15-валентна вакцинна композиція на основі кон’югату пневмококового полісахариду з білком

Реферат: Винахід належить до полівалентної імуногенної композиції, що включає 15 різних кон'югатів полісахаридів з білком. Кожний кон'югат складається з капсульного полісахариду, отриманого з різних серотипів Streptococcus pneumoniae (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F UA 106115 C2 (12) UA 106115 C2 або 33F), кон'югованого з білком-носієм, переважно CRM197. Імуногенна композиція, переважно сформульована у вигляді вакцини з ад'ювантом на основі алюмінію, надає широкий захист проти пневмококового захворювання, особливо у немовлят і маленьких дітей. UA 106115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднені заявки Немає. Галузь винаходу Даний винахід стосується полівалентних імуногенних композицій, що містять 15 різних кон’югатів полісахариду з білком. Кожний кон’югат складається з капсульного полісахариду, отриманого з відмінного від інших серотипу Streptococcus pneumoniae (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F або 33F), кон’югованого з білком-носієм, переважно CRM197. Імуногенна композиція, переважно складена як вакцина, що містить ад’ювант на основі алюмінію, забезпечує широку дію проти захворювань, викликаних пневмококовою інфекцією, особливо, у немовлят і маленьких дітей. Рівень техніки Streptococcus pneumoniae є важливою причиною тяжких захворювань у всьому світі. У 1997 році Центри по контролю і профілактиці захворювань (CDC) встановили, що щорічно в Сполучених Штатах відмічалося 3000 випадків пневмококового менінгіту, 50000 випадків пневмококової бактеріємії, 7000000 випадків пневмококового середнього отиту і 500000 випадків пневмококової пневмонії. Див. Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8):1-13. Крім того, ускладнення при цих захворюваннях можуть бути значними по деяких дослідженнях, що повідомляють про смертність до 8% і неврологічні наслідки до 25% при пневмококовому менінгіті. Див. Arditi et al., 1998, Pediatrics 102:1087-97. Полівалентні пневмококові полісахаридні вакцини, що мали ліцензію протягом багатьох років, довели свою корисність для профілактики захворювань, викликаних пневмококовою інфекцією, у дорослих, особливо немолодих людей і людей з високим ступенем ризику. Однак немовлята і маленькі діти мають слабку відповідь на некон’юговані пневмококові полісахариди. ® Пневмококова кон’югована вакцина Prevnar , що містить 7 серотипів, що найчастіше виділяються в той період часу (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F і 23F), які спричиняють інвазивне пневмококове захворювання у маленьких дітей і немовлят, уперше отримала ліцензію в Сполучених Штатах Америки в лютому 2000 року. Завдяки універсальному застосуванню ® Prevnar в Сполучених Штатах Америки сталося значне зниження інвазивних пневмококових ® захворювань у дітей через присутні в Prevnar серотипи. Див. Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36):893-7. Однак існує обмеження повноти ® охоплення серотипів за допомогою Prevnar в певних регіонах світу, і існують деякі свідчення безперечного виникнення серотипів в Сполучених Штатах Америки (наприклад, 19A і інш.). Див. O'Brien et al., 2004, Am J Epidemiol. 159:634-44; Whitney et al., 2003, Н Engl. J Med. 348:1737-46; Kyaw et al., 2006, Н Engl. J Med. 354:1455-63; Hicks et al., 2007, J Infect Dis 196:1346-54; Traore et al., 2009, Clin. Infect Dis 48:S181-S189. У публікації патентної заявки США № US 2006/0228380 А1 описана 13-валентна вакцина на основі кон’югату пневмококового полісахариду з білком, яка включає серотипи 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F і 23F. У публікації патентної заявки Китаю № CN 101590224 описана 14-валентна вакцина на основі пневмококового полісахариду з білком, яка включає серотипи 1, 2, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F і 23F. Інші PCVs охоплювали 7, 10, 11 або 13 з серотипів, що містяться в PCV-15, але для деяких серотипів спостерігалася імунна інтерференція (наприклад, знижений захист від серотипу 3 при застосуванні GSK's PCV-11) і знижений показник відповіді проти серотипу 6B при застосуванні Pfizer's PCV-13. Див. Prymula et al., 2006, Lancet 367:740-48 і Kieninger et al., Safety і Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as а 4-Dose Series in Healthy Infants і Toddlers, presented at the 48th Annual ICAAC/ISDA 46th Annual Meeting, Washington DC, October 25-28, 2008. Суть винаходу Даний винахід стосується імуногенної композиції, що містить (1) полівалентну суміш кон’югатів полісахаридів з білком, яка складається з капсульних полісахаридів 15 різних серотипів S. pneumoniae, кон’югованих з білком-носієм і (2) фармацевтично прийнятного носія. Більш конкретно, даний винахід стосується 15-валентної вакцинної композиції на основі пневмококового кон’югату (PCV-15), що містить полівалентну суміш кон’югатів полісахаридів з білком, що складається з капсульних полісахаридів з серотипів 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F і 33F S. Pneumoniae, кон’югованих з білком-носієм; і фармацевтично прийнятного носія. У одному конкретному варіанті здійснення імуногенна композиція містить капсульні полісахариди серотипів 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F і 33F, і білком-носієм є CRM197. У деяких варіантах здійснення композиція додатково містить ад’ювант. У деяких варіантах здійснення ад’ювантом є ад’ювант на основі алюмінію, такий як фосфат алюмінію, сульфат 1 UA 106115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 алюмінію або гідроксид алюмінію. У окремому варіанті здійснення винаходу ад’ювантом є фосфат алюмінію. Даний винахід також стосується способу індукування імунної відповіді проти капсульного полісахариду S. pneumoniae, що містить введення людині імунологічно ефективної кількості імуногенної композиції, описаної вище. Даний винахід додатково стосується імуногенної композиції, що вводиться в однократній дозі 0,5 мл, що містить в складі: 2 мкг кожного полісахариду, за винятком 6B в кількості 4 мкг; приблизно 32 мкг CRM197 білка-носія; 0,125 мг ад’юванту на основі елементарного алюмінію (0,5 мг фосфату алюмінію); 150 мМ хлориду натрію і 20 мМ L-гістидинового буфера. Короткий опис креслень ® Фіг. 1: Порівняння GMCs для PCV-15 відносно Prevnar у дитинчат макак-резус (серотипи Prevnar, PD-2 і PD-3). Планки погрішностей означають 2 стандартні помилки. ® Фіг. 2: Серотипспецифічні GMCs до серотипів, що не міститься в Prevnar , у дитинчат макакрезус, імунізованих за допомогою PCV-15. Планки погрішностей означають 2 стандартні помилки. Фіг. 3: NZWR-1: Порівняння середніх геометричних значень титрів у кроликів, імунізованих PCV-15 без (0xA) або з АРА (B1) (після введення дози 2). Планки погрішностей означають 95% CI на середньому геометричному значенні відмінності кратності (PCV-15 без АРА/PCV-15 з АРА). Докладний опис винаходу Даний винахід стосується полівалентної імуногенної композиції, що містить, яка складається головним чином з, або альтернативно, що складається з 15 відмінних один від одного кон’югатів полісахаридів з білком, де кожний з кон’югатів містить відмінний від інших капсульний полісахарид, кон’югований з білком-носієм, і де капсульні полісахариди отримують з серотипів 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F і 33F S. pneumoniae, разом з фармацевтично прийнятним носієм. У деяких варіантах здійснення білком-носієм є CRM197. Імуногенна композиція може додатково містити ад’ювант, такий як ад’ювант на основі алюмінію, такій як фосфат алюмінію, сульфат алюмінію і гідроксид алюмінію. Даний винахід також стосується способу індукування імунної відповіді на кон’югат капсульного полісахариду S. pneumoniae, що містить введення людині імунологічно ефективної кількості вищезгаданої полівалентної імуногенної композиції. Як представлено в прикладах, infra., доклінічні дослідження на дитинчатах макак-резус продемонстрували сильні відповіді антитіл на всі 15 серотипів в PCV-15, які є порівнянними з ® відповідями на 7 широко відомих серотипів в Prevnar . Висновок авторів заявки полягає в тому, що 15-валентна вакцина на основі пневмококового кон’югата, що включає додавання нових кон’югатів полісахаридів з білком, які містять серотипи 22F і 33F, представляє сильні відповіді антитіл, демонструє придатність розширюваного покриття пневмококових серотипів, не охоплених існуючими вакцинами проти пневмококових інфекцій. Термін "містить", який використовується для імуногенної композиції за винаходом стосується включення будь-яких компонентів (предмет для обмежень виразу «що складається з» для суміші антигенів), таких як ад’юванти і ексципієнти. Термін «що складається з» у разі використання відносно полівалентної суміші кон’югатів полісахаридів з білком стосується суміші, що має ті 15 специфічні кон’югати полісахаридів S. pneumoniae з білком і жодний інший кон’югат полісахаридів з білком від S. pneumoniae відмінного від них серотипу. Кон’югати капсульних полісахаридів Streptococcus pneumoniae з білком Капсульні полісахариди Steptococcus pneumoniae можна отримувати за допомогою стандартних способів, відомих фахівцям в даній галузі. Наприклад, полісахариди можна виділяти з бактерій і можна доводити їх розмір до певної міри відомими способами (Див., наприклад, European Patent №№ EP497524 і EP497525) і переважно за допомогою мікрофлюїдизації. Полісахариди можна розсортувати по розміру, щоб зменшити в'язкість в зразках полісахаридів і/або поліпшити фільтрованість для кон’югованих засобів. У даному винаході, капсульні полісахариди отримують з серотипів 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F і 33F S. pneumoniae. У одному з варіантів здійснення кожний пневмококовий полісахаридний серотип вирощують в соєвому середовищі. Індивідуальні полісахариди потім очищають за допомогою стандартних стадій, що включають центрифугування, осадження і ультрафільтрацію. Див., наприклад, публікацію патентної заявки США № 2008/0286838 і патент США № 5847112. Білки-носії є переважно білками, які є нетоксичними і нереактогенними і доступними в достатній кількості і ступені очищення. Білок-носій можна кон’югувати з або приєднувати до полісахариду S. pneumoniae для підвищення імуногенності полісахариду. Білки-носії повинні 2 UA 106115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 піддаватися стандартним процедурам кон’югування. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу як білок-носій застосовують CRM197. У одному з варіантів здійснення кожний капсульний полісахарид кон’югують з тим же білком-носієм (кожну молекулу капсульного полісахариду кон’югують з одиничним білком-носієм). У іншому варіанті здійснення капсульні полісахариди кон’югують з двома або більше білками-носіями (кожну молекулу капсульного полісахариду кон’югують з одиничним білком-носієм). У такому варіанті здійснення, кожний капсульний полісахарид того ж серотипу, як правило, кон’югують з тим же білком-носієм. CRM197 є нетоксичним варіантом (тобто анатоксином) дифтерійного токсину. У одному з варіантів здійснення його виділяють з культур штаму Corynebacterium diphtheria C7 (β197), вирощеного в касамінових кислотах і в середовищі на основі дріжджового екстракту. У іншому варіанті здійснення CRM197 отримують рекомбінантно відповідно до способів, описаних в патенті США № 5614382. Як правило, CRM197 очищають за допомогою комбінації ультрафільтрації, осадження сульфатом амонію і іонообмінної хроматографії. У деяких варіантах здійснення CRM197 отримують в Pseudomonas fluorescens за допомогою Pfenex Expression Technology™ (Pfenex Inc., San Diego, CA). Інші прийнятні білки-носії включають додаткові інактивовані бактеріальні токсини, такі як DT (дифтерійний анатоксин), TT (правцевий анатоксин) або фрагмент С TT, коклюшний анатоксин, холерний анатоксин (наприклад, як описано в публікації міжнародної патентної заявки № WO 2004/083251), Е. coli LT, Е. coli ST і екзотоксин А Pseudomonas aeruginosa. Також можна застосовувати білки бактеріальної зовнішньої мембрани, такі як комплекс зовнішньої мембрани з (OMPC), порини, трансферинзв'язувальні білки, пневмококовий поверхневий білок А (PspA; Див. публікацію міжнародної патентної заявки № WO 02/091998), пневмококовий білок адгезин (PsaA), пептидаза C5a стрептококів групи А або групи В, або білок D Haemophilus influenzae, пневмококовий пневмолізин (Kuo et al., 1995, Infect Immun. 63; 2706-13), включаючи пневмолізин (ply), детоксифікований в деякому відношенні, наприклад, dPLY-GMBS (Див. публікація міжнародної патентної заявки № WO 04/081515) або dPLY-формол, PhtX, включаючи PhtA, PhtB, PhtD, PhtE і злиття Pht білків, наприклад, злиття PhtDE, злиття PhtBE (Див. публікацію міжнародної патентної заявки №№ WO 01/98334 і WO 03/54007). Як білки-носії також можна застосовувати інші білки, такі як яєчний альбумін, гемоціанін морського блюдця (KLH), бичачий сироватковий альбумін (BSA) або очищене білкове похідне туберкуліну (PPD), PorB (from N. meningitidis), PD (білок D Haemophilus influenzae; Див., наприклад, європейський патент № EP 0594610 В), або їх імунологічно функціональні еквіваленти, синтетичні пептиди (Див. європейський патент №№ EP 0378881 і EP 0427347), білки теплового шоку (Див. публікацію міжнародної патентної заявки №№ WO 93/17712 і WO 94/03208), коклюшні білки (Див. публікацію міжнародної патентної заявки № WO 98/58668 і європейський патент № EP 0471177), цитокіни, лімфокіни, фактори росту або гормони (Див. публікацію міжнародної патентної заявки № WO 91/01146), штучні білки, що містять множинні епітопи CD4+ Т-клітин людини з різних антигенів, отриманих з різних патогенних мікроорганізмів (Див. Falugi el al., 2001, Eur J Immunol. 31:3816-3824), такі як білок N19 (Див. Baraldoi et al., 2004, Infect Immun. 72:4884-7), білки захоплення заліза (Див. публікацію міжнародної патентної заявки № WO 01/72337), токсин А або В C. difficile (Див. публікацію міжнародної патентної заявки № WO 00/61761) і флагелін (Див. Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol. Lett 64:9). Можна використовувати інші мутанти DT, такі як CRM176, CRM228, CRM 45 (Uchida et al., 1973, J Biol. Chem. 218:3838-3844); CRM 9, CRM 45, CRM 102, CRM 103 і CRM 107 і інші мутації, описані Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; делецію або мутацію Glu-148 на Asp, Gin або Ser і/або Ala 158 на Gly і інші мутації, описані в патенті США № 4709017 або патенті США № 4950740; мутацію щонайменше одного або декількох залишків Lys 516, Lys 526, Phe 530 і/або Lys 534 і інші мутації, описані в патенті США № 5917017 або патенті США № 6455673; або фрагмент, описаний в U.S. Pat. № 5843711. Очищені полісахариди хімічно активовані для того, щоб зробити сахариди здатними взаємодіяти з білком-носієм. Будучи активованим, кожний капсульний полісахарид нарізно кон’югують з білком-носієм для утворення глікокон’югату. Кон’югати полісахаридів можна отримувати за допомогою відомих методів зв’язування. У одному з варіантів здійснення хімічна активація полісахаридів і подальша кон’югація з білком-носієм досягається засобами, описаними в патентах США №№ 4365170, 4673574 і 4902506. У короткому викладі, ця хімія спричиняє за собою активацію пневмококового полісахариду за допомогою реакції з будь-яким окисником, який окиснює термінальну гідроксильну групу до альдегіду, такого як перйодат (включаючи перйодат натрію, перйодат калію або перйодова кислота). Ця реакція веде до випадкового окиснювального розщеплення віцинальних гідроксильних груп вуглеводів з утворенням реактивних альдегідних груп. 3 UA 106115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зв’язування з білком-носієм (наприклад, CRM197) можна зробити за допомогою відновного амінування через пряме амінування груп лізилу білка. Наприклад, кон’югацію проводять за допомогою реакції суміші активованого полісахариду і білка-носія з відновником, таким як ціаноборгідрид натрію. Альдегіди, які не прореагували, потім блокуються додаванням сильного відновника, такого як боргідрид натрію. У іншому варіанті здійснення спосіб кон’югації може бути оснований на активації сахариду за допомогою тетрафторборату 1-ціано-4-диметиламінопіридинію (CDAP) для утворення складного ефіру ціанату. Активований сахарид можна, таким чином, зв'язати прямо або за допомогою спейсерної (лінкерної) групи з аміногрупою білка-носія. Наприклад, спейсером міг би бути цистамін або цистеамін для утворення тіолованого полісахариду, який можна було б з'єднати з носієм через тіоефірний зв'язок, отриманий після реакції з білком-носієм, активованим малеінімідом (наприклад, із застосуванням GMBS), або галогенацетилованим білком-носієм з використанням хімії карбодііміду (наприклад, з використанням йодацетаміду [наприклад, етилового йодацетаміду HCl] або N-сукцинімідил бромацетату або SIAB, або SIA, або SBAP). Переважно, складний ефір ціанової кислоти (необов'язково вироблений хімією CDAP) зв'язують з гександіаміном або дигідразидом адипінової кислоти (ADH), і амінодериватизований сахарид, кон’югують з білком-носієм з використанням хімії карбодііміду (наприклад, EDAC або EDC) через карбоксильну групу білка-носія. Такі кон’югати описані в публікації міжнародної патентної заявки №№ WO93/15760, WO 95/08348 і WO 96/29094; і Chu et al., 1983, Infect Immunity 40:245-256. У інших прийнятних методах застосовують карбодііміди, гідразиди, активні складні ефіри, норборан, п-нітробензойну кислоту, Н-гідроксисукцинімід, S-NHS, EDC, TSTU. Багато які методи описані в публікації міжнародної патентної заявки № WO 98/42721. Кон’югація може ввести в дію карбонільний лінкер, який можна утворити за допомогою реакції вільної гідроксильної групи сахариду з CDI (Див. Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18), за якою йде реакція з білком для утворення карбаматного зв'язку. Це може спричинити скорочення аномерного кінця первинної гідроксильної групи, опційний захист/зняття захисту первинної гідроксильної групи, реакцію первинної гідроксильної групи з CDI для утворення проміжної сполуки CDI карбамату і зв’язування проміжної сполуки CDI карбамату з аміногрупою білка. У одному з варіантів здійснення перед отриманням лікарського засобу кожний пневмококовий капсульний полісахаридний антиген окремо очищають від S. pneumoniae, активують для утворення реактивних альдегідів, а потім ковалентно кон’югують із застосуванням відновного амінування з білком-носієм CRM197. Після кон’югації капсульного полісахариду з білком-носієм кон’югати полісахаридів з білком очищають (збагачують відповідно до кількості кон’югату полісахариду з білком) за допомогою одного або декількох з множини методів. Приклади цих методів добре відомі фахівцеві в даній галузі і включають проведення концентрації/діафільтрації, ультрафільтрації, осадження/елюції, хроматографії на колонках і глибинного фільтрування (Див., наприклад, патент США № 6146902.) Фармацевтичні/вакцинні композиції Даний винахід додатково стосується композицій, що включають фармацевтичні, імуногенні і вакцинні композиції, що містять, які складаються головним чином з, або альтернативно, які складаються з 15 відмінних один від одного кон’югатів полісахаридів з білком, де кожний з кон’югатів містить відмінний від інших капсульний полісахарид, кон’югований з білком-носієм, і де капсульні полісахариди отримують з серотипів 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F і 33F S. pneumoniae, разом з фармацевтично прийнятним носієм і ад’ювантом. Ці пневмококові кон’югати отримують за допомогою роздільних процесів, і з цієї маси складають єдину лікарську форму. Як визначено в даному винаході, "ад’ювант" є речовиною, яка служить для підвищення імуногенності імуногенної композиції за винаходом. Імунний ад’ювант може підвищувати імунну відповідь на антиген, який є слабко імуногенним, при введенні окремо, наприклад, не індукуючи або індукуючи слабкі титри антитіл або клітинноопосередковану імунну відповідь, збільшує титри антитіл до антигену, і/або знижує дозу антигену, ефективну для досягнення імунної відповіді у індивідуума. Таким чином, ад’юванти часто використовують, щоб стимулювати імунну відповідь, і вони добре відомі кваліфікованому фахівцеві в даній галузі. Прийнятні ад’юванти для підвищення ефективності цієї композиції як необмежувальні приклади включають: (1) солі алюмінію (алюмінієві галуни), такі як гідроксид алюмінію, фосфат алюмінію, сульфат алюмінію і т. д.; 4 UA 106115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (2) склади емульсій типу «масло-в-воді» (з або без інших специфічних імуностимулюючих засобів, таких як мураміл пептиди (визначені вище) або компоненти бактеріальної клітинної стінки), таких як, наприклад, (a) MF59 (публікація міжнародної патентної заявки № WO 90/14837), що містить 5% сквалену, 0,5% твіну 80, і 0,5% спану 85 (що необов'язково містить різні кількості MTP-PE), сформовані в субмікронні частинки із застосуванням мікрофлюїдизатора, такого як Model 110Y microfluidizer (Microfluidics, Newton, MA), (b) що містить 10% сквалену, 0,4% твіну 80, 5% плюронікблокованого полімера L121 і thr-MDP, або мікрофлюїдизованого в субмікронну емульсію або вортексованого для утворення емульсії частинок більшого розміру, (с) Ribi™ ад’ювантна система(RAS) (Corixa, Hamilton, MT), яка містить 2% сквалену, 0,2% твіну 80 і один або декілька компонентів бактеріальної клітинної стінки з групи, яка складається з 3-O-деацетилованого монофосфорилліпіду А (MPL™), описаного в патенті США № 4912094, диміколату трегалози (TDM) і каркаса клітинної стінки (CWS), переважно MPL+CWS (Detox™); і (d) Montanide ISA; (3) можна використовувати ад’юванти на основі сапоніну, такі як Quil А або STIMULON™ QS21 (Antigenics, Framingham, MA) (Див., наприклад, патент США № 5057540) або частинки, утворені з них, такі як ISCOM (імуностимулюючі комплекси, утворені за допомогою комбінації холестерину, сапоніну, фосфоліпіду і амфіпатичних білків) і Iscomatrix® (який має головним чином ту ж саму структуру, що і ISCOM, але без білка); (4) бактеріальні ліпополісахариди, синтетичні аналоги ліпіду А, такі як сполуки аміноалкілглюкозамін фосфату (AGP), або їх похідні або аналоги, які є доступними в Corixa, і які описані в патенті США № 6113918; один такий AGP є 2-[(R)-3тетрадеканоїлокситетрадеканоїламіно]етил-2-Дезокси-4-О-фосфоно-3-О-[(R)-3тетрадеканоїлокситетрадеканоїл]-2-[(R)-3-тетрадеканоїлокситетрадеканоїламіно]-b-Dглюкопіранозид, який також відомий, як 529 (раніше відомий як RC529), який формують у вигляді водної форми або у вигляді стабільної емульсії; (5) синтетичні полінуклеотиди, такі як олігонуклеотиди, що містять CpG мотив(и) (патент США № 6207646); і (6) цитокіни, такі як інтерлейкіни (наприклад, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 і т. д.), інтерферони (наприклад, гамма інтерферон), гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (GM-CSF), макрофагальний колонієстимулюючий фактор (M-CSF), фактор некрозу пухлини (TNF), костимулюючі молекули B7-1 і B7-2 і т. д.; і (7) комплемент, такий як тример компонента комплементу C3d. У іншому варіанті здійснення ад’ювантом є суміш 2, 3 або більше вищеописаних ад’ювантів, наприклад, SBAS2 (емульсія «масло-в-воді», яка також містить 3-деацетилований монофосфорилліпід А і QS21). Мурамілпептиди як необмежувальні приклади включають, N-ацетил-мураміл-L-треоніл-Dізоглутамін(thr-MDP), N-ацетил-нормураміл-L-аланін-2-(1'-2'дипальмитоїл-sn-гліцеро-3гідроксифосфорилокси)етиламін (MTP-PE) і т. д. У певних варіантах здійснення ад’ювантом є сіль алюмінію. Ад’юванти на основі солі алюмінію можуть бути вакциною, осадженою галунами алюмінію, або вакциною, адсорбованою галунами алюмінію. Ад’юванти на основі солі алюмінію добре відомі в даній галузі і описані, наприклад, в Harlow, Е. і D. Lane (1988; Antibodies: А Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) і Nicklas, W. (1992; Aluminium salts. Research in Immunology 143:489-493). Сіль алюмінію як необмежувальні приклади включає гідратований оксид алюмінію, гідрат оксиду алюмінію, тригідрат оксиду алюмінію (АТН), гідрат алюмінію, тригідрат алюмінію, алгідрогель, суперфос, амфогель, гідроксид алюмінію (III), гідроксифосфат сульфат алюмінію (ад’ювант на основі фосфату алюмінію (АРА)), аморфний оксид алюмінію, тригідрат оксиду алюмінію або тригідроксиалюміній. АРА є водною суспензією гідроксифосфату алюмінію. АРА проводять за допомогою змішування хлориду алюмінію і фосфату натрію в об'ємному співвідношенні 1:1 для осадження гідроксифосфату алюмінію. Після процесу змішування речовину подрібнюють за допомогою мішалки з великими зсувними зусиллями для досягнення цільового розміру складової частинки в діапазоні 2-8 мкм. Продукт потім діафільтрують в фізіологічному розчині і потік стерилізують. У деяких варіантах здійснення комерційно доступний Al(OH) 3 (наприклад, алгідрогель або суперфос виробництва Denmark/Accurate Chemical і Scientific Co., Westbury, NY) застосовують для адсорбції білків в співвідношенні 50-200 г білка/мг гідроксиду алюмінію. Адсорбція білків залежить в іншому варіанті здійснення від pI (ізоелектричний pH) білка і pH середовища. Позитивно заряджений іон алюмінію адсорбує білок з більш низьким pI більш сильно, ніж білок з більш високим pI. Солі алюмінію можуть утворювати депо Ag, який повільно вивільняється протягом 2-3 тижнів, можуть брати участь в неспецифічній активації макрофагів і активації 5 UA 106115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 комплементу і/або можуть стимулювати внутрішньо властивий імунний механізм (можливо за допомогою стимуляції сечової кислоти). Див., наприклад, Lambrecht et al., 2009, Curr Opin. Immunol. 21:23. Моновалентні основні водні кон’югати, як правило, перемішують разом, і розбавляють до цільових 8 мкг/мл для всіх серотипів за винятком 6B, який розбавляють до цільових 16 мкг/мл. Після розбавлення партію стерилізують за допомогою фільтрації, і однаковий об'єм ад’юванту фосфату алюмінію додають в стерильних умовах до цільової кінцевої концентрації алюмінію 250 мкг/мл. Після додавання ад’юванту сформовану партію фасують в ампули для однократного застосування в дозі 0,5 мл. У деяких варіантах здійснення ад’ювантом є CpG-вмісна нуклеотидна послідовність, наприклад, CpG-вмісний олігонуклеотид, зокрема, що CpG-містить олігодезоксинуклеотид (CpG ODN). У іншому варіанті здійснення ад’ювантом є ODN 1826, який можна придбати в Coley Pharmaceutical Group. "CpG-вмісний нуклеотид," "CpG-містить олігонуклеотид," "CpG олігонуклеотид", і подібні терміни стосуються нуклеотидної молекули з 6-50 нуклеотидів по довжині, яка містить неметиловану CpG функціональну групу. Див., наприклад, Wang et al., 2003, Vaccine 21:4297. У іншому варіанті здійснення передбачається будь-яке інше прийняте в цій галузі визначення термінів. CpG-вмісні олігонуклеотиди включають модифіковані олігонуклеотиди із застосуванням будь-яких синтетичних міжнуклеозидних зв'язків, модифіковані основи і/або модифікований цукор. Способи застосування CpG олігонуклеотидів добре відомі в даній галузі, і описані, наприклад, в Sur et al., 1999, J Immunol. 162:6284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol. Med. 127:13958; і Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110. Введення/Дозування Композиції і склади за даним винаходом можна використовувати для захисту і лікування людини, схильної до пневмококової інфекції, за допомогою введення вакцини системним способом або через слизову оболонку. У одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способу індукування імунної відповіді на кон’югат капсульного полісахариду S. pneumoniae, що містить введення людині імунологічно ефективної кількості імуногенної композиції за даним винаходом. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способу вакцинації людини від пневмококової інфекції, що включає стадію введення людині імунологічно ефективної кількості імуногенної композиції за даним винаходом. "Ефективна кількість" композиції за винаходом стосується дози, необхідної для того, щоб спричинити утворення антитіл, яка значно знижує імовірність або ступінь тяжкості інфекційності S. pneumoniae протягом подальшого можливого зараження. Способи за винаходом можна використовувати для профілактики і/або зниження первинних клінічних синдромів, викликаних S. pneumoniae, що включають і інвазивні інфекції (менінгіт, пневмонія і бактеріємія), і неінвазивні інфекції (гострий середній отит і синусит). Введення композицій за винаходом може включати одну або декілька: ін'єкцій за допомогою внутрішньом'язового, інтраперитонеального, інтрадермального або підшкірного введення; або введення через слизову оболонку перорально/аліментарно, через дихальні або сечостатеві шляхи. У одному з варіантів здійснення для лікування пневмонії або середнього отиту застосовують інтраназальне введення (в зв'язку з тим, що носоглоткове носійство пневмокока можна попереджати більш ефективно, таким чином, знижуючи вірулентність мікроорганізмів інфекції на її найбільш ранній стадії). Кількість кон’югату в кожній вакцинній дозі вибирають в кількості, яка індукує імунопротективну відповідь без значного несприятливого впливу. Така кількість може варіювати залежно від серотипу пневмокока. Як правило, кожна доза містить від 0,1 до 100 мкг кожного полісахариду, конкретно від 0,1 до 10 мкг, і більш конкретно від 1 до 5 мкг. Наприклад, кожна доза може містити 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, або 750 нг або 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або 100 мкг. Оптимальні кількості компонентів для конкретної вакцини можуть бути встановлені стандартними дослідженнями із залученням спостережень відповідних імунних відповідей у індивідуумів. Наприклад, в іншому варіанті здійснення дозування для вакцинації людини визначають за допомогою екстраполювання даних дослідження на тваринах на дані про людину. У іншому варіанті здійснення дозування визначають емпірично. У одному з варіантів здійснення доза солі алюмінію становить 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 або 700 мкг або 1, 1,2, 1,5, 2, 3, 5 мкг або більше. У ще одному варіанті здійснення доза алюмінієвих галунів, описаних вище, приводиться на мкг рекомбінантного білка. 6 UA 106115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У окремому варіанті здійснення даного винаходу вакцина PCV-15 представляє стерильний рідкий склад з пневмококових капсульних полісахаридів серотипів 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F і 33F, окремо кон’югованих з CRM197. Кожні 0,5 мл дози формулюють до складу: 2 мкг кожного сахариду, за винятком 4 мкг для 6B; приблизно 32 мкг для білка-носія CRM197 (наприклад, 32 мкг ±5 мкг, ±3 мкг, ±2 мкг, або ±1 мкг); 0,125 мг ад’юванту з елементарного алюмінію (0,5 мг фосфату алюмінію); і хлорид натрію і L-гістидиновий буфер. Концентрація хлориду натрію становить приблизно 150 мМ (наприклад, 150 мМ ± 25 мМ, ± 20 мМ, ± 15 мМ, ± 10 мМ або ± 5 мМ) і приблизно 20 мМ (наприклад, 20 мМ ± 5 мМ, ± 2,5 мМ, ± 2 мМ, ± 1 мМ, або ± 0,5 мМ) L-гістидиновий буфер. Відповідно до будь-яких способів за даним винаходом і в одному з варіантів здійснення пацієнтом є людина. У певних варіантах здійснення пацієнтом є немовля людини (у віці молодше 1 року), дитина ясельного віку (приблизно від 12 до 24 місяців), або маленька дитина (приблизно від 2 до 5 років). У інших варіантах здійснення пацієнтом є немолодий пацієнт (>65 років). Композиції за даним винаходом також придатні для застосування по відношенню до дітей, більш старшого віку, підлітків і дорослих (наприклад, у віці від 18 до 45 років або від 18 до 65 років). У одному з варіантів здійснення способів за даним винаходом композицію за даним винаходом вводять як однократне щеплення. У іншому варіанті здійснення вакцину вводять двічі, три рази або чотири рази або більше, рознесеними за часом належним чином. Наприклад, композицію можна вводити з інтервалами в 1, 2, 3, 4, 5 або 6 місяців або в будь-якому їх поєднанні. Режим імунізації може слідувати такому порядку, який призначений для пневмококових вакцин. Наприклад, по встановленому режиму вакцинація немовлят і дітей ясельного віку від інвазивного захворювання, викликаного S. pneumoniae проводять у віці 2, 4, 6 і 12-15 місяців. Таким чином, в переважному варіанті здійснення композицію вводять у вигляді серії з 4 доз у віці 2,4, 6 і 12-15 місяців. Композиції за даним винаходом також можуть включати один або декілька білків S. pneumoniae. Приклади білків S. Pneumoniae, прийнятні для включення, включають ті, які ідентифіковані в публікації міжнародної патентної заявки №№ WO 02/083855 і WO 02/053761. Склади Композиції за винаходом можна вводити індивідууму одним або декількома способами, відомими фахівцеві в даній галузі, такими як парентерально, черезслизово, черезшкірно, внутрішньом'язово, внутрішньовенно, інтрадермально, інтраназально, підшкірно, інтраперитонеально, і вони можуть бути складені відповідним чином. У одному з варіантів здійснення композиції за даним винаходом вводять за допомогою епідермальної ін'єкції, внутрішньом'язової ін'єкції, внутрішньовенної, внутрішньоартеріальної, підшкірної ін'єкції або ін'єкції через слизову дихальних шляхів у вигляді рідкого препарату. Рідкі склади для ін'єкції включають розчини і т. п. Композицію за винаходом можна складати у вигляді ампул з однократною дозою, ампул з багаторазовою дозою або попередньо заповнених шприців. У іншому варіанті здійснення композиції за даним винаходом вводять перорально, і вони, таким чином, складені в формі, прийнятній для перорального введення, тобто як твердий або рідкий препарат. Тверді пероральні склади включають таблетки, капсули, пілюлі, гранули, осади і т. п. Рідкі пероральні склади включають розчини, суспензії, дисперсії, емульсії, масла і т. п. Фармацевтично прийнятними носіями для рідких складів є водні або неводні розчини, суспензії, емульсії або масла. Прикладами неводних розчинників є пропіленгліколь, поліетиленгліколь і ін'єкційні органічні складні ефіри, такі як етилолеат. Водні носії включають воду, спиртові/водні розчини, емульсії або суспензії, що включають фізіологічний розчин і буферні середовища. Прикладами масел є масла тваринного, олії рослинного або синтетичного походження, наприклад, арахісова олія, соєва олія, оливкова олія, соняшникова олія, жир печінки риби, інші жири морських тварин або ліпід з молока або яєць. Фармацевтична композиція може бути ізотонічною, гіпотонічною або гіпертонічною. Однак часто переважними фармацевтичними композиціями для інфузії або ін'єкції є в основному ізотонічні у разі їх введення. Таким чином, для зберігання фармацевтичної композиції можуть бути переважними ізотонічні або гіпертонічні. Якщо фармацевтична композиція є гіпертонічною для зберігання перед введенням її можна розчинити, щоб вона стала ізотонічним розчином. Засобом надання ізотонічності може бути іонний засіб надання ізотонічності, такий як сіль, або неіонний засіб надання ізотонічності, такий як вуглевод. Приклади іонних засобів надання ізотонічності як необмежувальні приклади включають NaCl, CaCl2, KCl і MgCl2. Приклади неіонних засобів надання ізотонічності як необмежувальні приклади включають маніт, сорбіт і гліцерин. 7 UA 106115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також переважно, щоб щонайменше одна фармацевтично прийнятна добавка була буфером. Для деяких цілей, наприклад, коли фармацевтична композиція передбачається для інфузії або ін'єкції, часто бажано, щоб композиція містила буфер, який здатний додавати буферну місткість розчину з pH в діапазоні від 4 до 10, такому як від 5 до 9, наприклад від 6 до 8. Буфер можна, наприклад, вибрати з групи, яка складається з трісу, ацетату, глутамату, лактату, малеату, тартрату, фосфату, цитрату, карбонату, гліцинату, гістидину, гліцину, сукцинату і триетаноламінового буфера. Крім того, буфер може бути, наприклад, вибраний з буферів, сумісних з USP, для парентерального застосування, зокрема, коли фармацевтичний склад призначений для парентерального застосування. Наприклад, буфер можна вибрати з групи, яка складається з одноосновних кислот, таких як оцтова, бензойна, глюконова, гліцеринова і молочна; двоосновних кислот, таких як аконітова, адипінова, аскорбінова, вугільна, глутамінова, яблучна, бурштинова і винна, поліосновних кислот, таких як лимонна і фосфорна; і основ, таких як аміак, діетаноламін, гліцин, триетаноламін і тріс. Парентеральні носії (для підшкірної, внутрішньовенної, внутрішньоартеріальної або внутрішньом'язової ін'єкції) включають розчин хлориду натрію, декстрозу Рінгера, декстрозу і хлориду натрію, лактований розчин Рінгера і жирні масла. Внутрішньовенні носії включають рідкий і поживний наповнювачі, електролітні наповнювачі, такі які основані на декстрозі Рінгера і т. п. Прикладами є стерильні рідини, такі як вода і масла, з або без додавання поверхневоактивної речовини і інших фармацевтично прийнятних ад’ювантів. У основному, вода, фізіологічний розчин, водна декстроза і родинні цукрові розчини, гліколі, такі як пропіленгліколі або поліетиленгліколь, і полісорбат-80 є переважними рідкими носіями, особливо для ін'єкційних розчинів. Прикладами масел є масла тваринного, олії рослинного або синтетичного походження, наприклад, арахісова олія, соєва олія, оливкова олія, соняшникова олія, масло печінки риби, жири інших морських тварин або ліпід з молока або яєць. Склади за винаходом можуть також містити поверхнево-активну речовину. Переважні поверхнево-активні речовини як необмежувальні приклади включають: поверхнево-активні речовини на основі складних ефірів поліоксіетиленсорбітану (як правило, що позначаються як твіни), особливо, полісорбат 20 і полісорбат 80; співполімери етиленоксиду (EO), пропіленоксиду (PO) і/або бутиленоксиду (BO), що продаються під торговою маркою DOWFAX™, такі як лінійні EO/PO блок-співполімери; октоксиноли, у яких може варіювати число повторюваних етоксигруп (окси-1,2-етандіїл), з октоксинолом-9 (тритон X-100 або tоктилфеноксиполіетоксіетанол), що представляє особливий інтерес; (октилфенокси)поліетоксиетанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфоліпіди, такі як фосфатидилхолін (лецитин); етоксилати нонілфенолу, такі як серія Tergitol™ NP; жирні прості ефіри поліоксіетилену, похідні від лаурил, сетил, стеарил і олеїлових спиртів (відомих як поверхнево-активні речовини Бридж), такі як простий ефір триетиленгліколю і монолаурилу (Бридж 30); і складні ефіри сорбітану (загальновідомі як SPANs), такі як триолеат сорбітану (Span 85) і сорбітанмонолаурат. Переважною поверхнево-активною речовиною для включення в емульсію є твін 80 (поліоксіетилен сорбітан моноолеат). Можна використовувати суміші поверхнево-активних речовин, наприклад, суміші твін 80/спан 85. Комбінація складного ефіру поліоксіетилен сорбітану, такого як поліоксіетилен сорбітан моноолеат (твін 80) і октоксинолу, такого як t-октилфеноксиполіетоксіетанол (тритон X100) також є прийнятними. Інша придатна комбінація містить лаурет 9 плюс складний ефір поліоксіетилен сорбітану і/або октоксинол. Переважними кількостями поверхнево-активних речовин (% по масі) є: складні ефіри поліоксіетилен сорбітану (такі як твін 80) від 0,01 до 1%, зокрема, приблизно 0,1%; октил- або нонілфеноксиполіоксиетаноли (такі як тритон X-100 або інші детергенти в серії тритону) від 0,001 до 0,1%, зокрема, від 0,005 до 0,02%; прості ефіри поліоксіетилену (такі як лаурет 9) від 0,1 до 20%, переважно від 0,1 до 10%, і, зокрема, від 0,1 до 1%, або приблизно 0,5%. У іншому варіанті здійснення фармацевтична композиція доставляється в системі контрольованого вивільнення. Наприклад, засоби можна вводити з використанням внутрішньовенної інфузії, трансдермального пластиру, ліпосом або інших способів введення. У іншому варіанті здійснення використовують полімерні матеріали; наприклад, в мікросферах або імплантатах. Крім того, винахід включає сполуки, модифіковані ковалентним приєднанням водорозчинних полімерів, таких як поліетиленгліколь, співполімери поліетиленгліколю і поліпропіленгліколю, карбоксиметилцеллюлози, декстрану, полівінілового спирту, полівінілпіролідону або поліпроліну. Такі модифікації можуть збільшувати розчинність сполуки у водному розчині, 8 UA 106115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 усувати агрегацію, підвищувати фізичну і хімічну стабільність сполуки і багато в чому знижувати реактогенність сполук. У іншому варіанті здійснення бажана in vivo біологічна активність досягається введенням таких полімерних сполук абдуктів менш часто або в більш низьких дозах, ніж немодифікованих сполук. У переважному варіанті здійснення вакцинну композицію формулюють в L-гістидиновому буфері з хлоридом натрію. Описавши різні варіанти здійснення винаходу з посиланням на супутні описи і малюнки, потрібно розуміти, що винахід не обмежений тими точними варіантами здійснення, і що в ньому можуть бути реалізовані різні зміни і модифікації фахівцем в даній галузі без відхилення від об'єму або суті винаходу, як визначено в прикладеній формулі винаходу. Наступні приклади ілюструють, але не обмежують винахід. ПРИКЛАДИ Приклад 1 Отримання капсульних полісахаридів S. Pneumoniae Способи культивування пневмококів добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52. Способи отримання пневмококових полісахаридів також добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, європейський патент № EP0497524. Ізоляти пневмококових підтипів доступні в ATCC. Ці бактерії ідентифіковані як інкапсульовані нерухомі грампозитивні диплококи в формі ланцета, які є альфа-гемолітичними на кров-агарі. Підтипи розрізнюють на основі реакції Квеллінга з використанням специфічних антисироваток. Див., наприклад, патент США № 5847112. Банки клітин Банки клітин, що представляють кожний з серотипів S. Pneumococcus, присутніх в PCV-15, отримували в Merck Culture Collection (Rahway, N.J.) в заморожених пробірках. Посів мікробів Відталу посівну культуру переносили в посівний ферментер, що містить прийнятні попередньо стерилізовані середовища для вирощування. Вирощування посіву Культуру вирощували в посівному ферментері при контролі температури і pH. Повний об'єм посівного ферментера переносили в ферментер для виробництва, що містить попередньо стерилізоване середовище для вирощування. Вирощування для виробництва Вирощування для виробництва було кінцевою стадією процесу вирощування клітин. Температура, pH і швидкість перемішування контролювалися. Інактивація Процес вирощування обмежували за допомогою додавання інактиватора. Після інактивації партію переносили в інактиваційний бак, де вона підтримувалася при контрольованій температурі і обертанні. Очищення Клітинний дебрис видаляли із застосуванням поєднання центрифугування і фільтрації. Партію ультрафільтрували і діафільтрували. Партію потім піддавали фракціонуванню на основі розчинника, який усуває домішки, і відновлює полісахарид. Приклад 2 Отримання кон’югатів пневмококових полісахаридів і CRM197 Процес активації Сахариди різних серотипів окремо кон’югували з очищеним білком-носієм CRM197 з використанням стандартного технологічного процесу. У цьому процесі сахарид розчиняють, доводять його розмір до цільової молекулярної маси, хімічно активують, і заміняють буфер за допомогою ультрафільтрації. Очищений CRM197 потім кон’югують з активованим сахаридом, і отриманий кон’югат очищають за допомогою ультрафільтрації перед кінцевою фільтрацією через 0,2 мкм мембрану. Декілька параметрів процесу на кожному етапі, такі як pH, температура, концентрація, і час є серотипспецифічними, як описано в цьому прикладі. Етап 1: Розчинення Очищений полісахарид розчиняли у воді до концентрації 2-3 мг/мл. Розчинений полісахарид пропускали через механічний гомогенізатор з попередньою установкою тиску від 0 до 1000 бар. Після зменшення в розмірі сахарид концентрували і діафільтрували стерильною водою на ультрафільтрі MWCO10 кДа. Пермеат видаляли, і концентрат пристосовували до pH 4,1 з ацетат-натрієвим буфером з кінцевою концентрацією 50 мМ. Для серотипів 4 і 5 застосовували 9 UA 106115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 100 мМ ацетат натрію з pH 5,0. Для серотипу 4 розчин інкубували при 50±2°C. Гідроліз зупиняли охолоджуванням до 20-24°C. Етап 2: Реакція з перйодатом Необхідні молярні еквіваленти перйодату натрію для активації пневмококового сахариду визначали із застосуванням повного вмісту сахаридів. За допомогою повного змішування окиснення відбувалося протягом 3-20 годин при 20-24°C для всіх серотипів за винятком 5, 7F і 19F, для яких температура була 2-6°C. Етап 3: Ультрафільтрація Окислений сахарид концентрували і діафільтрували в 10 мМ фосфаті калію, pH 6,4 (10 мМ ацетат натрію, pH 4,3 для серотипу 5) на ультрафільтрі 10 кДа MWCO. Пермеат видаляли, і рН ретентату підводили до 6,3 - 8,4 за допомогою додавання 3 М калій фосфатного буфера. Процес кон’югації Етап 1: Реакція кон’югації Концентрований сахарид змішували з білком-носієм CRM197 зі співвідношенням реагуючих речовин 0,2-2 до 1. Перемішану суміш сахарид-CRM197 фільтрували через 0,2 мкм фільтр. Реакцію кон’югації стимулювали за допомогою додавання розчину ціаноборгідриду натрію до отримання 1,8-2,0 моль ціаноборгідриду натрію на моль сахариду. Реакційну суміш інкубували протягом 48-120 годин при 20-24°C (8-12°C для серотипів 3, 5, 6A, 7F, 19A і 19F). Етап 2. Боргідридна реакція У кінці інкубаційного періоду кон’югації реакційну суміш приводили до 4-8°C, і pH 8-10 або за допомогою 1,2 М буфера бікарбонату натрію або 3 М калій фосфатного буфера (за винятком серотипу 5). Реакцію кон’югації зупиняли за допомогою додавання розчину боргідриду натрію для отримання 0,6-1,0 молів боргідриду натрію на моль сахариду (0 моль боргідриду додавали для серотипу 5). Реакційну суміш інкубували протягом 45-60 хвилин. Етап 3: Етапи ультрафільтрації Реакційну суміш діафільтрували на ультрафільтрі 100 кДа MWCO мінімум з 20 об'ємами 100 мМ фосфату калію, pH буфера 8,4. Концентрат з ультрафільтра 100 кДа діафільтрували на ультрафільтрі 300 кДа MWCO з мінімум 20 діаоб’ємами 150 мМ хлориду натрію при 20-24°C. Фільтрат видаляли. Етап 4: Стерильна фільтрація Ретентат від діафільтрації через 300 кДа MWCO діафільтрували через 0,2 мкм фільтр і наповнювали контейнери з боросилікатного скла в належних об'ємах для випробування при випуску продукції, контролю в процесі виробництва і складання рецептури лікарської форми (за винятком серотипу 19F). Кон’югат серотипу 19F пропускали через 0,2 мкм фільтр в бак для зберігання, і інкубували при 20-24°C. Після інкубування кон’югат діафільтрували на ультрафільтрі 300 кДа MWCO з мінімум 20 діаоб’ємами 150 мМ хлориду натрію при 20-24°C. Пермеат видаляли, і ретентат фільтрували через 0,2 мкм фільтр, і наповнювали ним контейнери з боросилікатного скла в належних об'ємах для випробування при випуску продукції, контролю в процесі виробництва і складання рецептури лікарської форми. Кінцевий колективний концентрат зберігали при 2-8°C. Приклад 3 Склад 15-валентної вакцини на основі пневмококового кон’югата Необхідні об'єми колективних концентратів розраховували на основі об'єму замісу і колективних концентрацій сахариду. Об'єднані 15 кон’югатів додатково розводили до цільової адсорбційної концентрації за допомогою додавання хлориду натрію і L-гістидину, pH 5,8, що містить буфер. Після достатнього перемішування суміш стерильно фільтрували через 0,2 мкм мембрану. Стерильно сформовану масу акуратно змішували протягом і після її змішування з колективним фосфатом алюмінію. Складену вакцину зберігали при 2-8°C. У альтернативному процесі об'єднані 15 кон’югатів додатково розбавляли до цільової концентрації за допомогою додавання хлориду натрію і L-гістидину, pH 5,8, що містить буфер. Полісорбат 80 додавали до кінцевої концентрації 0,005%, до розбавленої буферизованої суміші кон’югатів перед стерильною фільтрацією. Після стерильної фільтрації сформовану вакцину зберігали при 2-8°C. Таблиця 1 представляє кінцеву композицію PCV-15 з або без додавання ад’юванту. 55 10 UA 106115 C2 Таблиця 1 Склад 15-валентних вакцинних композицій на основі пневмококових кон’югатів з додаванням або без додавання ад’юванта Клінічні склади, одиниця/0,5 мл дози PCV-15 з додаванням PCV-15 без ад’юванта додавання ад’юванта Антигени на основі пневмококових 32 мкг загального 32 мкг загального полісахаридів полісахариду (2 мкг полісахариду (2 мкг кожного з наступних кожного з наступних полісахаридів полісахаридів серотипів 1, 3, 4, 5, серотипів 1, 3, 4, 5, Активні 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, інгредієнти 19A, 19F, 22F, 23F, 19A, 19F, 22F, 23F, 33F; 4 мкг 33F; 4 мкг полісахариду полісахариду серотипу 6B) серотипу 6B) Белок-носитель CRM197 ~32 мкг ~32 мкг a Алюміній (мкг) 125 0 Полісорбат-80 (мкг) 0 2,5 L-гістидин (мМ) 20 20 Інші інгредієнти Хлорид натрію (мМ) 150 150 Вода для ін’єкцій В ДОСТАТНІЙ В ДОСТАТНІЙ b b КІЛЬКОСТІ КІЛЬКОСТІ Описані інгредієнтів a Кількість елементарного алюмінію в АРА. Підрахувати кількість достатню до 0,5 мл. b 5 10 15 20 25 30 Приклад 4 Дослідження імуногенності Експерименти були сплановані для оцінки імуногенності складних сполук вакцин на основі пневмококових кон’югатів на тваринних моделях дитинчат макак-резусів (IRM) і білих новозеландських кроликів (NZWR). Експерименти на дитинчатах макак-резусів були сплановані, щоб щільно відповідати рекомендованому режиму уведення вакцини на основі пневмококових кон’югатів у Сполучених Штатах, з курсом уведення для немовлят у віці 2, 4 і 6 місяців. Таким чином, дитинчати макак-резусів імунізували, починаючи у віці 2-3 місяців, і уводили вакцину з 2місячними інтервалами. 4-у дозу, що також є частиною рекомендованого режиму уведення вакцини для дітей у Сполучених Штатах, не вводили. Дорослих кроликів (NZWR) застосовували для оцінки сполук складних вакцин. Дослідження на NZWR проводили з застосуванням двох доз вакцин, що вводили за прискореною схемою імунізації (2-тижневий інтервал). Для доклінічної оцінки імунних відповідей кроликам уводили повну дозу для людини, у той час як дитинчата макак одержували половину дози для людини. Обґрунтуванням для відбору половини дози для людини для введення дитинчатам макак були обмеження в обсязі, якому можна вводити дитинчатам макак-резусів при однократній внутрішньом'язовій ін'єкції. Оцінка серотипспецифічних IgG відповідей Аналіз методом мультиплексної електрохемілюмінесценції (ECL) розробили для застосування до сироватки кроликів і макак-резусів на основі аналізу сироватки людини з застосуванням технології Meso Scale Discovery (MSD), що використовує мітку SULFO-МІТКА™, що випромінює світло від електрохімічної стимуляції. Див. Marchese et al., 2009, Clin. Vaccine Immunol. 16:387-96. З застосуванням спеціалізованого ECL спектрофотометра для читання планшетів, електричний струм пропускають через електроди, зв'язані з планшетами, результатом чого є ряд електрично індукованих реакцій, що приводять до люмінесцентного сигналу. Багатоточкова конфігурація, застосовувана в розвитку і валідації, складала 10 точок/ямку у форматі 96-ямкового планшета, і кожну ямку покривали 5 нг пневмококового (Pn) полісахариду (Ps) на точку. Застосовували два планшетних формати, щоб переконатися, що перехресно реагуючі полісахариди (тобто 6A і 6B, і 19A і 19F) тестували в окремих планшетах. Планшетний формат 1 містив серотипи 3, 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F і 23F, тоді як планшетний 11 UA 106115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 формат 2 містив серотипи 1, 5, 6A, 7F, 19A, 22F і 33F. Крім того, кожна ямка містила дві точки бичачого сироваткового альбуміну (BSA), що застосовували для оцінки аналізу фонової реактивності (тобто відповіді, зв'язаної із сироваткою і міченим вторинним антитілом під час відсутності PnPs). Стандарт аналізу (89SF-2), контролі і тестовані сироватки розбавляли до відповідних рівнів у фосфатно-сольовому буфері (PBS), що містить 0,05% твіну 20, 1% BSA, 5 мкг/мл C-полісахариду (CPs), 10 мкг/мл полісахариду серотипу 25 (PnPs25) і 10 мкг/мл полісахариду серотипу 72 (PnPs72), і інкубували протягом ночі при 4°C (від 2 до 8°C) або при температурі навколишнього середовища протягом 45 хвилин. Реагенти і стандарти антитіл людини застосовували при тестуванні зразків від дитинчат мавп, тоді як протикролячий IgG, мічений SULFO-МІТКА™ застосовували як вторинне антитіло при тестуванні зразків сироватки кролика. Кожен покритий антигеном планшет інкубували при температурі навколишнього середовища протягом 1 години на платформі шейкера з блокувальним агентом. Планшети відмивали 0,05% PBS-T, і додавали 25 мкл на ямку переадсорбованої, і розведеної тестованої сироватки і інкубували протягом 45 хв при температурі навколишнього середовища на платформі шейкера. Планшети відмивали 0,05% PBS-T, а потім додавали в кожну ямку козяче протилюдське IgG вторинне антитіло, мічене MSD SULFO-МІТКА™ (для сироваток макакрезусів), і мічене козяче протикроляче IgG вторинне антитіло (для сироватки кролика) додавали, і інкубували протягом 1 години при температурі навколишнього середовища на платформі шейкера. Планшети відмивали 0,05% PBS-T, і додавали в кожну ямку 150 мкл MSD Read Buffer-T 4X (з поверхнево-активною речовиною), розчинений у воді в співвідношенні 1:4. Планшети зчитувалися за допомогою застосування MSD Sector Imager Model № 2400 чи 6000. Для досліджень кроликів результати представлені у вигляді середніх геометричних значень титрів (GMTs) або співвідношень GMTs. Для дослідження дитинчат макак-резусів результати виражали як середні геометричні значення концентрацій, зчитаних зі стандартної кривої за допомогою застосування концентрацій серотипспецифічного IgG, що відповідають стандартному зразку людини (89 SF-2). Оцінка функціональних (опсонофагоцитуючих) відповідей Зразки від дитинчат макак-резусів з дослідження 2 тестували в 4-плексном МОРА дослідженні (MOPA-4). Див. Burton et al., 2006, Clin. Vaccine Immunol. 13:1004-9. У дослідженні застосовують бактеріальні штами, вибрані, щоб бути резистентними до одного з 4 антибіотиків, таким чином, щоб першу частину дослідження (опсонізація і захоплення в диференційовані клітини HL-60) можна було проводити із серотипами в кількості до 4 за один раз. Зчитування даних для бактеріального цитолізу проводиться паралельно в присутності кожного з 4 антибіотиків, до яких прийнятні штами є резистентними, щоб визначити індекс цитолізу для кожного специфічного серотипу. Результати виражають у вигляді реципрокного розведення, при якому спостерігають 50% цитоліз (після інтерполяції). Методологія статистичної обробки результатів доклінічних досліджень Обидві моделі на тваринах мають обмеження, пов'язані з розміром зразка. В основному, на кожен режим дослідження застосовували 8 дитинчати макак або 8 кроликів. 8 тварин використовували в дослідженні на критичне розходження кратності середнього геометричного значення титру між режимами лікування, при цьому розходження в 2,5 рази розглядали як поріг повноцінної відповіді. 2,5-кратне розходження визначали на основі припущення, що для кожного серотипу стандартне відхилення титрів, трансформованих натуральними логарифмами, у м 45 рамках режиму лікування є ln(2). Надаючи Yt позначати середнє ln трансформованих титрів в i го 2 режимі лікування, ni, число тварин у рамках i режиму лікування, σi відома зміна ln го трансформованих титрів серед тварин у рамках i режиму лікування, і встановлюючи ni=8 і 2 σi =(ln(2)) для всіх i, потім значення 2,5 отримано за допомогою обчислення е Yj  Yk , де 2 Yj  Yk  j2 nj 50 55  2 k nk  Z0,995 і Z0,995 означає зворотну величину стандартної нормальної функції розподілу з імовірністю 0,995 (тобто Z0,995=2,576). Варто відзначити, що розрахункове значення 2,44 округлене до 2,5, тому що 2,5 також надає прийнятну зворотну величину 0,4. Серотипспецифічна IgG відповідь дитинчат макак-резусів (IRMs) на PCV-15 Проводили пілотне дослідження імуногенності (IRM-1) для визначення того, чи будуть дитинчата макак-резусів (IRMs) гарною моделлю для оцінки вакцин на основі кон’югатів Pn полісахариду і CRM197. Головною метою експерименту було визначити, чи будуть IRMs (такі як дитини людини) несприйнятливі до вільних Pn полісахаридів, але добре відповідати на вакцини 12 UA 106115 C2 5 10 15 20 25 30 35 з кон’югатом. Групам з 5 IRMs робили ін'єкції, починаючи з віку 2-3 місяці або Pn полісахаридом, ® або Prevnar , або PCV-15. Три дози вакцини уводили внутрішньом’язово (в/м) з інтервалом 2 місяці, і серотипспецифічні IgG відповіді вимірювали до введення першої дози і через 1 місяць після введення 2 дози і через 1 місяць після введення 3 дози, застосовуючи багатоточковий електрохемілюмінесцентний аналіз (ECL) (дані не представлені). Результати вказували на те, що IRMs відповідали слабко, якщо узагалі відповідь була, на вільні Pn полісахариди, але дуже добре на вакцини на основі кон’югатів. Результати вказували на те, що індукція IgG відповіді на Pn полісахариди в дитинчат макак-резусів залежала від кон'югації полісахаридів з білком-носієм, і таким чином, була класичною Tклітиноопосередкованою відповіддю. Таким чином, було визначено, що IRM модель є придатною для оцінки складів PCV-15. Для оцінки складу PCV-15 проводили друге дослідження (IRM-2) із застосуванням процесу кон'югації балка, що мінімізував вміст вільного (некон’югованого) полісахариду і некон’югованого CRM197. На фіг. 1 представлені IgG відповіді на PCV-15 після введення дози 2 ® (PD-2) і після введення дози 3 (PD-3) проти відповіді на Prevnar для 7 серотипів, що містяться в ® Prevnar (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F). PD-2 відповіді на PCV-15 були еквівалентними або були ® дещо нижчими, ніж прийнятні відповіді на Prevnar , у той час як PD-3 відповіді на PCV-15 були ® трохи вищими, ніж відповіді, викликані Prevnar , майже для всіх серотипів. Відповіді IRM на серотипи, що не входять до складу Prevnar, але наявні в PCV-15, показані на фіг. 2. Відповіді PD-2 на серотипи, що не входять до складу Prevnar, але наявні в PCV-15, усі були щонайменше у 10 разів вищі, ніж концентрації IgG на початку дослідження (перед вакцинацією), і титри продовжували рости при PD-3. ® Результати вказують на те, що відповіді антитіл на PCV-15 і Prevnar були порівнянними для 7 загальних серотипів і що відповіді після вакцинації на PCV-15 були в 10 разів вищі, ніж на початку дослідження для 8 доданих серотипів. Функціональна (опсонофагоцитуюча) імунна відповідь IRMs на PCV-15 Щоб визначити чи індукувала PCV-15 функціональні відповіді антитіл у дитинчат макак, проводили опсонофагоцитуючий цитоліз (ОРА) на сироватці від IRM-2. Дані до вакцинації, ® відповіді PD-2 і PD-3 на PCV-15 і Prevnar представлені в таблиці 2. Представлені результати є GMTs зразків сироватки від 7-8 макак на момент часу, оцінений у двох повторах. Також представлені відсотки респондентів (тобто тих, у кого ОРА титри >8) у момент часу PD-3. PCV15 індукувала високий PD-2 GMT для всіх серотипів за винятком типів 1 і 33F. Після 3 доз вакцини PCV-15 індукувала високі ОРА GMTs для кожного серотипу і 100% ОРА частоту відповіді для всіх 15 серотипів, що містяться у вакцині. Слід зазначити, PCV-15 також ® індукувала гарну перехресну ОРА відповідь на серотип 6C, що не міститься у вакцині. Prevnar індукував високі ОРА титри і 100% частоту відповіді для всіх серотипів, що містяться в цій вакцині, але він індукував тільки слабку перехресну відповідь на серотипи 6A і 6C у групі макак. 13 UA 106115 C2 Таблиця 2 GMTs серотипспецифічних ОРА у дитинчат макак-резусів після вакцинації ® за допомогою PCV-15 або Prevnar (Середнє геометричне значення титрів перед вакцинацією (Pre), після введення дози 2 (PD-2) і після введення дози 3 (PD-3) і процент респондерів з титром ≥8 після введення дози 3) Prevnar Серотип 1 3 4 5 6A 6B 6C 7F 9V 14 18C 19A 19F 22F 23F 33F Перед вакцинацією n.d. n.d. 4 4 4 8 4 4 4 8 4 4 4 n.d. 4 n.d. PCV-15 Респондери РеспонПісля Після після Після Після дери після введення введення введення Перед введення введення введення дози 2 (PD- дози 3 дози 3 вакцинацією дози 2 дози 3 дози 3 2) (PD-3) (PD-3) (PD-2) (PD-3) (PD-3) (титри ≥8) (титри ≥8) n.d. n.d. n.d. 4 65 340 100% n.d. n.d. n.d. 5 1442 1548 100% 11459 5004 100% 4 5280 3453 100% 4 4 0% 4 1879 1719 100% 21 113 57% 4 1188 7807 100% 8294 6043 100% 4 2477 9601 100% 11 16 29% 4 1038 5134 100% 4 71 43% 4 7541 10092 100% 1779 748 100% 4 625 1297 100% 12395 7782 100% 4 11366 9891 100% 5571 1718 100% 4 1934 1701 100% 15 4 0% 4 2210 1895 100% 1365 432 100% 4 2555 4021 100% n.d. n.d. n.d. 4 2489 7298 100% 1789 2126 100% 4 3093 2465 100% n.d. n.d. n.d. 4 14 11548 100% Примітка: серотипи, які містяиться в Prevnar, виділені жирним шрифтом. Результати для серотипу 6C показані курсивом внаслідок того, що серотип не міститься в PCV-15. n.d. не визначено. 5 10 Оцінка складів PCV-15 у білих новозеландських кроликів Склади PCV-15 оцінювали в 4 дослідженнях на дорослих новозеландських білих кроликах (NZWRs) із застосуванням стиснутого режиму імунізації, при якому кролики отримували повну дозу вакцини для людини на 0 добу і 14 добу, і сироватку збирали на 0, 14 і 28 добу для аналізу. ® Всі дослідження порівнювали з Prevnar і підсумовувалися в таблиці 3 (NZWR експерименти 14). Результати представлені в таблиці 3 для відповідей новозеландських білих кроликів після введення дози 2, виражені у вигляді співвідношення середніх геометричних значень відповідей ® IgG на Merck PCV-15 над Prevnar для серотипів, спільних для цих вакцин. 14 UA 106115 C2 Таблиця 3 Співвідношення IgG відповідей після введення дози 2 (PCV-15:Prevnar™) для ведучих складів PCV-15, які тестуються на NZWR Серотип 4 6B 9V 14 18C 19F 23F 5 NZWR-1 0,70 1,35 2,07 2,37 0,87 0,66 0,36 NZWR-2 0,59 0,49 1,79 0,58 0,6 0,76 0,30 NZWR-3 0,63 1,53 1,70 2,32 0,52 2,70 1,22 NZWR-4 1,06 0,45 1,31 2,55 0,27 1,25 0,41 Серотипспецифічні IgG відповіді, головним чином, знаходилися в діапазоні в 2,5 рази ® відмінному від відповідних відповідей на Prevnar . Виняток становив серотип (23F), для якого ® відповідь була >2,5 рази нижчою, ніж відповідь на Prevnar в 2 з 4 експериментів. Декілька ® кратне підвищення рівнів антитіл до серотипів, що не міститься в Prevnar , від 0 доби до 28 доби (після дози 2, PD-2) підсумовані в таблиці 4. Таблиця 4 Кратне підвищення (після введення дози 2:перед введенням дози 1) IgG відповідей на серотипи, які не містяться в Prevnar™, але є ведучими складами PCV-15, які тестуються на NZWR Серотип 1 3 5 6A 7F 19A 22F 33F 10 15 NZWR-1 14,9 33,6 12,8 21,3 42,0 40,5 45,7 21,7 NZWR-2 30,5 16,2 70,2 77,8 83,8 79,1 87,8 47,9 NZWR-3 55,1 61,5 112,0 143,0 194,0 450,0 243,0 98,8 NZWR-4 59,9 28,5 134,0 123,0 108,0 314,0 135,0 69,4 Ефект дози вакцини на основі кон’югатів полісахаридів на імуногенність NZWRs Імуногенність підвищеної дози (подвійна доза, 2x) кон’югатів полісахаридів також оцінювали для всіх серотипів, що містяться в PCV-15 в порівнянні з дозою вакцини, що планується для людини (1x). Для 2x складу кон’югату полісахаридів, АРА концентрацію підвищували до 1,5х, щоб пересвідчитися, що більша частина кон’югату буде зв'язана з ад’ювантом з алюмінію. Як показано в таблиці 5, здавалося, що у вакцині не з'являлося значної переваги в підвищенні кількості кон’югату полісахариду. Відмінності між всіма серотипами знаходилися в межах 2кратних відмінностей, і середнє геометричне значення кратного співвідношення (1x PCV-15/2x PCV-15+1,5x АРА) становило 1,1. 15 UA 106115 C2 Таблиця 5 Середнє геометричне значення титрів IgG після введення дози 2 (95% довірчі інтервали) для ® † Prevnar , 1x дози для людини PCV-15* або 2x дози для людини PCV-15 у NZWR Режим лікування Серо-тип 4 6В 9V 14 18C 19F 23F 1 3 5 6A 7F 19A 22F 33F Prevnar™ (n=8) 1xPCV-15 (n=8) 2xPCV-15(n=8) 736,400 (483200, 1122400) 363,600 (205000, 644800) 298,200 (173800, 511700) 345,200 (200200, 595000) 954,500 (815700, 1116800) 720,100 (475700, 1090200) 816,300 (565100, 1179100) 5,300 (3100, 9200) 12,000 (8600, 16800) 5,700 (4100, 7900) 525,900 (275000, 1005600) 4,600 (4000, 5200) 432,800 (237800, 787800) 6,000 (4400, 8100) 6,600 (4700, 9300) 436,000 (199700, 951700) 176,500 (72800, 427800) 534,700 (362800, 788100) 198,900 (94500, 418700) 573,000 (396900, 827400) 548,000 (367700, 816800) 246,200 (117200, 517100) 91,500 (62600, 133600) 32,300 (19600, 53000) 245,600 (114200, 528200) 186,700 (71300, 488600) 326,900 (238000, 449000) 260,900 (145500, 468000) 359,800 (239000, 541700) 177,400 (118300, 266200) 472,100 (246800, 902900) 196,900 (85900, 451400) 580,600 (366300, 920200) 273,600 (229500, 326100) 455,900 (245100, 848000) 544,300 (269000, 1101400) 188,500 (78100, 454800) 72,200 (46700, 11600) 23,600 (14100, 39400) 224,600 (136700, 369100) 251,800 (102300, 620100) 212,200 (134200, 335500) 276,100 (153200, 497600) 345,300 (221200, 539000) 138,500 (68300, 280900) Відмінність кратності Співвідношення 2х PCV-15/1xPCV-15 1,1 1,1 1,4 0,8 1,0 0,8 0,8 0,7 0,9 1,3 0,6 1,1 1,0 0,8 *Склад з додаванням 1х ад’юванту з алюмінію (АРА). † Склад з додаванням 1,5х АРА. 5 10 15 Ефект ад’юванту з алюмінію на імуногенність PCV-15 у NZWRs Вплив ад’юванту алюмінію (АРА) на відповіді антитіл оцінювали в одному дослідженні на кроликах. Тестували PCV-15, складені таким чином: планована доза для людини АРА (PCV-15 1x АРА), подвійна планована доза для людини АРА (PCV-15 2x АРА), і без якого-небудь ® ад’юванту з алюмінію (PCV-15 0x АРА). Група Prevnar також була включена в це дослідження. Результати після введення дози 2 (PD-2) вказували на те, що подвоєння концентрації АРА незначно впливало на серотипспецифічну IgG відповідь на PCV-15. Кратна відмінність в титрі (1x APA/2x АРА) варіювала від 0,6 (серотип 6B) до 2,3 (серотип 22F) і середнє геометричне кратне співвідношення між 15 серотипами становило 1,1. За відсутності ад’юванту з алюмінію титри антитіл виявилися нижчі для багатьох серотипів, зв'язаних з PCV-15 з 1x АРА. Кратна відмінність в титрі (1x/0x) знаходилася в діапазоні від 0,5 (серотип 5) до 2,9 (серотип 23F) і середнє геометричне значення кратного співвідношення між 15 серотипами становило 1,4. Загалом, не представляється справжньою перевагою подвоєння рівня ад’юванту з алюмінію, і представляється недоліком усувати ад’ювант в моделі на тваринах (таблиця 6). 16 UA 106115 C2 5 Результати PD-2 указали на те, що в титрах антитіл відмічалося зниження для багатьох серотипів в режимі, який не містив ад’юванту фосфату алюмінію (АРА) при порівнянні з PCV-15, що містить АРА (фіг. 3), що вказує на необхідність включення ад’юванту алюмінію для оптимальної імуногенності PCV-15 у кроликів. Крім того, не було виявлено переваги, коли у вакцину включали подвоєну кількість АРА (дані не представлені). Таблиця 6 Середнє геометричне значення титрів IgG після введення дози 2 (95% довірчі інтервали) PCV-15, складеної з додаванням 1х, 2х або 0х ад’юванту з алюмінію (АРА) у NZWR Відмінність кратності відносно PCV-15 (1х АРА) Режим лікування Серотип 4 Prevnar™ (n=8) 380,700 PCV-15 1xAPA (n=8) 268,400 1 3 5 6A 7F 19A 22F 33F 10 15 (177400, 415700) (382700, 825400) 337,600 (75200, 269700) (174000, 654900) 282,200 (250400, 416500) (210400, 378500) 302,500 (232700, 393200) 328,200 (178200, 604300) 5,600 (4400, 7200) 6,300 (4800, 8100) 4,800 (4000, 5700) 84,500 (50300, 141900) 5,200 199,800 (132200, 302100) 117,200 (60300, 227700) 91,700 (46800, 179800) 156,100 (104800, 232500) 81,700 (50800, 131300) 163,600 (114000, 234900) 216,800 (3300, 8400) (141500, 332000) 95,100 (54300, 166700) 6,500 238,300 (161000, 352700) 348,900 (267200, 455500) 7,100 23F 562,000 (4900, 8500) 19F (90700, 226300) 323,000 18C (59800, 187400) 142,500 14 143,300 271,600 9V (205100, 351200) 105,900 6B (226100, 641000) 235,600 (5000, 10100) (106500, 521300) PCV-15 2x APA PCV-15 0x APA 1x/2x APA (n=8) (n=6) 196,200 404,600 1,4 (105500, (84000, 458800) 1550700) 236,200 93,800 0,6 (102000, (46300, 189700) 547100) 595,600 569,200 0,9 (390200, (239900, 908900) 1350500) 453,000 167,600 0,7 (237400, (65100, 431700) 864400) 248,700 175,200 1,1 (193900, (91800, 334000) 319000) 243,400 127,700 0,8 (87600, 676600) (35100, 463700) 77,600 40,200 1,5 (31300, 192300) (10100, 160900) 67800 53,300 1,4 (38900, 118100) (14800, 191600) 155,700 104,000 1,0 (75300, 322200) (45000, 240000) 60,700 176,100 1,3 (29100, 126400) (72100, 430300) 226,800 99,300 0,7 (92500, 556200) (48800, 202000) 282,100 212,200 0,8 (158200, (64200, 701900) 503200) 207,400 125,700 1,1 (69800, 615900) (34000, 465100) 149,400 336,800 2,3 (184200, (90100, 247600) 615700) 163,600 222,000 1,4 (125100, (92700, 288800) 393800) 1x/0x APA 0,7 1,5 1,0 2,0 1,6 1,6 2,9 1,7 1,5 0,5 1,6 1,0 1,9 1,0 1,1 Обговорення і висновки Доклінічні дані демонструють, що склад PCV-15 (сформульований із вмістом АРА) є високо імуногенним для двох видів (дитинчат макак-резус і кроликів). Серотипспецифічні відповіді на ® PCV-15 були порівнянними з відповідями, викликаними Prevnar для 7 серотипів, спільних для обох вакцин. Для 8 нових серотипів в PCV-15 була сильна відповідь, викликана як у дитинчат макак-резус, так і у кроликів з ≥10-кратним підвищенням IgG відповідей для всіх серотипів після 2 доз вакцини у обох видів. Обмежені експерименти з визначенням оптимальної дози вказували на те, що 2-кратне підвищення кількості кон’югатів полісахаридів не спричиняло підвищення відповіді антитіл. Схожим чином 2-кратне підвищення концентрації ад’юванту з алюмінію не 17 UA 106115 C2 представляло значного поліпшення профілю імуногенності PCV-15. Усунення ад’юванту, однак, мало результатом знижені відповіді на деякі серотипи, передбачаючи потенційну необхідність ад’юванту у людей. Функціональні відповіді антитіл (ОРА) були викликані PCV-15 на всі 15 серотипів у вакцині так само, як і на серотип 6C, який не є компонентом PCV-15. 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 20 25 1. Імуногенна композиція, яка містить: (1) полівалентну суміш кон'югатів полісахаридів з білком, яка складається з капсульних полісахаридів серотипів 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F і 33F Streptococcus pneumonia, кон'югованих з білком-носієм; і (2) фармацевтично прийнятний носій. 2. Імуногенна композиція за п. 1, де білком-носієм є CRM197. 3. Імуногенна композиція за п. 1, яка додатково містить ад'ювант. 4. Імуногенна композиція за п. 3, де ад'ювантом є ад'ювант на основі алюмінію. 5. Імуногенна композиція за п. 4, де ад'ювант вибраний з групи, яка складається з фосфату алюмінію, сульфату алюмінію і гідроксиду алюмінію. 6. Імуногенна композиція за п. 5, де ад'ювантом є фосфат алюмінію. 7. Імуногенна композиція за п. 1, складена в формі однократної 0,5 мл дози, що містить 2 мкг кожного сахариду, за винятком 4 мкг для 6В; приблизно 32 мкг білка-носія CRM197; 0,125 мг ад'юванту елементарного алюмінію (0,5 мг фосфату алюмінію); 150 мМ хлориду натрію і 20 мМ L-гістидинового буфера. 8. Спосіб індукування імунної відповіді на капсульний полісахарид Streptococcus pneumoniae, що включає введення людині імунологічно ефективної кількості імуногенної композиції за п. 1. 9. Спосіб за п. 8, де імуногенну композицію вводили у вигляді однократної 0,5 мл дози, складеної таким чином, що вона містить: 2 мкг кожного сахариду, за винятком 4 мкг для 6В; приблизно 32 мкг білка-носія CRM197; 0,125 мг ад'юванту елементарного алюмінію (0,5 мг фосфату алюмінію); 150 мМ хлориду натрію і 20 мМ L-гістидинового буфера. 18 UA 106115 C2 19 UA 106115 C2 20 UA 106115 C2 Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 21