Пегильований fab-фрагмент антитіла, який специфічно зв’язується з бета-амілоїдним пептидом

1. Молекула, яка містить фрагмент антитіла, яке специфічно зв'язує людський А пептид між амінокислотними положеннями 13-28, в якій згаданий фрагмент антитіла містить варіабельну ділянку легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 1 та варіабельну ділянку важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2, і в якій молекула поліетиленгліколю ковалентно приєднана до гіперваріабельної ділянки важкого ланцюга фрагмента антитіла. 2. Молекула за п. 1, в якій фрагментом антитіла є Fab-фрагмент. 3. Молекула за будь-яким із п. 1 або п. 2, в якій молекула поліетиленгліколю ковалентно приєднана до цистеїну у амінокислотному положенні 56 варіабельної ділянки важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2. 2 (19) 1 3 Цей винахід має відношення до фрагмента антитіла, який зв'язує бета-амілоїдний (Α) пептид і ковалентно приєднаний до однієї або декількох молекул поліетиленгліколю (PEG). Бета-амілоїдний пептид у циркулюючій формі складається з 39-43 амінокислот (переважно з 40 амінокислот або 42 амінокислот), що є результатом розщеплення білка-попередника, білкапопередника амілоїду (АРР). Виявляється, що перетворення бета-амілоідного пептиду з розчинної на нерозчинну форму з високим вмістом -складок та його відкладення у вигляді старечих бляшок та бляшок у судинах головного мозку пов'язане з рядом станів та захворювань, у тому числі із хворобою Альцгеймера, синдромом Дауна та церебральною амілоїдною ангіопатією (САА). Стани, які мають відношення до Α пептиду, можна лікувати шляхом запобігання та/або усунення відкладення Α пептиду. До числа терапевтичних засобів, що впливають на відкладення Α пептиду, належать антитіла проти Α пептиду, наприклад, гуманізовані антитіла та фрагменти, що обговорюються у WO 2001/62801, WO 2004/071408 та Тамура Й. (Tamura Y.) та інші, Neurobiol. of Dis. (2005) 20:541545. Незважаючи на те, що багато антитіл та їх похідних можуть застосовуватись для діагностики та терапії, ідеальна фармакокінетика антитіл для конкретного застосування часто є недосяжною. Терапевтичними антитілами, спрямованими проти різних станів та захворювань, які мають відношення до Α пептиду, є, як правило, імуноглобуліни з інтактними Fc-ділянками. Fc-ділянки несуть відповідальність за подовження періоду напіввиведення антитіла з плазми. Однак це подовження може бути недоліком, оскільки воно запобігає ефективному виведенню антитіла, яке є приєднаним до пептиду-мішені, результатом чого є наявність комплексу антиген-антитіло у циркулюючій плазмі впродовж тривалого періоду часу. Результатом подальшого введення антитіла є додаткове накопичення небажаного комплексу у плазмі. Fcділянка антитіла може мати певні небажані ефекторні функції і може потребувати модифікації для ліквідації таких функцій. Крім того, Fc-ділянка значно збільшує загальні розміри терапевтичного засобу, унаслідок чого часто виникають проблеми, пов'язані зі шляхом доставки, засобами для доставки та пристосуванням технологічних процесів до великосерійного виробництва. Фрагменти антитіл без Fc-ділянки, у тому числі Fab-фрагменти, досліджували in vivo для визначення потенційної придатності таких фрагментів для застосування як терапевтичні засоби. Однак результати досліджень вказують на те, що придатність терапевтичних засобів, що містять фрагменти типу Fab-фрагментів, є обмеженою внаслідок великої швидкості виведення та короткого періоду напіввиведення. Таким чином, існує потреба у активній терапевтичній молекулі антитіла проти Α пептиду з фармакокінетикою та фармакодинамі 95996 4 кою, що надають можливість розробки поліпшеної схеми приймання лікарського засобу з одночасним запобіганням потенційним побічним ефектам, які можуть бути спричинені утворенням комплексів у плазмі та потенційними ефекторними функціями. Цей винахід долає ряд проблем, пов'язаних із терапевтичними антитілами або фрагментами антитіл, які можуть спрямовуватись проти Α пептиду. До сполук за цим винаходом належить фрагмент антитіла, який зв'язує Α пептид і ковалентно приєднаний до однієї або декількох молекул поліетиленгліколю (PEG). Ці сполуки можна одержувати у системах бактеріальних або дріжджових клітин, що ліквідує різноманітні проблеми, пов'язані з продукуванням антитіл у лініях клітин ссавців, наприклад, проблеми, пов'язані з витратами, очищенням та забрудненням ендогенно продукованих антигенів. Крім того, сполуки за цим винаходом можуть вводитись під шкіру і мають ідеальні фармакокінетичні (РК) та фармакодинамічні (PD) властивості з одночасним збереженням спорідненості та селективності фрагмента антитіла повідношенню до Α пептиду. Заявники виявили, цілком непередбачувано та несподівано, що ковалентне приєднання молекул поліетиленгліколю до гіперваріабельної ділянки (CDR) фрагмента антитіла не змінює активності, спорідненості або селективності фрагмента антитіла по відношенню до Α пептиду. Цей винахід надає молекулу, яка містить фрагмент антитіла, який специфічно зв'язує людський Α пептид між амінокислотними положеннями 1328, де згаданий фрагмент антитіла ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю. За варіантом, якому віддається перевага, фрагментом антитіла є Fab-фрагмент. За одним із варіантів здійснення цей винахід надає молекулу, яка містить фрагмент антитіла, який має варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга, де варіабельна ділянка легкого ланцюга містить гіперваріабельні ділянки, які мають наведені нижче амінокислотні послідовності: CDRL1: SSSQSLIYSDGNAYLH (послідовність SEQ ID NO: 6), CDRL2: KVSNRFS (послідовність SEQ ID NO: 7) та CDRL3: TQSTHSPWT (послідовність SEQ ID NO: 8), і де варіабельна ділянка важкого ланцюга містить гіперваріабельні ділянки, які мають наведені нижче амінокислотні послідовності: CDRH1: GYTFSRYSMS (послідовність SEQ ID NO: 9), CDRH2: QINIRGCNTYYPDTVKG (послідовність SEQ ID NO: 10) або QINIRGNNTYYPDTVKG (послідовність SEQ ID NO: 11) та CDRH3: GDF (послідовність SEQ ID NO: 12). За варіантом, якому віддається перевага, така молекула має молекулу поліетиленгліколю, яка ковалентно приєднана до варіабельної ділянки важкого ланцюга або до варіабельної ділянки легкого ланцюга фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається більша перевага, така молекула має молекулу поліетиленгліколю, яка ковалентно приєднана до гіперваріабельної ділянки. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, така молекула має молекулу 5 поліетиленгліколю, яка ковалентно приєднана до залишку цистеїну у межах гіперваріабельної ділянки. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, така молекула має молекулу поліетиленгліколю, яка ковалентно приєднана до CDRH2: QINIRGCNTYYPDTVKG (послідовність SEQ ID NO: 10) варіабельної ділянки важкого ланцюга фрагмента антитіла. За іншим варіантом здійснення цей винахід надає молекулу, яка містить фрагмент антитіла, який має варіабельну ділянку легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 1 та варіабельну ділянку важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2. За варіантом, якому віддається перевага, така молекула має молекулу поліетиленгліколю, яка ковалентно приєднана до варіабельної ділянки важкого ланцюга або до варіабельної ділянки легкого ланцюга фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається більша перевага, така молекула має молекулу поліетиленгліколю, яка ковалентно приєднана до гіперваріабельної ділянки варіабельної ділянки важкого ланцюга фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, така молекула має молекулу поліетиленгліколю, яка ковалентно приєднана до залишку цистеїну у межах гіперваріабельної ділянки варіабельної ділянки важкого ланцюга фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, така молекула має молекулу поліетиленгліколю, яка ковалентно приєднана до цистеїну у амінокислотному положенні 56 варіабельної ділянки важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2. За іншим варіантом здійснення цей винахід надає молекулу, яка містить Fab-фрагмент або ScFv-фрагмент, де Fab-фрагмент або ScFvфрагмент ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю і має варіабельну ділянку легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 1 та варіабельну ділянку важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2. За варіантом, якому віддається перевага, така молекула має молекулу поліетиленгліколю, яка ковалентно приєднана до цистеїну у амінокислотному положенні 56 варіабельної ділянки важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2. За варіантом, якому також віддають перевагу, молекулярна маса поліетиленгліколю у такій молекулі становить від приблизно 0,5 кДа до приблизно 30 кДа, за варіантом, якому віддається більша перевага, 20 кДа. За іншим варіантом здійснення цей винахід надає молекулу, яка містить фрагмент антитіла з варіабельною ділянкою легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 1 та варіабельною ділянкою важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2, де згаданий фрагмент антитіла ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю з молекулярною масою 20 кДа у положенні 56 варіабельної ділянки важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2. За варіантом, якому віддається перевага, молекула поліетиленгліколю у такій молекулі ковалентно приєднується через малеімідний місток. За іншим варіантом здійснення цей винахід надає молекулу, яка містить фрагмент антитіла, який специфічно зв'язує людський Α пептид між амінокислотними положеннями 13-28, де згаданий 95996 6 фрагмент антитіла ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю і має варіабельну ділянку легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 1 та варіабельну ділянку важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 3. За варіантом, якому віддається перевага, така молекула має молекулу поліетиленгліколю, яка ковалентно приєднана до шарнірної ділянки фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається більша перевага, молекула поліетиленгліколю ковалентно приєднана до шарнірної ділянки через малеімідний місток. Цей винахід включає також молекулу, яка містить фрагменти антитіла, за варіантом, якому віддається перевага, фрагменти гуманізованого антитіла, де молекула поліетиленгліколю ковалентно приєднана до фрагмента антитіла, результатом чого є молекула активного лікарського засобу з фармакокінетичними та фармакодинамічними властивостями, які уможливлюють розробку тижневої схеми приймання лікарського засобу зі зведенням до мінімального рівня потенційних побічних ефектів, які можуть бути спричинені утворенням комплексів у плазмі, і збереженням або поліпшенням активності, спорідненості та селективності фрагмента антитіла по відношенню до Α пептиду. Цей винахід включає також способи лікування, запобігання або спричинення зворотного розвитку станів та захворювань, які мають відношення до Α пептиду, у тому числі передклінічної та клінічної стадій хвороби Альцгеймера, синдрому Дауна, передклінічної та клінічної стадій церебральної амілоїдної ангіопатії (САА), порушення пізнавальної здатності, інсульту, внутрішньомозкового крововиливу та загальної розумової слабкості. Ці способи включають введення в організм суб'єкта ефективної кількості молекул, опис яких наведено і які є предметом формули винаходу. Цей винахід надає молекулу, яка містить фрагмент антитіла, який специфічно зв'язує людський Α пептид між амінокислотними положеннями 1328, де згаданий фрагмент антитіла ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю. Винахідники встановили, що ковалентне приєднання молекули поліетиленгліколю до фрагмента антитіла, яке зв'язує Α пептид, не чинить негативного впливу на активність, спорідненість або селективність фрагмента антитіла по відношенню до Α пептиду. Ще більш несподівано винахідники встановили, що ковалентне приєднання молекули поліетиленгліколю, яка має молекулярну масу до 20 кДа, з гіперваріабельною ділянкою фрагмента антитіла, яке зв'язує Α пептид, також не чинить негативного впливу на активність, спорідненість або селективність фрагмента антитіла по відношенню до Α пептиду. Ці фрагменти антитіла можуть вводитись під шкіру і мають поліпшені фармакокінетичні (РК)/фармакодинамічні (PD) властивості для терапевтичного застосування з підтримкою гнучкої схеми приймання лікарського засобу. Крім того, ці фрагменти антитіла можуть продукуватись у системах бактеріальних або дріжджових клітин, що ліквідує різноманітні проблеми, пов'язані з продукуванням непроцесованих антитіл у клітинах ссавців. Згадані пегільовані фрагменти антитіла за цим 7 винаходом надають можливість запобігання та профілактичного або терапевтичного лікування у людей станів, які мають відношення до Α пептиду. Непроцесоване антитіло у тому вигляді, у якому воно існує в природних умовах, являє собою молекулу імуноглобуліну, яка складається з чотирьох пептидних ланцюгів, двох важких (Н) ланцюгів (приблизно 50-70 кДа у непроцесованому вигляді) та двох легких (L) ланцюгів (приблизно 25 кДа у непроцесованому вигляді), приєднаних один до одного дисульфідними зв'язками. Амінокінцева частина кожного ланцюга містить варіабельну ділянку довжиною приблизно 100-110 амінокислот або більше, яка відповідає головним чином за розпізнавання антигену. На карбоксильному кінці кожного ланцюга знаходиться константна ділянка, яка відповідає головним чином за ефекторну функцію. Легкі ланцюги підрозділяються на ланцюги типу каппа або типу лямбда і відрізняються конкретною константною ділянкою. Кожен легкий ланцюг містить N-кінцеву варіабельну ділянку легкого ланцюга (у цьому описі "LCVR") і константну ділянку легкого ланцюга, яка містить один домен, CL. Важкі ланцюги підрозділяються на ланцюги типу гамма, мю, альфа, дельта або епсилон і визначають ізотип антитіла як IgG, IgM, IgA, IgD та IgE, відповідно, і деякі з них можуть додатково підрозділятись на підкласи (ізотипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 та IgA2. Важкий ланцюг кожного типу відрізняється конкретною константною ділянкою. Кожен важкий ланцюг містить N-кінцеву варіабельну ділянку важкого ланцюга (у цьому описі "HCVR") і константну ділянку важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга складається з трьох доменів (СН1, СН2 та СН3) для IgG, IgD та IgA; і 4 доменів (CH1, СН2, СН3 та СН4) для IgM та IgE. HCVR та LCVR можуть додатково підрозділятись на гіперваріабельні ділянки, які називають ділянками, що обумовлюють комплементарність ("CDR"), які чергуються з більш консервативними ділянками, які називають каркасними ділянками ("FR"). Кожна HCVR та LCVR складається з трьох CDR та чотирьох FR, які розміщуються у напрямку від аміно-кінця до карбоксильного кінця таким чином: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. У цьому описі три гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга позначають як "CDRH1, CDRH2 і CDRH3", а три гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга позначають як "CDRL1, CDRL2 і CDRL3". Гіперваріабельні ділянки містять більшість залишків, які вступають до специфічних взаємодій з антигеном. Схема нумерації і місцезнаходження амінокислотних залишків гіперваріабельних ділянок у межах HCVR та LCVR відповідають добре відомій схемі нумерації, яка розроблена Кабатом (Kabat). Варіабельні ділянки кожної пари легкий/важкий ланцюг утворюють антигензв'язувальні центри антитіла У значенні, вживаному у цьому описі, терміни "антигензв'язувальний фрагмент", або "антигензв'язувальна ділянка", або "антигензв'язувальний домен", або "антигензв'язувальний сайт" взаємозамінно означають ту частину молекули антитіла, яка містить амінокислотні залишки, 95996 8 які взаємодіють з антигеном і наділяють антитіло його специфічністю та спорідненістю до згаданого антигену. Цей фрагмент антитіла містить "каркасні" амінокислотні залишки, необхідні для підтримання відповідної конформації антигензв'язувальних залишків. За варіантом, якому віддається перевага, каркасні ділянки антитіл за цим винаходом мають людське походження або по суті людське походження (людське походження на щонайменше 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99%) і відповідають схемі нумерації, яка розроблена Кабатом. За альтернативним варіантом антигензв'язувальний фрагмент може бути одержаний з людської послідовності. Термін "фрагмент антитіла", який вживають у цьому описі, має відношення до одного або декількох фрагментів антитіла, що зберігають здатність до специфічного зв'язування антигену (наприклад, Α пептиду). До прикладів молекул, які охоплюються терміном "фрагмент антитіла", належать (і) Fab-фрагмент, моновалентний фрагмент, який складається з доменів VL, VH, CL та CH1; (іі) F(аb')2-фрагмент, бівалентний фрагмент, який містить два Fab-фрагменти, зв'язані дисульфідним містком на шарнірній ділянці; (ііі) Fdфрагмент, який складається з доменів VH та CH1; (iv) Fv-фрагмент, який складається з доменів VL та VH одного плеча антитіла; та (ν) dAb-фрагмент (Уорд (Ward) та інші, (1989) Nature 341:544-546), який складається з домену VH. Крім того, хоча два домени Fv-фрагмента, VL та VH, кодуються окремими генами, вони можуть бути рекомбінантними способами з'єднані за допомогою синтетичного лінкера, який забезпечує їх одержання у вигляді одного білкового ланцюга, у якому ділянки VL та VH спаровані з одержанням моновалентних молекул (відомих як одноланцюгові Fv (scFv); дивись, наприклад, Берд (Bird) та інші, (1988) Science 242:423-426; та Хьюстон (Huston) та інші, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Вважається, що такі одноланцюгові антитіла також охоплюються терміном "фрагмент антитіла". Терміном "фрагмент антитіла" охоплюються також інші форми одноланцюгових антитіл, наприклад, діатіла. Діатіла являють собою бівалентні, біспецифічні зв'язувальні білки, у яких домени VH та VL експресуються на одному поліпептидному ланцюзі, але із застосуванням лінкера, який є занадто коротким для уможливлення парування двох доменів на одному і тому самому ланцюзі, таким чином примушуючи домени паруватись з комплеменарними доменами іншого ланцюга і утворюючи два антигензв'язувальні центри антитіла (дивись, наприклад, Холлігер П. (Holliger P.) та інші, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Поляк Р.Дж. (Poljak R.J.) та інші, (1994) Structure 2:1121-1123). Крім того, антитіло або його фрагмент можуть бути частиною більшої імуноадгезійної молекули, яка утворюється шляхом ковалентного або нековалентного зв'язування антитіла або фрагмента антитіла з одним або декількома іншими білками або пептидами. Приклади таких імуноадгезійних молекул включають застосування корової ділянки стрептавідину для одержання тетрамерної молекули scFv (Кіпріянов C.M. (Kipriyanov S.M.) та інші, 9 (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) та застосування залишку цистеїну, маркерного пептиду та С-кінцевої полігістидинової мітки для одержання бівалентних та біотинілованих молекул scFv (Кіпріянов С.М. (Kipriyanov S.M.) та інші, (1994) Mol. Immunol, 31:1047-1058). Фрагменти антитіл, наприклад, Fab- та F(аb')2-фрагменти, можуть одержуватись з цілих антитіл за допомогою традиційних способів, наприклад, шляхом розщеплення папаїном або пепсином, відповідно, цілих антитіл. Крім того, антитіла, фрагменти антитіл та імуноадгезійні молекули можуть бути одержані за допомогою стандартних методів рекомбінантних ДНК, які є добре відомими у цій галузі. Антитіла, фрагменти антитіл та імуноадгезійні молекули можуть бути або можуть не бути глікозилованими і, незважаючи на це, входити до обсягу цього винаходу. За варіантом, якому віддається перевага, фрагментом антитіла є Fab-фрагмент. Термін "гуманізоване антитіло" означає антитіло, яке частково або повністю складається з амінокислотних послідовностей, які походять з зародкової лінії людського антитіла або реаранжованої послідовності, і яке одержали шляхом зміни послідовності антитіла, яке має нелюдські гіперваріабельні ділянки. Каркасні ділянки варіабельних ділянок можуть замінюватись на відповідні людські каркасні ділянки. Людські каркасні ділянки включають геномні каркасні ділянки, а також ділянки, що містять одну або декілька амінокислотних замін. Зокрема, такі заміни включають мутації, при яких амінокислоту у певному положенні у людському каркасі замінюють на амінокислоту з відповідного положення природного каркасу нелюдської гіперваріабельної ділянки. Наприклад, гуманізоване антитіло, яке має мишачі гіперваріабельні ділянки, може містити одну або декілька замін, які замінюють конкретну амінокислоту людського каркасу на відповідну амінокислоту мишачого каркасу. Посиланнями, які містять додатковий опис методів, які використовують при гуманізації мишачого антитіла, що можуть застосовуватись є, наприклад, Квін (Queen) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88-2869, 1991; патент США №5,693,761; патент США №4,816,397; патент США № 5,225,539; комп'ютерні програми ABMOD та ENCAD, опис яких наведено у Левітт М. (Levitt Μ.), J. Mol. Вiol. 168:595-620, 1983; гуманізація може по суті здійснюватись за методом Вінтер (Winter) та співробітників (Джоне (Jones) та інші, Nature, 321:522-525, 1986; Ріхманн (Riechmann) та інші, Nature, 332:323-327, 1988; Вeрхойєн (Verhoeyen) та інші, Science, 239:1534-1536, 1988). За варіантом, якому віддається перевага, антитілом за цим винаходом є гуманізований фрагмент антитіла. За варіантом, якому віддається більша перевага, антитілом за цим винаходом є гуманізований Fab-фрагмент антитіла. Цей винахід включає також фрагменти антитіл, ковалентно приєднані до однієї або декількох молекул поліетиленгліколю. Мається на увазі, що терміни "поліетиленгліколь" та "PEG" застосовуються взаємозамінно і означають поліетиленгліколь або його похідну, які є відомими у цій галузі (дивись, наприклад, патенти США № 5,445,090; № 95996 10 5,900,461; № 5,932,462; № 6,436,386; № 6,448,369; № 6,437,025; № 6,448,369; № 6,495,659; № 6,515,100 та № 6,514,491). За варіантом, якому віддається перевага, молекула поліетиленгліколю ковалентно приєднана до одного або декількох залишків лізину або цистеїну фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається більша перевага, молекула поліетиленгліколю ковалентно приєднана до одного або декількох залишків лізину або цистеїну варіабельної ділянки важкого ланцюга фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, молекула поліетиленгліколю ковалентно приєднана до одного або декількох залишків лізину або цистеїну у межах гіперваріабельної ділянки фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, молекула поліетиленгліколю ковалентно приєднана до залишку цистеїну у амінокислотному положенні 56 варіабельної ділянки важкого ланцюга згаданої послідовності SEQ ID NO: 2. За альтернативним варіантом молекули поліетиленгліколю можуть приєднуватись через молекулу лінкера або спейсера до шарнірної ділянки фрагмента антитіла. Додання молекул лінкерів або спейсерів до шарнірних ділянок є добре відомим у цій галузі. Крім того, молекула поліетиленгліколю може бути ковалентно приєднана до модифікованих штучних амінокислот фрагмента антитіла методами, добре відомими у цій галузі. Поліетиленгліколь ("PEG"), за своєю типовою формою, являє собою лінійний полімер із кінцевими гідроксильними групами і має формулу НОСН2СН2-(СН2СН2О)n-СН2СН2-ОН, де n становить від приблизно 8 до приблизно 4000. Кінцевий атом водню може бути замінений на захисну групу, наприклад, алкільну або алканольну групу (M-PEG). За варіантом, якому віддається перевага, поліетиленгліколь має щонайменше одну гідроксильну групу, за варіантом, якому віддається більша перевага, це є кінцева гідроксильна група. За варіантом, якому віддається перевага, саме ця гідроксильна група активується для реагування з пептидом. Різноманітні хімічні модифікації застосовують для одержання активної похідної поліетиленгліколю з функціональною групою, наприклад, активним карбонатом, активним складним ефіром, альдегідом, трезилатом, або ж застосовують поліетиленгліколь-пропіональдегід, придатний для сполучення з даною молекулою-мішенню. Після цього активована похідна поліетиленгліколю ковалентно приєднується до реакційноздатної групи поліпептидного лікарського засобу. Існує багато форм поліетиленгліколю, придатних для цього винаходу. У цій галузі існують численні похідні поліетиленгліколю, які є придатними для застосування у цьому винаходу. Припускається, що молекула поліетиленгліколю, ковалентно приєднана до фрагмента антитіла за цим винаходом, не обмежується конкретним типом або розміром. Молекулярна маса поліетиленгліколю за варіантом, якому віддається перевага, становить від приблизно 0,5 кілодальтон (кДа) до приблизно 100 кДа, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 5 кДа до приблизно 30 кДа і за варіантом, якому віддається найбільша перевага, від прибли 11 зно 1 кДа до приблизно 20 кДа. Молекула поліетиленгліколю може бути лінійною або розгалуженою, і фрагмент антитіла проти Α пептиду за цим винаходом може мати 1 молекулу, 2 молекули, 3 молекули, 4 молекули, 5 молекул або 6 молекул поліетиленгліколю, приєднаних до пептиду. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, на фрагмент антитіла припадає одна молекула поліетиленгліколю; однак коли на молекулу пептиду припадає більше однієї молекули поліетиленгліколю, їх за варіантом, якому віддається перевага, може бути не більше шести. Крім того, припускається, що обидва кінці молекули поліетиленгліколю можуть бути пристосовані для перехресного взаємозв'язування двох або декількох молекул фрагмента антитіла проти Α пептиду. Методи приєднання молекул поліетиленгліколю до білків, антитіл та їх фрагментів є добре відомими у цій галузі. Термін "KD", який вживають у цьому описі, призначений для позначення константи дисоціації взаємодії конкретного антитіла з антигеном, її значення розраховується за формулою KD=koff/kon (вимірюється у М). Термін "kon", який вживають у цьому описі, призначений для позначення константи асоціації або константи швидкості прямої або комплексоутворювальної реакції, одиницею вимірювання -1 -1 якої є М с . Термін "koff", який вживають у цьому описі, призначений для позначення константи дисоціації або константи швидкості реакції дисоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген, одиницею -1 вимірювання якої є с . Словосполучення "специфічно зв'язує", яке застосовують у цьому описі, означає ситуацію, при якій один із членів специфічної пари, що зв'язується, крім свого специфічного зв'язувального партнера(-ів), з іншими молекулами суттєво не зв'язується. Згадане словосполучення застосовують також у тому випадку, коли, наприклад, антигензв'язувальний центр антитіла за цим винаходом є специфічним для конкретної антигенної детермінанти, яку несе ряд антигенів. У цьому випадку специфічне антитіло, що несе антигензв'язувальний центр, буде здатним до зв'язування різних антигенів, що несуть згадану антигенну детермінанту. Відповідно, молекула за цим винаходом специфічно зв'язує Αβ пептид, у той час як АРР нею специфічно не зв'язується. Крім того, молекула за цим винаходом специфічно зв'язується між лінійною, нелінійною або конформаційною антигенною детермінантою Αβ пептиду, яка містить амінокислоти HHQKLVFFAEDVGSNK (13-28) (послідовність SEQ ID NO: 4). Термін "активність" по відношенню до молекули за цим винаходом означає (але без обмеження) афінність і специфічність антигенної детермінанти/антигену, здатність нейтралізувати або антагонізувати активність Α пептиду in vivo або in vitro, IC50, in vivo стабільність антитіла та імуногенні властивості антитіла. Іншими визнаними у цій галузі біологічними властивостями або характеристиками антитіла, що піддаються встановленню, є, 95996 12 наприклад, перехресна реактивність (тобто з нелюдськими гомологами пептиду-мішені або загалом з іншими білками чи тканинами) і здатність до збереження високих рівнів експресії білка у клітинах ссавців. Вищезгадані властивості або характеристики можуть спостерігатись, визначатись чи оцінюватись за допомогою визнаних у цій галузі методів, у тому числі (але без обмеження) ELISA, конкурентного ELISA, аналізів поверхневого плазмонного резонансу Віаcore або KinЕхА, аналізів нейтралізації in vitro або in vivo без обмеження, зв'язування рецептора, продукування та/або секреції цитокіну або фактору росту, трансдукції сигналів та імуногістохімії зі зрізами тканин із різних джерел, у тому числі від людини, примату або з будь-якого іншого джерела. Терміни "індивід", "суб'єкт" та "хворий", які вживають у цьому описі взаємозамінно, означають ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, людину. За певним варіантом здійснення суб'єкт додатково характеризується захворюванням або розладом чи станом, для яких сприятливим було б зменшення активності Α пептиду. Словосполучення "клітина-хазяїн", "лінія клітин-хазяїв" та "культура клітин-хазяїв", які вживають у цьому описі, застосовуються взаємозамінно і означають окрему клітину або культуру клітин, що є реципієнтом будь-якого виділеного полінуклеотиду за цим винаходом або будь-якого рекомбінантного(-их) вектора(-ів), що містить(-ять) послідовність, яка кодує HCVR, LCVR чи моноклональне антитіло за цим винаходом. Клітини-хазяї включають нащадків однієї клітини-хазяїна. Нащадки можуть не бути повністю ідентичними, за морфологією або за загальним амінокислотним комплементом, вихідній батьківській клітині в результаті природної, випадкової або навмисної мутації та/або змін. Клітина-хазяїн включає клітини, трансформовані, трансдуковані або інфіковані рекомбінантним вектором або полінуклеотидом, що експресує фрагмент антитіла за цим винаходом або його легкий чи важкий ланцюг. Клітинахазяїн, яка містить рекомбінантний вектор за цим винаходом, постійно або тимчасово включений до хромосоми клітини-хазяїна, може також називатись "рекомбінантною клітиною-хазяїном". Клітинами для одержання клітин-хазяїв за цим винаходом, яким віддають перевагу, є клітини СНО (культура клітин яєчника китайського хом'ячка) (наприклад, АТСС (Американська колекція типових культур) CRL-9096), клітини NS0, клітини SP2/0, клітини COS (культура клітин яєчника мавпи) (наприклад, АТСС, CRL-1650, CRL-1651) та клітини HeLa (АТСС CCL-2). Інші клітини-хазяї для застосування за цим винаходом включають клітини рослин, дріжджові клітини, клітини інших ссавців та прокаріотні клітини. За варіантом, якому віддається більша перевага, клітинами для застосування за цим винаходом є дріжджові або прокаріотні клітини. Словосполучення "стан або захворювання, який(яке) має відношення до Α пептиду" або "стан або захворювання, пов'язаний(-е) з активністю Α пептиду" включає усі стани, розлади та захворювання, пов'язані з: 1) розвитком -амілоїдних 13 бляшок у головному мозку; 2) синтезом атипових форм Α пептиду; 3) утворенням особливо токсичних форм Α пептиду, або 4) аномальною швидкістю синтезу, розкладу або виведення Α пептиду. У таких станів та захворювань, як хвороба Альцгеймера, синдром Дауна, церебральна амілоїдна ангіопатія, певні судинні деменції і помірне погіршення пізнавальної здатності, є відомим або підозрюється такий зв'язок з Α пептидом. Цей винахід надає молекулу, яка містить фрагмент антитіла, який специфічно зв'язує Α пептид між амінокислотними положеннями 13-28, де згаданий фрагмент антитіла ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю. За варіантом, якому віддається перевага, згаданий фрагмент антитіла є фрагментом гуманізованого антитіла, наприклад, Fab-фрагментом та/або scFvфрагментом. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, згаданим фрагментом антитіла є Fab-фрагмент. Специфічне зв'язування молекул за цим винаходом з Α пептидом уможливлює застосування згаданих молекул як лікарський засіб при захворюваннях та розладах, які мають відношення до Α пептиду, тобто станів, захворювань або розладів, для яких сприятливим є пригнічення біологічної активності Α пептиду. За одним із варіантів здійснення цього винаходу фрагмент антитіла має варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга, де варіабельна ділянка легкого ланцюга містить гіперваріабельні ділянки, які мають такі амінокислотні послідовності: CDRL1: SSSQSLIYSDGNAYLH (послідовність SEQ ID NO: 6), CDRL2: KVSNRFS (послідовність SEQ ID NO: 7) та CDRL3: TQSTHSPWT (послідовність SEQ ID NO: 8) та/або де варіабельна ділянка важкого ланцюга містить гіперваріабельні ділянки з такими амінокислотними послідовностями: CDRH1: GYTFSRYSMS (послідовність SEQ ID NO: 9), CDRH2: QINIRGCNTYYPDTVKG (послідовність SEQ ID NO: 10) або QINIRGNNTYYPDTVKG (послідовність SEQ ID NO: 11) та CDRH3: GDF (послідовність SEQ ID NO: 12). 3a варіантом, якому віддається перевага, одночасно існує шість гіперваріабельних ділянок фрагмента антитіла за цим винаходом. Композиція, що містить гіперваріабельну ділянку за цим винаходом, буде являти собою загалом послідовність важкого або легкого ланцюга антитіла або значну її частину, де гіперваріабельна ділянка знаходиться на місці, яке відповідає схемі нумерації, яка розроблена Кабатом. Каркасна ділянка має три гіперваріабельні ділянки для кожного ланцюга, важкого і легкого, у вигляді суміжної послідовності, яку представляє наведена нижче формула: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3FR4. Ділянки FR1, FR2, FR3 та FR4 важкого або легкого ланцюга об'єднуються з одержанням повної каркасної ділянки фрагмента антитіла при розміщенні у вигляді суміжної послідовності з гіперваріабельними ділянками у зазначеному порядку. За варіантом, якому віддається перевага, каркасні ділянки антитіла за цим винаходом мають людське походження або по суті людське походження (тобто більше ніж приблизно на 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%). 95996 14 За варіантом, якому віддається перевага, фрагмент антитіла за цим винаходом містить LCVR, що містить пептид з наведеною нижче послідовністю: DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCSSSQS?LIYSDGNAYLHWYLQKP GQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVG VYYCTQSTHSPWTFGGGTKVEIK (послідовність SEQ ID NO: 1) та HCVR, що містить пептид з послідовністю, вибраною з групи, яку складають такі послідовності: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFSRY SMSWVRQAPG KGLEWVGQINIRGCNTYYPDTVKGRFTISRDDS KNTLYLQMNS LKTEDTAVYYCTTGDFWGQGTLVTVSS (послідовність SEQ ID NO: 2), EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFSRY SMSWVRQAPG KGLEWVGQINIRGNNTYYPDTVKGRFTISRDDS KNTLYLQMNS LKTEDTAVYYCTTGDFWGQGTLVTVSS (послідовність SEQ ID NO: 3). За альтернативним варіантом фрагмент антитіла містить LCVR, що містить пептид з послідовністю SEQ ID NO: 1, та HCVR, що містить пептид з послідовністю, вибраною з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 3, де HCVR та LCVR у фрагменті антитіла існують одночасно. Фахівцю буде зрозуміло, що фрагменти антитіла за цим винаходом не обмежуються конкретними послідовностями HCVR та LCVR, але включають також варіанти цих послідовностей, які, у разі наявності у молекулі за цим винаходом, зберігають або поліпшують антигензв'язувальну здатність та щонайменше одну з інших функціональних властивостей вихідного антитіла, наприклад, специфічність антигенної детермінанти, здатність до конкурування з вихідним антитілом щодо зв'язування з Α пептидом, ІС50 та/або значення KD чи koff щодо зв'язування Α пептиду. За іншим варіантом здійснення винаходу уся або частина варіабельної ділянки обмежується конкретною послідовністю LCVR, як показано послідовністю SEQ ID NO: 1, та HCVR, як показано послідовностями SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 3, і додатково відрізняється тим, що антагонізує або нейтралізує щонайменше одну активність Α пептиду in vivo або in vitro. Антитіло за цим винаходом, де уся або частина варіабельної ділянки обмежується конкретною послідовністю, як показано LCVR SEQ ID NO: 1 та HCVR SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 3, додатково відрізняється тим, що специфічно зв'язує людський Α пептид, але не зв'язує людський АРР. За одним з аспектів цього винаходу молекула поліетиленгліколю (або його похідної) ковалентно приєднана до одного або декількох залишків лізину, цистеїну або штучної модифікованої амінокис 15 лоти фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається перевага, молекула поліетиленгліколю ковалентно приєднана до варіабельної ділянки важкого ланцюга або до варіабельної ділянки легкого ланцюга фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається більша перевага, така молекула має молекулу поліетиленгліколю, яка ковалентно приєднана до гіперваріабельної ділянки варіабельної ділянки важкого ланцюга фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, така молекула має молекулу поліетиленгліколю, яка ковалентно приєднана до цистеїну у амінокислотному положенні 56 варіабельної ділянки важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2. За альтернативним варіантом молекули поліетиленгліколю можуть бути приєднані до Fabфрагмента антитіла проти Α пептиду через молекулу лінкера або спейсера до шарнірної ділянки фрагмента антитіла. За іншим аспектом цього винаходу молекула поліетиленгліколю ковалентно приєднана до одного або декількох модифікованих засобами генної інженерії залишків лізину, цистеїну або штучної амінокислоти антитіла за цим винаходом на заміну сигналу глікозилування на молекулах антитіла, без значного впливання на спорідненість та селективність фрагмента антитіла по відношенню до Α пептиду. За варіантом, якому віддається перевага, молекула поліетиленгліколю замінює сигнал глікозилування на варіабельній ділянці важкого ланцюга або на варіабельній ділянці легкого ланцюга фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається більша перевага, молекула поліетиленгліколю замінює сигнал глікозилування на гіперваріабельній ділянці варіабельної ділянки важкого ланцюга фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, молекула поліетиленгліколю замінює сигнал глікозилувания у положенні 56 варіабельної ділянки важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2. Термін "молекула поліетиленгліколю, ковалентно приєднана до антитіла", який вживається у цьому винаході, не обмежений конкретним типом або розміром молекули. Молекулярна маса поліетиленгліколю за варіантом, якому віддається перевага, становить від приблизно 0,5 кДа до приблизно 100 кДа, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 0,5 кДа до приблизно 30 кДа і за варіантом, якому віддається найбільша перевага, від приблизно 1 кДа до приблизно 20 кДа. За альтернативним варіантом молекулярна маса поліетиленгліколю може вибиратись з групи, яку складають приблизно 0,5 кДа, приблизно 1 кДа, приблизно 5 кДа, приблизно 10 кДа та приблизно 20 кДа. Молекула поліетиленгліколю може бути лінійною або розгалуженою, і пегільоване антитіло проти Α пептиду за цим винаходом може мати більше однієї молекули поліетиленгліколю, приєднаної до пептиду. За варіантом, якому віддається перевага, одне пегільоване антитіло проти Α пептиду має одну молекулу поліетиленгліколю. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, молекула антитіла за цим винаходом містить фрагмент антитіла з варіабельною ділянкою 95996 16 легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 1 та варіабельною ділянкою важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2, де згаданий фрагмент антитіла ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю з молекулярною масою 20 кДа у положенні 56 варіабельної ділянки важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2. Антигенна детермінанта Α пептиду, між якою зв'язуються антитіла за цим винаходом, являє собою лінійну, нелінійну або конформаційну антигенну детермінанту, яка містить амінокислоти HHQKLVFFAEDVGSNK (послідовність SEQ ID NO: 4). Антитіла, що зв'язують згадану антигенну детермінанту, специфічно і переважно зв'язують Α пептид, порівняно з їх зв'язуванням АРР. Моноклональні антитіла за цим винаходом зв'язують А пептид з, наприклад, спорідненістю або специфічністю, у щонайменше 2 рази, 5 разів, 10 разів, 20 разів, 30 разів, 40 разів, 50 разів, 60 разів, 70 разів, 80 разів, 90 разів або 100 разів більшою, ніж спорідненість або специфічність, з якою вони зв'язують людський АРР; за варіантом, якому віддається більша перевага, зі спорідненістю або специфічністю у щонайменше 150 разів, 200 разів, 250 разів, 300 разів, 350 разів, 400 разів, 450 разів, 500 разів, 550 разів або 600 разів більшою, ніж спорідненість або специфічність, з якою вони зв'язують людський АРР; за варіантом, якому віддається ще більша перевага, вони зв'язують АРР на рівнях, що не перевищують фонові рівні, як визначається, наприклад, за допомогою ELISA, конкурентного ELISA або значеннями KD, які одержують при проведенні аналізу Віаcore або KinЕхА. Фрагменти антитіла за цим винаходом зв'язують антигенну детермінанту між амінокислотами HQKLVFFAEDVGSNK (послідовність SEQ ID NO: 5) з, наприклад, спорідненістю або специфічністю, у щонайменше 2 рази, 5 разів, 10 разів, 20 разів, 30 разів, 40 разів, 50 разів, 60 разів, 70 разів, 80 разів, 90 разів або 100 разів більшою, ніж спорідненість або специфічність, з якою вони зв'язують антигенну детермінанту, що не містить амінокислот HQKLVFFAEDVGSNK (послідовність SEQ ID NO: 5). За варіантом, якому віддається більша перевага, зі спорідненістю або специфічністю у щонайменше 150 разів, 200 разів, 250 разів, 300 разів, 350 разів, 400 разів, 450 разів, 500 разів, 550 разів або 600 разів більшою, ніж спорідненість або специфічність, з якою вони зв'язують антигенну детермінанту, що не містить амінокислот HQKLVFFAEDVGSNK (послідовність SEQ ID NO: 5); за варіантом, якому віддається ще більша перевага, вони зв'язують антигенну детермінанту, що не містить амінокислот HQKLVFFAEDVGSNK (послідовність SEQ ID NO: 5), на рівнях, що не перевищують фонові рівні, як визначається, наприклад, за допомогою ELISA, конкурентного ELISA або значеннями KD, які одержують при проведенні аналізу Віаcore або KinЕхА. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, цей винахід надає фрагмент антитіла, який має сильну зв'язувальну спорідненість до Α пептиду, тобто зв'язує Α пептид або його частину, яка містить послідовність HQKLVFFAEDVGSNK (послідовність SEQ ID NO: 5) [тобто антитіло кон 17 тактує з поліпептидом HQKLVFFAEDVGSNK], зі зв'язувальною спорідненістю (KD) до людського Α пептиду, меншою ніж приблизно 200 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 40 пМ або 30 пМ, за варіантом, якому віддається перевага, меншою ніж приблизно 20 пМ, як визначається за допомогою KinЕхА. За альтернативним варіантом зв'язувальна спорідненість (KD) до людського Α пептиду знаходиться у межах 0,1 пМ-200 пМ. Спорідненість антитіл може визначатись, як описано у наведених нижче прикладах або за допомогою інших методів, доступних у цій галузі. Шлях введення антитіла за цим винаходом може бути пероральним, парентеральним, інгаляційним або місцевим. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом можуть включатись до складу фармацевтичної композиції, придатної для парентерального введення. Термін "парентеральне", який вживають у цьому описі, включає внутрішньовенне, внутрішньом'язове, підшкірне, ректальне, вагінальне або внутрішньоочеревинне введення. Перевагу віддають периферичній системній доставці шляхом внутрішньовенної, внутрішньоочеревинної або підшкірної ін'єкції. За варіантом, якому віддається більша перевага, шляхом введення антитіла за цим винаходом є підшкірна ін'єкція. Придатні носії для таких ін'єкцій є відомими у цій галузі. Фрагмент антитіла за цим винаходом має коротший період напіввиведення з плазми, ніж відповідне непроцесоване антитіло проти Α пептиду, і виводиться з плазми швидше, ніж відповідне непроцесоване антитіло проти Α пептиду. За альтернативним варіантом антитіло за цим винаходом має довший період напіввиведення з плазми, ніж відповідний Fab-фрагмент проти Α пептиду, не приєднаний ковалентно до молекули поліетиленгліколю, і виводиться з плазми з меншою швидкістю, ніж відповідний Fab-фрагмент проти Α пептиду, який не приєднаний ковалентно до молекули поліетиленгліколю (Приклад 1, Приклад 2 та Приклад 3). Термін "відповідний" стосовно антитіла, який вживають у цьому описі, означає антитіло з однаковою LCVR та HCVR. Наприклад, відповідне непроцесоване антитіло по відношенню до Fabфрагмента антитіла, що має LCVR з послідовністю SEQ ID NO: 1 та HCVR з послідовністю SEQ ID NO: 2, буде мати таку саму LCVR з послідовністю SEQ ID NO: 1 та HCVR з послідовністю SEQ ID NO: 2 спільно з інтактним Fc-доменом. За іншим аспектом цей винахід спрямований на рекомбінантні полінуклеотиди, що кодують антитіла, які при експресії містять LCVR з послідовністю SEQ ID NO: 1 та HCVR з послідовністю SEQ ID NO: 2. З причини виродженості кодону ці послідовності можуть бути легко замінені на інші полінуклеотидні послідовності. Полінуклеотиди за цим винаходом, яким віддають особливу перевагу, кодують антитіла, які при експресії містять гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга з послідовностями SEQ ID NO: 6-8 та гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга з послідовностями SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 або SEQ ID NO: 11 та SEQ ID NO: 12 чи будь-які варіабельні ділянки з послідовностями SEQ ID NO: 1-3. Приклади послідовностей 95996 18 полінуклеотидів, які кодують LCVR з послідовністю SEQ ID NO: 1 та HCVR з послідовністю SEQ ID NO: 2, представлені послідовностями SEQ ID NO: 13 (LCVR) та SEQ ID NO: 14 (HCVR), відповідно. Полінуклеотиди будуть, як правило, додатково включати полінуклеотидну послідовність контролю експресії, функціонально з'єднану з кодувальними послідовностями гуманізованого імуноглобуліну, у тому числі з'єднані природним шляхом або гетерологічні промоторні ділянки. За варіантом, якому віддається перевага, послідовності контролю експресії будуть еукаріотними промоторними системами у векторах, здатних до трансформування або трансфікування еукаріотних клітин, однак можуть також застосовуватись контрольні послідовності для прокаріотних клітин. Після включення вектора до відповідної лінії клітин-хазяїв, клітинахазяїн розмножується в умовах, придатних для експресії нуклеотидних послідовностей, далі за бажанням може відбуватись збирання та очищення легких ланцюгів, важких ланцюгів, димерів легкого/важкого ланцюга або інтактних антитіл, зв'язувальних фрагментів або інших форм імуноглобулінів. Нуклеїновокислотні послідовності за цим винаходом, здатні до кінцевої експресії бажаних антитіл або фрагментів антитіл, можна одержати з цілого ряду різних полінуклеотидів (геномна ДНК, кДНК, РНК, синтетичні олігонуклеотиди тощо) та складових (наприклад, V-, J-, D- та С-фрагменти) за допомогою будь-яких з цілого ряду добре відомих методів. З'єднання відповідних геномних та синтетичних послідовностей є традиційним методом продукування, однак можуть застосовуватись також послідовності кДНК. Людські послідовності ДНК константних ділянок можуть виділятись за добре відомими методами з цілого ряду людських клітин, але перевагу віддають імморталізованим В-клітинам. Відповідні клітини для полінуклеотидних послідовностей та клітини-хазяї для експресії та секреції імуноглобулінів можна одержати з ряду джерел, добре відомих у цій галузі. Крім гуманізованих антитіл або фрагментів антитіл, конкретний опис яких наведено, інші "по суті гомологічні" модифіковані антитіла можуть легко конструюватись і одержуватись за допомогою різноманітних методів рекомбінантних ДНК, добре відомих фахівцям у цій галузі. Наприклад, каркасні ділянки можуть відрізнятись від нативних послідовностей на рівні первинної структури декількома амінокислотними замінами, кінцевими та проміжними доданнями та делеціями тощо. Крім того, цілий ряд різних людських каркасних ділянок може застосовуватись самостійно або у комбінації як основа для гуманізованих антитіл за цим винаходом. Загалом модифікації генів можуть легко здійснюватись за допомогою добре відомих методів, наприклад, шляхом сайтспрямованого мутагенезу. Як вказувалось вище, полінуклеотиди будуть експресуватись в клітинах-хазяях після функціонального зв'язування (наприклад, позиціонування для забезпечення функціонування) послідовностей з послідовністю контролю експресії. Ці експресійні вектори, як правило, розмножуються у кліти 19 нах-хазяях як епісоми або як складова частина хромосомної ДНК хазяїна. Експресійні вектори, як правило, будуть містити селекційні маркери, наприклад, тетрациклін або неоміцин, для уможливлення виявлення тих клітин-хазяїв, які були трансформовані бажаними послідовностями ДНК. Експресійні вектори для цих клітин будуть включати послідовності контролю експресії, наприклад, точку ініціювання реплікації, промотор, енхансер та необхідні сайти процесування інформації, наприклад, сайти зв'язування рибосом, сайти сплайсингу РНК, сайти поліаденілування та послідовності термінатора транскрипції. Послідовностями контролю експресії, яким віддають перевагу, є промотори, які одержують з імуноглобулінових генів, SV40, аденовірусу, вірусу папіломи великої рогатої худоби, цитомегаловірусу тощо. Вектори, які містять полінуклеотидні послідовності, які становлять інтерес (наприклад, кодувальні послідовності важкого і легкого ланцюга та послідовності контролю експресії), можуть переноситись до клітини-хазяїна добре відомими способами, які різняться у залежності від типу клітини. Різноманітні хазяї можуть використовуватись для експресії антитіл за цим винаходом із застосуванням методів, добре відомих у цій галузі. Лінії клітин, яким віддається перевага, включають COS (культура клітин яєчника мавпи), СНО (культура клітин яєчника китайського хом'ячка), SP2/0, NS0 (доступні із загальнодоступних репозиторіїв, таких як АТСС, Американська колекція типових культур, Manassas, штат Вірджинія) та лінії дріжджових клітин. За варіантом, якому віддається перевага, клітина-хазяїн за цим винаходом містить один або декілька векторів або генно-інженерних конструкцій, які містять нуклеїновокислотну молекулу за цим винаходом. Клітиною-хазяїном за цим винаходом є клітина, у яку був введений вектор за цим винаходом, де згаданий вектор містить полінуклеотид, який кодує LCVR за цим винаходом та/або полінуклеотид, який кодує HCVR за цим винаходом. Цей винахід надає також клітину-хазяїна, у яку були введені два вектори за цим винаходом, один з яких містить полінуклеотид, який кодує LCVR антитіла за цим винаходом, і один, що містить полінуклеотид, який кодує HCVR, наявну у антитіла за цим винаходом, кожен з яких функціонально з'єднаний з промоторною послідовністю. Типи клітин включають клітини ссавців, бактеріальні, рослинні та дріжджові клітини. За варіантом, якому віддається перевага, згаданою клітиною є клітина СНО, клітина COS, клітина SP2/0, клітина NS0, дріжджова клітина або похідна чи нащадки клітин будь-якого типу, якому віддається перевага. Після експресії інтактні антитіла, їхні димери, окремі легкі та важкі ланцюги або інші форми імуноглобулінів за цим винаходом можуть очищатись стандартними методами у цій галузі, у тому числі шляхом осадження сульфатом амонію, іонообмінного хроматографування, афінного хроматографування, хроматографування з оберненою фазою, хроматографування на колонках з гідрофобною взаємодією, гель-електрофорезу тощо. Для фармацевтичного застосування перевага віддається по суті чистим імуноглобулінам із щонайменше 95996 20 приблизно 90%, 92%, 94% або 96% однорідністю; найбільша перевага віддається 98-99% або більш високому рівню однорідності. Після очищення до необхідного (часткового чи повного) рівня однорідності, пептиди можуть застосовуватись із терапевтичними або профілактичними цілями, як вказується у цьому описі. Доведено, що ряд симптомів, наслідком яких є порушення пізнавальної здатності, інсульт, внутрішньомозковий крововилив та загальна розумова слабкість, пов'язані з невритичними бляшками та бляшками у судинах головного мозку, що містять Α пептид. Серед цих станів є як передклінічна, так і клінічна стадії хвороби Альцгеймера, синдром Дауна, передклінічна і клінічна стадії церебральної амілоїдної ангіопатії (САА). Амілоїдні бляшки утворюються з Α пептиду. Ці пептиди циркулюють у крові та у цереброспінальній рідині (CSF), як правило, у формі комплексів із ліпопротеїдами. Α пептид у циркулюючій формі складається з 39-43 амінокислот (головним чином, з 40 амінокислот або 42 амінокислот), що є результатом розщеплення звичайного білка-попередника, білкапопередника амілоїду, який часто позначають як АРР. Певні форми розчинного амілоїдного білка є нейротоксичними самі по собі і можуть визначати тяжкість нейродегенерації та/або погіршення пізнавальної здатності (Маклін К.А. (McLean С.А.) та інші, Ann. Neturol. (1999) 46:860-866; Ламберт Μ.Π. (Lambert M.P.) та інші, (1998) 95:6448-6453; Наслунд Дж. (Naslund J.), J. Am. Med. Assoc. (2000) 283:1571). Таким чином, фармацевтична композиція, яка містить молекулу за цим винаходом, може бути придатною для запобігання або лікування станів, при яких наявність Α пептиду спричинює або докладає свій внесок до небажаних патологічних ефектів, або при яких зниження активності Α пептиду має терапевтичну користь у ссавців, за варіантом, якому віддається перевага, людей, з включенням (але без обмеження) клінічної або передклінічної стадії хвороби Альцгеймера, синдрому Дауна, клінічної або передклінічної стадії церебральної амілоїдної ангіопатії (САА), продромальної стадії хвороби Альцгеймера, помірного погіршення пізнавальної здатності (МСІ) та порушення пізнавальної здатності, інсульту, внутрішньомозкового крововиливу та загальної розумової слабкості, які, як виявляється, пов'язані з старечими бляшками та бляшками у судинах головного мозку, що містять Α пептид. Цим винаходом передбачається застосування молекули за цим винаходом для запобігання або лікування щонайменше одного з вищезгаданих розладів, при яких активність Α пептиду є шкідливою або для яких сприятливими є знижені рівні біоактивного Α пептиду. Крім того, передбачається застосування молекули за цим винаходом при виготовленні лікарського засобу для лікування щонайменше одного з вищезгаданих розладів. Терміни "лікування", "лікувати" тощо, які вживають у цьому описі, означають досягнення бажаного фармакологічного та/або фізіологічного ефекту. Згаданим ефектом може бути часткове або повне вилікування захворювання та/або позбав 21 лення від негативного впливу, пов'язаного з розвитком захворювання. Термін "лікування", який вживають у цьому описі, означає введення сполуки, зокрема, людині, і включає: (а) пригнічення захворювання, тобто припинення його розвитку; або (b) полегшення симптомів захворювання, тобто спричинення зворотного розвитку захворювання або розладу чи полегшення його симптомів або ускладнень. Схеми приймання лікарського засобу можуть підбиратись так, щоб забезпечити оптимальну бажану реакцію (наприклад, терапевтичну або профілактичну реакцію). Наприклад, може вводитись одна ударна доза, декілька поділених доз лікарського засобу, повторюваних через певні проміжки часу, або доза може бути пропорційно зменшена чи збільшена, залежно від того, що буде необхідним в конкретній терапевтичній ситуації. Молекула за цим винаходом може включатись до складу фармацевтичних композицій, придатних для введення суб'єкту. Молекули за цим винаходом можуть вводитись самостійно або у поєднанні з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем та/або наповнювачем у вигляді одно- чи багаторазових доз. Фармацевтичні композиції для введення розробляються так, щоб бути придатними для вибраного способу введення, і відповідним чином застосовуються фармацевтично прийнятний розріджувач, носій та/або наповнювачі, наприклад, диспергувальні речовини, буфери, поверхнево-активні речовини, консерванти, солюбілізатори, агенти для регулювання ізотонічності, стабілізатори тощо (дивись, наприклад, Приклад 14 у цьому описі). Згадані композиції розробляються за традиційними методами, опис яких наведено, наприклад, у Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19-е видання, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, штат Пенсільванія, 1995, який надає стислий опис способів одержання лікарських форм, які є загальновідомими лікарям-практикам. Фармацевтична композиція, яка містить молекулу за цим винаходом, може вводитись суб'єкту з групи ризику або такому, що виявляє патології, опис яких наведено, із застосуванням стандартних способів введення, у тому числі перорального, внутрішньовенного, внутрішньоочеревинного, підшкірного, долегеневого, черезшкірного, внутрішньом'язового, інтраназального, защічного, сублінгвального або супозиторного введення. За варіантом, якому віддається перевага, молекула за цим винаходом може водитись суб'єкту з групи ризику або такому, що виявляє патології, опис яких наведено, шляхом підшкірного введення. За варіантом, якому віддається перевага, фармацевтична композиція за цим винаходом містить "терапевтично ефективну кількість" або "профілактично ефективну кількість" молекули за цим винаходом. Термін "терапевтично ефективна кількість" означає кількість, ефективну (у дозах та впродовж необхідних періодів часу) для досягнення бажаного терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість молекули може змінюватись у залежності від таких факторів, наприклад, як стан захворювання, вік, стать і маса індивіда та здатність молекули до викликання бажаної реакції 95996 22 у індивіда. Терапевтично ефективна кількість є також такою кількістю, при якій будь-яка токсична або шкідлива дія молекули переважається терапевтично сприятливою дією. Термін "профілактично ефективна кількість" означає кількість, ефективну (у дозах та впродовж необхідних періодів часу) для досягнення бажаного профілактичного результату. Як правило, оскільки профілактична доза застосовується у суб'єктів перед початковою стадією захворювання або під час неї, профілактично ефективна кількість буде меншою, ніж терапевтично ефективна кількість. Терапевтично ефективна або профілактично ефективна кількість активного агента є принаймні мінімальною дозою, але меншою за токсичну дозу, яка є необхідною для справляння терапевтично сприятливої дії на суб'єкта. Інакше кажучи, терапевтично ефективною кількістю молекули за цим винаходом є кількість, яка у ссавців, за варіантом, якому віддається перевага, людей, зменшує активність Α пептиду, наприклад, шляхом зв'язування з Α пептидом, де присутність Α пептиду спричинює або сприяє небажаним патологічним ефектам, або результатом зниження вмісту Α пептиду є сприятлива терапевтична дія на ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, людину. Шлях введення молекули за цим винаходом може бути пероральним, парентеральним, інгаляційним або місцевим. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом можуть включатись до складу фармацевтичної композиції, придатної для парентерального введення. Термін "парентеральне", який вживають у цьому описі, означає внутрішньовенне, внутрішньом'язове, підшкірне, ректальне, вагінальне або внутрішньоочеревинне введення. Перевагу віддають периферичній системній доставці шляхом внутрішньовенної, внутрішньоочеревинної або підшкірної ін'єкції. Найбільшу перевагу віддають підшкірній ін'єкції. Придатні носії для таких ін'єкції є відомими у цій галузі. Фармацевтична композиція за типовим варіантом повинна бути стерильною і стійкою в умовах виготовлення і зберігання у відповідному контейнері, у тому числі, наприклад, герметизованому флаконі або шприці. Таким чином, фармацевтичні композиції можуть фільтруватись у стерильних умовах після їх виготовлення, або їхня мікробіологічна прийнятність повинна забезпечуватись іншими способами. Типова композиція для внутрішньовенного вливання повинна містити 250-1000 мл рідини, наприклад, стерильного розчину Рінгера, фізіологічного розчину, розчину декстрози, розчину Хенкса) і терапевтично ефективну дозу (наприклад, від 1 мг/мл до 100 мг/мл або більше) терапевтичного агента для доставки типових доз, перелік яких наведено нижче. Доза може змінюватись у залежності від типу і тяжкості захворювання. Як добре відомо у галузі медицини, дози для будьякого суб'єкта залежать від багатьох факторів, у тому числі розміру хворого, площі поверхні тіла, віку, конкретної сполуки, призначеної для введення, статі, часу і шляху введення, загального стану здоров'я, а також лікарських засобів, які вводяться одночасно. Типова доза може бути, наприклад, у 23 межах від 0,001 мкг до 1000 мг; однак передбачаються дози, які є меншими або більшими за цей наведений з ілюстративною метою діапазон, особливо приймаючи до уваги вищезгадані фактори. Схемою щоденного парентерального введення може передбачатись введення від приблизно 0,1 мкг/кг до приблизно 100 мг/кг загальної маси тіла, за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно 0,3 мкг/кг до приблизно 10 мг/кг, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 1 мкг/кг до 1 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 0,5 мг/кг до 10 мг/кг маси тіла на добу. Розвиток може контролюватись шляхом періодичного оцінювання симптомів захворювання. Для повторних введень впродовж декількох днів або довше, у залежності від стану, лікування повторюють доти, доки не відбудеться бажаного усунення симптомів захворювання. Однак придатними можуть бути інші схеми приймання лікарського засобу, які не виключаються. У залежності від схеми зниження фармакокінетичних показників, якого бажає досягти лікар-практик, необхідна доза може доставлятись шляхом введення одноразової ударної дози, шляхом введення численних ударних доз або шляхом постійного вливання молекули. Ці запропоновані кількості молекули за цим винаходом вводять в організм суб'єкта значною мірою за розсудом лікаря. Ключовим фактором у виборі відповідної дози і схеми застосування лікарського засобу є одержаний результат. Факторами, які повинні прийматись до уваги у цьому контексті, є конкретний розлад, який піддають лікуванню, конкретний ссавець, який зазнає лікування, клінічний стан конкретного хворого, причина захворювання, місце введення антитіла, конкретний тип антитіла, спосіб введення, схема застосування та інші фактори, відомі лікарям-практикам. Терапевтичні агенти за цим винаходом можуть заморожуватись або ліофілізуватись для зберігання та відновлюватись у відповідному стерильному носії перед застосуванням. Наслідком ліофілізації і відновлення може бути втрата активності антитіла різного ступеня. Дози повинні регулюватись для компенсування можливої втрати активності. Наведені нижче приклади призначені для ілюстрування, але не для обмеження цього винаходу. У прикладах, наведених нижче, серед інших застосовують мишаче моноклональне антитіло, позначене "266" (m266), яке спочатку одержали шляхом імунізації пептидом, який складається із залишків 13-28 людського Α пептиду та Fabфрагмента мишачого моноклонального антитіла, позначеного 266 (m266-Fab). Дієвість антитіла підтверджують імунною реакцією зі згаданим пептидом. Одержання m266 було описано вище. Для ковалентного приєднання молекули поліетиленгліколю до m266-Fab, Fab може бути підданий мутації для ведення залишку цистеїну до CDR2 (N56C) варіабельної ділянки важкого ланцюга і пегільований способом, показаним нижче (Приклад 4). Оскільки у прикладах наведено опис експериментів, які проводили на мишачих системах, застосування мишачих моноклональних антитіл є задовільним. Однак у способах лікування за цим винаходом, 95996 24 призначених для застосування на людях, перевагу віддають гуманізованим формам антитіл за цим винаходом або їхнім фрагментам. 1A1-Fab, на який посилаються у наведених нижче прикладах, являє собою Fab-фрагмент гуманізованого антитіла, який містить LCVR послідовності SEQ ID NO: 1 та HCVR послідовності SEQ ID NO: 2. Приклад 1 Дослідження PK/PD при підшкірному введенні пегільованого m266-Fab мишам лінії PDAPP Для дослідження фармакокінетичної/фармакодинамічної реакції антитіла та комплексу антитіло-Α пептид, застосовують молодих (віком 3 місяці) трансгенних мишей лінії PDAPP. Дослідженню піддають декілька антитіл, у тому числі мишаче 266 Fab (m266-Fab), m266-Fab+5 кДа PEG (молекула поліетиленгліколю, молекулярна маса 5 кДа), m266-Fab+10 кДа PEG, m266Fab+20 кДа PEG та інтактне непроцесоване m266 IgG антитіло. Мишам лінії PDAPP+/- підшкірно вводять антитіло (1 мг/кг), після чого беруть проби плазми у такі моменти часу: 1 год, 4 год, 8 год, 24 год, 48 год, 96 год, 168 год та 240 год після введення дози. Дослідження тварин, які одержали антитіло m266-Fab, здійснюють із додатковими більш ранніми моментами часу завдяки швидкому метаболізму цієї складової. Моменти часу для m266-Fab є такими: 1 год, 4 год, 8 год, 12 год, 16 год, 24 год та 48 год після введення дози. Загалом досліджують п'ять тварин/антитіло/момент часу. Цільну кров одержують шляхом пункції серця голками № 23, приєднаними до шприців 1СС, які заздалегідь були промиті 0,5 Μ розчином EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота). Проби крові інкубують на льоду під час процедури виділення, після чого центрифугують (14000 об/хв) у мікроцентрифузі з охолодженням при температурі 4°С впродовж 15 хв. Одержані зразки плазми розділяють на аліквоти і зберігають при температурі 80°С. А. Методика фармакокінетичних аналізів Fabфрагмента Концентрації Fab-фрагмента у плазмі визначають за допомогою методу "антигенної пастки" ELISA. Стисло, планшети впродовж ночі сенсибілізують кон'югатом Α-BSA (сироватковий альбумін великої рогатої худоби) при температурі 4°С або впродовж 1 год при температурі 37°С, після чого блокують за допомогою казеїнового буфера компанії Pierce. Стандартні, контрольні та експериментальні зразки вміщують у планшети з подальшим інкубуванням при кімнатній температурі впродовж 1 год. Для колориметричного аналізу застосовують козячу антимишачу HRP (пероксидаза з хрону); колориметрична реакція відбувається у OPD (дигідрохлорид офенілендіаміну) субстраті. Оптичну густину планшетів зчитують при А493 з контролем при А700. Рівень імунореактивності зразків плазми визначають за стандартними кривими, одержаними з використанням відомих кількостей m266-Fab у мишачій плазмі із застосуванням 4/5-параметричного алгоритму. Аналітичний діапазон для m266-Fab становить від 0,05 мкг/мл до 0,5 мкг/мл. Діапазон для пегільованих Fab-фрагментів становить від 0,075 мкг/мл до 0,8 мкг/мл. 25 Рівень імунореактивності зразків плазми визначають за стандартними кривими, одержаними з використанням відомих кількостей m266-Fab у мишачій плазмі із застосуванням 4/5параметричного алгоритму. Аналітичний діапазон для m266-Fab становить від 0,05 мкг/мл до 0,5 мкг/мл. Діапазон для пегільованих Fab-фрагментів становить від 0,075 мкг/л до 0,8 мкг/мл. Результати чітко демонструють, що додання молекули поліетиленгліколю та збільшення розміру молекули поліетиленгліколю підвищує час утримування пегільованих Fab-фрагментів у плазмі (2545 нг/мл через 8 год для пегільованого m266-Fab (20 кДа)), порівняно з непегільованими m266-Fabфрагментами (350 нг/мл через 8 год). В. Твердофазний імуноферментний аналіз m266 Α Для визначення кількості Α пептиду у плазмі за відсутності або за наявності терапевтичного антитіла (непроцесованого антитіла або Fabфрагмента) удосконалюють та застосовують твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA). Α пептиди, кількість яких визначають за допомогою згаданого аналізу, являють собою непроцесовані Α1-40 або Α1-42. 96-лункові планшети Immulon 4HBX для проведення ELISA (компанія ThermoLabsystems) сенсибілізують (100 мкл/лунка) впродовж ночі при температурі 4°С розчином (10 мкг/мл у PBS (забуферений фосфатом фізіологічний розчин)) С-кінцевого іммобілізованого антитіла (m2G3 для планшетів з Α40 або m21F12 для планшетів з Α42). Експериментальні планшети герметизують для запобігання випаровуванню під час інкубування впродовж ночі. Наступного дня розчин із лунок видаляють, і лунки тричі промивають PBS (400 мкл/лунка) за допомогою машини для миття 96-лункових планшетів (компанія Labsystems 96-Well Plate washer). Додають блокувальний буфер (360 мкл 1% розчину молока у PBS), і планшети інкубують при температурі 37°С впродовж 1 год. Зразки готують шляхом розбавлення плазми експериментальними розріджува 95996 26 чами для одержання: 20% розчину плазми, 0,5 Μ розчину гуанідину, 5 мМ розчину трис-буфера з рН 8,0, 0,5Х суміші інгібіторів протеаз, розчину m266 (25 мкг/мл) та PBS. Для певних моментів часу може виникнути необхідність у зменшенні об'єму плазми, яка застосовується у аналізі, в результаті наявності в ній високих рівнів Α пептиду. У цих випадках залишковий об'єм плазми регулюють за допомогою плазми пацюків (кінцевий відсотковий об'єм підтримують на рівні 20%). Стандартні зразки Α пептиду з концентраціями у межах від 250 пг/мл до 3,9 пг/мл одержують у стандартному розріджувачі (20% розчин плазми пацюків, 0,5 Μ розчин гуанідину, 5 мМ розчин трис-буфера, рН 8,0 та 0,5Х повна суміш інгібіторів протеаз без EDTA (компанія Roche Diagnostics), розчин m266 (25 мкг/мл) та PBS). Включення розчину інтактного m266 (25 мкг/мл) як до експериментального, так і до стандартного розріджувачів є необхідним для нейтралізації будь-якого негативного впливу змінних рівнів антитіл з центральним доменом на процес аналізу. Після блокування планшети 4 рази промивають PBS. Контрольні, експериментальні і стандартні зразки завантажують у окремі лунки серіями по три зразки кожного (100 мкл/лунка), планшети герметизують та інкубують впродовж ночі при температурі 4°С. Наступного ранку планшети 4 рази промивають PBS-T (PBS+0,05% розчин твін-20), і лунки інкубують із розчином біотинілованого вторинного антитіла m3D6 (100 мкл/лунка, розведення у 0,5% суміші BSA/PBS-T) впродовж 2 год при кімнатній температурі. Планшети після 4-разового промивання PBS-T інкубують з кон'югатом стрептавідину-поліпероксидази (1:5000 у 0,5% суміші BSA/PBS-T) впродовж 1,5 год при кімнатній температурі. Планшети 4 рази промивають PBS-T, і додають ТМВ субстрат (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) (100 мкл/лунка, компанія Sigma). Розвиток колориметричної реакції контролюють при 650 нм у моменти часу 15 хв, 30 хв та 60 хв. Таблиця 1 Результати дослідження фармакодинаміки: Середня концентрація Α40 у плазмі (пг/мл) Час (год) m266 Fab m266 Fab+5 кДа PEG M266 Fab+10 кДа PEG m266 Fab+20 кДа PEG m266 Інтактне 1 246,7 253,5 178,4 196,3 223,7 4 498,8 693,2 898,1 816,6 1110 8 576,7 997,8 1011 1259 1852 12 530,9 18 344,1 24 181,2 914,7 1728 2966 6919 48 200,1 789,6 2642 8557 96 79,1 104,8 329,3 10792 168 62,64 76,49 143,3 9923 240 50,14 98,24 101,2 6114 Крім більш гнучкої схеми приймання лікарського засобу, якою можна маніпулювати, виходячи з молекулярної маси молекули поліетиленгліколю, результати показують, що пегільований комплекс Fab-фрагмент-антиген не накопичується у цирку люючій плазмі впродовж тривалих періодів часу, подібно до інтактного антитіла (m266 інтактне). Інтактне антитіло подовжує період напіввиведення антитіла з плазми, результатом чого є наявність комплексу антиген:антитіло у циркулюючій плазмі 27 95996 впродовж тривалого періоду часу (>240 год). Нативні Fab-фрагменти (m266-Fab), з іншого боку, мають високу швидкість виведення та короткий період напіввиведення (