Гуманізоване антитіло, яке специфічно зв’язується з бета-амілоїдним пептидом (аb)

1. Гуманізоване антитіло 12А11 або його антигензв'язуючий фрагмент, що специфічно зв’язується з бета-амілоїдним пептидом (Аβ), що включає ділянки, які визначають комплементарність до антигену (CDR1, CDR2 і CDR3), з послідовності варіабельного легкого ланцюга 12А11, яка включає амінокислотні залишки 43-58 послідовності SEQ ID NO:2, амінокислотні залишки 74-80 послідовності SEQ ID NO:2, і амінокислотні залишки 113-121 послідовності SEQ ID NO:2, і ділянки, що визначають комплементарність до антигену (CDR1, CDR2 і CDR3), з послідовності варіабельного важкого ланцюга 12А11, яка включає амінокислотні залишки 50-56 послідовності SEQ ID NO:4, амінокислотні залишки 71-86 послідовності SEQ ID NO:4, і амінокислотні залишки 119-128 послідовності SEQ ID NO:4, яке відрізняється тим, що каркасна ділянка гуманізованої варіабельної області легкого ланцюга має принаймні 85% ідентичності послідовності до каркасної ділянки варіабельної області легкого ланцюга людини з антитіла підгрупи ІІ людини К64 (AIMS4) (accession no. BAC01733) і каркасна ділянка гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга має, принаймні, 85% ідентичності послідовності до каркасної ділянки варіабельної області важкого ланцюга людини з антитіла підгрупи III людини М72 (accession no. ААА69734), за умови, що принаймні одне положення, яке вибране з групи, що склада UA (21) a200512805 (22) 01.06.2004 (24) 10.06.2010 (86) PCT/US2004/017514, 01.06.2004 (31) 60/474,654 (32) 30.05.2003 (33) US (46) 10.06.2010, Бюл.№ 11, 2010 р. (72) БАЗІ ГАРІК, US, САЛДАНХА ДЖОУЗ В., GB, БАРД ФРЕДЕРІК, US (73) ВАЙЄТ, US, ЕЛАН ФАРМА ІНТЕРНЕШЕНЛ ЛІМІТЕД, IE (56) BARD F ET AL: "Epitope and isotype specificities of antobodies to beta-amyloid peptide for protection against Alzheimer's disease-like neuropathology" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, DC, US, vol. 100, no. 4, 18 February 2003 (2003-02-18), pages 2023-2028, XP002982464 ISSN: 0027-8424. QUEEN C ET AL: "A HUMANIZED ANTIBODY THAT BINDS TO THE INTERLEUKIN 2 RECEPTOR" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, DC, US, vol. 86, no. 24, 1 December 1989 (1989-12-01), pages 10029-10033, XP000310534 ISSN: 0027-8424. SOLOMON B.: 'Immunological approaches as therapy for Alzheimer's disease' EXPERT OPIN BIOL THER. vol. 2, no. 8, December 2002, pages 907 917, XP002971402. HOLTZMAN D.M. ET AL: 'Abeta immunization and anti-Abeta antibodies: potential therapies for the prevention and treatment of Alzheimer's disease' ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS vol. 54, no. 12, pages 1603 - 1613, XP002982465. DODEL R.C. ET AL: 'Immunotherapy for Alzheimer's disease' LANCET NEUROLOGY vol. 2, no. 4, April 2003, pages 215 - 220, XP004810319. US B1 6750324, 15.06.2004. US B1 6743427, 01.06.2004. WO A2 088306, 07.11.2002. US A1 2004082762, 29.04.2004. 2 (19) 1 3 ється з H24, H28, H29, H37, H48, H67, H71, Н73 і H78 (відповідно до Kabat-нумерації) зайняте тим самим залишком амінокислоти, який присутній в ідентичному положенні каркасної ділянки варіабельної області важкого ланцюга мишачого 12А11 імоноглобуліну. 2. Гуманізоване антитіло 12А11 або антигензв'язуючий фрагмент за п.1, що включає гуманізований важкий ланцюг і гуманізований легкий ланцюг, яке відрізняється тим, що (а) гуманізований легкий ланцюг включає каркасну ділянку варіабельної області з послідовності каркасної ділянки варіабельної області легкого ланцюга людини, названої далі як SEQ ID NO:8; і (b) гуманізований важкий ланцюг включає каркасну ділянку варіабельної області з послідовності каркасної ділянки варіабельної області важкого ланцюга людини, названої далі як SEQ ID NO:11; і відрізняється тим, що гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент специфічно зв'язується з бета-амілоїдним пептидом (Aβ) з афінністю принаймні 107 M-1. 3. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п.1 або п.2, яке відрізняється тим, що гуманізована варіабельна область легкого ланцюга позначена як SEQ ID NO:7. 4. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H28, H29, H37, H48, H67, H71, Н73 і H78 (відповідно до Kabatнумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, S, L, I, L, L, K, T і V відповідно. 5. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H29, H37, H71 і Н73 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, L, I, K і T відповідно. 6. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H29, H37 і H71 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, L, I і K відповідно. 7. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H29 і H37 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, L і I відповідно. 8. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H29, H37, H48, H67, H71, Н73 і H78 (відповідно до Kabatнумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, L, I, L, L, K, T і V відповідно. 9. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H28, H29, H37, H67, H71, Н73 і H78 (відповідно до Kabatнумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, S, L, I, L, K, T і V відповідно. 90846 4 10. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H28, H29, H37, H48, Н71, Н73 і Н78 (відповідно до Kabatнумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, S, L, I, L, K, T і V відповідно. 11. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H28, H29, H37, H48, Н67, Н71 і Н73 (відповідно до Kabatнумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, S, L, I, L, L, K і T відповідно. 12. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H29, H37, Н67, Н71, Н73 і Н78 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, L, I, L, K, T і V відповідно. 13. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H29, H37, Н48, Н71, Н73 і Н78 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, L, I, L, K, T і V відповідно. 14. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H29, H37, Н48, Н67, Н71 і Н73 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, L, I, L, L, K і T відповідно. 15. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H28, H29, H37, Н71, Н73 і Н78 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, S, L, I, K, T і V відповідно. 16. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H28, H29, H37, Н67, Н71 і Н73 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, S, L, I, L, K і T відповідно. 17. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H28, H29, H37, Н48, Н71 і Н73 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, S, L, I, L, K і T відповідно. 18. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H29, H37, Н71, Н73 і Н78 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, L, I, K, T і V відповідно. 19. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H29, H37, Н67, 5 90846 6 Н71 і Н73 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, L, I, L, K і T відповідно. 20. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H29, H37, Н48, Н71 і Н73 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, L, I, L, K і T відповідно. 21. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H28, H29, H37, Н71 і Н73 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, S, L, I, K і T відповідно. 22. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H29, H48, Н67, Н71, Н73 і Н78 (відповідно до Kabat-нумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, L, L, L, K, T і V відповідно. 23. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що положення H24, H28, H29, H37, H48, Н67, Н71 і Н78 (відповідно до Kabatнумерації) каркасної ділянки гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга зайняті F, S, L, I, L, L, K і V відповідно. 24. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п.1 або п.2, яке відрізняється тим, що гуманізована варіабельна область важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, що включає амінокислоти 1-120 послідовності SEQ ID NO:10, і гуманізована варіабельна область легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, що включає амінокислоти 1-112 послідовності SEQ ID NO:7. 25. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-3, яке відрізняється тим, що гуманізована варіабельна область важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, що включає амінокислоти 1-120 послідовності, вибраної з групи, що складається з послідовностей SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID, NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 та SEQ ID NO:31; і гуманізована варіабельна область легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, що включає амінокислоти 1-112 послідовності SEQ ID NO:7. 26. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п.1 або п.2, яке відрізняється тим, що гуманізована варіабельна область важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, що включає амінокислоти 1-121 послідовності SEQ ID NO:22 або SEQ ID NO:23, і гуманізована варіабельна область легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, що включає амінокислоти 1-112 послідовності SEQ ID NO:7. 27. Гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-26, яке відрізняється тим, що ізотопом є гамма 1. 28. Ізольована нуклеїнова кислота, що кодує гуманізовану варіабельну область важкого ланцюга за будь-яким з пп.1-26. 29. Ізольована нуклеїнова кислота, що кодує гуманізовану варіабельну область легкого ланцюга за будь-яким з пп.1-3. 30. Ізольована нуклеїнова кислота, що відповідно кодує гуманізовану варіабельну область важкого ланцюга за будь-яким з пп.1-26 і гуманізовану варіабельну область легкого ланцюга за будь-яким з пп.1-3. 31. Вектор або вектори, що включають нуклеїнову кислоту або нуклеїнові кислоти за будь-яким з пп.28-30. 32. Ізольована клітина-хазяїн, яка включає вектор або вектори за п.31. 33. Спосіб виготовлення гуманізованого антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, що містить клітину-хазяїн за п.32, яка культивується за таких умов, що антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент виробляється і вказане антитіло ізолюється з клітини-хазяїна або культури. 34. Фармацевтична композиція, яка містить гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп.1-26 і фармацевтичний носій. 35. Застосування гуманізованого антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким з пп.1-26 для лікування або профілактики амілоїдного захворювання. 36. Застосування за п.35, яке відрізняється тим, що амілоїдним захворюванням є хвороба Альцгеймера. 37. Застосування за п.35 або п.36, яке відрізняється тим, що доза антитіла становить від 0,01 до 5мг/кг ваги тіла. 38. Застосування за п.37, яке відрізняється тим, що доза становить 1мг/кг ваги тіла. Ця заявка проголошує переваги попередньо зареєстрованої патентної заявки, США, серійний No.60/474,654 (поданої 30 травня, 2003), під назвою "Гуманізовані антитіла, які розпізнають бета амілоїдний пептид". Весь зміст вищезазначеної заявки наведений тут у вигляді довідкової інформації. Хвороба Альцгеймера (ХА) - це прогресуюче захворювання, що призводить до сенільної деменції. Див., як правило, Selkoe, TINS 16:403 (1993); Hardy et al., WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438 (1994); Duff et al., Nature 373:476 (1995); Games et al., Nature 373:523 (1995). У широкому розумінні, хвороба має 2 форми: пізню форму, яка розпочинається в похилому віці (після 65 років і пізніше), і ранню, яка розвивається задовго до настання сенільного періоду, тобто, від 35 до 65 років. Патологія однакова в обох формах хвороби, однак порушення більш серйозні і поширені у ви 7 падку, коли захворювання розпочинається у молодшому віці. Хворобу характеризують щонайменше два типи уражень мозку - утворення нейрофібрилярних сплетень і сенільних бляшок. Нейрофібрилярні сплетення утворені внутрішньоклітинними відкладеннями мікротрубочок, зв'язаних тау протеїном, що складається з двох ниток, скручених одна з однією в пари. Сенільні бляшки (тобто, амілоїдні бляшки) становлять собою області дезорганізованого нейропілю до 150 мкм в діаметрі з екстрацелюлярними амілоїдними відкладеннями в центрі, які видно при мікроскопічному вивченні зрізів мозкової тканини. Накопичення амілоїдних бляшок у мозку пов'язане також з синдромом Дауна та іншими когнітивними розладами. Основним компонентом амілоїдних бляшок є пептид, названий Αβ або β-амілоїдний пептид. Αβпептид є внутрішнім фрагментом з молекулярною масою 4-kDa, утворений 39-43 амінокислотами більшого трансмембранного глікопротеїну зазначеного білка, який називається попередником амілоїдного білка (АРР - amyloid precursor protein). Внаслідок протеолітичного процессингу АРР різними секретазами, Αβ головним чином виявляється як в короткій формі, утвореній 40 амінокислотними залишками, так і в довгій, - в утворенні якої беруть участь 42-43 амінокислотні залишки. Частина гідрофобного трансмембранного домену АРР виявлена на карбоксильному кінці Αβ і може відповідати за здатність Αβ агрегуватись у бляшки, зокрема у випадку, коли йдеться про довгу форму. Накопичення амілоїдних бляшок у мозку в кінцевому результаті призводить до загибелі нервових клітин. Фізичні симптоми, пов'язані з цим типом ураження мозку, характеризують хворобу Альцгеймера. Був встановлений зв'язок між виникненням кількох мутацій АРР білка і наявністю хвороби Альцгеймера. Див. наприклад, Goate et al., Nature 349:704) (1991) (валін 717 на ізолейцин); Chartier 717 Harlan et al. Nature 353:844 (1991)) (валін на гліцин); Murrell et al., Science 254:97 (1991) (валін717 на фенілаланін); Mullan et al., Nature Genet. 1:345 (1992) (подвійна мутація, яка змінює лізин595метіонін596 на аспарагін595-лейцин596). Вважають, що такі мутації викликають хворобу Альцгеймера за рахунок зростання або зміни процесингу АРР до Αβ, зокрема процесингу АРР, який супроводжується збільшенням кількості довгої форми Αβ (тобто, Αβ1-42 і Αβ1-43). Вважають, що мутації в інших генах, таких як пресенілін гени, PS1 і PS2, опосередковано впливають на процесинг АРР, що призводить до збільшення кількості довгої форми Αβ (див. Hardy, TINS 20:154(1997)). Для того щоб з'ясувати значення амілоїдних бляшок у виникненні хвороби Альцгеймера, як моделі успішно використовуються миші (Games et al., supra, Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1550 (1997)). Зокрема, коли трансгенним мишам лінії PDAPP (які експресують мутантну форму АРР людини і зумовлюють розвиток хвороби Альцгеймера у молодому віці ), вводили довгу форму Αβ, вони виявляли як зменшення розвитку симптомів хвороби Альцгеймера, так і збільшення титру антитіл до Αβ пептиду (Schenk et al., Nature 90846 8 400, 173 (1999)). Результати спостережень, які обговорювались вище, показують, що Αβ, особливо його довга форма, є одним з чинників, що зумовлюють розвиток хвороби Альцгеймера. Таким чином, існує потреба в опрацюванні нових видів терапії і препаратів для лікування хвороби Альцгеймера, зокрема, терапії і препаратів, здатних виявляти позитивний терапевтичний ефект у фізіологічних (тобто, нетоксичних) дозах. Даний винахід відрізняється новими імунологічними препаратами, зокрема, терапевтичними препаратами антитіл для профілактики і лікування амілоїдогенної хвороби [наприклад, хвороби Альцгеймера). Винахід оснований, принаймні частково, на ідентифікації і визначенні характерних особливостей моноклонального антитіла 12А11, яке специфічно зв'язується з Αβ-пептидом і є ефективним у зменшенні накопичення бляшок, пов'язаного з амілоїдогенними розладами. Структурний і функціональний аналіз цього антитіла призвів до створення різних гуманізованих антитіл для використання з метою профілактики і/або лікування захворювання. Зокрема, винахід відрізняється "гуманізацією" варіабельниих областей цього антитіла і, відповідно, передбачає "гуманізований" імуноглобулін або ланцюги антитіла, інтактні "гуманізовані" імуноглобуліни чи антитіла, і функціональні фрагменти імуноглобуліну чи антитіла, зокрема, антигензв'язуючі фрагменти, що належать цьому антитілу. Поліпептиди, що включають ділянки, які визначають комплементарність до антигену (CDR), представленого моноклонального антитіла, також були розкриті, а також полінуклеотидні препарати, вектори і клітини-господарі, придатні для кодування названих поліпептидів. Розкрито способи лікування амілоїдогенних хвороб чи розладів (наприклад, хвороби Альцгеймера), а також фармацевтичні композиції і набір реактивів для використання в цих заявках. Винахід також відрізняється за методами ідентифікації залишків у межах представлених монокпональних антитіл, які є важливими для належного імунологічного функціонування і для ідентифікації залишків, що здатні до заміни при створенні гуманізованих антитіл, які мають підвищену зв'язуючу афінність і/або знижену імуногенність, коли використовуються як терапевтичні препарати. Крім того, представлені антитіла - це антитіла (наприклад, гуманізовані антитіла), які мають змінені ефекторні функції та їх терапевтичне використання. Фіг.1 графічно відображає результати експерименту, в якому досліджували ефективність різних антитіл, включаючи 12А11, щодо очищення Αβ бляшок за допомогою аналізу фагоцитозу ex vivo. Фіг.2А графічно відображає результати експерименту, в якому досліджували ефективність різних антитіл, включаючи 12А11, щодо здатності зменшувати загальні рівні Αβ. Відрізки представляють середні значення, а пунктирна горизонтальна лінія показує контрольний рівень. Фіг.2В графічно відображає результати експерименту, в якому аналізували ефективність різних антитіл, включаючи 12А11, щодо здатності зменшувати невритич 9 ну дистрофію. Відрізки представляють середні значення, а пунктирна горизонтальна лінія показує контрольний рівень. Дані наведено для окремих тварин, і виражено як відсоток невритичної дистрофії порівняно з середнім значенням контролю (прийнятого за 100%). Фіг.3А відображає послідовність ДНК, що включає послідовність мишачого 12А11 VL ланцюга і виведену амінокислотну послідовність для VL ланцюга (SEQ ID NO:5 і 2, відповідно). Зрілий VL лацюг позначений суцільною чорною лінією. CDRділянки позначені відкритими відрізками. Фіг.3В зображує ДНК послідовність, включаючи послідовність VH ланцюга мишачого 12А11 і виведену амінокислотну послідовність для VH ланцюга (SEQ ID NO:6 і 3, відповідно). Зрілий VH ланцюг позначений суцільною чорною лінією. CDR-ділянки позначені відкритими відрізками. ДНК-послідовності включають центри клонування і Kozakпослідовності (ліворуч від кодуючих послідовностей) ) і сплайсуючі та клонуючі послідовності (праворуч). Фіг.4 графічно відображає результати ELISAтесту з експерименту, в якому визначали зв'язування химерного 12А11, химерного і гуманізованого 3D6, і химерного і гуманізованого 12Β4 3Αβ1-42. Фіг.5А зображує вирівнювання амінокислотних послідовностей легкого ланцюга мишачого (або химерного) 12А11 (SEQ ED NO:2), гуманізованого 12А11 (зрілий пептид, SEQ ID NO:7), GenBank ВАС01733 (SEQ ID NO:8) і гаметної лінії А19 (Х63397, SEQ ID NO:9) антитіл. CDR-ділянки обведені. Пакувальні залишки - підкреслені. Відлік ведеться від першого метионіну, а не у відповідності з Kabat-нумерацією. Фіг.5В зображає порівняльний аналіз амінокислотних послідовностей важкого ланцюга мишачого (або химерного) 12А11 (SEQ ID NO:4), гуманізованого 12аА11 (версія 1) (зрілий пептид, SEQ ID NO:10), GenBank ААА69734 (SEQ ED NO:11), і гаметної лінії GenBank 567123 антитіла (SEQ ED NO:12). Пакувальні залишки підкреслені, канонічні залишки обведені суцільною лінією, а залишки Верньє обнесені точками. Відлік ведеться від першого метионіну, а не у відповідності з Kabatнумерацією. Фіг.6А-В зображає порівняння амінокислотних послідовностей важких ланцюгів гуманізованого12А11 в1 (SEQ ID NO:10), в2 (SEQ ID NO:13), в2.1 (SEQ ID NO:14), в3 (SEQ ID NO:15), в4.1 (SEQ ID NO:16), в4.2 (SEQ ID, NO:17), в4.3 (SEQ ID NO:18), в4.4 (SEQ ID NO:19), в5.1 (SEQ ID NO:20), в5.2 (SEQ ID NO:21), в5.3 (SEQ ID NO:22), в5.4 (SEQ ID NO:23), в5.5 (SEQ ID NO:24), в5.6 (SEQ ID NO:25), в6.1 (SEQ ID NO:26), в6.2 (SEQ ID NO:27), в6.З (SEQ ED NO:28), в6.4 (SEQ ID NO:29), в7 (SEQ ID NO:30) і в8 (SEQ ID NO:31). Фіг.6С відображає зворотні мутації, зроблені в гуманізованому 12А11, версії - від в1 до в8. Фіг.7 відображає результати ELISA-тесту на зв'язування Αβ(1-42) у порівнянні з химерним 12А11, гуманізованим 12А11 в1, гуманізованим 12А11 в2, гуманізованим 12А11 в2.1, і гуманізованим 12А11 в3. 90846 10 Фіг.8 відображає результати ELISA-тесту на конкурентне зв'язування Αβ1-42 у порівнянні з мишачим 12А11, химерним 12А11 і h12А11 в1. Даний винахід представляє нові імунологічні препарати і способи для профілактики або лікування хвороби Альцгеймера чи інших амілоїдогенних захворювань. Винахід оснований, принаймні, частково, на визначенні-характерних особливостей моноклонального імуноглобуліну, 12А11, ефективного при зв'язуванні бета амілоїдного білка (Αβ) (наприклад, здатного зв'язувати розчинний і/або агрегований Αβ), здатного брати опосередковану участь у фагоцитозі (наприклад, агрегованого Αβ), зменшувати кількість бляшок і/або зменшувати невритичну дистрофію (наприклад, у пацієнта). Винахід, крім того, оснований на визначенні і структурній характеристиці первинної і вторинної структури варіабельних областей легкого і важкого ланцюгів 12А11 імуноглобуліну і ідентифікації залишків, важливих для активності та імуногенності. Представлені імуноглобуліни - це імуноглобуліни, які включають варіабельний легкий і/або варіабельний важкий ланцюг 12А11 моноклонального імуноглобуліну, описаного тут. Кращі імуноглобуліни, наприклад, терапевтичні імуноглобуліни, це ті імуноглобуліни, що включають гуманізований варіабельний легкий і/або гуманізований варіабельний важкий ланцюг. Надано перевагу варіабельному легкому і/або варіабельному важкому ланцюгам, які включають ділянку, що визначає комплементарність до антигену (CDR), 12A11 імуноглобуліну (наприклад, донорного імуноглобуліну) і варіабельні каркасні ділянки, головним чином, з акцепторного імуноглобуліну людини. Вислів "головним чином з акцепторного імуноглобуліну людини" означає, що більшість або основні залишки каркасної ділянки походять з акцепторної послідовності людини, що, однак, робить можливим заміну залишків у певних позиціях залишками, відібраними для того щоб підвищити активність гуманізованого імуноглобуліну (наприклад, змінити активність таким чином, щоб вона повніше імітувала активність донорного імуноглобуліну) або відібраними для того, щоб зменшити імуногенність гуманізованого імуноглобуліну. В одному втіленні, винахід представляє гуманізований імуноглобулін, легкий і важкий ланцюг якого включає ділянки, що визначають комплементарність до антигену (CDR), варіабельної області 12А11 (тобто, включає одну, дві або три CDR- ділянки з набору послідовностей варіабельної області легкого ланцюга, яка далі називається як SEQ ID NO:2 або включає одну, дві або три CDRділянки з набору послідовностей варіабельної області важкого ланцюга, яка далі називається як SEQ ID NO:4), і включає варіабельну каркасну ділянку головним чином з послідовності легкого або важкого ланцюгів акцепторного імуноглобуліну людини, необов'язково маючи, принаймні, один залишок, утворений внаслідок зворотної мутації до відповідного мишачого залишку, де вказана зворотна мутація істотно не впливає на здатність ланцюга спрямовувати зв'язування Αβ. В іншому втіленні, винахід представляє гуманізований імуноглобулін, легкий і важкий ланцюги 11 якого включають ділянки, що визначають комплементарність до антигену (CDR-ділянки), варіабельної області 12А11 (тобто, включають одну, дві або три CDR-ділянки з набору послідовностей варіабельної області легкого ланцюга, які далі називаються як SEQ ID NO:2 і/або включає одну, дві або три CDR-ділянки з набору послідовностей варіабельної області важкого ланцюга, далі - SEQ ID NO:4), і включає варіабельну каркасну ділянку, головним чином, з послідовності легкого або важкого ланцюга акцепторного імуноглобуліну людини, необов'язково маючи, принаймні, хоч один залишок з каркасної ділянки, заміщений відповідним амінокислотним залишком з послідовності легкого або важкого ланцюга 12А11 миші, де залишок з каркасної частини обирається з групи, яка складається з (а) залишка, який нековалентно безпосередньо зв'язується з антигеном; (b) залишка, прилеглого до CDR-ділянки; (с) залишка, який взаємодіє з CDR (наприклад, визначеного шляхом моделювання легкого і важкого ланцюга на розшифрованій структурі ланцюга гомологічного відомого імуноглобуліну); і (d) залишка, який бере участь в утворенні поверхні розділення VL-VH. В іншому втіленні, винахід представляє гуманізований імуноглобулін, легкий або важкий ланцюг якого включає CDR-ділянки варіабельної області 12А11 і варіабельні ділянки каркасної області послідовності легкого або важкого ланцюга акцепторного імуноглобуліну людини, необов'язково маючи, принаймні, хоч один залишок з каркасної ділянки, заміщений відповідним амінокислотним залишком з послідовності варіабельної області легкого або важкого ланцюга мишачого 12А11, де залишок з каркасної частини є залишок, що здатний впливати на структуру варіабельної області легкого ланцюга або його функцію, як було визначено шляхом аналізу тривимірної моделі варіабельної області, наприклад, що залишок, здатний взаємодіяти з антигеном, займає проксимальну позицію щодо антигензв'язуючого центра; залишок, здатний взаємодіяти з CDR, - це той залишок, що прилеглий до CDR, залишок, який знаходиться в межах 6 Å CDR залишка, канонічний залишок, залишок зони Верньє, внутрішньоланцюговий пакувальний залишок, рідкісний залишок, або залишок центра гліколізації на поверхні структурної моделі. В іншому втіленні, винахід представляє, крім замін, які було описано вище, заміну, принаймні, одного рідкісного "людського" залишка каркасної частини. Наприклад, рідкісний залишок може бути заміщений амінокислотним залишком, який є звичайним для послідовності варіабельного ланцюга людини в цій позиції. В альтернативному варіанті, рідкісний залишок може бути замінений відповідним амінокислотним залишком з гомологічної послідовності варіабельного ланцюга гаметної лінії. В іншому втіленні, винахід представляє гуманізований імуноглобулін, який включає легкий ланцюг і важкий ланцюг, як було описано вище, або антигензв'язуючий фрагмент вказаного імуноглобуліну. В типовому втіленні, гуманізований імуноглобулін зв'язує (наприклад, специфічно зв'язує) бета амілоїдний пептид (Αβ) із зв'язуючою афінніс 90846 12 тю, принаймні, 107 М-1, 108 М-1, або 109 М-1. В іншому втіленні, імуноглобулін або антигензв'язуючий фрагмент включає важкий ланцюг, який має ізотип γ1. В іншому втіленні, імуноглобулін або антигензв'язуючий фрагмент-зв'язує (наприклад, специфічно зв'язує) як·розчинний бета амілоїдний пептид (Αβ), таки агрегований Αβ. В іншому втіленні, імуноглобулін або антигензв'язуючий фрагмент "перехоплює" розчинний Αβ (наприклад;" розчинний Αβ1-42). У іншому втіленні, імуноглобулін або антигензв'язуючий фрагмент є посередниками фагоцитозу (наприклад, індукують фагоцитоз) бета амілоїдного пептиду (Αβ). В ще одному втіленні, імуноглобулін або антигензв'язуючий фрагмент долає гематоенцефалічний бар'єр у суб'єкта. У ще одному втіленні, імуноглобулін або антигензв'язуючий фрагмент зменшує як накопичення бета амілоїдного пептиду (Αβ), так і невритичну дистрофію у суб'єкта. В іншому втіленні, винахід представляє химерні імуноглобуліни, які включають варіабельні області 12А11 (наприклад, послідовності варіабельної області, далі SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:4). В ще одному втіленні, імуноглобулін або його антигензв'язуючий фрагмент, крім того, включає константні області з IgG1. Імуноглобуліни, описані в цьому винаході, особливо придатні для використання в терапевтичних методах, які мають на меті профілактику або лікування амілоїдогенних захворювань. В одному втіленні, винахід представляє спосіб профілактики або лікування амілоїдогенного захворювання (наприклад, хвороби Альцгеймера), що включає введення пацієнтові ефективної дози гуманізованого імуноглобуліну, як тут описано. В іншому втіленні, винахід представляє фармацевтичні композиції, які включають гуманізований імуноглобулін, як тут описано, і фармацевтичний носій. Також представлені ізольовані молекули нуклеїнової кислоти, вектори і клітини-господарі для отримання імуноглобулінів або фрагментів імуноглобулінів, або ланцюгів імуноглобулінів, як тут описано, а також методи для отримання вказаних імуноглобулінів, фрагментів імуноглобуліну або ланцюгів імуноглобуліну. Даний винахід також представляє метод для ідентифікації залишків 12А11, які підлягають заміні при отриманні гуманізованого 12А11 імуноглобуліну, відповідно. Наприклад, метод для ідентифікації каркасних залишків варіабельної області, які підлягають заміні, включає моделювання тривимірної структури варіабельної області 12А11 на основі структури розшифрованого гомологічного імуноглобуліну і аналіз вказаної моделі щодо наявності залишків, здатних впливати на конформацію або функцію варіабельної області 12А11 імуноглобуліну, внаслідок чого ідентифікуються залишки, які підлягають заміні. Крім того, винахід представляє використання послідовностей варіабельної області, далі SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:4, або будьякої її частини, для отримання тривимірного "внутрішнього образу" 12А11 імуноглобуліну, ланцюга 12А11 імуноглобуліну, або його домену. Крім того, даний винахід представляє імуноглобулін, який має змінені ефекторні функції, такі як 13 здатність зв'язувати ефекторні молекули, наприклад, комплемента або рецептора на ефекторній клітині. Зокрема, імуноглобулін даного винаходу має змінену константну область, наприклад, Fcобласть, де, щонайменше, один амінокислотний залишок в Fc-області замінений іншим залишком або бічним ланцюгом. В одному втіленні, модифікований імуноглобулін є імуноглобуліном IgG класу, включає, принаймні, заміну одного амінокислотного залишка Fc-області, внаслідок чого імуноглобулін має змінені ефекторні функції, наприклад, у порівнянні з немодифікованим імуноглобуліном: В окремих втіленнях, імуноглобулін даного винаходу має змінені ефекторні функції, внаслідок чого він є менш імуногенним (наприклад, не викликає небажаної активності ефекторних клітин, лізису, або зв'язування комплемента), має посилену здатність до кліренсу амілоїду, і/або має бажаний час напіврозпаду. Перед описом винаходу, для того щоб зрозуміти його, має бути корисним навести визначення певних термінів, які будуть використані надалі. Термін "імуноглобулін" або "антитіло" (використовуються тут поперемінно) стосується білка, який має основну структуру, утворену чотирма поліпептидними ланцюгами, - двома легкими і двома важкими, вказані ланцюги стабілізуються, наприклад, за рахунок утворення між ланцюгами дисульфідних зв'язків, які мають здатність специфічно зв'язувати антиген. Термін "одноланцюговий імуноглобулін" або "одноланцюгове антитіло" (використовуються тут поперемінно) стосується білка, структура якого утворена ланцюгом, що включає два поліпептиди, важкий і легкий ланцюг, вказані ланцюги стабілізуються, наприклад, за рахунок існування між пептидними ланцюгами лінкерів, які мають здатність специфічно зв'язувати антиген. Термін "домен" стосується глобулярної області важкого або легкого поліпептидного ланцюга, яка включає пептидні "петлі" (наприклад, включає від 3 до 4 пептидних петель), стабілізовані, наприклад, β-складчастою конформацією і/або дисульфідними зв'язками всередині ланцюга. Домени далі називаються тут як "константні" або "варіабельні", на підставі відносної втрати здатності послідовності до мінливості всередині доменів представників різних класів у випадку "константного" домену, або значної мінливості всередині доменів представників різних класів, коли йдеться про "варіабельний" домен. Терміни антитіло або поліпептидні "домени" часто використовуються у винаході поперемінно як антитіло або поліпептидні "області". "Константні" домени легкого ланцюга антитіла називаються поперемінно як "константні області легкого ланцюга", "константні домени легкого ланцюга", "CL" області або "CL" домени. "Константні" домени важкого ланцюга антитіла називаються поперемінно як "константні області важкого ланцюга", "константні домени важкого ланцюга", "СН" області або "СН" домени). "Варіабельні" домени легкого ланцюга антитіла називаються поперемінно як "варіабельні області легкого ланцюга", "варіабельні домени легкого ланцюга", "VL" області або "VL" домени). "Варіабельні" домени важкого ланцюга антитіла називаються поперемінно як "варіа 90846 14 бельні області важкого ланцюга", "варіабельні домени важкого ланцюга", "СН" області або "СН" домени). Термін "ділянка" також може стосуватись частини або порції ланцюга антитіла або домену ланцюга антитіла (наприклад, частини або порції важкого або легкого ланцюга або частини чи порції константного або варіабельного домену, як визначено тут), а також більш дискретних частин або порцій вказаних ланцюгів або доменів. Наприклад, легкий і важкий ланцюги або варіабельні домени легкого і важкого ланцюгів включають "ділянки, які визначають комплементарність", або "CDR" чергуються з "ділянками каркасної частини" або "FRділянками", як тут визначено. Імуноглобуліни або антитіла можуть існувати в мономерній або полімерній формі, наприклад, ІgМ антитіла, які існують в пентамерній формі, і/або ІgА антитіла, які існують в мономерній, димерній або мультимерній формах. Термін "фрагмент" стосується частини або порції антитіла або ланцюга антитіла, яка включає менше число амінокислотних залишків, ніж інтактне або повне антитіло або ланцюг антитіла. Фрагменти можуть бути отримані шляхом хімічної або ферментативної обробки інтактного або повного антитіла або ланцюга антитіла. Фрагменти також можуть бути отримані за допомогою рекомбінантних засобів. Типові фрагменти включають Fab, Fab', F(ab')2, Fabc і/або Fv фрагменти. Термін "антигензв'язуючий фрагмент" стосується поліпептидного фрагменту імуноглобуліну або антитіла, який зв'язує антиген або конкурує з інтактним антитілом (тобто, з інтактним антитілом, від якого вони походять) за зв'язування антигена (тобто, специфічне зв'язування). Термін "конформація" стосується третинної структури білка або поліпептиду (наприклад, антитіла, ланцюга антитіла, домену або його ділянки). Наприклад, фраза "конформація легкого (або важкого) ланцюга" стосується третинної структури варіабельної області легкого (або важкого) ланцюга, а фраза "конформація антитіла" або "конформація фрагменту антитіла" стосується третинної структури антитіла або його фрагменту. "Специфічне зв'язування" антитіла означає, що антитіло виявляє істотну спорідненість до певного антигену або епітопу і, здебільшого, не виявляє значної перехресної реактивності. У типових втіленнях антитіло не виявляє перехресної реактивності (наприклад, не реагує перехресно з не-Αβ пептидами або з віддаленими епітопами на Αβ). "Істотне" або краще зв'язування включає зв'язування з афінністю, принаймні, 106, 107, 108, 109М-1, або 1010М-1. Бажано, щоб афінність була більша, ніж 107М-1, особливо більша, ніж 108М-1. Значення, проміжні між вказаними величинами, будуть також розглянуті в межах даного винаходу і найкраща зв'язуюча афінність може бути визначена як низка значень афінності, наприклад, від 106 до 1010М-1 бажано, від 107 до 1010М-1, ще більш бажано - від 108 до 1010М-1. Антитіло, яке "не виявляє значної зворотної реактивності", це антитіло, що не буде істотно зв'язуватись з небажаним об'єктом (наприклад, небажаним об'єктом білкової природи). Наприклад, антитіло, яке специфічно зв'язується з 15 Αβ, буде істотно зв'язуватись з Αβ, але не буде істотно реагувати з не-Αβ протеїнами або пептидами (наприклад, не-Αβ протеїнами або пептидами, які входять до складу бляшок). Антитіло, специфічне по відношенню до певного епітопу, не буде, наприклад, значно зворотно реагувати з віддаленими епітопами на тому ж білку або пептиді. Специфічне зв'язування може бути визначене відповідно до будь-яких загальноприйнятих в імунології способів для визначення такого зв'язування. Переважно, специфічне зв'язування визначається за допомогою Scatchard-аналізу і/або аналізу конкурентного зв'язування. Зв'язуючі фрагменти отримують за допомогою методики рекомбінантних ДНК або ферментативного чи хімічного розщеплення інтактних імуноглобулінів. Зв'язуючі фрагменти включають Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, одинарні ланцюги і одноланцюгові антитіла. Інші, ніж "біспецифічні" або "біфункціональні" імуноглобуліни або антитіла, імуноглобулін або антитіло розшифровуються, для того щоб мати ідентичні їх зв'язуючі центри. "Біспецифічні" або "біфункціональні антитіла" - це штучні гібридні антитіла, які мають дві різні (важкий/легкий) пари ланцюгів і два різних зв'язуючих центри. Біспецифічні антитіла можуть бути отримані за допомогою цілої низки методів, включаючи злиття гібридом або зшивання Fab' фрагментів. Див., наприклад, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315321 (1990); Kostelny el al., J. Immunol. 148,15471553 (1992). Термін "гуманізований імуноглобулін" або "гуманізоване антитіло" стосується імуноглобуліну або антитіла, яке включає, принаймні, один ланцюг гуманізованого імуноглобуліну або антитіла (наприклад, принаймні, один гуманізований легкий або важкий ланцюг). Термін "ланцюг гуманізованого імуноглобуліну" або "ланцюг гуманізованого антитіла" (тобто, "легкий ланцюг гуманізованого імуноглобуліну" або "важкий ланцюг гуманізованого імуноглобуліну") стосується ланцюга імуноглобуліну або антитіла (тобто, легкого або важкого ланцюга, відповідно), який має варіабельну область, що включає варіабельну каркасну ділянку, головним чином, з імуноглобуліну або антитіла людини і ділянки, які визначають комплементарність до антигену (CDR-ділянки) (наприклад, принаймні, одну CDR, бажано, дві CDR, ще більш бажано - три CDR), головним чином з імуноглобуліну або антитіла, що не належать людині, і, до того ж, включає константні області (наприклад, принаймні, одну константну область або її частину, у випадку легкого ланцюга, і переважно, три константні області, якщо йдеться про важкий ланцюг). Термін "гуманізована варіабельна область" (наприклад, "варіабельна область гуманізованого легкого ланцюга" або "варіабельна область гуманізованого важкого ланцюга) стосується варіабельної області, яка включає варіабельну каркасну ділянку, головним чином з імуноглобуліну або антитіла людини, і ділянки, які визначають комплементарність до антигена (CDR-ділянки), головним чином з імуноглобуліну або антитіла, що не належать людині. Фраза "головним чином з імуноглобуліну або антитіла людини" або "головним чином, людський" 90846 16 означає, що, коли провести порівняльний аналіз первинної структури імуноглобуліну або антитіла людини, ділянка виявляє принаймні 80-90%, бажано, принаймні 90-95%, ще більш бажано, принаймні, 95-99% ідентичності (тобто, ідентичності локальної послідовності) з послідовністю каркасної частини або константної області молекули імуноглобуліну людини, що робить можливим, наприклад, консервативні заміни, заміни консенсусної послідовності, заміни послідовності гаметної лінії, зворотні мутації тощо. Введення консервативних замін, замін у консенсусній послідовності, замін у гаметній послідовності, зворотних мутацій, тощо, часто називаєтеся як "оптимізація" гуманізованого антитіла або ланцюга. Фраза "головним чином з імуноглобуліну або антитіла, що не належать людині" або "головним чином, нелюдський" означає, що послідовність амінокислот імуноглобуліну або антитіла, принаймні, на 80-95%, бажано, принаймні, на 90-95%, ще більш бажано, на 96%, 97%, 98%, або 99% ідентична послідовності організму, наприклад, іншого ссавця, а не людини. Відповідно, всі ділянки або залишки гуманізованого імуноглобуліну або антитіла, або ланцюга, гуманізованого імуноглобуліну або антитіла, за винятком, можливо, CDR-ділянок, головним чином, ідентичні відповідним ділянкам або залишкам однієї або кількох послідовностей нативного імуноглобуліну людини. Термін "відповідна ділянка" або "відповідний залишок" стосується ділянки або залишка на іншій амінокислоті або нуклеотидній послідовності, яка займає те ж саме (тобто, ідентичне) положення, що й ділянка або залишок першої амінокислоти або нуклеотидної послідовності, коли здійснюється порівняльний аналіз першої і другої послідовностей. Термін "істотна ідентичність" означає, що дві поліпептидні послідовності, при оптимальному порівняльному аналізі, який здійснюється за допомогою програм GAP або BESTFIT з використанням по умовчанню різниці ваги, ідентичні, принаймні, на 50-60%, бажано, принаймні, на 60-70%, ще більш бажано, принаймні, на 70-80%, бажаніше, принаймні на 80-90%, навіть ще бажаніше, принаймні, на 90-95%, і навіть ще бажаніше, принаймні, на 95% чи ще більше (наприклад, 99% ідентичності послідовності чи більше). Термін "достатня ідентичність" означає, що дві поліпептидні послідовності, при оптимальному порівняльному аналізі, наприклад, такому, що здійснюється за допомогою програм GAP або BESTFIT з використанням по умовчанню різниці ваги, виявляють, принаймні, 80-90% ідентичності послідовності, бажано, принаймні, 90-95% ідентичності послідовності, і ще більш бажано, принаймні, 95% ідентичності послідовності чи ще більше (наприклад, 99% ідентичності послідовності або більше). Для порівняння послідовності, як правило, одна послідовність слугує еталоном, з яким порівнюються досліджувані послідовності. При використанні алгоритму порівняння послідовностей, досліджувані та еталонні послідовності вводять у комп'ютер, вказують координати підпослідовностей, якщо необхідно, і визначають параметри програми алгоритмічної послідовності. Алгоритм порівняння послідовності 17 далі підраховує відсоток ідентичності досліджуваних послідовності(тей) відносно еталонної послідовності, базуючись на параметрах зазначеної програми. Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути виконано, наприклад, з використанням алгоритму локальної гомології Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), алгоритму гомології вирівнювання Needleman & Wunsch, J. Моl. Biol. 48:443 (1970), методу пошуку подібності Pearson & Lipman, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), комп'ютеризованим виконанням цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA, і TFASTA з пакету програмного забезпечення Wisconsin Genetics, Genetics Computer- Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) або шляхом візуального обстеження (див. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Як приклад алгоритму, придатного для визначення відсотка ідентичності послідовності і подібності послідовності, можна навести BLAST алгоритм, який описано в Altschul et al., J. Моl. ВіоІ. 215:403 (1990). Програмне забезпечення для виконання BLAST-аналізу доступне для широкого загалу через Національний Центр Біотехнологічної Інформації (NCBI) (доступна для загалу через Інтернет сервер Національних Інститутів здоров'я NCBI). Здебільшого, для вирівнювання послідовностей можуть бути використані програмні параметри, встановлені виробником програм, хоча також можуть бути використані параметри, задані користувачем. Для амінокислотних послідовностей, програма - BLASTP використовує "по умовчанню" довжину слова (W) з 3, очікування (Е) з 10, і ВLOSUM62-матрицю кількісної оцінки (дuв. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1989)). Переважно, положення залишків, які не є ідентичними, відрізняється шляхом замін консервативних амінокислот. З метою класифікації амінокислотних замін, як консервативних, так і неконсервативних, амінокислоти групуються наступним чином: Група І (з гідрофобними бічними ланцюгами): лейцин, метионін, аланін, валін, лейцин, ізолейцин; Група II (з нейтральними гідрофільними бічними ланцюгами): цистеїн, серин, треонін; Група III (з кислотними бічними ланцюгами): аспарагін, глутамін; Група IV (з основними бічними ланцюгами): аспарагін, глутамін, гістидин, лізин, аргінін; Група V (залишки, які впливають на розташування ланцюга): гліцин, пролін; і Група VI (ароматичні бічні ланцюги): триптофан, тирозин, фенілаланін. Консервативні заміни включають заміни між амінокислотами одного й того ж класу. Неконсервативні заміни полягають у заміні члена одного класу представником іншого класу. Переважно, гуманізовані імуноглобуліни або антитіла зв'язують антиген з афінністю, яка в 3, 4 або п'ять разів більша, ніж у відповідного негуманізованого антитіла. Наприклад, якщо негуманізоване антитіло має зв'язуючу афінність 109М-1, гуманізовані антитіла будуть мати зв'язуючу афінність, принаймні, 3 109М-1, 4 109Μ-1 або 5 109Μ-1. Характеризуючи зв'язуючі властивості імуноглобуліну або ланцюга антитіла, ланцюг може бути описаний, виходячи з його здатності 90846 18 "спрямовувати зв'язування антигена (наприклад, Αβ)". Говорять, що ланцюг "спрямовує зв'язування антигена", якщо він надає інтактному імуноглобуліну або антитілу (або його антигензв'язуючому фрагменту) властивості до специфічного зв'язування або зв'язуючої афінності. Вважають, що мутація (наприклад, зворотна мутація ) істотно впливає на здатність важкого або легкого ланцюга спрямовувати зв'язування антигена, якщо вона впливає (наприклад, зменшує) зв'язуючу афінність інтактного імуноглобуліну або антитіла (або його антигензв'язуючого фрагмента), який містить вказаний ланцюг, принаймні, на порядок, у порівнянні з антитілом (або його антигензв'язуючим фрагментом), яке представляє ідентичний ланцюг, в якому відсутня зазначена мутація. Мутація ''істотно не впливає (наприклад, зменшує) на здатність ланцюга спрямовувати зв'язування антигена", якщо вона впливає (наприклад, зменшує) на зв'язуючу афінність інтактного імуноглобуліну або антитіла (або його антигензв'язуючого фрагмента), який включає зазначений ланцюг, лише в два, три, чотири рази у порівнянні з антитілом (або його антигензв'язуючим фрагментом), який включає ідентичний ланцюг, що не містить такої мутації. Термін "химерний імуноглобулін" або антитіло стосується імуноглобуліну або антитіла, варіабельні області якого походять від одного виду, а константні області походять від іншого виду. Химерні імуноглобуліни або антитіла можуть бути сконструйовані, наприклад, із використанням методів генетичної інженерії, з використанням сегментів гену імуноглобуліну, що належать різним видам. Введенням терміну "гуманізований імуноглобулін" або "гуманізоване антитіло" не мали" наміру охопити ним химерні імуноглобуліни або антитіла, як визначено infra. Хоча гуманізовані імуноглобуліни або антитіла за своєю конструкцією є химерними (гібридними) (тобто, включають ділянки більше, ніж одного виду білка), їм також притаманні додаткові властивості (тобто, варіабельні області, які містять залишки донорних CDR і залишки каркасної частини акцептора), не виявлені у химерних імуноглобулінів або антитіл, як визначено тут. "Антиген" - це об'єкт (наприклад, білковий об'єкт або пептид), з яким антитіло специфічно зв'язується. Термін "епітоп" або "антигенна детермінанта" стосується місця на антигені, в якому імуноглобулін або антитіло (або його антигензв'язуючий фрагмент) специфічно зв'язується. Епітопи можуть бути утворені як сусідніми амінокислотами, так і несусідніми амінокислотами, накладання яких забезпечується третинною структурою білка. Епітопи, утворені сусідніми амінокислотами, як правило, стійкі до дії денатуруючих розчинів, тоді як епітопи, утворені внаслідок складчастості третинної структури білка, втрачаються після обробки денатуруючими розчинами. Епітопи здебільшого включають, щонайменше, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 амінокислот, які мають унікальну просторову структуру. Методи визначення просторової структури включають, наприклад, рентгенокристалографію і двохмірний ядерний магнітний резонанс. Див., наприклад, Epitope Mapping Protocols in 19 Methods in Molecular Biology, Vol.66, G. E. Morris, Ed. (1996). Антитіла, які розпізнають один і той же епітоп, можуть бути ідентифіковані за допомогою простого методу імунного аналізу, який показує здатність одного антитіла блокувати зв'язування іншого антитіла з антигеном-мішенню, тобто, за допомогою конкурентно-зв'язуючого аналізу. Конкурентне зв'язування визначається за допомогою тесту, в якому досліджуваний імуноглобулін виявляє специфічне зв'язування еталонного антитіла із звичайним антигеном, таким як Αβ. Відомо багато способів конкурентно-зв'язуючого аналізу, наприклад: твердофазний прямий або непрямий імунорадіометричний аналіз (RIA), твердофазний прямий або непрямий імуноферментний аналіз (ЕІА), аналіз конкурентного імуносендвічу (див. Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); твердофазний прямий біотин-авідин імуноферментний аналіз ЕІА (див. Kirkland et al., J.Immunol. 137:3614 (1986)); твердофазний прямий аналіз з використанням міток, твердофазний прямий аналіз з використанням міченого імуносендвічу (див. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); твердофазний прямий імунорадіометричний аналіз (RIA) з використанням 1125 мітки (див. Morel et al., Моl. Immunol. 25(1 ):7 (1988)); твердофазного прямого біотин-авідин ЕІА (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); і прямого RIA з використанням міток. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Як правило, такі дослідження передбачають, використання очищеного антигена, зв'язаного з твердою поверхнею або клітинами, які несуть один з цих імуноглобулінів: немічений досліджуваний імуноглобулін і мічений еталонний (референс) імуноглобулін. Конкурентне інгібирування вимірюється шляхом визначення кількості мітки, зв'язаної з твердою поверхнею або клітинами в присутності досліджуваного імуноглобуліну. Як правило, досліджуваний імуноглобулін присутній в надлишку. Здебільшого, якщо конкуруюче антитіло присутнє в надлишку, воно буде гальмувати специфічне зв'язування еталонного антитіла з маркерним антигеном, щонайменше на 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 7075% чи більше. Епітоп також розпізнається імунокомпетентними клітинами, наприклад, В-лімфоцитами і /або Т-лімфоцитами. Клітинне імунологічне розпізнавання епітопа може бути визначене за допомогою аналізу in vitro, який оцінює антиген-залежну проліферацію, що визначається шляхом включення 3 Н-тимідину, секрецією цитокіну, секрецією антитіла чи антиген-залежного кіллінгу [цитолізу] (аналіз цитотоксичності Т-лімфоцитів). Типові епітопи або антигенні детермінанти можуть бути виявлені в попереднику амілоїдного білка людини (АРР), але переважно вони знаходяться в Αβ пептиді АРР. Існують численні ізоформи АРР, наприклад, АРР695, АРР751 і АРР770. Амінокислотам в межах АРР задані номери відповідно до послідовності АРР770 ізоформи (див., наприклад, GenBank Accession No.Р05067). Αβ (який тут також названий як бета амілоїдний пептид і Αбета) пептид є внутрішній фрагмент АРР, з моле 90846 20 кулярною масою, приблизно, 4-kDa, утворений 3943 амінокислотами АРР (Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 і Αβ43). Αβ40, наприклад, складається з 672-711 залишків АРР і Αβ42 складається з 673-713 залишків АРР. Внаслідок протеолітичного процесингу АРР різними секретазними ферментами in vivo або in situ, Αβ виявляється як в "короткій формі", 40 амінокислот завдовжки, так і в "довгій формі", яка утворена 42-43 амінокислотами. Бажані епітопи або антигенні детермінанти, як тут описано, розміщені на N-кінцевій ділянці Αβ-пептиду і включають залишки 1-10 амінокислот Αβ, переважно від 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 до 3-7 залишків Αβ42. Крім названих, епітопи або антигенні детермінанти включають 2-4, 5, 6, 7 або 8 залишків Αβ, 3-5, 6, 7, 8 або 9 залишків Αβ, або 4-7, 8, 9 або 10 залишків Αβ42. Коли говорять, що антитіло зв'язується з епітопом в межах точно визначених залишків, таких як Αβ3-7, це означає, що антитіло специфічно зв'язується з поліпептидом, який включає точно визначені залишки (тобто, Αβ3-7 в цьому прикладі). Таке· антитіло не обов'язково контактує з кожним 3-7г залишком Αβ. Заміна кожної окремої амінокислоти або делеція в межах Αβ3-7 теж не обов'язково істотно впливає на зв'язуючу спорідненість. Термін "амілоїдогенна хвороба" включає будьяке захворювання, пов'язане (чи зумовлене) утворенням або відкладенням нерозчинних амілоїдних фібрил. Типові приклади амілоїдогенних захворювань включають, але не обмежені ними, системний амілоїдоз, хворобу Альцгеймера, дорослу форму діабету, хворобу Паркінсона, хворобу Гентінгтона, фронто-темпоральну деменцію, пріонові інфекційні спонгіозні енцефалопатії (куру і хворобу Крейтцфельдта-Якоба у людей, свербець і BSE у овець і великої рогатої худоби, відповідно). Різні амілоїдогенні захворювання визначаються або характеризуються природою поліпептидної складової, яка відкладається в нейрофібрилах. Наприклад, у суб'єктів або пацієнтів, які страждають від хвороби Альцгеймера, β-амілоїдний білок (наприклад, природний тип, варіант, або процесований β-амілоїдний білок) є характерним поліпептидним компонентом амілоїдних відкладень. Відповідно, хвороба Альцгеймера є прикладом "захворювання, що характеризується відкладеннями Αβ" або "захворювання, пов'язаного з відкладеннями Αβ", наприклад, у мозку суб'єкта або пацієнта. Терміни "β-амілоїдний білок", "β-амілоїдний пептид", "β-амілоїд", "Αβ" і "Αβ-пептид" використовуються тут поперемінно. "Імуногенний агент" або "імуноген" здатний індукувати імунну реакцію проти себе на введення ссавцям, необов'язково у поєднанні з ад'ювантом. Термін "лікування", як тут використовується, визначається як застосування або введення терапевтичного засобу пацієнту, або застосування чи введення терапевтичного засобу в ізольовану тканину або клітинну лінію, отриману від пацієнта, який має хворобу, симптоми хвороби або схильність до хвороби, з метою лікувати, полегшувати страждання, надавати допомогу, лікувати, покращувати стан або впливати на хворобу, симптоми хвороби або схильність до хвороби. 21 Термін "ефективна доза" або "ефективне дозування" визначається як кількість препарату, достатня для того, щоб досягти, принаймні, частково, бажаного ефекту. Термін "терапевтично ефективна доза" визначається як кількість препарату, достатня для того, щоб лікувати або, принаймні, блокувати хворобу і її ускладнення у пацієнта, який вже потерпає від хвороби. Кількість препарату, ефективна для такого використання, залежить від серйозності захворювання та загального стану імунної системи пацієнта. Термін "пацієнт" включає людину та інших ссавців, які отримують препарат з профілактичною або лікувальною метою. "Розчинний" або "дисоційований" Αβ стосується неагрегованого або розщепленого Αβполіпептиду, включаючи мономерний розчинний, а також олігомерний розчинний Αβ-поліпептид (наприклад, розчинні Αβ димери, тримери тощо). "Нерозчинний" Αβ стосується агрегованого Αβполіпептиду, наприклад, Αβ, який утримується не ковалентними зв'язками. Вважають, що Αβ (наприклад, Αβ42) агрегується, принаймні, частково, завдяки наявності гідрофобних залишків у С-кінцевій ділянці пептиду (частина трансмембранного домену АРР). Розчинний Αβ може бути виявлений in vivo в біологічних рідинах, таких як спиномозкова рідина і/або сироватка. У альтернативному варіанті, розчинний Αβ можна приготувати, розчиняючи ліофілізований пептид у бичачій сироватці DMSO за допомогою ультразвуку. Для того щоб видалити будь-які нерозчинні частки, отриманий внаслідок цього розчин центрифугують (наприклад, при 14,000 g, 4°С, 10 хвилин). Термін "ефекторна функція" стосується активності залишків Fc-області антитіла (наприклад, IgG антитіла) і включає, наприклад, здатність антитіла зв'язувати ефекторні молекули, такі як комплемент і/або Fc рецептори, які можуть контролювати кілька імунних функцій антитіла, таких як активність ефекторних клітин, лізис, комплементопосередкована активність, кліренс антитіла, і час напіврозпаду антитіла. Термін "ефекторна молекула" стосується молекули, яка здатна зв'язуватись з Fc-областю антитіла (наприклад, IgG антитіла), включаючи, але не обмежена цим, білок комплемента або Fc рецептором. Термін "ефекторна клітина" стосується клітин, здатних зв'язуватись з Fc частиною антитіла (наприклад, IgG антитіла), у типовому випадку via Fc рецептор, експресований на поверхню ефекторних клітин, включаючи, але не обмежена цим, лімфоцити, наприклад, антигенпредставляючі клітини і Т-лімфоцити. Термін "Fc область" стосується С-кінцевої ділянки IgG антитіла, зокрема, С-кінцевої ділянки важкого ланцюга(гів) зазначеного антитіла. Хоча межі Fc-області важкого ланцюга IgG можуть дещо варіювати, Fc-область типово визначається як відстань від амінокислотного залишка Cys226 до карбоксикінцевої ділянки важкого ланцюга(гів) IGg. Термін "Kabat-нумерація", за виключенням тих випадків, коли прийнята інша нумерація, визначається як нумерація залишків, наприклад, важкого 90846 22 ланцюга IgG антитіла, використовуючи EU індекс, як це описано у Kabat et at. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), спеціально включена тут як довідкова інформація. Термін "Fc рецептор" або "FcR" стосується рецептора, який зв'язується з Fc-областю антитіла. Типові Fc рецептори, які зв'язуються з Fc-областю антитіла (наприклад, IgG антитіла) включають, але не обмежені цим, рецептори FcyRI, FcyRIl, and FcyRIII підкласів, включаючи алельні варіанти і альтернативно сплайсовані форми цих рецепторів. Fc рецептори критично розглянуто в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et at., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas ei at., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Імунологічні і терапевтичні реактиви Імунологічні і терапевтичні реактиви винаходу включають або складаються з імуногенів· або антитіл, або функціональних чи антигензв'язуючих їх фрагментів, як тут визначено. Відомо, що основною структурною одиницею антитіла є тетрамер, утворений субодиницями. Кожен тетрамер утворений двома ідентичними парами поліпептидних ланцюгів, причому кожна пара має один легкий (близько 25kDa) і один важкий (близько 50-70kDa) ланцюг. Аміно-термінальна частина кожного ланцюга включає варіабельну область, яка складається з 100-110 і більше амінокислот, в основному відповідальних за розпізнавання антигена. Карбокси-термінальна частина кожного ланцюга визначає константну область, відповідальну в основному за ефекторну функцію. Легкі ланцюги класифікуються як каппа або лямбда і складаються приблизно з 230 залишків у довжину. Важкі ланцюги класифікуються як гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ), або епсилон (ε), і складаються приблизно з 450-600 залишків у довжину, і визначають ізотипи антитіла IgG, IgM, IgA, IgD і IgE, відповідно. Як важкі, так і легкі ланцюги упаковані в домени. Термін "домен" стосується глобулярної ділянки білка, наприклад, імуноглобуліну або антитіла; Імуноглобулін або домени антитіла включають, наприклад, 3 або 4 пептидних петлі, стабілізовані β-складчастою структурою і міжланцюговими дисульфідними зв'язками. Інтактні легкі ланцюги мають, наприклад, два домени (VL і CL), інтактні важкі ланцюги мають, наприклад, чотири або п'ять доменів (VH, СH1, СН2 і СН3). В межах легкого і важкого ланцюгів варіабельні і константні ділянки об'єднані за допомогою "J''ділянки, яка складається з 12 або більшого числа амінокислот, важкий ланцюг також включає "D''ділянку, яка складається з 10 і більше амінокислот (Див. Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989), Ch. 7, включена у повному обсязі як довідкова інформація для будьяких потреб). Варіабельна область кожної пари (важкий/легкий) ланцюгів утворює антитіло-зв'язуючий центр. Таким чином, інтактне антитіло має 2 зв'язуючих центри. За винятком гетеровалентних або біспецифічних антитіл, два зв'язуючих центри однакові. Всі ланцюги виявляють однакову загальну 23 структуру відносно консервативних каркасних ділянок (FR), до складу яких входять 3 гіперваріабельні ділянки, які ще називають ділянками, що визначають комплементарність до антигена, або CDR-ділянками. Природні ланцюги або ланцюги, отримані за допомогою методів рекомбінантних ДНК, можуть бути експресовані з використанням лідерної послідовності, яка видаляється протягом клітинного процесингу, для того щоб утворився зрілий ланцюг. Зрілий ланцюг може також мати рекомбінантне походження і мати неприродну лідерну послідовність, наприклад, для того щоб підсилювати секрецію або змінювати процесинг окремих ланцюгів, що становлять особливий інтерес. CDR-ділянки двох зрілих ланцюгів кожної пари приєднані за допомогою каркасних ділянок, що робить можливим зв'язування із специфічним епітопом. Від N-кінцевого до С-кінцевого як легкий, так і важкий ланцюги, включають домени FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. "FR4" називається також в імунології як D/J ділянка варіабельного важкого ланцюга і J ділянка варіабельного легкого ланцюга. Розподіл амінокислот у кожному домені відбувається відповідно до визначення Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of-Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991). Альтернативне структурне визначення було запропоноване Chothia et al., J. Моl. ВіоІ. 196:901 (1987); Nature 342:878 (1989); and J. Моl. Віоl 186:651 (1989) (в подальшому це джерело називається колективно як "Chothia et al." і включено у повному обсязі для використанні з будь-якою метою як довідкова інформація). Α. Αβ Антитіла Терапевтичні препарати винаходу включають антитіла, які специфічно зв'язуються з Αβ або іншими компонентами амілоїдних бляшок. Перевагу надають антитілам, які є моноклональними антитілами. Деякі з цих антитіл специфічно зв'язуються з агрегованою формою Αβ, не зв'язуючи при цьому розчинну форму. Деякі антитіла специфічно зв'язують розчинну форму, не зв'язуючись з агрегованою формою. Деякі антитіла зв'язуються як з агрегованою, так і з розчинною формами. Антитіла, які використовуються в терапевтичних методах, переважно мають інтактну константну область або, принаймні, достатню для того, щоб взаємодіяти з Fc-рецептором. Перевага надається антитілам, ефективним при стимуляції Fc-опосередкованого фагоцитозу Αβ в бляшках. Перевага віддається ізотипу IgG1 людини, тому що він має найвищу афінність ізотипів людини до FcR1 рецептора на фагоцитах (наприклад, на гістиоцитах мозку або мікрогліальних клітинах). IgG1 людини еквівалентний мишачому lgG2a, тобто останній з двох вищезгаданих є придатним для вивчення in vivo ефективності на тваринних (наприклад, мишачих) моделях хвороби Альцгеймера. Фрагменти біспецифічного Fab також можуть бути використані, у якого одне плече (спейсерна група) має специфічність до Αβ, а інше - до Fc рецептора. Бажані антитіла зв'язуються з Αβ із афінністю, більшою (або рівною) ніж, приблизно, 106, 107, 108,109, або 1010М-1 (включаючи проміжні значення афінності). 90846 24 Моноклональні антитіла зв'язуються із специфічним епітопом в межах Αβ, який може бути конформативним або неконформативним епітопом. Профілактична і терапевтична ефективність антитіл може бути досліджена за допомогою методик трансгенної тваринної моделі, описаних в Прикладах. Кращі моноклональні антитіла зв'язуються з епітопом в межах 1-10 залишків Αβ (з першим Nкінцевим залишком природного Αβ, позначеним 1), більш бажано, зв'язуються з епітопом в межах 3-7 залишків Αβ. В деяких методах використовуються множинні моноклональні антитіла, які мають зв'язуючу специфічність по відношенню до різних епітопів, наприклад, антитіло, специфічне до епітопу в межах залишків 3-7 Αβ, може бути введене одночасно з антитілом, специфічним до епітопу, який знаходиться поза 3-7 залишками Αβ. Такі антитіла можуть бути введені послідовно або одночасно. Також можуть бути використані антитіла до інших, ніж Αβ, амілоїдних компонентів (наприклад, призначені або одночасно призначені). Специфічність епітопа антитіла може бути визначена шляхом створення бібліотеки генів фага, в якій різні члени представляють різну підпослідовність Αβ. Потім бібліотека генів фага відбирається для членів, які специфічно зв'язуються із досліджуваним антитілом. Ізолюється родина послідовностей.· Здебільшого така родина включає звичайну капсидну послідовність, і варіюючі довжини фланківних послідовностей у різних членів. Найкоротша капсидна послідовність, що виявляє специфічне зв'язування антитіла, визначає межі епітопа антитіла. Антитіла можуть також бути досліджені за допомогою конкурентно-зв'язуючого аналізу на специфічність епітопа щодо антитіла, епітопи якого вже визначені. Наприклад, антитіла, які конкурують з 12А11 антитілами за зв'язування з Αβ, зв'язуються з тим же самим або подібним епітопом, що й 12А11, наприклад, тим, що розташований в межах 3-7 залишка Αβ. Серологічне тестування на специфічність зв'язування епітопа є корисною передумовою визначення терапевтичної ефективності. Наприклад, антитіло, яке зв'язується з епітопом в межах 1-7 залишків Αβ, ймовірно, буде ефективним при профілактиці і лікуванні хвороби Альцгеймера відповідно до методології даного винаходу. Антитіла, які специфічно зв'язуються з певним сегментом Αβ, якому слід надати перевагу, без зв'язування з іншими ділянками Αβ, мають низку переваг у порівнянні з моноклональними антитілами, які зв'язуються з іншими ділянками, або політональними сироватками до інтактного Αβ. Перш за все, при однаковому масовому дозуванні, доза антитіл, які специфічно зв'язуються з певними сегментами, містить вищу молярну частку антитіл, ефективних при виведенні амілоїдних бляшок. Подруге, антитіла, які специфічно зв'язуються з певними сегментами, можуть індукувати "очищуючу" відповідь проти амілоїдних відкладень, не індукуючи при цьому "очищуючу" відповідь проти інтактного АРР поліпептиду, зменшуючи у такий спосіб можливі побічні ефекти. 1. Утворення антитіл, які не належать людині 25 Даний винахід представляє антитіла, які не належать людині, наприклад, антитіла, що специфічні стосовно певних Αβ епітопів винаходу. Такі антитіла можуть бути використані при складанні різних терапевтичних композицій винаходу або, переважно, можуть забезпечити гіперваріабельні ділянки для утворення гуманізованих або химерних антитіл (докладно описані нижче). Виробництво моноклональних антитіл, що не належать людині, наприклад, антитіл мишей, морських свинок, приматів, кроликів або щурів, може супроводжуватись, наприклад, імунізацією тварин Αβ. Довший поліпептид, який включає Αβ або імуногенний фрагмент Αβ або антитіла, антиідіотипічного до антитіла до Αβ, також можуть бути використані. Див. Harlow & Lane, supra, включений як довідкова інформація для будь-яких цілей. Такий імуноген може бути отриманий з природного джерела шляхом синтезу поліпептиду або рекомбінантної експресії. Імуноген необов'язково має застосовуватись у поєднанні з білком-носієм, як описано нижче. Імуноген необов'язково має застосовуватись разом з ад'ювантом. Термін "ад'ювант" стосується сполуки, яка при застосуванні у поєднанні з антигеном підсилює імунну відповідь по відношенню до антигена, а при введенні поодинці не викликає імунної відповіді до антигена. Ад'юванти можуть підсилювати імунну відповідь за рахунок кількох механізмів, включаючи такі як рекрутмент лімфоцитів, стимуляція В і/або Τ клітин, стимуляція макрофагів. Можуть бути використані кілька типів ад'ювантів, як описано нижче. При імунізації лабораторних тварин бажано віддавати перевагу повному ад'юванту Фрейнда, за яким використовується неповний ад'ювант. Для отримання поліклональних антитіл здебільшого використовуються кролі або морські свинки. Типове приготування поліклональних антитіл, наприклад, для пасивного захисту, може бути виконане таким чином. 125 нетрансгенних мишей імунізуються введенням 100мг Αβ1-42, з використанням CFA/IFA ад'юванту, після чого через 4-5 місяців їх безболісно умертвляли. Кров імунізованих мишей збирали. IgG відокремлювали від інших компонентів крові. Антитіла, специфічні до імуногену, можуть частково бути очищені методом афінної хроматографії. Від однієї миші отримують в середньому 0.5-1мг імуноген-специфічних антитіл, внаслідок чого загальний вихід становить 60120мг. Для отримання моноклональних антитіл здебільшого використовуються миші. Моноклональні антитіла можуть бути отримані проти окремого фрагмента, шляхом введення мишам фрагмента або довшої форми Αβ, за рахунок отримання гібридом і скринінгом гібридом щодо наявності антитіла, яке специфічно зв'язує Αβ. Необов'язково, антитіла тестуються на зв'язування зі специфічною ділянкою або бажаним фрагментом Αβ без зв'язування з іншими фрагментами Αβ, які не перекриваються. Цей скринінг може бути здійснений шляхом визначення зв'язування антитіла з набором делеційних мутантів Αβ пептиду і з'ясовуючи, які делеційні мутанти зв'язуються з антитілом. Величина зв'язування може бути оцінена, наприклад, за 90846 26 допомогою методу імуноферментного налізу ELISA або вестерн-блоту. Найменший фрагмент, який виявляє специфічне зв'язування з антитілом, визначає епітоп антитіла. Альтернативно, специфічність епітопа може бути визначена за допомогою методу конкурентного аналізу, в якому тестантитіло і еталонне (референс-антитіло) конкурують за зв'язування Αβ. Якщо тестові і еталонні антитіла конкурують, тоді вони зв'язуються з тим самим епітопом, або достатньо близькими епітопами, так що зв'язування одного антитіла накладається на зв'язування іншого. Бажаним ізотипом для таких антитіл є мишачий ізотип lgG2a або рівноцінний ізотип іншого виду. Ізотип lgG2a миші рівноцінний ізотипу lgG1 людини (наприклад, IgG1 людини). 2. Химерні або гуманізовані антитіла Даний винахід також представляє химерні і/або гуманізовані антитіла (тобто, химерні і/або гуманізовані імуноглобуліни), специфічні до бета амілоїдного пептиду. Химерні і/або гуманізовані антитіла мають однакову або подібну зв'язуючу специфічність і афінність як і мишаче або інше антитіло, що не належить людині, і є стартовим матеріалом для конструювання химерного або гуманізованого антитіла. а. Отримання химерних антитіл Термін '"химерне антитіло" стосується антитіла, гени легкого і важкого ланцюгів якого були сконструйовані, як правило, з використанням методів генної інженерії, з сегментів гена імуноглобуліну, які належать різним видам. Наприклад, варіабельні (V) сегменти генів мишачого моноклонального антитіла можуть бути з'єднані з константними (С) сегментами генів антитіл людини, таких як lgG1 і lgG4. Кращим є ізотип IgG1 людини. Таким чином, типове химерне антитіло є гібридним білком, який складається з V- або антигензв'язуючого домену мишачого антитіла і С- або ефекторного домену антитіла людини. b. Отримання гуманізованих антитіл Термін "гуманізоване антитіло" стосується антитіла, яке включає, щонайменше, один ланцюг, який містить каркасні залишки варіабельної області, головним чином, з ланцюга антитіла людини (названого як акцепторний імуноглобулін або антитіло) і, щонайменше, одну ділянку, яка визначає комплементарність до антигену, головним чином, з мишачого антитіла (названого якдонорний імуноглобулін або антитіло). Див., Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989), US 5,530,101, US 5,585,089, US 5,693,761, US 5,693,762, Selick et al., WO 90/07861, і Winter, US 5,225,539 (включено як довідкова інформація для використання у повному обсязі з будь-якою метою). Константна область(і), якщо вона присутня, також, значною мірою або повністю походить з імуноглобуліну людини. Заміна каркасної частини варіабельного домену людини мишачими CDR-ділянками найбільш ймовірно призведе до збереження їх правильної просторової орієнтації, якщо каркасна частина варіабельного домену людини набуде тієї ж самої або подібної конформації, як варіабельна каркасна частина антитіла миші, з якої походять CDR 27 ділянки. Цього можна досягти за рахунок отримання варіабельних доменів людини з антитіл людини, послідовність каркасної ділянки яких виявляє високий ступінь ідентичності з послідовністю варіабельного домену каркасної частини мишачих антитіл, звідки було взято CDR-ділянки. Каркасна частина варіабельних областей важкого і легкого ланцюга може походити з тієї ж самої або іншої послідовності антитіла людини. Можуть бути використані природні послідовності антитіла людини або може бути використаний набір послідовностей з різних антитіл людини. Див. Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993) and Carter et al., WO 92/22653. При наявності ідентифікованих ділянок, що визначають комплементарність, донорного мишачого імуноглобуліну і прийнятного акцепторного імуноглобуліну людини, наступним кроком має бути визначення того, який з цих компонентів, якщо це взагалі можливо, повинен бути замінений, для того щоб оптимізувати властивості гуманізованого антитіла, яке буде отримано. Загалом, кількість замін амінокислотних залишків людини мишачими має бути зведена до мінімуму, тому що введення мишачих залишків збільшує ризик утворення антитіл, які будуть викликати у людини імунну відповідь проти мишачих антитіл (НАМА). Для того, щоб стежити за можливістю виникненням НАМАреакції, у окремого пацієнта або протягом клінічних випробувань можуть бути застосовані загальноприйняті в імунології методи вивчення імунної відповіді. У пацієнтів, щодо яких були застосовані гуманізовані антитіла, імуногенність може бути визначена на початку введення препарату, а також протягом застосування вказаного виду терапії. НАМА-реакція вимірюється, наприклад, визначенням антитіл до гуманізованого терапевтичного препарату, в зразках сироватки, взятих у пацієнта, за допомогою загальноприйнятих методів, включаючи технологію поверхневого резонансу плазмону (BIACORE) і/або твердофазного імуноферментного аналізу ELISA. Певні амінокислоти серед каркасних залишків варіабельної області людини відбираються для заміни, виходячи з їхньої потенційної здатності впливати на конформацію CDR і/або зв'язування антигена. Неприродне накладання CDR-ділянок миші на каркасну ділянку варіабельної області антитіла людини може призвести до певних структурних обмежень, які, якщо не буде здійснена заміна певних амінокислотних залишків, можуть призвести до втрати зв'язуючої афінності. Відбір амінокислотних залишків для заміни визначається, частково, за допомогою комп'ютерного моделювання. Комп'ютерне технічне і програмне забезпечення описується тут для отримання трьохвимірного зображення молекул імуноглобуліну. Загалом, створення моделей молекули розпочинається з використання розшифрованої структури для ланцюгів імуноглобуліну або їх доменів. Для того щоб змоделювати ланцюги, порівнюється амінокислотна послідовність цих ланцюгів з амінокислотною послідовністю ланцюгів або доменів, тривимірна структура яких вже розшифрована, 90846 28 ланцюги або домени, які виявляють найвищий ступінь подібності послідовностей, є відправною точкою при побудові моделі молекули. Для моделювання відбираються ланцюги або домени, ідентичність послідовностей яких становить, принаймні, 50%, краще ті, ідентичність послідовностей між якими становить, принаймні, 60%, 70%, 80%, 90% і більше. Стартова структура молекули модифікується, що дає змогу змоделювати відмінності між положенням дійсних амінокислот в ланцюгах чи доменах імуноглобуліну і положенням цих амінокислот в стартовій моделі. Модифіковані структури потім "вмонтовуються" в складний імуноглобулін. Врешті решт модель доопрацьовується з точки зору мінімізації енергії і перевірки, що всі атоми знаходяться в межах прийнятних відстаней один від одного, і що довжина зв'язків і кутів знаходяться в межах, допустимих з точки зору хімії. Відбір амінокислотних залишків для заміни може також бути визначений, частково, за рахунок вивчення особливостей амінокислот, що перебувають в певному місцеположенні, або емпіричного спостереження за впливом замін чи мутагенезу певних амінокислот. Наприклад, якщо відрізняється амінокислота в мишачому залишку каркасної частини варіабельної області і відібраний залишок каркасної ділянки варіабельної області людини, амінокислота в каркасній частині імуноглобуліну людини має бути, як правило, замінена рівноцінною амінокислотою каркасної області антитіла миші, якщо ця кислота задовольняє таким вимогам: (1) нековалентно прямо зв'язує антиген, (2) прилягає до CDR ділянки, (3) іншим чином взаємодіє з CDR-ділянкою (наприклад, знаходиться в межах приблизно 3-6 Å від CDR-ділянки, як було визначено за допомогою комп'ютерного моделювання), або (4) бере участь в утворенні поверхні контакту VL-VH. Залишки, які "нековалентно прямо зв'язують антиген", включають амінокислоти каркасних областей в таких положеннях, для яких існує висока ймовірність прямої взаємодії з амінокислотами антигена за рахунок виникнення сил хімічного зв'язку, наприклад, водневого зв'язку або сил Ван дер Ваальса, гідрофобної взаємодії тощо. CDR-ділянки і каркасні ділянки визначаються у відповідності до Kabat et al. або Chothia et al., supra. Якщо залишки каркасної частини, як визначено Kabat et al., supra, утворюють· залишки структурних петель, як визначено Chothia et al., supra, амінокислоти антитіла миші можуть бути відібрані для заміни в гуманізованому антитілі. Залишки, які "прилеглі до CDR-ділянки", включають амінокислотні залишки, що перебувають у положенні, безпосередньо прилеглому до однієї або кількох CDRділянок у первинній послідовності ланцюга гуманізованого імуноглобуліну, наприклад, в положенні, безпосередньо прилеглому до CDR-ділянки, як визначено Kabat, або CDR-ділянки, як визначено Chothia (Див., наприклад, Chothia and Lesk JMB 196:901 (1987)). Ці амінокислоти особливо ймовірно взаємодіють з амінокислотами в CDR-ділянках і, якщо їх обирають з акцепторного імуноглобуліну, 29 спотворюють донорні CDR-ділянки і зменшують афінність. Крім того, прилеглі амінокислоти можуть взаємодіяти безпосередньо з антигеном (Amit et al., Science, 233:747 (1986), включено тут як довідкова інформація), і, відбираючи ці амінокислоти у донора, може бути бажано, для того щоб утримувати всі зв'язки антигена, які забезпечують афінність у вихідному антитілі. Залишки, які "іншим чином взаємодіють з CDR-ділянкою" включають ті залишки, що, як визначено за допомогою аналізу вторинної структури, перебувають в просторовій орієнтації, яка дозволяє їм впливати на CDR-ділянку. В одному втіленні, залишки, які "іншим чином взаємодіють з CDR-ділянкою", ідентифікуються за допомогою аналізу тривимірної моделі донорного імуноглобуліну (наприклад, комп'ютерної моделі). Тривимірна модель, у випадку типового вихідного донорного антитіла, показує, що певні амінокислоти, які знаходяться поза CDR-ділянками, розташовані поряд з ними, внаслідок чого існує велика ймовірність взаємодії цих амінокислот з амінокислотами CDRділянок за рахунок виникнення водневого зв'язку, сил Ван дер Ваальса, гіброфобної взаємодії тощо. У цьому положенні можуть бути відібрані амінокислоти донорного імуноглобуліну, а не амінокислоти акцепторного імуноглобуліну. Амінокислоти, що відповідають цьому критерію, як правило, повинні мати атом бічного ланцюга, розташований на" відстані приблизно 3 Å від деяких атомів CDRділянок, і повинні включати атом, який міг би взаємодіяти з атомами CDR-ділянки внаслідок виникнення хімічних сил, які були перелічені вище. У випадку атомів, які можуть утворювати водневий зв'язок, відстань 3 Å - це та відстань, що вимірюється між їх ядрами, тоді як для атомів, що не утворюють водневого зв'язку, 3 Å - це відстань між поверхнями сил Ван дер Ваальса. Тому, в останньому випадку, ядра мають бути розташованими на відстані приблизно 6 Å (3 Å плюс сума радіусів сили Ван дер Ваальса), для того щоб атоми могли взаємодіяти. У багатьох випадках відстань між ядрами становить від 4 чи 5 до 6 Å. При визначенні того, чи може амінокислота взаємодіяти з CDR-ділянками, бажано не розглядати останніх & амінокислот важкого ланцюга CDR2, як частини CDR-ділянок, тому що із структурної точки зору ці 8 амінокислот поводять себе швидше як частина каркасної області. Амінокислоти, які здатні взаємодіяти з амінокислотами CDR-ділянок, можуть бути ідентифіковані у дещо інший спосіб. Площа поверхні кожної амінокислоти каркасу, доступна для розчинника, підраховується двома способами: (1) в інтактному антитілі, і (2) в гіпотетичній молекулі, яка включає антитіло, CDR-ділянки якого видалені. Істотна відмінність між цими значеннями, що становить біля 10 квадратних ангстремів або більше, свідчить, що доступ амінокислоти каркасної частини до розчинника, принаймні, частково, блокується CDRділянками, і, відповідно, та амінокислота вступає в контакт з CDR-ділянками. Площа поверхні амінокислоти, досяжна для розчинника, може бути обрахована, базуючись на тривимірній моделі антитіла, із використанням загальновідомих в 90846 30 імунології алгоритмів (наприклад, Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983) and Lee and Richards, J. Моl. Biol. 55:379 (1971), обидва джерела включені тут як довідкова інформація). Амінокислоти каркасу також можуть інколи взаємодіяти з CDR-ділянками опосередковано, впливаючи на конформацію іншої амінокислоти каркасної області, яка, в свою чергу, контактує з CDR-ділянками. Відомо, що амінокислоти в кількох положеннях в каркасній частині є важливими для визначення конформації CDR (наприклад, здатні взаємодіяти з CDR-ділянками) у багатьох антитіл (Chothia and Lesk, supra, Chothia et al., supra and Tramontane et al., J. Моl. Biol. 215:175 (1990), всі включені тут як довідкова інформація). Ці автори визначили консервативні залишки каркасної області, важливі для конформації CDR, за допомогою аналізу структури кількох антитіл, структуру яких було розшифровано. Проаналізовані антитіла потрапили до обмеженого числа структурних або "канонічних" класів, основаних на конформації CDR-ділянок. Консервативні каркасні залишки в межах представників канонічного класу було віднесено до "канонічних" залишків. Канонічні залишки включають залишки 2, 25, 29, 30, 33, 48, 64, 71, 90, 94 і 95 легкого ланцюга і залишки 24, 26, 29, 34, 54, 55, 71 і 94 важкого ланцюга. Додаткові залишки (наприклад, залишки, що визначають структуру CDR) можуть бути визначені за допомогою методології Martin and Thorton (1996) J. МоІ. Biol. 263:800. Крім того, відомо, що амінокислоти в положеннях 2, 48, 64 і 71 легкого ланцюга, а також 26-30, 71 і 94-важкого ланцюга (відлік за Kabat), здатні взаємодіяти з CDR-ділянками у багатьох антитіл. Амінокислоти в положеннях 35 легкого'ланцюга і 93 та 103 важкого ланцюга, очевидно, також взаємодіють з CDRділянками. Додаткові залишки, які можуть впливати на конформацію CDR-ділянок, можуть бути визначені за допомогою методології Foote and Winter (1992), J. Моl. Biol. 224:487. Такі залишки називаються залишками "Верньє" і є тими залишками каркасної області, які безпосередньо розташовані в основі (тобто, утворюють "платформу") CDRділянок. У всіх цих перелічених положеннях, для гуманізованого імуноглобуліну краще обирати донорну, а не акцепторну амінокислоту. З іншого боку,, певні залишки, здатні до взаємодії з CDRділянкою, такі як перші 5 амінокислот легкого ланцюга, інколи можуть бути обрані з акцепторного імуноглобуліну без втрати афінності у гуманізованому імуноглобуліні. Залишки, які "беруть участь в утворенні поверхні контакту VL-VH або "пакувальні залишки", включають ті залишки, які знаходяться на поверхні розділу між VL і VH, як визначено, наприклад, Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 (1985) або Chothia et al, supra. Загалом, рідкісні пакувальні залишки повинні бути використані в гуманізованому антитілі, якщо вони відрізняються від таких залишків в каркасній частині імуноглобуліну людини. Загалом, одна або кілька амінокислот, які задовольняють вказаним вище критеріям, можуть бути замінені. В деяких втіленнях, замінюються всі або більшість амінокислот, які задовольняють вка 31 заним вище критеріям. Інколи існує певна невизначеність щодо того, чи буде відповідати цим критеріям окрема амінокислота, і імуноглобуліни альтернативних варіантів будуть продукуватись, один з яких має цю заміну, а інший - ні. Імуноглобуліни альтернативних варіантів, отримані таким чином, можуть бути досліджені для визначення бажаної активності з використанням будь-якого з методів імунологічного аналізу, описаних у цьому винаході, внаслідок чого буде відібраний потрібний імуноглобулін. Як правило, CDR-ділянки гуманізованих антитіл значною мірою ідентичні, і, здебільшого, ідентичні відповідним CDR-ділянкам донорного антитіла. Однак, в деяких втіленнях, могло б бути бажаним модифікувати одну або кілька CDRділянок, для того щоб модифікувати антигензв'язуючу специфічність антитіла і/або зменшити імуногенність антитіла. Як правило, один або більше залишків CDR змінюються, для того щоб модифікувати зв'язування і досягти більш сприятливого on-rate зв'язування, і більш сприятливого off-rate зв'язування, або їх обох, так щоб була досягнена ідеалізована константа зв'язування. Використовуючи цю стратегію, можна отримати антитіло, що має ультрависоку зв'язуючу афінність, наприклад, 1010М-1 або більше. Коротше кажучи, донорна послідовність CDR-ділянки називається базовою послідовністю, в якій один або більше залишків пізніше замінюють. Методики розвитку афінності, як тут описано, можуть бути використані, для того щоб змінити CDR-ділянку(и) з подальшим скринінгом отриманих внаслідок цього зв'язуючих молекул з метою виявити бажані зміни у зв'язуванні. Цей метод також може бути використаний, для того щоб змінити донорну CDR-ділянку, як правило, мишачу CDR-ділянку, для того щоб зробити її менш імуногенною, так щоб мінімізувати потенційну реакцію утворення у людини антимишачих антитіл (НАМА) або взагалі її уникнути. Відповідно, оскільки CDR-ділянка(и) змінюються, може бути здійснений моніторинг та обчислення змін зв'язуючої афінності, а також імуногенності, для того щоб отримати антитіло, в якому найбільш оптимально поєднуються зв'язуюча активність та низька імуногенність (див., наприклад, U.S. Pat. No.6,656,467 and U.S. Pat. Pub. US20020164326A1). При іншому підході, для того щоб визначити внесок кожної окремої CDR-ділянки у зв'язування і/або імуногенність антитіла, CDR-ділянки аналізують за допомогою систематичної заміни кожної донорної CDR-ділянки відповідним "двійником" з антитіла людини. Після цього отриманий ряд гуманізованих антитіл вивчають з метою визначення антигенної афінності і потенційної імуногенності кожної CDR-ділянки. У такий спосіб визначають дві клінічно важливі властивості кандидата, що зв'язує молекули, тобто зв'язування антигена та низьку імуногенність. Якщо сироватки пацієнта проти відповідного мишачого або CDR-прищепленої (гуманізованої) форми антитіла є доступними, тоді може бути проведений скринінг повної панелі антитіл, що представляють систематичний обмін CDR-ділянками людини, для того щоб визначити 90846 32 антиідіотипічну відповідь пацієнтів проти кожної донорної CDR-ділянки (для отримання технічних деталей, див., напр., Iwashi et al., Моl. Immunol. 36:1079-91 (1999). Такий підхід дає змогу відрізнити необхідні донорні CDR-ділянки від донорних CDR-ділянок, що не є необхідними. Останні з вищезгаданих донорних CDR-ділянок можуть надалі бути замінені "двійниками" CDR-ділянок мишачого імуноглобуліну. Там, де необхідна CDR-ділянка не може бути замінена без неприпустимої втрати функції, ідентифікацію залишків CDR-ділянки, що визначають специфічність (SDR), здійснюють за допомогою, наприклад, сайт-спрямованого мутагенезу. У такий спосіб, CDR-ділянка може потім бути реконструйована, для того щоб залишити лише SDR-залишки, які походять з імуноглобуліну людини і/або є мінімально імуногенною в позиціях інших амінокислот, що залишились, в межах всієї CDR-ділянки. Такий підхід, при якому "пересаджується" лише частина донорної CDR-ділянки, називається також як "вкорочена" CD-пересадка (для отримання технічних деталей вищезгаданих методик, див., напр., Tamura et al., J. of Immunology 164(3): 1432-41. (2000); Gonzales et al, Моl Immunol 40:337-349 (2003); Kashmiri et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38:3-16 (2001); і De Pascalis et al., J. of Immunology 169(6):3076-84. (2002). Крім того, інколи можна здійснити заміну одного або кількох консервативних амінокислотних залишків в CDR-ділянках без істотної зміни зв'язуючої афінності гуманізованого імуноглобуліну, який отримується внаслідок цього. Під консервативними замінами мають на увазі такі поєднання, як гліцин, аланін; валін, ізолейцин, лейцин; аспарагінова кислота, глутамінова кислота; аспаратін, глутамін; серин, треонін; лізин, аргінін; а також фенілаланін, тирозин. Додатковими кандидатами для заміни є амінокислоти каркасної частини акцепторного імуноглобуліну людини, які є незвичайними або "рідкісними" для імуноглобуліну людини в цьому положенні. Ці амінокислоти можуть бути замінені амінокислотами, які займають аналогічне положення в донорному мишачому антитілі, або амінокислотами з аналогічних положень більш типових імуноглобулінів людини. Наприклад, заміна може вважатись бажаною, якщо амінокислота в каркасній області акцепторного імуноглобуліну людини є рідкісною для цього положення, і відповідна амінокислота в донорному імуноглобуліні є звичайною для цього положення у послідовностях імуноглобуліну людини; або якщо амінокислота в акцепторному імуноглобуліні є рідкісною для цього положення і відповідна амінокислота в донорному імуноглобуліні також є рідкісною у порівнянні з іншими послідовностями імуноглобуліну людини. При доборі залишків для зворотних мутацій, основуючись на їх вкладі в конформацію CDR, слід брати до уваги, чи є залишок рідкісним для послідовності каркасної області акцепторного імуноглобуліну людини. Наприклад, якщо зворотна мутація призводить до заміни залишка, який є рідкісним для послідовностей каркасної області акцепторного імуноглобуліну людини, гуманізоване антитіло можна дослідити для визначення активності з цим 33 залишком і без нього. Якщо зворотна мутація не є необхідною для активності, вона може бути виключена, для того щоб зменшити перестороги щодо імуногенності. Наприклад, зворотна мутація в наступних залишках може ввести залишок, який є рідкісним в послідовності каркасної області акцепторного імуноглобуліну людини; uk=v2(2.0%), L3 (0.4%), Т7 (1.8%), Q18 (0.2%), L83 (1.2%), I85 (2.9%), А100 (0.3%) and L106 (1.1%); і vh=Т3 (2.0%), K5 (1.8%), I11 (0.2%), S23 (1.5%), F24 (1.5%), S41 (2.3%), K71 (2.4%), R75 (1.4%), І82 (1.4%), D83 (2.2%) and L109 (0.8%). Ці критерії допомагають впевнитись, що нетипова амінокислота в каркасній області імуноглобуліну людини не дезінтегрує структуру антитіла. Крім того, внаслідок заміни нетипової акцепторної амінокислоти людини амінокислотою від донорного антитіла, яка може виявитись типовою для антитіл людини, гуманізоване антитіло може стати менш імуногенним. Термін "рідкісний", як тут використовується, вказує на те, що амінокислота виявляється в цьому положенні менше, ніж, приблизно, в 20%, переважно, менше, ніж біля 10%, ще краще, менше, ніж в 5%, навіть ще краще, якщо менше, ніж в приблизно 3%, навіть ще краще, якщо менше, ніж в 2% і навіть ще краще, якщо в 1% послідовностей в репрезентативній вибірці послідовностей, а термін "поширена", як тут використовується, вказує, що амінокислота виявляється в більше, ніж 25%, але, як правило, більше, ніж біля 50% послідовностей в репрезентативній вибірці. Крім того, всі послідовності варіабельних областей легкого і важкого ланцюгів імуноглобуліну людини відповідно згруповані в "підгрупи" послідовностей, які особливо гомологічні одна одній і мають ті ж самі амінокислоти в певних критичних положеннях (Kabat et al., supra). Наприклад, при вирішенні питання, чи є амінокислота в акцепторній послідовності антитіла людини "рідкісною" чи "поширеною", часто бажано розглядати лише послідовності варіабельної області людини, а при вирішенні питання, чи є амінокислота в послідовності мишачого антитіла "рідкісною" чи "поширеною", - лише послідовності варіабельної області мишачого антитіла. Додатковими кандидатами для заміни є амінокислоти каркасної області акцепторного імуноглобуліну людини, які були б ідентифіковані як частина CDR-ділянки відповідно до альтернативного визначення, запропонованого Chothia et al., supra. Додатковими кандидатами для заміни є амінокислоти каркасної області акцепторного імуноглобуліну людини, які були б ідентифіковані як частина CDR-ділянки відповідно до АbМ і/або контактних визначень. Додатковими кандидатами для заміни є залишки каркасної області акцепторного антитіла, які відповідають рідкісним або нетиповим залишкам каркасної області донорного антитіла. Рідкісні або нетипові залишки донорної каркасної області - це ті залишки, які є рідкісними або нетиповими (як тут визначено) в цьому положенні для мишачих антитіл. Для антитіл миші, підгрупа може бути визначена відповідно до Kabat і положення залишків визначається, яке відрізняється від консенсусної послідовності. Ці специфічні донорні відмінності 90846 34 можуть вказувати на соматичні мутації в мишачій послідовності, які підвищують активність. Нетипові залишки, які, відповідно до прогнозування, здатні впливати на зв'язування (напр., пакувальні канонічні і/або залишки Верньє), зберігаються, тоді як залишки, які, відповідно до прогнозування, не мають істотного впливу на зв'язування, можуть бути замінені. Рідкісні залишки в межах 12А11 UK послідовності включають І85 (3.6%). Рідкісні залишки в межах 12А11 vh послідовності включають Т3 (1.0%), 111 (1.7%), L12 (1.7%), S41 (2.8%), D83 (1.8%) and A85 (1.8%). Додатковими кандидатами для заміни є залишки негаметної лінії, які зустрічаються в каркасній області акцепторного антитіла. Наприклад, якщо ланцюг акцепторного антитіла (тобто, ланцюг антитіла людини, який виявляє істотну гомологічність з послідовністю ланцюга донорного антитіла) порівнюється з ланцюгом гаметного антитіла (яке теж виявляє значну гомологічність ланцюгу донорного антитіла), залишки каркасної області акцепторного ланцюга, які не відповідають залишкам каркасної області ланцюга гаметної лінії, можуть бути заміщені відповідними залишками з гаметної послідовності. На відміну від замін специфічних амінокислот, які обговорювались вище, каркасні області гуманізованих імуноглобулінів, як правило, істотно ідентичні, і, більш того, ідентичні каркасним областям антитіл людини, з яких вони походять. Звичайно, багато амінокислот в каркасній області не мають значного прямого впливу або взагалі не впливають на специфічність або афінність антитіла. Таким чином, багато окремих консервативних замін залишків каркасної частини можуть бути дозволені без відчутного впливу на специфічність або афінність гуманізованого імуноглобуліну, отриманого внаслідок цього. Таким чином, в одному втіленні каркасна ділянка варіабельної області гуманізованого імуноглобуліну виявляє, принаймні, 85% гомологічності послідовності каркасної ділянки варіабельної області імуноглобуліну людини або співпадіння цих послідовностей. В іншому втіленні, каркасна частина варіабельної області гуманізованого імуноглобуліну виявляє, принаймні, 90%, краще 95%, ще краще 96%, 97%, 98% або 99% гомологічності послідовності каркасу варіабельної області імуноглобуліну людини або співпадіння цих послідовностей. Однак, загалом, такі заміни небажані. В типових втіленнях гуманізовані антитіла винаходу виявляють специфічну зв'язуючу афінність щодо антигену, принаймні, 107, 108, 109 або 1010М1 . В інших втіленнях, антитіла винаходу можуть мати зв'язуючу афінність, принаймні, 1010, 1011 або 1012М-1. Як правило, верхня межа зв'язуючої афінності гуманізованих антитіл з антигеном в три, чотири або п'ять разів перевищує афінність донорного імуноглобуліну. Часто нижня межа зв'язуючої афінності також в три, чотири або-п'ять разів перевищує нижню межу афінності донорного імуноглобуліну. В альтернативному випадку, афінність може бути співставлена із зв'язуючою афінністю гуманізованого антитіла, в якому відсутні будь-які заміни (наприклад, антитіло, яке має донорні CDR 35 ділянки і акцепторні FR-ділянки, але жодних замін в каркасній частині). В цьому випадку, зв'язування оптимізованого антитіла (яке включає заміни) переважно, принаймні, в два-три рази більше, або в три-чотири рази більше у порівнянні з антитілом, в якому заміни відсутні. Для того щоб робити порівняння, активність різних антитіл може бути визначена, наприклад, за допомогою BIACORE (тобто, поверхневого резонансу плазмону з використанням немічених реактивів) або методу конкурентного зв'язування. с. Виготовлення гуманізованих 12А11 Антитіл Краще втілення даного винаходу представляє гуманізоване антитіло до N-кінцевої ділянки Αβ, зокрема, для використання в терапевтичнихі/або діагностичних методах, описаних тут. Особливо бажаним стартовим матеріалом для виготовлення гуманізованих антитіл є моноклональне антитіло 12А11. 12А11 є специфічним до Ν-кінцевої ділянки Αβ, що, як було показано, (1) має високу авідність до агрегованого Αβ1-42, (2) має здатність зв'язувати розчинний Αβ, і (3) є проміжною ланкою фагоцитозу (наприклад, індукує фагоцитоз) амілоїдних бляшок (див. Приклад І). Ефективність антитіла 12А11 in vivo описується в Прикладі II. Клонування і секвенування кДНК, яка кодує варіабельні області важкого і легкого ланцюгів антитіла 12А11, наводяться в Прикладі III. Придатна послідовність акцепторного антитіла людини визначається за допомогою комп'ютерних порівнянь амінокислотних послідовностей варіабельних областей миші з послідовностями відомих антитіл людини. Порівняння здійснюється окремо для важкого і легкого ланцюгів, однак на основі принципів, подібних у кожному випадку. Зокрема, варіабельні домени антитіл людини, каркасна область яких виявляє високий ступінь гг ідентичності послідовності з VL і VH каркасними- областями миші, були визначені за допомогою баз даних Kabat Database або IgG Protein Sequence Database з використанням програми NCBI IgG BLAST (доступна для широкого загалу через Інтернет сервер Національних Інститутів Здоров'я NCBI) з відповідними послідовностями каркасної області миші. В одному втіленні, були відібрані акцепторні послідовності, які були гомологічними донорним послідовностям миші, наприклад, послідовностям каркасної області (FR), більш, ніж на 50%. Бажано віддати перевагу послідовностям акцепторного антитіла, які виявляють 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% або більше гомологічності. Комп'ютерне порівняння 12А11 показало, що легкий ланцюг 12А11 (мишача підгрупа II) виявляє найвищу ідентичність послідовності до легких ланцюгів людини підтипу, каппа II, і що важкі ланцюги 12А11 (мишача підгрупа 1b) виявляють найвищу ідентичність до важких ланцюгів людини підтипу II, як·визначено Kabat et al., supra. Каркасні ділянки важкого і легкого ланцюгів можуть походити від антитіл людини цих підтипів, або від консенсусних послідовностей таких підтипів. В першій спробі гуманізації каркасні ділянки варіабельної області легкого ланцюга походили з антитіл людини підгрупи II. Виходячи з попередніх експериментів, проведених для того, щоб досягти високих рівнів 90846 36 експресії гуманізованих антитіл, які мають каркасні ділянки варіабельних областей важкого ланцюга антитіл, що походять з підгрупи II антитіл людини, було встановлено, що рівні експресії таких антитіл інколи були низькими. Відповідно, базуючись на доказах, наведених у Saldanha et al. (1999) Моl Immunol. 36:709-19, були обрані каркасні ділянки з підгрупи III антитіл людини, а не з підгрупи II антитіл людини. Антитіло підгрупи II антитіл людини K64(AIMS4) (accession No.BAC01733) було ідентифіковане з основної бази даних NCBI, яке має істотну ідентичність послідовності з варіабельними областями легкого ланцюга 12А11. Антитіло М72 підгрупи III людини (accession No.AAA69734) було ідентифіковане з основної бази даних NCBI, яке має істотну ідентичність послідовності з варіабельними областями важкого ланцюга 12А11 (див. також Schroeder and Wang (1990) Ргос. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 872: 6146-6150. Альтернативні акцепторні послідовності легкого ланцюга включають, наприклад, PDB Accession No.1KFA (gi24158782), PDB Accession No.1KFA (gі24158784), EMBL Accession No.CAE75574.1 (gi38522587), EMBL Accession No.CAE75575.1 (gi38522590), EMBL Accession No.CAE84952.1 (gi39838891), DJB Accession No.BAC01734.1 (gi21669419), DJB Accession No.BAC01730.1 (gi21669411), PIR Accession No.S40312 (gi481978), EMBL Accession No.CAA51090.1 (gi3980118), GenBank Accession No.AAH63599.1 (gi39794308), PIR Accession No.S22902 (gі106540), PIR Accession No.S42611 (gi631215), EMBL Accession No.CAA38072.1 (gi433890), GenBank Accession No.AAD00856.1 (gi4100384), EMBL Accession No.CAA39072.1 (gi34000), PIR Accession No.S23230 (gi2S4256), DBJ Accession No.BAC01599.1 (gi21669149), DBJ Accession No.BAC01729.1 (gi21669409), DBJ Accession No.BAC01562.1 (gi21669075), EMBL Accession No.CAA85590.1 (gi587338), GenBank Accession No.AAQ99243.1 (gi37694665), GenBank Accession No.AAK94811.1 (gi18025604), EMBL Accession No.CAB51297.1 (gi5578794), DBJ Accession No.BAC01740.1 (gi21669431), and DBJ Accession No.BAC01733.1 (gi21669417). Альтернативні акцепторні послідовності важкого ланцюга включають, наприклад, GenBank Accession No.AAB35009.1 (gi1041885), DBJ Accession No.BAC01904.1 (gi21669789), GenBank Accession No.AAD53816.1 (gi5834100), Gen Bank Accession No.AAS86081.1 (gi46254223), DBJ Accession No.BAC01462.1 (gi21668870), GenBank Accession No.AAC18191.1 (gi3170773), DBJ Accession No.BAC02266.1 (gi21670513), GenBank Accession No.AAD56254.1 (gi5921589), GenBank Accession No.AAD53807.1 (gi5834082), DBJ Accession No.BAC02260.1 (gi21670501), GenBank Accession No.AAC18166.1 (gi3170723), EMBL Accession No.CAA49495.1 (gi33085), PIR Accession No.S31513 (gi345903), GenBank Accession No.AAS86079.1 (gi46254219), DBJ Accession No.BAC01917.1 (gi21669815), DBJ Accession No.BAC01912.1 (gi21669805), GenBank Accession No.AAC18283.1 (gi3170961), DBJ Accession No.BAC01903 (gi21669787), DBJ 37 Accession No.BAC01887.1 (gi21669755), DBJ Accession No.BAC02259.1 (gi21370499), DBJ Accession No.BAC01913.1 (gi21669807), DBJ Accession No.BAC01910.1 (gi21669801), DJB Accession No.BAC02267.1 (gi21670515), GenBank Accession No.AAC18306.1 (gi3171011), GenBank Accession No.AAD53817.1 (gi5834102), PIR Accession No.E36005 (gi106423), EMBL CAB37129.1 (gi4456494) and GenBank AAA68892.1 (gi186190). В типових втіленнях, гуманізовані антитіла за винаходом включають CDR-ділянки з 12А11 і FRділянки з акцепторної послідовності, наведеної supra. Залишки з каркасних ділянок, важливі для конформації CDR-ділянки і/або активності, як тут описано, обираються для зворотної мутації (якщо існують відмінності між донорною і акцепторною послідовностями). Потім обираються залишки для заміни, як описано далі. Коли амінокислота відрізняється між варіабельною областю каркасної частини 12А11 і аналогічною зоною варіабельної області каркасної частини антитіла людини, як правило, здійснюють заміну амінокислоти каркасної частини антитіла людини на ідентичну амінокислоту миші, якщо є підстави очікувати, що ця амінокислота: (1) нековалентно безпосередньо зв'язує антиген, (2) прилягає до CDR ділянки, є частиною CDRділянки при альтернативному визначенні, запропонованому Chothia et al., supra, або у інший спосіб взаємодіє з CDR-ділянкою (наприклад, знаходиться на відстані приблизно 3Å А від CDRділянки), або (3) бере участь в утворенні поверхні контакту VL-VH. Структурний аналіз варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів антитіла 12А11 і гуманізація антитіла 12А11 описано на Прикладі V. Якщо стисло, то були вивчені тривимірні моделі для структур 1KTR легкого ланцюга мишачих антитіл розшифрованої структури і 1JRH та 1ETZ - для важкого ланцюга. Альтернативні тривимірні моделі, які можуть бути досліджені щодо ідентифікації залишків, важливих для конформації CDR (наприклад, залишків Верньє), включають PDB Accession No.2JEL (gi3212688), PDB Accession No.1TET (gi494639), PDB Accession No.IJP5 (дії 6975307), PDB Accession No.1CBV (gi493917), PDB Accession No.2PCP (gi4388943), PDB Accession No.1191 (gi2050118), PDB Accession No.1CLZ (gi1827926), PDB Accession No.1FL6 (gi17942615) і PDB Accession No.1KEL (gi1942968) для легкого ланцюга і PDB 1GGI (gi442938), PDB Accession No.1GGB (gi442934), PDB Accession No.1N5Y (gi28373913), PDB Accession No.2HMI (gi3891S21), PDB Accession No.1FDL (gi229915), PDB Accession No.1KIP (дії942788), PDB Accession No.1KIQ (дії942791) і PDB Accession No.1VFA (gi576325) для важкого ланцюга. Інформація щодо тривимірної структури антитіл, описаних тут, є доступною для широкого загалу, наприклад, завдяки базі даних дослідної лабораторії структурної біоінформатики білка (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' 90846 38 Protein Data Bank (PDB). PDV і є вільно досяжною via світову мережу Інтернет і описана Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research, 28:235. Вивчення розшифрованих тривимірних структур дозволяє ідентифікувати залишки, які взаємодіють з CDR в 12А11. Альтернативно, тривимірні моделі 12А11 VH і VL ланцюгів можуть бути створені за допомогою моделюючого програмного забезпечення. Якщо стисло, то створюється тривимірна модель, виходячи із структури важкого і легкого ланцюгів найближчого розшифрованого антитіла миші. З цією метою, 1KTR може бути використаний як матриця для моделювання легкого ланцюга 12А11, а 1ETZ і 1JRH використовуються як матриці для моделювання важкого ланцюга. Далі модель вдосконалюється шляхом кроків, спрямованих на мінімізацію енергії, для того щоб зменшити ймовірність несприятливих атомних контактів і щоб оптимізувати електростатичну взаємодію, а також взаємодію за рахунок сил Ван дер Ваальса. Додатковий аналіз тривимірної структури і/або моделювання можуть бути виконані за допомогою 2JEL (2.5А) і/або 1ТЕТ (2.3А) для легкого ланцюга і 1GGI (2.8А) для важкого ланцюга (або інших антитіл, наведених supra), основуючись на подібності між цими розшифрованими структурами мишачого імуноглобуліну і відповідними ланцюгами 12А11. Комп'ютерна модель структури 12А11 може, таким чином, слугувати відправною точкою для того, щоб передбачити тривимірну структуру антитіла, яке включає ділянки 12А11, що визначають комплементарність до антигену (гіперваріабельні ділянки), замінені в структурах каркасної ділянки людини. Можуть бути сконструйовані додаткові моделі, які представляють структуру після здійснення подальших амінокислотних замін. Загалом, бажано здійснити заміну однієї, більшості або всіх амінокислот, які відповідають критеріям, що були зазначені вище. Відповідно, гуманізовані антитіла даного винаходу завжди будуть містити заміну залишка каркасної ділянки легкого ланцюга людини відповідним залишком 12А11, щонайменше, в 1, 2, 3 або більше обраних положеннях. Гуманізовані антитіла також здебільшого містять заміну залишка каркасної ділянки важкого ланцюга людини відповідним залишком 12А11, щонайменше, в 1,2, 3 або більше обраних положеннях. Інколи, однак, існує певна невизначеність щодо того, чи буде відповідати цим критеріям конкретна амінокислота, і чи будуть продукуватись імуноглобуліни альтернативних варіантів, один з яких має цю заміну, а інший - ні. За умови, що мишачі залишки були б введені замість залишків, які є рідкісними в імуноглобулінах людини у певному положенні, бажано б було дослідити активність антитіла, що включає певну заміну або ні. Якщо активність (наприклад, афінність і/або специфічність зв'язування) антитіл, які включають заміну, і тих, що не включають замін, приблизно однакова, може бути надана перевага антитілу, в яке заміни не вводились, оскільки у цьому випадку можна очікувати зменшення НАМА відповіді, як тут описано. 39 Іншими кандидатами для заміни є амінокислоти каркасної області акцепторного імуноглобуліну людини, які ε нетиповими для імуноглобуліну людини в цьому положенні. Ці амінокислоти можуть бути замінені амінокислотами, що займають ідентичне положення в більш типових імуноглобулінах людини. Альтернативно, амінокислоти в ідентичних положеннях в 12А11 миші можуть бути введені в каркасні області імуноглобуліну людини, якщо такі амінокислоти типові для імуноглобуліну людини в ідентичному положенні. Іншими кандидатами для заміни є залишки негаметної лінії, які зустрічаються в каркасній області. Шляхом комп'ютерного порівняння 12А11 з відомими гаметними послідовностями, можуть бути ідентифіковані гаметні послідовності з найвищим ступенем ідентичності послідовності важкого чи легкого ланцюга. Порівняння первинної структури каркасної області і гаметної послідовності дасть змогу виявити, які залишки можуть бути обрані для заміни відповідними амінокислотами гаметної послідовності. Залишки, які не відповідають між каркасною частиною відібраного акцепторного легкого ланцюга і однією з цих гаметних послідовностей, 90846 40 можуть бути відібрані для заміни відповідними залишками гаметної послідовності. Рідкісні мишачі залишки визначаються шляхом порівняння послідовностей донорних VL і/або VH з послідовностями інших членів підгрупи, до яких послідовності донорних VL і/або VH належать (відповідно Kabat), і визначення положення залишків, які відрізняються від консенсусної послідовності. Ці донорські специфічні відмінності можуть вказувати на соматичні мутації, які підвищують активність. Нетипові або рідкісні залишки, розташовані поряд із зв'язуючим центром, очевидно, можуть контактувати з антигеном, у зв'язку з чим бажано зберегти ці мишачі залишки. Однак, якщо нетиповий мишачий залишок не має істотного значення для зв'язування, слід надати перевагу використанню відповідного акцепторного залишка, оскільки мишачий залишок може створювати імуногенні неоепітопи в гуманізованому антитілі. За умови, коли нетиповий залишок в донорній послідовності дійсно є поширеним залишком у відповідній акцепторній послідовності, цілком очевидно, що бажаним є акцепторний залишок. Таблиця 1А узагальнює результати аналізу послідовності 12А11 VH і VL областей. 41 Наведено гаметні послідовності, які можуть бути використані при замінах амінокислот. Інформація про тривимірну структуру антитіла, наведена тут, є доступною для широкого загалу, наприклад, завдяки базі даних дослідної лабораторії структурної біоінформатики білка (PDB). PDB є вільно доступною via світову мережу Інтернет і описана Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research, p.235-242. Послідовності генів гаметної лінії, згадані тут, є загально відомими, наприклад, завдяки базі даних Національного Центру Біотехнологічної Інформації (NCBI) стосовно послідовностей в колекціях Igh, Ig каппа і Ig лямбда гаметної лінії V генів (як відділення Національної Бібліотеки Медицини (NLM) в Національному Інституті Здоров'я (NIH)). Дослідження гомології "генам гаметної лінії Іg" бази даних NCBI забезпечується програмою IgG BLAST™. У типовому втіленні, гуманізоване антитіло даного винаходу складається (і) з легкого ланцюга, який включає варіабельний домен, що містить 90846 42 CDR-ділянки 12А11 VL миші і каркасну частину акцепторного імуноглобуліну людини, каркасна частина має нуль, один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять і більше залишків, заміщених відповідним залишком12А11 і (іі) важкий ланцюг, що містить CDR-ділянки 12А11 VH і каркасну частину акцепторного імуноглобуліну людини, каркасна частина має щонайменше один, краще два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім або дев'ять або більше залишків, заміщених відповідним залишком 12А11, і, необов'язково, щонайменше, одним, краще двома або трьома залишками, заміщеними відповідним залишком гаметної послідовності людини. В іншому типовому втіленні, гуманізоване антитіло даного винаходу включає (і) легкий ланцюг, що складається з варіабельного домену, який включає мишачі 12А11 VL CDR-ділянки і акцепторну каркасну ділянку людини, каркасна ділянка має, щонайменше, один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або більше залишків, що є 43 результатом зворотної мутації (тобто, заміщені відповідним залишком 12А11), де зворотна мутація(ції) відбувається в канонічному, пакувальному залишку і/або залишку Верньє, а (іі) важкий ланцюг включає 12А11 VH CDR-ділянки і каркасну ділянку акцепторного імуноглобуліну людини, каркасна частина несе, щонайменше, один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять і більше залишків, які отримані внаслідок зворотної мутації(й) і є канонічними пакувальними і/або залишками Верньє. В певних втіленнях, зворотні мутації відбуваються лише за місцем пакувальних і/або канонічних залишків або початково є канонічними і/або пакувальними залишками (наприклад, лише 1 або 2 залишки Верньє, що відрізняються між донорною і акцепторної послідовністю, отримані внаслідок зворотної мутації). В інших втіленнях, гуманізовані антитіла включають найменше число зворотних мутацій, зберігаючи при цьому зв'язуючу афінність, яку можна співставити з афінністю донорного антитіла (або його химерної версії). Для того щоб досягти таких версій, різні комбінації зворотних мутацій можуть бути виключені, а отримані в результаті антитіла досліджені на ефективність (наприклад, зв'язуючу афінність). Наприклад, зворотні мутації (наприк., 1, 2, 3, або 4 зворотні мутації) в положенні залишків Верньє можуть бути виключені або зворотні мутації в комбінаціях пакувальних залишків та залишків Верньє, Верньє і канонічних або пакувальних і канонічних залишків можуть бути виключені. В іншому втіленні, гуманізоване антитіло даного винаходу має структурні особливості, як тут описано, і, крім того, виявляє, принаймні, один (краще два, три, чотири або всі) з наступних видів активності: (1) зв'язує розчинний Αβ; (2) зв'язує агрегований Αβ1-42 (наприклад, як визначено за допомогою імуноферментного аналізу ELISA); (3) перехоплює розчинний Αβ; 4) зв'язує Αβ в бляшках (наприклад, забарвлювання зрізів бляшок мозкової тканини пацієнтів з хворобою Альцгеймера і/або зрізів мозку мишей PDAPP-лінії); (5) зв'язує Αβ з афінністю, яка не менше, ніж в 2-3 рази нижча у порівнянні з химерним 12А11 (наприклад, 12А11, яке несе послідовності варіабельної області миші і послідовності константної області людини); (6) є посередником фагоцитозу Αβ (наприклад, при дослідженні фагоцитозу ex vivo, як тут описано); і (7) має здатність долати гематоенцефалічний бар'єр (наприклад, виявляє короткий час локалізації в мозку, наприклад, в PDAPP тваринній моделі, як тут описано). В іншому втіленні, гуманізоване антитіло даного винаходу має такі структурні особливості, як тут описано, що певною мірою зв'язує Αβ або зв'язує з афінністю, здатною викликати in vivo, принаймні, один з наступних ефектів: (1) зменшувати накопичення Αβ бляшок; (2) запобігати утворенню бляшок; (3) знижувати рівень розчинного Αβ; (4) зменшувати патологічні зміни нервової тканини, пов'язані з амілоїдогенним розладом; (5) зменшувати або покращувати, принаймні, один з фізіологічних симптомів, пов'язаних з амілоїдогенним розладом; і/або (6) покращувати когнітивні функції. 90846 44 В іншому втіленні, гуманізоване антитіло даного винаходу має структурні особливості, як тут описано, і специфічно зв'язується з епітопом, який включає 3-7 залишки Αβ. В ще одному втіленні, гуманізоване антитіло даного винаходу має структурні особливості, як тут описано, завдяки чому зв'язується з Nкінцевим епітопом Αβ (наприклад, зв'язується з епітопом в межах 3-7 амінокислот Αβ), і здатне зменшувати (1) рівні Αβ пептиду; (2) накопичення Αβ бляшок; і (3) невритичні зміни або дистрофію нервової тканини, пов'язану з амілоїдогенним розладом. Види активності, описані вище, можуть бути визначені за допомогою одного з численних методів, описаних тут або в імунології (наприклад, дослідження зв'язування, дослідження фагоцитозу тощо). Активність антитіла може бути досліджена або за допомогою аналізу in vivo (наприклад, використовуючи мічені компоненти і/або методики візуалізації), або в культурі in vitro (наприклад, використовуючи зразки або препарати, що були взяті у суб'єкта). Активність може бути досліджена прямо або опосередковано. В певних кращих втіленнях аналізуються неврологічні розлади (наприклад, амілоїдні відкладення, невритичні відкладення, тощо). Такі розлади можуть бути досліджені на живих об'єктах (наприклад, на тваринній моделі хвороби Альцгеймера, або у людей, наприклад, щодо яких було застосовано імунотерапію), використовуючи методики безболісного визначення. Альтернативно, такі розлади можуть бути досліджені у суб'єктів після смерті. Дослідження таких розладів на тваринних моделях і/або на людях після смерті корисне для оцінки ефективності різних препаратів (наприклад, гуманізованих антитіл), які повинні використовуватись у подібних імунотерапевтичних застосуваннях. В інших кращих втіленнях, поведінка або неврологічні параметри можуть оцінюватись як показники вищезгаданої невропатологічної активності або розладів. 3.Виготовлення варіабельних областей При наявності концептуально підібраних CDRділянки і каркасної частини гуманізованих імуноглобулінів, існує ціла низка методів для отримання таких імуноглобулінів. Загалом, одна або кілька ділянок, що визначають комплементарність до антигену (CDR) важкого і/або легкого ланцюга мишачого антитіла, можуть бути гуманізовані, наприклад, шляхом введення в контекст однієї або кількох каркасних областей людини, за допомогою праймер-опосередкованої полімеразної ланцюгової реакції (PCR). Коротше, праймери призначені для того, щоб гібридизуватись з CDRділянкою(ами)-мішенями мишачого антитіла, які також включають послідовності, що перекриваються, і можуть бути гібридизовані з каркасними ділянками антитіла людини. Таким чином, за відповідних умов, праймери можуть ампліфікувати мишачі CDR-ділянки з матриці нуклеїнової кислоти мишачого антитіла, які можна додавати до ампліфікованого фрагмента матриці каркасної послідовності антитіла людини. Аналогічним чином, праймери можуть бути призначені, для того щоб 45 гібридизувати з каркасними ділянками-мішенями антитіла людини, де PCR-реакція за допомогою цих праймерів призводить до ампліфікації каркасної ділянки(нок) антитіла людини. Якщо після цього кожен продукт ампліфікації денатурується, комбінується і гібридизується з іншими продуктами, мишачі CDR-ділянки, які мають каркасну послідовність людини, що перекривається з ампліфікованою каркасною послідовністю людини, можуть бути генетично зв'язані. Відповідно, в одній або більшій кількості таких реакцій, одна або більше мишачих CDR-ділянок можуть бути генетично зв'язані з введеними каркасними областями людини. В деяких втіленнях, праймери можуть також включати бажані послідовності розпізнавання рестриктази, для того щоб сприяти введенню за допомогою методів генетичної інженерії послідовностей, ампліфікованих за допомогою PCR-реакції в більший генетичний сегмент, наприклад, варіабельний сегмент легкого або важкого ланцюга, важкий ланцюг або вектор. Крім того, праймери, які використовуються для того щоб ампліфікувати або мишачі CDR-ділянки, або каркасні області людини, можуть мати бажані помилкові спарювання основ, внаслідок чого різні кодони вводяться в мишачі CDR-ділянки або каркасні області людини. Типові помилкові спарювання (основ) вводять зміни в каркасних ділянках людини, які зберігають або покращують структурну орієнтацію мишачої CDRділянки і, таким чином, її зв'язуючу афінність, як тут описано. Слід розуміти, що вищевказаний підхід може бути використаний для того, щоб ввести одну, дві або всі три мишачі CDR-ділянки в контекст каркасних областей людини, які вводяться. Методи для ампліфікації і зшивання різних послідовностей за допомогою праймер-опосередкованої PCR-реакції описані, наприклад, у Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); DNA Cloning, Vols. 1 and 2, (D.N. Glover, Ed. 1985); PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999) (Editor); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992). Завдяки виродженості генетичного коду, численна кількість послідовностей нуклеїнової кислоти кодуватиме кожну амінокислотну послідовність імуноглобуліну. Бажані послідовності нуклеїнової кислоти можуть бути отримані de novo за допомогою твердофазного синтезу ДНК або шляхом PCRмутагенезу заздалегідь виготовленого варіанту бажаного полінуклеотиду. Мутагенез з використанням олігонуклеотидів - це той метод, якому слід надати перевагу при здійсненні замін, делецій і отримання інсерційних сегментів в поліпептидімішені ДНК. Див. Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Якщо говорити стисло, поліпептид-мішень ДНК змінюється шляхом гібридизації олігонуклеотиду, який кодує бажану мутацію до одноланцюгової матриці ДНК. Після гібридизації, використовується ДНК-полімераза, для того щоб відбувся синтез цілісного комплементарного ланцюга матриці, яка заключає в собі олігонуклеотидний праймер, і кодує задану зміну в поліпептиді-мішені ДНК. 90846 46 4. Підбір константних областей Варіабельні сегменти антитіл, утворені, як описано supra (наприклад, варіабельні області важкого і легкого ланцюга химерного; або гуманізованого антитіл) у типовому випадку зв'язані, принаймні, з частиною константної області імуноглобуліну (Fc область), як правило, тієї, що належить імуноглобуліну людини. ДНК-послідовність константної області імуноглобуліну людини може бути ізольована за допомогою загальноприйнятих методик з численної групи клітин людини, однак бажано надавати перевагу іморталізованим Влімфоцитам (див. Kabat et al., supra, i Liu et al., WО 87/02671) (кожна з яких включена як посилання у повному обсязі для використання з будь-якою метою). Зазвичай, антитіло має включати константні ділянки як легкого, так і важкого ланцюгів. Константна область важкого ланцюга, як правило, включає СН1, шарнірну, СН2, СН3, і СН4 ділянки. Антитіла, описані-тут, включають антитіла, які мають константні області всіх типів, включаючи IgM, IgG, IgD, ІgА і ІgЕ, і будь-який ізотип, включаючи IgG1, lgG2, lgG3 і lgG4. Якщо бажано, щоб антитіло (наприклад, гуманізоване антитіло) проявляло цитотоксичну активність, константний домен, як правило, є комплементом, який утримує константний домен, і в типовому випадку належить до IgG1 класу. Кращим є ізотип IgG1 імуноглобуліну людини. Константні області легкого ланцюга можуть походити з лямбда або каппа класів. Гуманізоване антитіло може включати послідовності, що належать більше, ніж до одного класу або ізотипу. Антитіла можуть експресуватись як тетрамери, що складаються з двох легких і двох важких ланцюгів, як окремі важкі ланцюги, легкі ланцюги, як Fab, Fab' F(ab')2, і Fv, або як антитіла, утворені поодинокими ланцюгами, в яких варіабельні домени важкого і легкого ланцюга з'єднані спейсерною областю. 5. Експресія рекомбінантних антитіл Гібридні та гуманізовані антитіла, як правило, утворюються внаслідок рекомбінантної експресії. Нуклеїнові кислоти, що кодують варіабельні області легкого і важкого ланцюга, які необов'язково зв'язані з константними ділянками, вбудовуються в вектори експресії. Легкі і важкі ланцюги можуть тонуватись з використанням одного або різних експресуючих векторів. Сегменти ДНК, які кодують ланцюги імуноглобуліну, операбельно пов'язані з контролюючими послідовностями у векторі(ах) експресії, які забезпечують експресію поліпептидів імуноглобуліну. Контролюючі послідовності експресії включають, але не обмежені ними, промотори (наприклад, зв'язані природньо або гетерологічні промотори), сигнальні послідовності, елементи енхансера і послідовності завершення транскрипції. Переважно, послідовності, які контролюють експресію, є промоторними системами еукаріотів в векторах, здатних до трансформації або трансфекції еукаріотних клітин-господарів (наприклад, COS клітин). Після введення вектора в прийнятного господаря, господар утримується в умовах, що забезпечують високий рівень експресії нуклеотидних послідовностей, збирання та очистки антитіл, які перехресно реагують. 47 Ці вектори експреси, як правило, реплікуються в організмі господаря або як епісоми, або як інтегральна частина хромосомальної ДНК господаря. Як правило, вектори експресії включають маркери селекції (наприклад, ампіцилін-резистентності, гігроміцин-резистентності, тетрациклінрезистентності, канаміцин-резистентності або неоміцин-резистентності), для того щоб виявити ті клітини, які містять трансформовану ДНК з заданою послідовністю (див., наприклад, Itakura et al., US Patent 4,704,362). Ε. coli - один з прокаріотів, який є надзвичайно корисним для клонування полінуклеотидів (наприклад, ДНК послідовностей) в даному винаході. Інші мікроорганізми, які можуть бути корисними для використання як господарі, включають бацили, такі як Bacillus subtilis, та інші представники родини Enterobacteriaceae, такі як Salmonella, Serratia, а також різні види Pseudomonas. В цих господаряхпрокаріотах, також можна зробити вектори експресії, які в типовому випадку включають послідовності, що контролюють експресію, які сумісні з клітиною господаря (наприклад, сайт ініціації реплікації). До того ж, може бути присутнє будьяке число добре відомих промоторів, таких як система промотора лактози, система промотора триптофану (trp), система промотора бета-лактамази або система промотора фага лямбда. Промотори типово повинні контролювати експресію, як правило, необов'язково з послідовністю оператора, і мають послідовності рибосомального зв'язуючого центра і т.п.для ініціації і завершення транскрипції і трансляції. Інші мікроорганізми, такі як дріжджі, також можуть бути використані для експресії. Saccharomyces є кращий господар, з прийнятними векторами, які мають послідовності, що контролюють експресію (наприклад, промотори), сайт ініціації реплікації, термінальну ділянку тощо, як бажано. До типових промоторів належать 3фосфогліцераткіназа та інші гліколітичні ферменти. Промотори індуцибельних дріжджів включають, серед інших, промотори алкогольдегідрогенази, ізоцитохрому С, ферментів, відповідальних за утилізацію мальтози і галактози. Крім мікроорганізмів, культура клітин тканин ссавців також може бути використана для експресії і утворення поліпептидів даного винаходу (наприклад, полінуклеотидів, які кодують імуноглобуліни або його фрагменти). Див. Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Наразі віддається перевага клітинам еукаріотів, тому що ціла низка придатних клітинних ліній господаря, здатних до секреції гетерологічних протеїнів (наприклад, інтактних імуноглобулінів), була отримана в галузі, яка включає СНО клітинні лінії, різноманітні Cos клітинні лінії, HeLa клітини, переважно, мієломні клітинні лінії, або трансформовані В-лімфоцити або гібридоми. Як правило, ці клітини не належать людині. Вектори експресії для цих клітин можуть включати послідовності, що контролюють експресію, такі як сайт ініціації реплікації, промотор і енхансер (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), і сайти, необхідні для процессингу інформації, такі як сайти, що зв'язують рибосоми, 90846 48 сайти сплайсингу РНК, сайти поліаденілювання, і послідовності термінатора транскрипції. Здебільшого послідовності, які контролюють експресію, це промотори, що походять з генів імуноглобуліну, SV40, аденовірусу, вірусу бибачої папіломи, цитомегаловірусу і т.п.Див. Co et al.,J. Immunol. 148:1149 (1992). Альтернативно, послідовності, які кодують антитіло, можуть бути включені в трансгени для введення в геном трансгенної тварини і наступної експресії в молоко трансгенної тварини (див., наприклад, Deboer et al., US 5,741,957, Rosen, US 5,304,489, and Meade et al., US 5,849,992). Прийнятні трансгени включають кодуючі послідовності для легкого і/або важкого ланцюгів в оперативно зчеплені з промотором і енхансером специфічного гену молочної залози, такого як казеїн або лактоглобулін. Альтернативно, антитіла (наприклад, гуманізовані антитіла) винаходу можуть бути отримані у трансгенних рослин (наприклад, тютюну, кукурудзи, сої і люцерни). Оптимізовані вектори 'плантитіл' (Hendy et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:137-146) і стратегії очищення у поєднанні із зростаючим числом видів сільськогосподарських рослин, здатних до трансформації, роблять ці методи практичними і ефективними засобами отримання рекомбінантних імуноглобулінів не лише для застосування в медицині та ветеринарії, але й також для промислового використання (наприклад, каталітичні антитіла). Крім того, було показано, що антитіла, які утворюються в рослинах, є безпечними та ефективними і дають змогу уникнути використання матеріалів, що мають тваринне походження, а, отже, і уникнути ризику забруднення збудниками інфекційної спонгіозної енцефалопатії (TSE). До того ж, відмінності між способами глікозилювання в антитілах, отриманих в тваринних та рослинних клітинах, мають незначний вплив, або зовсім не впливають на зв'язування антигена або на специфічність. Крім того, жодних доказів токсичності або НАМА-ефекту не було встановлено у пацієнтів, які отримували місцеве пероральне застосування секреторного димерного ІgА антитіла, що мало рослинне походження (див. Larrick et al. (1998) Res. Immunol. 149:603-608). Різні методи можуть бути використані для експресії рекомбінантних антитіл у трансгенних рослин. Наприклад, важкий і легкий ланцюги антитіла можуть незалежно бути клоновані у векторах експресії (наприклад, векторах Agrobacterium tumefaciens), після чого здійснюється трансформація рослинної тканини in vitro за допомогою рекомбінантного мікроорганізму або шляхом прямої трансформації, наприклад за допомогою часточок, навантажених вектором, який після цього фізично вводиться в рослинну тканину за допомогою, наприклад балістичної методики. Після цього, реконструюються цілі рослини, які експресують окремі ланцюги, з наступним статевим схрещуванням, що в кінцевому результаті призводить до виробництва повністю зібраного і функціонального антитіла. Подібні протоколи були використані, для того щоб експресувати функціональні антитіла в рослинах тютюну (див. Hiatt et al. (1989) Nature 342:76-87). В 49 різних втіленнях, сигнальні послідовності можуть бути використані, для того щоб промотувати експресію, зв'язування і пакування ланцюгів незібраного антитіла шляхом спрямовування ланцюгів до відповідного середовища рослин (наприклад, водне середовище апопласту або інші специфічні рослинні тканини, включаючи бульби, плоди або насіння) (див. Fiedler et al. (1995) Bio/Technology 13:1090-1093). Рослинні біореактори також можуть бути , використані, для того щоб збільшити вихід антитіла та істотно скоротити затрати. Вектори, які включать полінуклеотидні послідовності, що становлять інтерес (наприклад, послідовності, що кодують важкий і легкий ланцюг, а також послідовності, що контролюють експресію), можуть бути перенесені в клітину-господаря за допомогою загальновідомих методів, які можуть бути різними в залежності від типу клітини господаря. Наприклад, трансфекція хлоридом кальцію широко використовується для клітин прокаріотів, тоді як щодо інших типів клітин можуть бути застосовані такі методи, як обробка фосфатом кальцію, електропорація, ліпофекція, біолістикс або вірусна трансфекція. (Див. звичайно Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989) (наведені тут як довідкова інформація у повному обсязі для використання з будь-якою метою). Інші методи, які використовуються для трансформації клітин ссавців, включають використання полібрену, злиття протопластів, ліпосоми, електропорацію і мікроін'єкції (див. звичайно, Sambrook et al., supra). Для отримання трансгенних тварин, трансгени можуть бути введені шляхом мікроін'єкції в запліднені ооцити, або можуть бути вмонтовані в геном ембріональних стовбурових клітин, після чого ядра таких клітин переносяться в без'ядерні ооцити (цитопласти). Якщо важкий і легкий ланцюги клонуються на різних векторах експресії, здійснюють одночасну трансфекцію цих векторів, для того щоб отримати експресію і "збирання" інтактних імуноглобулінів. Після експресії повні антитіла, їх димери, окремі важкі і легкі ланцюги, або інші форми імуноглобуліну даного винаходу можуть бути очищені відповідно до стандартних методик галузі, включаючи преципітацію сульфатом амонію, афінну хроматографію, хроматографію на колонках, очистку за допомогою рідинної хроматографії високого розрішення, електрофорезу в гелі тощо (див., звичайно Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). По суті, бажано використовувати чисті імуноглобуліни, однорідність популяції або моноклональність яких становить, принаймні, від 90 до 95%, для фармацевтичних потреб бажано використовувати імуноглобуліни, моноклональність яких становить від 98 до 99% і більше. 6. Фрагменти антитіла В рамках даного винаходу розглядаються також фрагменти антитіла. В одному втіленні передбачено отримання фрагментів, що не належать людині, і/або химерних антитіл. В іншому втіленні, передбачено отримання фрагментів гуманізованих антитіл. Типово ці фрагменти виявляють специфічне зв'язування з антигеном з афінністю, принай 90846 50 мні, 107, більш типово 108 або 109М-1. Фрагменти гуманізованого антитіла включають поодинокі важкі ланцюги, легкі ланцюги, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, i Fv. Фрагменти отримують за допомогою методик рекомбінантних ДНК або шляхом ферментного або хімічного розділення інтактних імуноглобулінів. 7. Картування епітопа Картування епіопа може бути здійснено, для того щоб визначити, яка антигенна детермінанта чи епітоп Αβ розпізнається антитілом. В .одному втіленні, картування епітопа виконується відповідно до методики Replacement NET (rNET) аналізу. Аналіз картування rNET епітопа забезпечує інформацію щодо вкладу окремих залишків в межах епітопа в загальну зв'язуючу активність антитіла. rNET аналіз використовує синтезовані аналоги пептидів, в яких методично заміщується один залишок. Зв'язування досліджуваного антитіла визначається у порівнянні з природним пептидом (природним антигеном) і у порівнянні з 19 альтернативними "однозаміщеними" пептидами, кожен пептид заміщений у першому положенні однією з 19 амінокислот, що не є природною для цього положення. Профіль антитіла, що генерується, відображує вплив заміщення в цьому положенні різними "неприродними" (для цього положення) залишками. У подібний спосіб генеруються профілі у послідовних положеннях уздовж антигенного пептиду. Після цього комбінований профіль або карту епітопа (відображує заміну в кожному положенні всіма 19 залишками, неприродними для цього положення) можна порівняти з картою, подібним чином отриманою для іншого антитіла./Значною мірою подібні або ідентичні карти свідчать про те, що антитіла, які порівнюються, мають ту ж або подібну специфічність до епітопа. 8 Дослідження терапевтичної ефективності антитіл на тваринній моделі Групам мишей лінії PDAPP, 7-9-місячного віку шляхом ін'єкції вводили 0.5мг в PBS поліклональних анти-Αβ або специфічних анти-Αβ моноклональних антитіл. Всі препарати антитіла зазнають очистки, для того щоб забезпечити низький рівень ендотоксинів. Моноклональні антитіла можуть бути отримані проти фрагменту, при введенні мишам шляхом ін'єкції фрагменту або довшої форму Αβ, далі отримують гібридоми і здійснюють скринінг гібридом на антитіло, яке специфічно зв'язує певний фрагмент Αβ без зв'язування з іншими фрагментами Αβ, які не перекриваються. Ін'єкції мишам вводили внутрішньоочеревинно, як потрібно, через 4 місяці, для того щоб підтримувати концентрацію циркулюючого антитіла, яка вимірюється за допомогою методу імуноферментного аналізу ELISA, титр антитіл становить більше, ніж 1/1000, як визначено за допомогою ELISA, до Αβ42 або іншого імуногену. За титрами антитіл вели спостереження, мишей безболісно умертвляли наприкінці 6 місяця після початку введення ін'єкцій. Гістохімічні, токсикологічні дослідження, а також визначення рівня Αβ було проведено посмертно. В кожній групі було використано по 10 мишей. 9. Скринінг антитіл на здатність очищати амілоїдні відкладення 51 Винахід також представляє методи скринінгу антитіла на активність виводити амілоїдні відкладення або інші антигени, або зв'язані біологічні об'єкти, які повинні підлягати виведенню або очищенню. Для того щоб дослідити активність антитіл проти амілоїдних відкладень, зразок тканини мозку пацієнта, що потерпає від хвороби Альцгеймера, або модельної тварини з проявами патології альцгеймерівського типу, контактує з фагоцитами, які несуть Fc-рецептор, дакими як мікрогліальні клітини, і досліджуваним антитілом в культурі in vitro. Фагоцити можуть представляти первинну культуру або клітинну лінію і можуть належати миші (наприклад, BV-2 або С8-В4 клітини) або людині (наприклад, ТНР-1 клітини). В деяких методах, компоненти монтуються на мікроскопічному препараті, для того щоб полегшити моніторинг за допомогою мікроскопа. В інших методах, різноманітні реакції здійснюються паралельно в лунках планшета. В такому форматі окремі мініатюрні мікроскопічні препарати можуть бути розміщені в окремих комірках або мікролунках планшета. Може також бути використаний немікроскопічний формат, виявлення, такий як виявлення Αβ за допомогою імуноферментного аналізу ELISA. Переважно, проводиться серія вимірів кількості амілоїдних відкладень в реактивній суміші in vitro, починаючи з початкового значення до початку реакції, і одного або кількох значень, отриманих протягом реакції. Антиген може бути виявлений шляхом фарбування, наприклад, міченими флуоресцентними барвниками, антитіла до Αβ або до інших компонентів, амілоїдних бляшок. Як антитіла, що використовуються для фарбування, можуть бути використані ті ж антитіла, здатність до кліренсу яких вивчається. Зменшення амілоїдних відкладень відносно початкового значення протягом реакції свідчить про те, що досліджуване антитіло має здатність до кліренсу. Такі антитіла, ймовірно, будуть корисними для профілактики або лікування хвороби Альцгеймера або інших амілоїдогенних захворювань. Особливо корисними для профілактики або лікування хвороби Альцгеймера або інших амілоїдогенних захворювань будуть антитіла, здатні викликати кліренс як компактних, так і дифузних амілоїдних бляшок, наприклад, 12А11 антитіло даного винаходу, або його гібридна чи гуманізована версії. Аналогічні методи можуть бути використані для скринінгу антитіл на активність очищувати інші типи біологічних об'єктів. Аналіз може бути використаний для виявлення очищуючої здатності антитіла фактично проти будь-якого біологічного об'єкту. Як правило, біологічний об'єкт відіграє однакову роль у виникненні хвороби у людини чи тварини. Біологічний об'єкт може бути представлений у вигляді препарату тканини або у ізольованому вигляді. Якщо це препарат тканини, він переважно не піддається фіксації, для того щоб забезпечити легкий доступ до компонентів зразка тканини і уникнути появи артефактів, що мають місце при фіксації. Як приклади тканин, що можуть бути використані в цьому дослідженні, можна навести ракову тканину, передракову тканину, тканину, яка містить доброякісні новоутворення, такі як бородавки чи родимки, тканину, інфіковану па 90846 52 тогенними мікроорганізмами, тканину, що містить клітини зони запалення (запального інфільтрату), тканину, що несе патологічну міжклітинну речовину (наприклад, фібринозний перикардит), тканину, що несе аберрантні антигени, і тканину рубців. Приклади ізольованих біологічних об'єктів, які можуть бути використані, включають Αβ, вірусні антигени або віруси, протеоглікани, антигени інших патогенних мікроорганізмів, пухлинні антигени, і молекули адгезії. Такі антигени можуть мати природне походження, бути одержані за рахунок експресії рекомбінантних ДНК або хімічного синтезу, серед інших засобів. Зразки тканини або ізольовані біологічні об'єкти приводять в контакт з фагоцитами, що несуть Fc рецептори, такими як мікрогліальні клітини або антитіла, які повинні бути досліджені в культуральному середовищі. Антитіло може бути спрямоване на досліджуваний біологічний об'єкт або на антиген, зв'язаний з цим об'єктом. В останньому випадку метою дослідження є з'ясувати, чи фагоцитується біологічний об'єкт антигеном. Як правило, хоча це й не є обов'язковим, антитіло і біологічний об'єкт (інколи разом зі зв'язаним антигеном), у контактують один з одним ще до того, як до середовища додають фагоцити. Далі здійснюється моніторинг концентрації біологічного об'єкта і/або зв'язаного антигена, що залишаються в середовищі, якщо вони присутні. Зменшення кількості або концентрації антигена або зв'язаного біологічного об'єкта в середовищі свідчить про те, що антитіло виявляє "очищуючу" відповідь проти антигена і/або зв'язаного біологічного об'єкта у поєднанні з фагоцитами. 10. Химерні / Гуманізовані Антитіла, що мають змінені ефекторні функції Для вищеописаних антитіл винаходу, які включають константну область (Fc область), могло б також бути бажаним змінювати ефекторні функції молекули. Як правило, ефекторні функції залишків антитіла в константній або Fc області молекули, яка може бути посередником зв'язування з різними ефекторними молекулами, наприклад, білками комплемента або Fc-рецепторами. Зв'язування комплемента з Fc областю є важливим, наприклад, для опсонізації і лізису клітин патогена, а також активації запальної реакції. Зв'язування антитіла з Fc рецепторами, наприклад, на поверхні ефекторних клітин, може приводити в дію цілу низку важливих і різноманітних біологічних реакцій, наприклад, поглинання і деструкцію патогенів і часточок, навантажених антитілами, кліренс імунних комплексів, лізис клітинами-кілерами клітинмішеней, навантажених антитілами (наприклад, антитілозалежна клітинно-опосередкована цитотоксичність, або ADCC), секрецію медіаторів запалення, плацентарний перенос антитіл, контроль за утворенням імуноглобуліну. Відповідно, залежно від конкретного терапевтичного або діагностичного застосування, вищезгадані імунні функції, або лише певні імунні функції, можуть бути бажаними. Шляхом зміни Fc ділянки антитіла, було досягнуто різних аспектів зміни ефекторних функцій молекули, включаючи підсилення або пригнічення різних реакцій імунної 53 системи, зі сприятливим ефектом в діагностиці і лікуванні. Можуть бути отримані антитіла винаходу, які реагують лише з певним типом Fc рецепторів, наприклад, антитіла винаходу можуть бути модифіковані, для того щоб зв'язуватись лише з певними Fc рецепторами, або, якщо це бажано, повністю втратити здатність до зв'язування з Fc рецептором шляхом делеції або альтерації центру зв'язування Fc рецептора, локалізованого в Fc області антитіла. Інші бажані альтерації Fc області антитіла винаходу наведені нижче. Типово, система нумерації Kabat використовується для того, щоб визначити, який амінокислотний залишок(ки) Fс області (наприклад, IgG антитіла) змінюється (наприклад, шляхом амінокислотних замін), для того щоб досягти бажаної зміни ефекторної функції. Ця система нумерації використовується також для того, щоб порівняти антитіла різних видів, так, щоб бажані ефекторні функції, які притаманні, наприклад, мишачим антитілам, можна було після цього методично конструювати в антитілах людини, гуманізованих або химерних антитілах винаходу. Наприклад, було встановлено, що антитіла (наприклад, IgG антитіла) можуть бути згруповані на основі їх здатності до сильного, проміжного або слабкого зв'язування з Fc рецептором (наприклад, Fc рецептором на моноцитах людини (FcyRI)). Шляхом порівняння амінокислотних послідовностей у цих групах, які відрізняються різною афінністю, було визначено центр зв'язування моноцитів у шарнірній області (Лей234-Сер239). Крім того, рецептор FcyRI людини зв'язує IgG1 людини і lgG2a миші як мономер, однак зв'язування lgG2b миші відбувається в 100 разів слабкіше. Порівняння·амінокислотних послідовностей цих білків у шарнірній області показало, що послідовність 234 до 238, тобто, Лей-Лей-Глі-Глі-Про (SEQ ID NO:32), у антитіл, які здатні до сильного зв'язування, змінюється на Лей-Глу-Глі-Глі-Про (SEQ ID NO:33) в ланцюзі миші гамма 2b, тобто, антитіла, для якого характерне слабке зв'язування. Таким чином, можуть бути зроблені відповідні зміни послідовності шарнірної області антитіла людини, якщо є бажаним послаблене зв'язування з FcyRI рецептором. Зрозуміло, що інші альтерації також можуть бути виконані, для того щоб досягти такого ж або подібного результату. Наприклад, афінність FcyRI може бути змінена шляхом заміни визначеного залишка залишком, який має неприйнятну функціональну групу на його бічних ланцюгах, або шляхом введення зарядженої функціональної групи (наприклад, Глу або Асп), або, наприклад, ароматичного неполярного залишка (наприклад, фенілаланіну, тирозину або триптофану). Ці зміни однаковою мірою можуть бути застосовані в системах послідовностей миші, людини і щура, які виявляють гомологію послідовності між різними імуноглобулінами. Було показано, що для lgG3 людини, яке зв'язується з FcyRI рецептором людини, заміна Лей 235 на Глу порушує взаємодію мутанта з рецептором. Таким чином, зв'язуючий центр для цього рецептора може "вмикатись" або "вимикатись" внаслідок відповідних мутацій. 90846 54 Мутації на прилеглих або близких сайтах шарнірної області (наприклад, заміщення залишків 234, 236 або 237 на Ала) свідчить, що альтерації залишків 234, 235, 236, і 237, принаймні, впливають на афінність до FcyRI рецептора. Відповідно, антитіла винаходу також можуть мати змінену Fc область із зміненою афінністю до FcyRI у порівнянні з немодифікованим антитілом. Таке антитіло просто має модифікацію амінокислотного залишка 234, 235,236, або 237. Спорідненість до інших Fc рецепторів може бути змінена за допомогою подібного підходу, наприклад, для контролю імунної реакції у різний спосіб. Як наступний приклад, можуть бути змінені лізисні властивості IgG антитіл, які проявляються після зв'язування СІ компонента комплемента. Перший компонент системи комплемента, СІ, включає три білки, відомі як Clq, Clr і CIs, що міцно зв'язані один з одним. Було показано, що Clq відповідальний за зв'язування комплексу, утвореного трьома білками, з антитілом. Відповідно, Clq-зв'язуюча активність антитіла може бути змінена шляхом зміни СН2 домену антитіла, в якому, щонайменше, один із амінокислотних залишків 318, 320, і 322 важкого ланцюга був змінений на залишок, який має інший бічний ланцюг. Нумерація залишків важкого ланцюга здійснюється відповідно до EU індексу (див. Kabat et al., supra). Інші прийнятні заміни, які обумовлюють, наприклад, зменшення або відміну специфічного Clq-зв'язування з антитілом, включають заміну будь-якого серед залишків 318 (Глу), 320 (Ліз) і 322 (Ліз), на Ала. Крім того, шляхом мутаційних змін цих залишків було показано, що Clq-зв'язування зберігається доти, доки залишок 318 має бічний ланцюг, який утримується за допомогою водневого зв'язку, а кожен із залишків 320 і 322 має позитивно заряджені бічні ланцюги. Clq-зв'язуюча активність може бути скасована внаслідок заміни будь-якого з трьох визначених залишків на залишок, бічні ланцюги якого мають невідповідну сукупність функціональних характеристик. Не обов'язково замінювати іонні залишки лише на Ала, для того щоб скасувати Clqзв'язування. Можливим також є використання інших алкілзаміщених неіонних залишків, таких як гліцин, ізолейцин, лейцин, або валін, чи таких ароматичних неполярних залишків як фенілаланін, тирозин, триптофан і пролін на місці будь-якого з трьох залишків, для того щоб скасувати Clqзв'язування. Крім того, можна також використовувати такі полярні неіонні залишки, як серин, треонін, цистеїн і метионін на місці залишків 320 і 322, але не 318, для того щоб скасувати Clq-зв'язуючу активність. Також зазначається, що бічні ланцюги іонних або неіонних полярних залишків будуть здатні утворювати водневі зв'язки у спосіб, подібний до зв'язків, які утворює залишок глутаміну. Тому, заміна 318 (Глу) залишка полярним залишком може модифікувати, але не скасувати Clq-зв'язуючу активність. 55 Відомо також, що заміна залишка 297 (Асн) на Ала призводить до втрати здатності до лізису, в той же час лише дещо зменшуючи (приблизно втричі) спорідненість до Clq. Ця зміна порушує центр глікозилювання і наявність вуглеводу, який потрібен для активації комплемента. Будь-яка інша заміна в цьому сайті також порушить центр глікозилювання. Винахід також забезпечує антитіло, яке має змінені ефекторні функції, де антитіло має модифіковану шарнірну область. Модифікована шарнірна область може представляти повну шарнірну область, яка походить від антитіла іншого класу або підкласу, ніж антитіло, якому належить СН1 домен. Наприклад, константний домен (СН1) антитіла IgG класу може бути прикріплений до шарнірної області антитіла lgG4 класу. Альтернативно, нова шарнірна область може становити частину природної шарнірної зони або одиницю, що повторюється, в якій кожна одиниця повтору походить із природної шарнірної області. В одному прикладі, природна шарнірна область змінюється шляхом конверсії одного або кількох цистеїнових залишків на нейтральний залишок, такий як аланін, або шляхом конверсії належним чином розташованих залишків на місце цистеїнових залишків. Такі зміни виконуються з використанням методів хімії білків і, головним чином, методів генетичної інженерії, як тут описано. В одному втіленні винаходу, число цистеїнових залишків у шарнірній області зменшується, наприклад, до одного залишка цистеїну. Ця модифікація має перевагу при полегшенні збирання молекул антитіла, наприклад, молекул біспецифічного антитіла і молекул антитіла, де Fc частина заміщена молекулою ефектора або репортерною групою, оскільки це єдине, що необхідно для того, щоб утворився єдиний дисульфідний зв'язок. Ця модифікація також забезпечує специфічну мішень для прикріплення шарнірної області до іншої шарнірної області або до молекули ефектора чи репортерної групи, прямо або -·. опосередковано, наприклад, з використанням хімічних засобів. Навпаки, число цистеїнових залишків у шарнірній області антитіла збільшується, наприклад, щонайменше, на один залишок, ніж це зазвичай притаманно для цього залишку. Збільшення числа цистеїнових залишків може бути використано для стабілізації взаємодії між прилеглими шарнірними областями. Інша перевага цієї модифікації полягає в тому, що вона спрощує використання цистеїнтіолових груп для прикріплення молекули ефектора або репортерної групи до зміненого антитіла, міченого радіоактивною міткою. Відповідно, винахід забезпечує обмін шарнірними областями між антитілами різних класів, зокрема, IgG класів, і/або збільшення або зменшення числа цистеїнових залишків в шарнірній області для того, щоб досягти зміни ефекторної функції (див., наприклад, U.S. Patent No.5,677,425, який повністю включений тут). Визначення зміненої ефекторної функції антитіла виконується з використанням методів аналізу, описаних тут, або методик, прийнятих в інших галузях. 90846 56 Важливо, що отримане внаслідок цього антитіло, може підлягати одному або кільком способам аналізу для оцінки будь-якої зміни біологічної активності у порівнянні з вихідним антитілом. Наприклад, здатність антитіла із зміненою Fc ділянкою зв'язувати комплемент або Fc рецептори може бути оцінена за допомогою методів аналізу, висвітлених тут, а також за допомогою будь-якого іншого методу, прийнятого в цій галузі. Виготовлення антитіл винаходу виконується з використанням будь-якої прийнятної методики, включаючи методики, які тут описані, а також методики, відомі тим, хто має досвід роботи у цій галузі. Наприклад, прийнятна амінокислотна послідовність, наприклад, та, що утворює частину або весь релевантний константний домен, наприклад, Fc область, тобто, СН2, і/або СН3 домен(и) антитіла, і включає належним чином змінений залишок(ки), може бути синтезована, а потім за допомогою хімічних засобів приєднана до відповідного місця молекули антитіла. Переважно, для виготовлення змінених антитіл використовують методи генетичної -інженерії. Ці методики включають, наприклад, виготовлення прийнятних праймерів для використання в полімеразній реакції синтезу ланцюга (PCR), так що послідовність ДНК, яка кодує, принаймні, частину важкого ланцюга IgG, наприклад, Fc або константну область (наприклад, СН2, і/або СН3) змінюється в одному або кількох залишках. Після цього сегмент може бути оперативно зв'язаний з іншою частиною антитіла, наприклад, варіабельною областю антитіла і регуляторними елементами, потрібними для експресії в клітину. Даний винахід також включає вектори, які використовуються для трансформації клітинної лінії, вектори, які використовуються для виготовлення трансформуючих векторів, клітинні лінії, трансформовані з використанням трансформуючих векторів, клітинні лінії, трансформовані з використанням попередніх векторів, і методи для їх виготовлення. Переважно, клітинна лінія, яка трансформується, для того щоб продукувати антитіла із зміненою Fc-областю (тобто, із зміненою ефекторною функцією), представляє собою імморталізовану клітинну лінію ссавців (наприклад, СНО клітина). Не зважаючи на те що клітинна лінія, яка використовується для того, щоб продукувати антитіло із зміненою Fc-областю, переважно це клітинна лінія ссавців, будь-яка інша прийнятна клітинна лінія, така як лінія бактеріальних клітин або дріжджова клітинна лінія, може альтернативно бути використана. 11. Розвиток (дозрівання) афінності Антитіла (наприклад, гуманізовані антитіла) винаходу можуть бути модифіковані з метою покращення функції за допомогою будь-якої з цілої низки методик "розвитку" афінності. Як правило, ідентифікується молекула-кандидат із зв'язуючою афінністю до заданої молекули-мішені, потім вона покращується або "розвивається (дозріває)" за допомогою методик мутагенезу, що призводить до утворення однієї або кількох похідних молекулкандидатів, які мають більш бажану зв'язуючу взаємодію з молекулою-мішенню. Як правило, це є 57 афінність антитіла (або авідність, тобто, комбіновані афінності антитіла щодо мішені-антигена), яка модифікується, однак, інші властивості молекули, такі як стійкість, ефекторна функція, здатність до очищення (до кліренсу), секреції або транспортна функція, можуть також бути модифіковані, або окремо, або паралельно з афінністю, за допомогою методик розвитку (дозрівання) афінності. В типових втіленнях, афінність антитіла (наприклад, гуманізованого антитіла даного винаходу) зростає. Наприклад, антитіла, що мають зв'язуючу афінність, принаймні, 107М-1, 108М-1 або 109М-1, можуть "дозрівати", внаслідок чого їх афінність буде становити, щонайменше, 109М-1, 1010М-1 або 1012М-1. Один з підходів до розвитку афінності зв'язуючої молекули полягає в тому, що синтезується нуклеїнова кислота, яка кодує зв'язуючу молекулу, або її фрагмент, що кодує бажану зміну або зміни. Методики синтезу олігонуклеотиду є загальновідомими з рівня техніки і можуть бути легко автоматизовані, для того щоб отримати одну або кілька нуклеїнових кислот, які мають будь-яку бажану зміну(и) кодону. Сайти рестрикції, "мовчазні" мутації, використання сприятливих кодонів також можуть бути введені у такий спосіб. Альтернативно, один або більше кодонів можуть бути змінені, для того щоб представити набір певних амінокислот, напр., набір, який виключає цистеїни, що можуть утворювати дисульфідні зв'язки, і обмежений певною ділянкою, наприклад, CDR-ділянкою або її фрагментом. Альтернативно, ця ділянка може бути представлена частково або повністю рандомізованим набором амінокислот (для отримання додаткової інформації. Див., наприклад, U.S. Patent Nos. 5,830,650; 5,798,208; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,723,323; 4,528,266; 4,359,53; 5,840,479; і 5,869,644). Є зрозумілим, що наведені вище підходи можуть частково або повною мірою реалізовані за допомогою полімеразноланцюгової реакції (PCR), яка є загальновідомою з рівня техніки і сприяє введенню олігонуклеотидів, наприклад, праймерів (затравок) або одноланцюгових нуклеїнових кислоти, що мають, наприклад, бажану заміну(и), у двохланцюгові нуклеїнові кислоти і ампліфіковані в кількості, що достатня для подальших маніпуляцій, таких як введення за допомогою методів генної інженерії в прийнятний вектор експресії або клонуючий вектор. Така PCRреакція може бути здійснена за умов, що роблять можливим введення невідповідних нуклеотидів, для того щоб таким чином ввести додаткову варіабельність в нуклеїнові кислоти, які надалі будуть ампліфіковані. Особливості експериментальних методик для здійснення PCR-реакції і відповідні комплекти реактивів, реактиви, і праймерні послідовності можна виявити, наприклад в U.S. Pat. Nos. 4,683,202; 4,683,195; 6,040,166; і 6,096,551. Методики введення CDR-ділянок в каркасні області антитіла, які використовують PCR-реакції, основані на застосуванні праймерів ("затравок"), описано, наприклад, в U.S. Patent No.5,858,725. Методики ампліфікації бібліотек антитіл (і бібліотек, виготовлених відповідно до методу), основані на використанні праймерів, включають викорис 90846 58 тання мінімальних наборів праймерів, здатних виявляти гомологію послідовності з більшим набором молекул антитіла, так що більший і різноманітніший набір молекул антитіла може бути ефективно ампліфікований, що описано, наприклад, в U.S. Pat. Nos. 5,780,225; 6,303,313; і 6,479,243. Методики, що не ґрунтуються на використанні PCR-реакції для здійснення сайтспрямованого мутагенезу, також можуть бути використані, включаючи "Kunkel" мутагенез, що передбачає використання одноланцюгових матриць, які включають урацил, і праймерів, що гібридизують і вводять мутацію при проходженні через певний штам Е. соli (див., наприклад, U.S. pat. No.4,873,192). Додаткові методики для зміни послідовності антитіла або його фрагменту, включають синтез нуклеїнової кислоти або PCR-реакцію нуклеїнових кислот за неоптимальних (тобто, умов, що припускають виникнення помилок) умов, денатурацію і ренатурацію ("гібридизацію") таких нуклеїнових кислот, розщеплення за допомогою екзонуклеази і/або ендонуклеази, після чого відбувається повторне збирання шляхом зшивання або PCR (shuffling нуклеїнової кислоти), або комбінування однієї чи кількох вищезгаданих методик, як описано, наприклад, в Патентах США №№6,440,668; 6,238,884; 6,171,820; 5,965,408; 6,361,974; 6,358,709; 6,352,842; 4,888,286; 6,337,186; 6,165,793; 6,132,970; 6,117,679; 5,830,721; і 5,605,793. В окремому втіленні, банки (бібліотеки) антитіла (або бібліотеки розвитку афінності), що включають родину молекул-кандидатів антитіла, які відрізняються певними фрагментами молекулкандидатів антитіла, наприклад, однією або кількома CDR-ділянками (або її фрагментом), однією або кількома каркасними областями, і/або однією чи кількома константними областями (наприклад, константною областю, що має ефекторну функцію), можуть бути експресовані з подальшим скринінгом щодо бажаних властивостей за допомогою загальноприйнятих в галузі методик (див., Патенти США №№6,291,161; 6,291,160; 6,291,159; і 6,291,158). Наприклад, бібліотеки експресії варіабельних доменів антитіла, що мають варіабельність CDR3 послідовностей, і методики для отримання банків (бібліотек) антитіла людини, що мають варіабельність CDR3 послідовностей, шляхом введення за допомогою мутагенезу, варіабельність CDR3 послідовностей і відновлення бібліотеки можуть бути сконструйовані (див., наприклад, Патент США №6,248,516). В кінцевому результаті, для експресії афінності "зрілих" антитіл, нуклеїнові кислоти, що кодують молекули-кандидати антитіла, можуть бути введені в клітини у прийнятному форматі експресії, наприклад, як повністю важкий та легкий ланцюги антитіла (наприклад, IgG), Fab фрагменти антитіла (наприклад, Fab, F(ab')2), або як один ланцюг антитіл (scFv) за допомогою стандартного вектора і технологій трансфекції/трансформації клітин (див., наприклад, Патент США №№6,331,415; 6,103,889; 5,260,203; 5,258,498; і 4,946,778). В. Нуклеїнова кислота, яка кодує імунологічні і терапевтичні препарати 59 Імунна відповідь проти амілоїдних відкладень також може бути індукована шляхом введення нуклеїнових кислот, що кодують антитіла або компоненти їх ланцюгів, які використовуються для пасивної імунізації. Такими нуклеїновими кислотами можуть бути ДНК або РНК. Сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує імуноген, як правило, зв'язаний з регуляторними елементами, такими як промотор і ген-енхансер, що робить можливою експресію сегменту ДНК в задані клітини-мішені пацієнта. Для експресії в клітини крові, оскільки це бажано для індукування імунної відповіді, типові елементи промотора і енхансера включають такі елементи, що містяться в генах важкого або легкого ланцюгів імуноглобуліну і/або головного промотора і енхансера вірусу мозаїки цвітної капусти (CMV) (Stinski, U.S. Patent Nos. 5,168,062 and 5,385,839). Зв'язані регуляторні елементи і кодуючі послідовності часто клонуються в вектор. Для введення двохланцюгових антитіл два ланцюги можуть клонуватись в одному й тому ж або окремих векторах. Наявна ціла низка вірусних векторних систем, включаючи ретровірусні системи (див., наприклад, Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102109 (1993)); аденовірусні вектори (див., наприклад, Bett et al., J. Virol. 67:5911 (1993)); вектори, асоційовані з аденовірусом (див., наприклад, Zhou et al., J. Exp. Med. 179:1867 (1994)), вірусні вектори з родини поксвірусів, включаючи вірус вісповакцини і поксвіруси птахів, вірусні вектори з роду альфа вірусів, на зразок тих, що походять від Сіндбіс вірусу і вірусу енцефаліту лісу Семлікі (див. Dubensky et al., J. Virol. 70:508 (1996)), вірусу венесуельського енцефаліту коней (див. Johnston et al., US 5,643,576) і рабдовірусів, таких як вірус везикулярного стоматиту (див. Rose, 6,168,943) і віруси папіломи (Ohe et al., Human Gene Therapy 6:325 (1995); Woo et al., WO 94/12629 and Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)). ДНК, яка кодує імуноген, або вектор, що включає цю ж ДНК, можуть бути упаковані в ліпосоми. Придатні ліпіди і пов'язані аналоги описують Eppstein et al., US 5,208,036, Feigner et al., US 5,264,618, Rose, US 5,279,833, and Epand et al., US 5,283,185. Вектори і ДНК, кодуюча імуноген, можуть бути адсорбовані або зв'язані з мікрочастинками носіїв, прикладом яких є полімери поліметилметакрилат і полілактиди, а також полі(лактидико-гліколіди), див., наприклад, McGee et al., J. Micro Encap. (1996). Вектори генної терапії або "голі" поліпептиди (наприклад, ДНК) можуть бути доставлені in vivo шляхом введення окремому пацієнту, як правило, шляхом системного введення (наприклад, внутрішньовенно, інтраперитонеально, через ніс, через шлунок, внутрішньошкірно, внутрішньом'язово, підшкірно чи інтракраніально) або місцевого застосування (див., наприклад, Anderson et al., US 5,399,346). Термін "голий нуклеотид" стосується полінуклеотиду, який не зв'язаний із засобами, що полегшують трансфекцію. Голі нуклеотиди інколи клонуються у векторах плазмід. Такі вектори, крім того, можуть включати анестезуючу речовину, таку 90846 60 як бупівакаїн (Weiner et al., US 5,593,972). ДНК також може бути введена за допомогою методу генного "дробовика". Див. Xiao & Brandsma, supra. ДНК, яка кодує імуноген, осаджується на поверхні металевих мікрогранул. Мікроскопічні "кулі" прискорюються шоковою хвилею або за допомогою гелію, що розширюється, і проникають в тканину на глибину кількох шарів клітин. Наприклад, для виконання спрямованого трансгенозу придатний прилад The Accel™ Gene Delivery Device, який виготовляє Agricetus, Inc. Middleton Wl. Альтернативно, "гола" ДНК може бути перенесена через шкіру в кровоносне русло простим нанесенням ДНК на шкіру за допомогою хімічного або механічного подразнення (див. Howell et al., WO 95/05853). У наступному варіанті, вектори, які кодують імуногени, можуть бути введені в клітини ex vivo, такі як клітини, що взяті у конкретного пацієнта (наприклад, лімфоцити, пунктат кісткового мозку, біопсія тканини), або універсальні донорські кровотворні стовбурові клітини, після чого відбувається реімплантація цих клітин в організм пацієнта, як правило, після відбору клітин, в які було вбудовано вектор. II. Способи профілактики і лікування Даний винахід спрямований inter alia на лікування хвороби Альцгеймера та інших амілоідогенних захворювань шляхом застосування терапевтичних імунологічних препаратів (наприклад, гуманізованих імуноглобулінів) до специфічних епітопів Αβ пацієнту за умови, що вони викликають сприятливу терапевтичну реакцію у пацієнта (наприклад, індукують фагоцитоз Αβ, зменшують накопичення бляшок, інгібують утворення бляшок, зменшують невритичну дистрофію, покращують когнітивної функції і/або призводять до зворотного розвитку симптомів, лікування або профілактики когнітивних розладів) у пацієнта, наприклад, для профілактики або лікування амілоїдогенної хвороби. Винахід також спрямований на використання розкритих імунологічних препаратів (наприклад, гуманізованих імуноглобулінів) у виробництві медикаментів для лікування або профілактики амілоїдогенної хвороби. В одному аспекті, винахід забезпечує способи профілактики або лікування захворювання, пов'язаного з амілоїдними відкладеннями Αβ у мозку пацієнта. Такі захворювання включають хворобу Альцгеймера, синдром Дауна та інші когнітивні ушкодження. Останнє може супроводжуватись або ні іншими особливостями амілоїдогенного захворювання. Деякі способи винаходу забезпечують застосування ефективних доз антитіла, яке специфічно зв'язує компонент амілоїдних відкладень у пацієнта. Такі способи особливо корисні для профілактики або лікування хвороби Альцгеймера у людей. Типові способи включають застосування ефективної дози антитіла, яке специфічно зв'язується з Αβ. Ці методи забезпечують застосування ефективної дози антитіла, яке специфічно зв'язується з епітопом в межах 1-10 залишків Αβ, наприклад, антитіл, які специфічно зв'язуються з епітопом в межах 1-3 залишків Αβ, антитіл, які специфічно зв'язуються з епітопом в межах 1-4