних монегативним фенотипом (порівняй Рейрат (Reyrat) делях (Приклад 3), жива вакцина за цим винахота інші, 1995). дом є особливо придатною для введення імуно2. Конструювання мікобактеріального "човнидефіцитним суб'єктам, наприклад, суб'єктам, що кового" експресійного вектора pMV306:Hly на осстраждають на ВІЛ-інфекцію або суб'єктам, яких нові Е. coli. піддають лікуванню імуносупресорними лікарсьДля перенесення функції виходу з фагосом кими засобами. За варіантом здійснення, якому (опосередкованої Hly EGD Sv 1/2а L. віддають особливу перевагу, жива вакцина за цим monocytogenes) до БЦЖ Pasteur (1173Р3) delta винаходом застосовується як протитуберкульозна ureC, застосовували мікобактеріальний "човниковакцина для імунодефіцитних суб'єктів. вий" вектор на основі Е. coli. Інтегративна плазміЗа додатковим варіантом здійснення, якому да рМV306, попередник вектора pMV361, забезпевіддають перевагу, жива вакцина застосовується чує стійку хромосомну експресію Hly. як протипухлинна вакцина, наприклад, як вакцина Фрагмент ДНК Pstl (1,7 тис.п.н.), одержаний проти поверхневого раку сечового міхура. За ще від pILH-Ι, що кодує відкриту рамку зчитування hlуіншим додатковим варіантом здійснення цього hlуА (рНlу152-специфічний гемолізин А Е. coli), винаходу, якому віддають перевагу, жива вакцина вводили на сайт Pstl плазміди рАТ261. Одержаний застосовується у ветеринарній галузі, наприклад, таким чином гібридний ген кодує експресію секретованих білків, що спрямовуються до супернатан 13 91180 14 ту БЦЖ-специфічним сигнальним пептидом потенціалу rBCG ureC Hly використали морських Ag85B. Цю генно-інженерну конструкцію позначисвинок, як більш сприйнятливу модельну тварину. ли як pAT261:Hly, і її полігенний експресійний клаМорських свинок підшкірно імунізували відповідстер Xbal-Sall під транскрипційним контролем міним мікобактеріальним вакцинним штамом, rBCG кобактеріального промотора hsp60 у подальшому ureC Hly або батьківським штамом БЦЖ, і після застосовували для введення до батьківського векаерозольного контрольного зараження H37Rv М. тора pMV306 з одержанням генно-інженерної tuberculosis контролювали приріст маси тіла, а конструкції pMV306:Hly. Аналізували послідовність також рівень колонієтвірних одиниць. Морські свиДНК hly-специфічних інсерційних сайтів обох міконки, імунізовані rBCG ureC Hly, демонстрували бактеріальних експресійних плазмід. Зрілий гібриприріст маси тіла, подібний приросту маси тіла дний білок Hly гіпотетично включає 30 амінокислот тварин, вакцинованих батьківським штамом БЦЖ на N-кінці і 52 амінокислоти на С-кінцевій ділянці до 120 дня, після чого невакциновані тварини явно гібридування, яка частково належить HlyA E. coli. страждали на туберкульоз, про що свідчить відсу3. Захисний потенціал на мишачій моделі тність приросту маси тіла. Експресійний вектор pMV306:Hly трансформуВізуальне обстеження легень і селезінки певали в уреазадефіцитний штам БЦЖ Pasteur (BCG ред аналізом колонієтвірних одиниць показало, що Ρ ureC). Одержаний штам позначили як rBCG ureC туберкульозні горбики на поверхні обох органів Hly. Захисний потенціал цього уреазадефіцитного БЦЖ-імунізованих морських свинок були набагато мікобактеріального штаму, який порівнювали з більшими і численішими, аніж у BCG ureC Hlyбатьківським BCG Pasteur і BCG Pasteur ureC на вакцинованих тварин. моделі мишачого туберкульозу, показано на Фіг. 1. Приклад 3. Оцінка нешкідливості BCG ureC Hlv Несподівано встановили, що rBCG ureC Hly індуМишей лінії Ragl-/-, у яких були відсутні Т- і Вкував посилений захист вже на початкових часоклітини, інфікували 106 мікроорганізмами батьківвих стадіях (30 день після контрольного зараженського штаму БЦЖ (wt) або штаму rBCG ureC Hly. ня), який зберігався впродовж усього періоду Контролювали присутність мікроорганізмів у легеспостереження (до 90 дня). нях і селезінці. У легенях спостерігали значно Зі штамом rBCG ureC Hly здійснили додаткозменшену кількість колонієтвірних одиниць rBCG вий експеримент із визначення довготривалого ureC Hly (Фіг. 2а). У селезінці спостерігали дещо захисту. Мишей лінії BALB/c вакцинували внутрішзменшену кількість колонієтвірних одиниць після ньовенним шляхом rBCG ureC Hly, rBCG-Hly або інфікування rBCG ureC Hly, порівняно з інфікуванбатьківським штамом БЦЖ, і піддавали контрольня батьківським штамом БЦЖ (Фіг. 2b). ному зараженню на 120 день після інфікування На додаток до цього, нешкідливість BCG ureC H37Rv M. tuberculosis. rBCG-Hly і батьківський Hly перевіряли на SCID-мишах (миші, що стражштам БЦЖ індукували порівнянний ступінь захисту дають на тяжкий комбінований імунодефіцит). проти H37Rv Μ. tuberculosis на 90 день. На значну З цією метою SCID-мишам внутішньовенно противагу цьому, rBCG ureC індукував поліпшений вводили 107-108 мікроорганізмів rBCG ureC Hly або захист вже на початкових часових стадіях, розпобатьківського штаму БЦЖ. У той час як SCID-миші, чинаючи з 30 дня після контрольного зараження. яким вводили батьківський штам, загинули до 25 На додаток до цього, цей посилений захист тривав дня після інфікування, миші, яким вводили rBCG впродовж усього періоду спостереження і продеureC Hly, залишались живими до 150 дня після монстрував зниження навантаження H37Rv M. інфікування (Фіг. 3). tuberculosis у легенях на 90 день після контрольЦі експерименти продемонстрували, що BCG ного зараження більше ніж у 2 log колонієтвірні ureC Hly має підвищений рівень нешкідливості, одиниці порівняно з мишами, які раніше у дослідах порівняно з батьківським штамом БЦЖ. не використовувались, і більше ніж у 1 log колонієПосилання твірну одиницю порівняно з мишами, вакцинова1. Aidoo M., Lalvani A., Allsopp C.E.M. et al. (1995), ними батьківським штамом БЦЖ. Identification of conserved antigenic components for a Подібні результати одержали після контрольcytotoxic Τ lymphocyte-inducing vaccine against ного зараження клінічним ізолятом М. tuberculosis malaria, The Lancet 345: 1003. Beijing. Мишей лінії BALB/c імунізували внутріш2. Andersen P. (1994), Effective vaccination of mice ньовенним шляхом rBCG ureC Hly, BCG-Hly або against Mycobacterium tuberculosis infection with a батьківським штамом БЦЖ і піддавали контрольsoluble mixture of secreted Mycobacterial protein, ному зараженню на 120 день після інфікування М. Infect. Immun. 62: 2536-2544. tuberculosis Beijing. Вакцинація BCG ureC Hly інду3. Andersen P., Andersen А.В., SorensenAX. and кувала поліпшений захист проти М. tuberculosis Nagai S. (1995), Recall of long-lived immunity to Beijing вже на початкових часових стадіях (30 Mycobacterium tuberculosis infection in mice, J. день), який зберігався впродовж усього періоду Immunol. 154:3359. спостереження до 90 дня після контрольного за4. Berche P., Gaillard J.L., and Sansonetti P.J. раження. Порівняно з вакцинацією батьківським (1987), Intracellular growth of Lmonocytogenes as a штамом БЦЖ, вакцинація rBCG ureC Hly забезпеprerequisite for in vivo induction of Τ cell-mediated чила зниження навантаження М. tuberculosis immunity, J. Immunol. 138: 2266-2276. Beijing у легенях на 1 log колонієтвірну одиницю. 5. Bielecki J., Youngman P., Connelly P., and Portnoy Приклад 2. Довготривалий захист проти H37Rv D.A. (1990), Bacillus subtilus expressing a hemolysin Μ. tuberculosis у морських свинок gene from Listeria monocytogenes can grow in Оскільки миші є відносно стійкими до інфікуmammalian cells, Nature 354:175-176. вання М. tuberculosis, для перевірки імунізаційного 15 91180 16 6. Blander S.J. and Horwitz M.A. (1991), Vaccination Autran B. (1996), Dynamics of viral variants in HIV-1 with a major secretory protein of Legionella induces Nef and specific cytotoxic Τ lymphocytes in vivo. J. humoral and cell-mediated immune responses and Immunol. 157: 4212. protective immunity across different serogroups of 20. Harboe M., Oettinger Т., Wiker H.G. et al. (1996), Legionella pneumophila and different species of Evidence for occurrence of the ESAT-6 protein in Legionella, J. Immunol. 147: 285. Mycobacterium tuberculosis and virulent 7. Bosch F.X., Durst M., Schwarz E., Boukamp P., Mycobacterium bovis and for its absence in Fusenig N.E. and zur Hausen H. (1991), The early Mycobacterium bovis BCG, Infect. Immun. 64: 16. genes E6 and E7 of cancer associated human 21. Harrer Т., Harrer E., Kalams S.A., Barbosa P., papilloma viruses as targets of tumor suppression?, Trocha A, Johnson R.P., Elbeik Т., Feinberg M.B., Behring Inst. Mitt. 108. Buchbinder S.P. and Walker B.D. (1996), Cytotoxic Τ 8. Bulow R. and Boothroyd J.C. (1991), Protection of lymphocytes in asymptomatic long-term mice from fatal Toxoplasma gondii infection by nonprogressing HIV-1 infection. Breadth and immunization with p30 antigen in Iiposomes, J. specificity of the response and relation to in vivo viral Immunol. 147: 3496. quasispecies in a person with prolonged infection and 9. Clemens D.L., and Horwitz M.A. (1996), The low viral load, J. Immunol. 156:2616. Mycobacterium tuberculosis phagosome interacts 22. Harth G., Lee B.-Y., Wang. J., Clemens D.L., and with early endosomes and is accessible to Horwitz M.A. (1996), Novel insights into the genetics, exogenouslyadministeredtransferrin, J. Exp. Med. biochemistry, and immunocytochemistry of the 30184: 1349-1355. kilodalton major extracellular protein of 10. Clemens D.L., Lee B.Y., Horwitz M.A. (1995), Mycobacterium tuberculosis, Infect. Immun. 64: 3038Purification, characterization, and genetic analysis of 3047. Mycobacterium tuberculosis urease, a potentially 23. Hess J., Wels W., Vogel M., and Goebel W. critical determinant of host-pathogen interaction. J. (1986), Nucleotide sequence of plasmid-encoded Bacteriol. 1995 177: 5644-5652. hemolysin determinant and its comparison with a 11. Darji Α., Chakraborty Т., Wehland J., and Weiss corresponding chromosomal hemolysin sequence, S. (1996), Listerioiysin generates a route for the FEMS Lett. 34: 1-11. presentation of exogenous antigens by major 24. Hess J., and Kaufmann S.H.E. (1993), bistocompatibility complex class I, Eur. J. Immunol. Vaccination strategies against intracellular microbes, 25: 2967-2971. FEMS Microbiol. Immunol. 7: 95-103. 12. Domann E., and Chakraborty T. (1989), 25. Hess J., Gentschev l., Miko D., Welzel M., Ladel Nucleotide sequence of the listerioiysin gene from a C, Goebel W., and Kaufmann S.H.E. (1996), Superior Listeria monocytogenes serotype 1 / 2a strain, efficacy of secreted over somatic p60 or listeriolysin Nucleic Acids Res. 17: 6406. antigen display in recombinant Salmonella vaccine 13. Fleschl., Hess J.H., Oswald IP., and Kaufmann induced protection against listeriosis, Proc. Natl. S.H.E. (1994), Growth inhibition of Mycobacterium Acad. Sci. USA 93:1458-1463. bovis by IFN-y stimulated macrophages: regulation by 26. Hess J., and Kaufmann S.H.E. (1997), Principles endogenous tumor necrosis factor-a and by 1L-10, of cell-mediated immunity underlying vaccination Int. Immunol. 6: 693-700. strategies against intracellular pathogens, in Host 14. Flynn J.L, Goldstein M.M., Triebold K.J., Koller В., Response to Intracellular Pathogens, S.H.E. and Bloom B.R. (1992), Major histocompatibility Kaufmann (ed), R.G. Landes Co., Austin, pp. 75-90. complex class 1-restricted Τ cells are required for 27. Hess J., Miko D., Catic Α., Lehmensiek V., resistance to Mycobacterium tuberculosis infection, Russell D.C., Kaufmann S.H., (1998), Mycobacterium Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12013-12017. bovis Bacille Calmette-Guerin strains secreting 15. Fu T.M., Friedman A, Ulmer J.B., Liu M.A. and listeriolysin of Listeria monocytogenes. Proc. Natl. Donnelly J.J. (1997), Protective cellular immunity: Acad. Sci. USA. 95(9):5299-304. cytotoxic T-lymphocyte responses against dominant 28. Horwitz M.A., Lee B.-W.E., Dillon BJ., and Harth and recessive epitopes of influenza virus G. (1995), Protective immunity against tuberculosis nucleoprotein induced DNA immunization, J. Virol. 71: induced by vaccination with major extracellular 2715. proteins of Mycobacterium tuberculosis, Proc. Natl. 16. Gaillard J.L., Berche P., Mourner J., Richard S., Acad. Sci. USA 92: 1530-1534. and Sansonetti P.J. (1987), In vitro model of 29. Houbiers J.G.A., Nijman H.W., van der Burg S.H., penetration and intracellular growth of Listeria Drijfhout J.W., Kenemans P., van de Velde C.J.H., monocytogenes in the human enterocyte-Iike cell line Brand A, Momburg F., Kast W.M. and Melief C.J.M. Caco-2, Infect. Immun. 55: 2822-2829. (1993), In vitro induction of human cytotoxic Τ 17. Gentschev I., Sokolovic Z., Mollenkopf H.-J., Hess lymphocyte responses against peptides of mutant and J., Kaufmann S.H.E., Kuhn M., Krohne G.F., and wild-type p53, Eur. J. Immunol. 23: 2072. Goebel W. (1995), Salmonella secreting active 30. Huygen K., Content J., Denis O., Montgomery listerioiysin changes its intracellular localization, D.L, Yawman AM., Deck R.R., DeWitt СМ., Orme Infect. Immun. 63: 4202-4205. I.M., Baldwin S., D'Souza C, Drowart A, Lozes E., 18. Grange J.M. (1996), Epidemiological aspects of Vandenbussche P., Van Vooren J.-P., Liu M.A, and drug resistance, in Mycobacteria and human disease, Ulmer J.B. (1996), Immunogenicity and protective Arnold, London, pp. 124-125. efficacy of a tuberculosis DNA vaccine, Nat. Med. 2: 19. Haas G., Plikat U., Debre P., Lucchiari M., 893-898. Katlama C, Dudoit Y., Bonduelle O., Bauer M., 31. Kaufmann S.H.E. (1993), Immunity to intracellular Ihlenfeldt H.G., Jung G., Maier В., Meyerhans A. and bacteria, Annu. Rev. Immunol. 11:129-163. 17 91180 18 32. Khan I.A., Ely K.H. and Kasper L.H. (1991), A utilization for the demonstration of allelic exchange in purified parasite antigen (p30) mediates CD8 Τ cell Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin. Proc immunity against fatal Toxoplasma gondii infection in Natl Acad Sci USA. 92(19): 8768-72. mice, J. Immunol. 147: 3501. 46. Roche P.W., Triccas J.A., and Winter N. (1995), 33. King CH., Mundayoor S., Crawford J.T. and BCG vaccination against tuberculosis: past Shinnik T.M. (1993), Expression of contact-dependent disappointments and future hopes, Trends Microbiol. cytolytic activity by Mycobacterium tuberculosis and 3: 397-401. isolation of the genomic locus that encodes the 47. Russell D.G. (1995), Mycobacterium and activity, Infect. Immun. 61: 2708-2712. Leishmania: stowaways in the endosomal network. 34. Kochi A. (1991), The global tuberculosis situation Trends in Cell Biology 5:125-128. and the new control strategy of the World Health 48. Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T. (1989), Organization, Tubercle 72: 1-6. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edition, 35. Ladel CH., Daugelat S., and Kaufmann S.H.E. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. (1995), Immune response to Mycobacterium bovis 49. Schoel В., Welzel M., and Kaufmann S.H.E. bacille Calmette Guerin infection in major (1994), Hydrophobic interaction chromatography for histocompatibility complex class I- and ll-deficient the purification of cytolytic bacterial toxins, J. knock-out mice: contribution of CD4 and CD8 T-cells Chromatography A 667:131-139. to acquired resistance, Eur. J. Immunol. 25: 377-384. 50. Sorensen A.L., Nagai S., Houen G., Andersen P. 36. Laemmli U.K. (1970), Cleavage of structural and Andersen A.B. (1995), Purification and proteins during the assembly of the head of characterization of a low-molecular-mass-T-cell bacteriophage T4, Nature 227: 680-685. antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis, 37. Langermann S., Palaszynski S.R., Burlein J.E., Infect. Immun. 63:1710. Koenig S., Hanson M.S., Briles D.E., and Stover C.K. 51. Stover C.K., Bansal G.P., Hanson M.S. Burlein (1994), Protective humoral response against J.E., Palaszynski S.R., Young J.F., Koenig S., Young pneumococcal infection in mice elicited by D.B., SadzieneA., BarbourA.G. (1993), Protective recombinant Bacille Calmette-Guerin vaccines immunity elicited by recombinant Bacille Calmette expressing pneumococcal surface protein Α., J. Exp. Guerin (BCG)expressing outer surface protein A Med. 180: 2277-2286. (OspA) lipoprotein: A candidate lyme disease 38. Matsui M., Moots R.J., Warburton R.J., Peacevaccine, J. Exp. Med. 178:197-209. Brewer Α., Tussey L.G., Quinn D.G., McMichael A.J. 52. Stover С.K., de la Cruz V.F., Fuerst T.R., Burlein and J.A. Frelinger (1995), Genetic evidence for J.E., Benson L.Α., Bennett L.T., Bansal G.P., Young differences between intracellular peptides of influenza J.F., Lee M.H., Hatfull G.F., Snapper S.B., Barletta A matrix peptide-specific CTL recognition, J. R.G., Jacobs W.R., Jr., and Bloom B.R. (1991), New Immunol. 154: 1088. use of BCG for recombinant vaccines, Nature 351: 39. Matsuo K., Yamaguchi R., YamazakiA., Tasaka 456-460. H., Terasaka K., and Yamada T. (1990), Cloning and 53. Sturgill-Koszycki S., Schlesinger P.H., expression of the Mycobacterium bovis BCG gene for Chakraborty P., Haddix P.L, Collins H.L, Fok A.K., extracellular alpha antigen, J. Bacteriol. 170: 3847Men R.D., Gluck S.L, Heuser J. and Russell D.G. 3854. (1994), Lack of acidification in Mycobacterium 40. Mazzaccaro R.Z., Gedde M., Jensen E.R., Van phagosomes produced by exclusion of the vesicular Santen H.M., Ploegh H.L., Rock K.L., and Bloom B.R. proton-ATPase, Science 263: 678-681. (1996), Major histocompatibility class I presentation of 54. Towbin H., Staehelin T., and Gordon J. (1979), soluble antigen facilitated by Mycobacterium Electrophoretic transfer of proteins from tuberculosis infection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: 11786-11791. procedure and some applications, Proc. Natl. Acad. 41. McDonough K.A., Kress Y., and Bloom B.R. Sci. USA 76: 4350-4354. (1993), Pathogenesis of tuberculosis: Interaction of 55. Tsuchiya S., Kobayashi Y., Goto Y., Okumura H., Mycobacterium tuberculosis with macrophages, Nakae S., Konno Т., and Tada K. (1982), Induction of Infect. Immun. 61: 2763-2773. maturation in cultured human monocytic leukemia 42. Murray P.J., Aldovini A., and Young R.A. (1996), cells by a phorbol diester, Cancer Res. 42: 1530Manipulation and potentiation of anti-mycobacterial 1536. immunity using recombinant bacilleCalmette-Guerin 56. Tweten R.K. (1995), Pore-forming toxins of gramstrains that secrete cytokines, Proc. Natl. Acad. Sci. positive bacteria, in Virulence Mechanisms of USA 93: 934-939. Bacterial Pathogens, J.A. Roth et al. (ed), American 43. Nato R, Reich K., Lhopital S., Rouye S., Geoffroy Society for Microbiology, Washington, D.C., pp. 207C, Mazie J.C., and Cossart P. (1991), Production and 228. characterization of neutralizing and non-neutralizing 57. van Elsas Α., van der Burg S.H., van der Міnnе monoclonal antibodies against listeriolysin O., Infect. С.Е., Borghi M., Mourer J.S., Melief C.J.M. and Immun. 59: 4641-4646. Schrier P.I. (1996), Peptide-pulsed dendritic cells 44. Portnoy D.A., Jacks P.S., and Hinrichs D.J. induce tumoricidal cytotoxic Τ lymphocytes from (1988), Role of hemolysin for the intracellular growth healthy donors against stably HLA-A*0201-binding of Listeria monocytogenes, J. Exp. Med. 167:1459peptides from Melan-A/MART-1 self antigen, Eur. J. 1471. Immunol. 26:1683. 45. Reyrat J.M., Berthet F.X., Gicquel В., (1995) The urease locus of Mycobacterium tuberculosis and its 19 91180 20 21 91180 22 23 91180 24 25 91180 26 27 91180 28 29 91180 30 31 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 91180 Підписне 32 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601