Стійкий до дії гербіцидів aнas-протеїн, кодуюча цей протеїн молекула днк, та клітина, модифікована цією днк

Винахід стосується моделювання структури і проектування варіантів ацетогідроксикислої синтетази (AHAS), стійкої до імідозолінонів та інших гербіцидів, AHAS-інгібування гербіцидів, AHAS-варіантів, DNA кодування цих варіантів, рослин для цих варіантів та методів боротьби з бур'янами. Ацетогідроксикисла синтетаза (AHAS) - це фермент, який каталізує початкову стадію в біосинтезах ізолейцину, лейцину, валіну в бактеріях, дріжджах та рослинах. Для прикладу, стабілізована AHAS з Zea Mays (кукурудзи) - це майже 599-амінокислотний протеїн, локалізований в хлоропласті (див. мал.1). Фермент використовує тіамін пірофосфат (ТРР) і флавін аденін динуклеотид (FAD) як кофактори, та піруват - як субстрат до ацетолактату. Фермент також каталізує конденсацію пірувату і 2-кетобутирату до ацетогідроксибутирату. AHAS відома також як ацетолактат синтетаза або ацетолактат піруватліаза (карбоксилація), і позначається EC 4.1.3.18. Активний фермент є, певно, по меншій мірі гомодимером. Ibdah та ін. (Protein Science, 3:479-S, 1994), в рефераті, описують одну модель активного центру AHAS. Різні гербіциди містять імідозолінові складові, такі як Imazethapyr (PURSUITâ - Американська Ціанамідна Компанія - Уейн, Нью-Джерсі), складові на основі сульфонілсечовини, такі як сульфометиронметіл (OUST® E.I. du Pont de Nemours та Компанія - Вілнінгтон, DE), сульфонаміди тріазолпіримідину (Broadstrike™ - Dow Eianco; див. Gerwick та ін., Pestic. Sci. 29:357-364, 1990), сульфамоїлсечовини (Rodaway та ін., Механізми селекції Ас 322,140 в рисі-падці; Wheat та Barley, Тези Брайтонської конференції захисту врожаю від бур'янів, 1993), піримідил-окси-бензойні кислоти (STABLEâ - Хімічна Індустріальна Компанія Kumiai, E.I. du Pont de Nemours та Компанія; див. також Пестицидний щорічник, т.10 видання, стор.888-889, Clive Tomlin, видання Британської Ради захисту врожаю, 49 Downing Street, Farmhan, Surrey G49 7PH, Об'єднане Королевство), сульфонілкарбоксиаміди (Alvarado та ін., патент США №4,883,914) діють як інгібітори ферментативної активності AHAS. (Див. Chaleff та ін., Наука, 224:1443, 1984; LaRossa та ін., Біохімічний журнал, 253:8753, 1984; Ray, Фізіологія рослин, 75:827, 11984; Шенер та ін., Фізіологія рослин, 76:545, 1984). Ці гербіциди високоефективні і зовсім безпечні. Але застосування їх в сільському господарстві обмежується їх недостатньою селективністю, оскільки врожай значно залежить від чутливості бур'янів до фітотоксичної дії цих гербіцидів. Bedbrook та ін., Патент США №5,013,659, №5,141,870, №5,378,824, відкрили кілька варіантів AHAS, стійких до сульфонілсечовини. Але всі ці варіанти були отримані з мутагенних рослин, насіння або клітин, та відібрані для стійких до гербіцидів мутантів, або були виділені з таких мутантів. Досягти потрібного результату таким способом проблематично (по меншій мірі спочатку), тому що тільки випадково можна потрапити на потрібну мутацію, тоді як раціональний підхід до отримання потрібних протеїнів базується на структурному моделюванні. Таким чином, є необхідність пошуку методів і композицій, які б забезпечували широкий спектр селективності і/або стійкість оброблюваних посівів до гербіцидів. Цим винаходом розкривається, що селективна гербіцидна стійкість різних форм AHAS і рослин, що її містять, може регулюватись модифікацією структури AHAS, на противагу піруват оксидазі (РОХ), визначенню вузлів сполучення гербіциду або вузлів на моделі AHAS, та отриманню специфічних мутацій, які змінюють властивість вузлів сполучення гербіциду. Ці варіанти або рослини не інгібуються або знищуються одним чи більшою кількістю класів гербіцидів і поступаються AHAS в його активності по підтримці росту посівів. Фігура 1 ілюструє ряд, що складається з 600 амінокислот, який приблизно відповідає ряду, що складається з 599 амінокислот AHAS з Zea Mays (кукурудза), що подається як приклад рослинного ферменту AHAS. Цей ряд не включає транзитних рядів і екстрагліцинів з залишками розщепленого тромбіну. Радикали Met 53, Arg 128 і Phel35 показані досить чітко. Фігура 2 ілюструє вирівнювання ряду кукурудзяної AHAS і піруват оксидази з Lactobacillus Planarum. Фігура 3 схематично представляє вторинну структуру підгрупи AHAS. Регулярні елементи вторинної структури, a-спіралі і b-шари виглядають як кола і еліпси відповідно, і пронумеровані окремо для кожного з трьох доменів в підгрупі. Петлі та спіральні ділянки обмежені чорними лініями з числами, які приблизно визначають початок і кінець цих елементів. Розташування кофакторних сполучних і відомих мутантних місць вказано відповідно октаедрами і зірками. Фігура 4 є ілюстрацією розробленої на комп'ютері моделі активних ділянок кукурудзяної AHAS з imazethapyr (гербіциду PURSUITâ), сформованих в вузлах сполучення. Фігура 5 демонструє гомологію серед амінокислотних рядів AHAS, отриманих від різних рослинних видів. pAS 751 є кукурудзяний als 2 AHAS-ізозим, виділений з рАС 751Е. Вираження через вектор Соlі, як на Фігура 1; Maize als 2 - це кукурудзяний 3 AHAS-ізозим; Tobac 1 - тютюновий AHAS SuRA ізозим; Tobac 2 - тютюновий AHAS SuRB ізозим; Athcsr 12 - Csr 1.2 AHAS-ген Arabidopsis thaliana (Резуховидка Таля); Bnaal 3 - AHAS III ізозим Brassica napus (Рапс або Брюква); Bnaal 2 - Brassica napus AHAS II ізозим. рАС 751 і Maize als 2 - це ідентичні гени, за виключенням того, що Maize als 2 розпочинається на початку транзитного ряду, а рАС 751 - на очікуваній активній N-кінцевій ділянці з додатковим гліцином на N-кінці, що відповідає тромбіну, означеного ряду з вираженням через вектор pGEX-2T. В такій позиції N-кінцевий гліцин не може бути природною амінокислотою. Ряд амінокислот, вирівняний AHAS-протеїнами, був розроблений PILEUP (GCG Package - Генетична комп'ютерна група, Inc., - Дослідний відділ університету - Мадисон - WI), а узгоджений ряд генеровано PRETTY GCG Package. Фігура 6 - це фотографічна ілюстрація SDS-поліакриламідного гелю, забарвленого протеїном, виділеного з AHAS-кукурудзи. Вміст (зліва на право): А -маркери молекулярних мас; В - коліклітинний екстракт Круде; С очищена глютатіон-агароза; D - очищені витяжки тромбіну; Ε - гель, двічі профільтрований крізь глютатіонагарозову колонку і Sephacryl-100. Фігура 7 ілюструє результати випробувань in vitro ферментної активності природних і мутантних AHASпротеїнів в присутності і без високої концентрації гербіциду Imazethapyr (PURSUITâ гербіцид). Вісь Υ вказує на % активності мутантів ферментів, де за 100% взята активність при відсутності інгібітора. Фігура 8 - це графік результатів випробувань in vitro природних і мутантних AHAS-протеїнів в присутності і без високої концентрації гербіциду сульфометиронметилу (OUSTâ гербіцид). Вісь Υ вказує % активності мутанту ензиму, де за 100% взято активність при відсутності інгібітору. Фігура 9 - це графік результатів випробувань in vitro ферментної активності природного AHAS-протеїну Arabidopsis та Met124lle мутанту AHAS-протеїну Arabidopsis в присутності і без високої концентрації гербіцидів imazethapyr (PURSUITâ гербіцид) та сульфометиронметилу (OUST® гербіцид). Вісь Υ показує % активності мутанту ферменту, де за 100% взято активність при відсутності інгібітору. Фігура 10 - це графічна ілюстрація досліджень in vitro ферментної активності природнього AHAS-протеїну Arabidopsis і Met124His мутанту AHAS-протеїну Arabidopsis в пристуності і без високої концентрації Imazethapyr (PURSUITâ гербіцид) та сульфометиронметилу (OUSTâ гербіцид). Вісь Υ вказує на % активності мутанту ферменту, де 100% - активність при відсутності інгібітору. Фігура 11 - графік результатів досліджень in vitro ферментної активності природного AHAS-протеїну Arabidopsis і Argl99Glu мутанту AHAS-протеїну Arabidopsis в присутності і без високої концентрації гербіцидів Imazethapyr (PURSUITâ гербіцид) і сульфометиронметилу(ОUSТâ гербіцид). Вісь Υ - % активності, де 100% при відсутності інгібітору. Фігура 12 - це схема DNA-вектора, використовуваного для трансформації рослин, складовою якого є ген nptll (з закодованою канаміциновою опірністю) під контролем промотора 35S та гену AHAS (природного чи його варіанту) під контролем Arabidopsis AHAS промотора. Фігура 13 - це фотографія розвинутих коренів тютюну, обороблених Arabidopsis AHAS-геном з домішками Met124lle або Arg199Glu. Рослини розвивалися 18 днів після оборобки їх сумішшю з 0,25мкМ Imazethapyr. Фігура 14 - це фотографія рослин тютюну, оброблених Arabidopsis AHAS геном з домішками Met124lle, Met124His або Arg199Glu. Поле було двічі оброблене з розрахунку 100г/га Imazethapyr. Фігура 15 - це фотографія результатів тестів на проростання в присутності гербіциду GL 299, 263 (імазамокс), який був введений в насіння, зібране з первинної рослини, обробленої Arabidopsis AHAS-геном з домішками Met124lle, Met124His або Arg199Glu. Цей винахід належить до методу моделювання модифікації структури речовини з метою виробництва варіантів AHAS-протеїнів, стійких до гербіцидів. Метод включає: (а) вирівнювання цільового AHAS-протеїну в піруват оксидазній матриці або моделювання еквіваленту AHAS таким чином, щоб досягти утворення тривимірної структури цільового AHAS-протеїну; (б) моделювання одного чи більше гербіцидів з тривимірною структурою для локалізації вузлів сполучення гербіциду з метою отримання цільового AHAS-протеїну; (в) вибір мішеней для мутації як мінімум з однією амінокислотою в цільовому AHAS-протеїн і, де мутація реалізується щонайменше через один гербіцид для вузла сполучення; (г) мутація DNA кодуванням кінцевого AHAS-протеїну для отримання мутантної DNA кодуванням різноманітних AHAS, що містять мутацію, наприклад домішкою щонайменше однієї будь-якої амінокислоти; (д) вираження мутованої DNA в одній клітині в таких умовах, в яких різні AHAS з мутацією, наприклад будь-якими амінокислотами, продукуються в потрібній позиції; Метод далі може включати: (є) вираження DNA, кодованого різними природними AHAS-протеїнами паралельно і в другій клітині; (є) виділення різнотипних природних і варіантних AHAS-протеїнів з клітин; (ж) випробування різнотипних природних AHAS-протеїнів як каталізаторів для перетворення пірувату в ацетолактат або в конденсації пірувату і 2-кетобутирату в ацетогідроксибутират в присутності чи без гербіциду; (з) повторювання стадій (в)-(ж), де DNA кодування AHAS-варіанту (д) використовується для AHAS, кодованої DNA-варіантом (в) так, що перший гальмувач гербіциду з AHAS-протеїну ідентифікується: (і) при відсутності гербіциду, (а) каталітична активність достатня для життєздатності клітини, де це відбувається; (б) каталітична активність в комбінації з будь-яким гербіцид-стіким AHAS-протеїном хоч і реалізується в клітині, в якій можуть бути аналогії або відмінності з первинним AHAS-протеїном, все ж проявляється тільки в життєздатній клітині; де необхідна клітинна життєздатність для виявлення AHAS-активності; і (іі) Каталітична активність вище в присутності щонайменше одного гербіциду порівняно з природною AHAS. Пропонується альтернативний метод структурованого моделювання AHAS-протеїну, стійкого до гербіциду. Метод включає: (а) формування цільового AHAS-протеїну в поліпептидній матриці з ряду на Фігурі 1, або функціонально еквівалентне формування тривимірної структури цільового AHAS-протеїну; (б) моделювання одного чи більше гербіцидів в тривимірну структуру з метою локалізації вузлів сполучення в цільовому AHAS-протеїні; (в) вибір мішеней для мутацій щонайменше з однією амінокислотою в AHAS-протеїні там, де мутація змінює силу хімічного зв'язку з гербіцидом у вузлі сполучення; (г) мутація DNA кодуванням цільового AHAS-протеїну для виробництва мутованої DNA кодуванням варіанту AHAS, який має позиційну мутацію; (д) введення мутованого DNA в одну клітину при умовах, коли виробляються варіанти AHAS, що мають мутації в потрібній позиції. Цей метод може надалі включати: (є) проведення DNA кодування різних природних AHAS-протеїнів паралельно в другій клітині; (є) виділення природного та варіантного AHAS-протеїну з клітин; (ж) випробування природного і варіантного AHAS-протеїну для каталітичної активності при конверсії пірувату в ацетолактат або при конденсації його з 2-кетобутиратом в ацетогідроксибутират, в присутності чи без гербіциду; і (і) Повторення стадій (в)-(ж), де DNA кодування AHAS варіанту на етапі (д) використовується як AHASкодування DNA на стадії (в) до того часу, доки перший гербіцид-стійкий AHAS-протеїн ідентифікується: (і) відсутністю щонайменше одного гербіциду; (а) каталітична активність суттєва тільки в життєздатній клітині; або (б) каталітична активність в комбінації з гербіцид-стійким AHAS-протеїном також виявляється в клітині, яка може бути подібною або відрізнятися від первинного AHAS варіанту протеїну, який забезпечує достатню життєздатність клітини; де є вимоги до AHAS-активності по забезпеченню життєздатності клітини; та (іі) Каталітична активність підвищує стійкість щонайменше до одного гербіциду краще, ніж з природним AHAS. Метод включає інші альтернативні втілення: (а) вирівнювання цільового AHAS-протеїну в першій AHAS-матриці, використовуючи вузли зв'язку гербіцидів та ряди з Фігури 1, або функціонально еквівалентне вирівнювання тривимірної структури цільового AHAS-протеїну; (б) селекція, як мета мутації, щонайменше однієї амінокислотної позиції в цільовому AHAS-протеїні, де мутації найактивніше проходять щонайменше з одним гербіцидом в вузлі сполучення; (в) мутація DNA кодуванням цільового AHAS-протеїну для продукування мутантної DNA, кодованням варіанту AHAS з позиційною мутацією; і (г) введення мутантної DNA в одну клітину за умов, при яких продукується варіант AHAS з позиційною мутацією. Цей метод може далі включати: (д) проведення DNA кодування цільового природного AHAS-протеїну паралельно в другій клітині; (e) виділення природного і варіантного AHAS-протеїну з клітин; (є) випробування природного і варіантного типів AHAS-протеїну як каталізаторів при конверсії пірувату в ацетолактат або конденсації пірувату і 2-кетобутирату в ацетогідроксибутират в присутності чи без гербіциду; та (ж) повторення стадій (б)-(є), де DNA кодування AHAS варіанту на стадії (2) застосовується як AHASкодування DNA на стадії (б) до того, як визначиться перший гербіцид-стійкий AHAS варіантний протеїн; (і) за відсутності щонайменше одного гербіциду, (а) каталітична активність достатня для підтримки життєздатності клітини; або (б) каталітична активність в комбінації з гербіцид-стійким AHAS варіантним протеїном, також виражена в клітині, яка може бути подібна чи відрізнятися від першого AHAS варіантного протеїну, суттєва тільки для підтримки життєздатності клітини, в якій це виражено; де, клітина потребує AHAS активності для своєї життєздатності; і (іі) Каталітична активність більш стійка у присутності щонайменше одного гербіциду, ніж з довільним природним AHAS. При переважному втіленні цих методів каталітична активність за відсутності гербіциду становить щонайменше 5%, а часом перевищує 20% з довільним AHAS. У випадку імідозолінонового гербіцид-стійкого AHAS варіанту протеїну така: (і) Каталітична активність при відсутності гербіциду становить більше 20% від активності довільного природного AHAS; (іі) Каталітична активність відносно більш стійка в присутності імідозолінонових гербіцидів, порівнюючи з довільним природним AHAS; і (iiі) Каталітична активність відносно більш чутлива до присутності сульфонілсечовинних гербіцидів в порівнянні з імідозоліноновими гербіцидами. Цей винахід пропонує отримувати ізольовану DNA кодуванням варіантних протеїнів ацетогідроксикислої синтетази (AHAS); варіантні протеїни, що містять AHAS-протеїни, модифіковані таким чином: (і) заміщення щонайменше одного будь-якого амінокислотного радикал радикалом амінокислоти ряду на Фігурі 1, відібраним з групи Р48, G49, S52, М53, Е54, А84, А95, Т96, S97, G98, Р99, G100, А101, V125, R127, R128, М129, І130, G131, Т132, D133, F135, Q136, D186, 1182, Т259, Т260, L261, М262, G263, R276, М277, L278, G279, Н281, G282, Т283, V284, G300, V301, R302, F303, D304, R306, V307, Т308, G309, К310, 1311, Е312, A313, F314, А315, S316, R317, А318, К319, І320, Е329, І330, К332 N333, К334, Q335, Т404, G413, V414, G415, Q416, Н417, Q418, М419, W420, А421 А422, L434, S435, S436, А437, G438, L439, G440, А441, М442, G443, D467, G468 S469, L471, N473, L477, М479, Q495, Н496, L497, G498, М499, V501, Q502, Q504 D505, R506, Y508, К509, А510, N511, R512, А513, Н514, Т515, S524, Н572, Q573 Е574, Н575, V576, L577, Р578, М579, І580, Р581, G583, G584, будь-які функціональнi еквіваленти і будь-які співвідношення будь-яких вище перерахованих. (іі) вилучення 5 амінокислотних радикалів з перерахованих вище або 5 амінокислотних радикалів з подальшим хоча б одним радикалом ряду Фігури 1, вибраним з групи, що містить Р48, G49, S52, М53, Е54, А84, А95, Т96, S97, G98, Р99, G100, А101, V125, R127, R128, М129, І130, G131, Т132, D133, F135, Q136, D186, 1187, Т259, Т260, L261, М262, G263, R276, М277, L278, G279, Н281, G282, Т283, V284. G300, V301, R302, F303, D304, R306, V307, Т308, G309, К310, 1311, Е312, А313, А315, S316, R317, А318, К319, I320, Е329, І330, К332, N333, К334, Q335, Т404, G413, V414, G415, Q416, Н417, Q418, М419, W420, А421, А422, G443, D467, G468, S469, L471, N473, L477, М479, Q495, Н496, L497, G498, V499, V501, Q502, Q504, D505, R506, Y508, К509, А510, N511, R512, А513, Н514, Т515, S524, Н572, Q573, Е574, Н575, V576, L577, Р578, М579, І580, Р581, G583, G584, функціональні еквіваленти і комбинації з будь-яких вище перерахованих; (ііі) вилучення щонайменше одного радикалу амінокислоти або його функціонального еквіваленту між Q124 і Η150 ряду на Фігурі 1; (iv) додавання щонайменше одного радикалу амінокислоти або його функціонального еквіваленту між Q124 і Η150 ряду на Фігурі 1; (ν) вилучення щонайменше одного радикалу амінокислоти або його функціонального еквіваленту між G300 і D324 ряду на Фігурі 1; 11 (vi) додавання щонайменше одного радикалу або його функціонального еквіваленту між G300 і D324 ряду на Фігурі 1; або (vii) будь-які комбінації усіх вищеперерахованих. В цій числовій системі радикал #2 відповідає можливому кінцевому аміну активного протеїну, тобто після виділення цільового пептиду з хлоропласту. Модифікації, націлені на зміну властивостей гербіциду, особливо імідозолінонового, уповільнюють ферментну активність протеїну. Найчастіше ізольована DNA кодує гербіцид-стійкий варіант AHAS. Крім того, DNA вектори охоплюють кодування AHAS-варіантів, варіантів AHAS-протеїнів, також клітин, які ростуть в організмі чи в клітинній культурі, що має AHAS-варіанти або охоплює ці вектори. В іншому аспекті, цей винахід дає метод для оцінки гербіцидної стійкості в клітині чи в клітинах, особливо в рослинній клітині або в клітинах, наприклад, в насінні. AHAS-ген, переважно Arabidopsis thaliana AHAS-ген, змінюється до здатності в присутності гербіциду уповільнювати ферментну активність. Мутантний ген розмножується в узгодженому визначеному напрямку і трансформує гербіцид-чутливу клітину в умовах, які забезпечують достатній рівень гербіцидної стійкості клітини. Також спостережні методи контролю за бур'янами там, де посів містить гербіцид-стійкі AHAS-гени згідно з цим винаходом в кількостях, які дозволяють ефективно боротися з бур'янами. Також відкрито метод структурованого моделювання для підготовки первинного гербіциду, який уповільнює AHAS-активність. Метод охоплює: (а) вирівнювання цільового AHAS-протеїну в піруватоксидазній матриці або AHAS-моделювання функціонального еквіваленту для отримання тривимірної структури AHAS-протеїну; (б) моделювання вторинного гербіциду з AHAS-інгібіторною активністю в тривимірній структурі для отримання локальної структури, або комбінації їх вузлів сполучення гербіциду в цільовому AHAS-протеїні; і (в) визначення непептидного первинного гербіциду, який має взаємодіяти - і переважно хімічно зв'язуватися - з ефективним фрагментом вузла хімічного сполучення, що інгібує активність AHAS; при цьому первинний гербіцид інгібує активність AHAS настільки, що позбавляє життєздатності клітину, яка власне і потребує цієї активності AHAS. Відкритий також альтернативний метод структурованого моделювання для отримання первинного гербіциду, здатного зменшувати AHAS-активність. Метод охоплює: (а) вирівнювання цільового AHAS-протеїну в первинній AHAS-матриці, отриманій з поліпептиду ряду на Фігурі 1, або його функціонального еквіваленту, для отримання об'ємної структури цільового AHAS-протеїну; (б) моделювання вторинного гербіциду з AHAS-інгібіруючою активністю в об'ємну структуру для отримання локальної структури, або комбінації їх вузлу сполучення гербіциду в цільовому AHAS-протеїні, і (в) визначення непептидного первинного гербіциду, який має взаємодіяти - і переважно хімічно зв'язуватися - з ефективним фрагментом вузла хімічного сполучення, що інгібує активність AHAS; при цьому первинний гербіцид інгібує активність AHAS настільки, що позбавляє життєздатності клітину, яка власне і потребує цієї активності AHAS. Майже в кожному методі первинний гербіцид має в своєму складі щонайменше одну функціональну групу, яка взаємодіє з функціональною групою вузла хімічного сполучення. Цей винахід охоплює раціональне проектування або структуроване молекулярне моделювання модифікованих версій AHAS-ферментів і AHAS-інгібованих гербіцидів. Ці модифіковані ферменти (AHASваріант протеїни) стійкі до дії гербіцидів. Винахід також охоплює DNAs, що кодують ці варіанти, вектори, які включають ці DNAs, AHAS-варіантні протеїни і клітини, що визначають ці варіанти. Додатково впроваджуються методи досягнення гербіцидної стійкості в рослинах через визначення цих варіантів і методів контролю за бур'янами. DNA і AHAS-варіанти цього винаходу були відкриті на базі досліджень молекулярного моделювання структури AHAS. Раціональне структуроване проектування варіантів AHAS і AHAS-інгібіторів гірбіцидів Гербіцид-стійкі варіанти AHAS, згідно з винаходом, використовуються для досягнення гербіцидної стійкості в рослинах і можуть розроблятися з РОХ-моделлю, AHAS-моделлю або їх функціональними еквівалентами, такими як транскетолази, карболігази, піруват декарбоксілази, протеїни, що зв'язані FAD чи TRR, протеїни з структурою, що східна з РОХ чи AHAS; з AHAS-моделлю такою, як модель з рядом на Фігурі 1; або з функціональним еквівалентом ряду Фігури 1, включаючи варіанти з попередніх моделей. Протеїни, що можуть бути використані, включають будь-які протеїни із значенням найменшого середнього квадратного кореня відхилення менше 3,5 ангстрем в їх Сa вуглецях відносно будь-яких вищеописаних молекул. AHAS для гербіцидів аналогічно моделюється з цих матриць. Функціональний еквівалент ряду AHAS амінокислот - це ряд із значною, тобто 60-70%, гомологією, особливо при збереженні ділянок, наприклад, з можливими вузлами сполучення. Ступінь гомологічності може бути визначений простим центруванням, заснованим на відомих програмах, наприклад, GAP і PILEUP від GCG. Гомологія означає ідентичну амінокислоту або збережену складову. Функціональний еквівалент, особливо радикал амінокислоти в AHASпротеїні на Фігурі 1, є амінокислотним залишком з іншого AHAS-протеїну, який вирівняний з ряду на Фігурі 1 по відомим програмам, таким як GAP і PILEUP від GCG, і знаходиться в ряду амінокислотних радикалів на Фігурі 1. Типові стадії раціонального планування включають: (1) вирівнювання цільового AHAS-протеїну з РОХосновою чи структурою, або з AHAS-основою чи структурою; (2) необов’язково та якщо AHAS-основа визначена вузлом сполучення гербіциду, моделювання одного чи більше гербіцидів в об'ємну структуру, щоб локалізувати вузол зв'язку гербіциду в цільовому протеїні; (3) відбір мутацій, базованих на моделі; (4) орієнтований мутагенезис; (5) визначення і очистка варіантів. Додаткові стадії можуть включати: (6) випробування ферментних властивостей та (7) оцінку зручних варіантів порівняння властивостей довільної природної AHAS. Нижче кожна стадія висвітлюється окремо. 1. Молекулярне моделювання Молекулярне моделювання (особливо моделювання гомологів протеїну) може проводитися тільки з розумінням природи структури і активності цих протеїнів. Структурна модель протеїну може бути визначена прямо з експериментальних даних, таких як х-променева (рентгенівська) кристалографія, непряме гомологічне моделювання або подібне, або їх комбінація (Див. White та ін., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 23:349, 1994). Пояснення об'ємних структур AHAS дає основу для розвитку раціональних схем мутації специфічних амінокислотних радикалів в AHAS, що обумовлює гербіцидну стійкість в поліпептиді. Молекулярне моделювання структури Zea mays AHAS, використовуючи як матрицю відомі Х-променеві кристалічні структури відносно піруват оксидази (РОХ) з Lactobacillus plantarum, впроваджує об'ємну модель AHAS-структури, яка корисна для розробки гербіцид-стійких AHAS-варіантів або AHAS-інгібованіх гербіцидів. Така процедура моделювання має ту перевагу, що AHAS і РОХ розподіляють частину своїх біохімічних характеристик і можуть отримувати від загального спадкового гену (Chang та ін., J. Bacteriol. 170:3937, 1988). Оскільки високий ступінь гомології в AHAS, модельовна AHAS, описана тут, або функціональні еквіваленти її, можуть також використовуватися як матриці для лроектуваня AHAS варіантів протеїну. Походження моделі, яка використовує інтерактивні молекулярні графіки і вирівнювання, детально описано нижче. Отримана з цієї моделі тривимірна AHAS-структура приблизно прогнозує просторову організвацію активних центрів ферменту і вузлів сполучення інгібіторів, включаючи гербіциди, але не обмежується імідазоліноновими гербіцидами. Інтерпретована біохімічно модель описана далі. Моделювання гомології протеїнів вимагає вирівнювання первинного ряду протеїнів при дослідженні їх з іншими протеїнами з відомою кристалічною структурою. Для моделювання AHAS гомології піруват оксидаза (РОХ) була вибрана тому, що РОХ та AHAS притаманні схожі біохімічні характеристики. Для прикладу, і AHAS і РОХ володіють аспектами ферментних реакційних механізмів такими, як кофактори та метали. Ферменти тіамін пірофосфат (ТРР), флавін аденін динуклеотид (FAD) і двовалентний катіон необхідні для ферментної активності. FAD безпосередньо сприяє окислювально-відновлювальній реакції під час каталізу в РОХ, але, ймовірно, виконує тільки структуральну функцію в AHAS, яка, можливо, є залишком при еволюції РОХ в AHAS. Обидва ферменти використовують піруват як субстрат і утворюють гідрокси-етил-тіамін-пірофосфат як стабільний проміжний продукт реакції (Schloss J.V.Ta ін., в Biosynthesis of branched chain amino acids, Barak Z.I.H., Chipman D.M., Schloss I.V. (ред.) VCH Publishers, Вейнхейм, Германія, 1990). На додаток, AHAS ативність присутня в можливих POX-AHAS протеїнах, що складаються з N-кінцевої половини РОХ і С-кінцевої половини AHAS, але ця активність не висока. AHAS і РОХ поводяться подібно і в розчинах (Risse, В. та ін,. Protein Sci. 1:1699 and 1710, 1992; Singh, В.К., & Schmitt, G.K.(1989); FEBS Letters, 258:113; Singh, B.K. et. al. (1989) в: Prospects for Amino Acid Biosinthesis Inhibitors in Crop Protection and Pharmaceutical Chemistry, (Lopping, L.G., та ін., ред., ВСРС Monograph p.87). Із збільшенням концентрації протеїну, і РОХ, і AHAS послідовно переходять з мономерів в димери і тетрамери. Підвищення концентрації FAD також дає високий вихід субодиниці. Тетрамірні форми обох протеїнів стабільні до нагріву і хімічної денатурації. Далі, кристалічна структура РОХ з Lactobacillus plantarum була розчинена, Muller та ін., Scince 252:965, 1993. У цьому винаході знайдено, що фізична, біохімічна і генетична гомологія між AHAS і РОХ з їх кристалічною структурою можуть бути стартовою точкою для моделювання AHAS-структури. Ряди AHAS і Lactobacillus plantarum POX непридатні для повного комп'ютерного вирівнювання. Більше того, тільки 20% амінокислот ідентичні, 50% радикалів - подібного класу (тобто кислотного, основного, ароматичного і т.д.). Але, якщо ряди порівнювати з гідрофільними і гідрофобними радикалами, більше 500 з 600 амінокислот не є гармонійними. Вторинна структура, передбачена для AHAS, (Holley та ін., Рrос. Natl. Asad. Sci. USA, 86:152, 1989) виявила значну подібність до структури РОХ. Близько 70% радикалів, передбачених у вторинній структурі AHAS, збігається з такими і в РОХ. РОХ-мономери складаються з трьох доменів з центрами, паралельними β-шарами, які перетинаються з aспіралями і довгими петлями. (Muller та ін., Science 253:965, 1993). Топологія шарів в доменах різна, особливо в першому і третьому, звивини зібрані в β-шари в ряді 2-1-3-4-6-5, в той час як β-шари в другому домені відповідають ряду 3-2-1-4-5-6. Комп'ютерні вирівнювання базувались на передбаченій вторинній структурі і ряді гомології. Метод прийнятого ряду збалансованих пар, описаний Needleman та Wunch, J. Моl. ВіоІ. 48:443, 1970, теж був використаний. Два ряди були вирівняні по максиму вирівнювальних міток. Рівняльні мітки (мітки гомології) - це сума міток для всіх пар порівнюваних радикалів плюс необов'язкові пропуски у вирівнюванні. Мітки для вирівнювання пар радикалів переводяться у ціле значення. Система міток гомологів заснована на спостереженні частоти дивергенції між даними парами радикалів. (МО Dayhoff, R.M.Schwartz & ВС Orcutt "Atlas of Protein Sequence and Structure" Vol.5 suppl. 3pp.345-362, 1978). Вирівнювання надалі відокремлювалося переміщенням проміжків так, щоб зберегти регулярну вторинну структуру. Генеровані амінокислоти оцінювались по вирівнювальних схемах, які порівнювались зi значенням інтерактивних молекулярних графіків. Вибирались вирівнювання з більш збереженими зміщеннями з достатньою функціональністю амінокислот у цьому місці. Кінцеві вирівнювання з великою схожістю між РОХ і AHAS вказані на Фігурі 2. Були визначені збережені пучки радикалів, особливо для ТРР сполучень і сполучень частин FAD. Вирівнянням виявлена висока подібність між AHAS і РОХ в першому домені, в більшості частин другого домену і близько половини третього домену. На поверхні протеїну очікувались ділянки з низьким вирівнюванням і складками в РОХ і AHAS, коли вони не сполучались з інгібітором. Передбачення місць мутації не дуже ефективне по причині малих зсувів (переміщень) у вирівнюваннях. Більшість ТРР зв'язаних радикалів найбільш збережені між РОХ і AHAS (наприклад, P48-G49-G50). В деяких випадках радикали були закриті ТРР між РОХ і AHAS, але залишались на ділянках, які добре збереглися, наприклад радикали 90-110. З іншого боку, місця сполучення FAD виявляються гірше збереженими. Хоча деякі FAD сполучення радикалів були добре збережені (наприклад, D325-I326-D327-Р328), інші помітно відрізнялися між AHAS і РОХ (для прикладу, радикали в петлях між позиціями 278 і 285) не є гомологами. Детальний аналіз виявляє, що для деяких погано збережених місць контакту взаємодії були опосередковані поліпептидною основою більше, чим бічним ланцюжком. Відповідно, збереження необхідно тільки для поліпептидних складок і не потрібно для амінокислотного ряду (наприклад, основа радикалів 258263 сполучає рибітол-ланцюжок в FAD). Місця сполучень частин аденіну та ізоалоксазину зовсім різні. Після вирівнювання первинної структури модель гомології була вбудована переміщенням AHAS амінокислотного ряду в РОХ матричну структуру. Рухливі координати були вбудовані раціонально, використовуючи матриці амінокислотних радикалів до повної невизначеності бічних ланцюжків. Банк пошуків і енергетичної мінімізації малих частин молекул були використані до повної конформації невизначених ділянок петель. Кофактори ТРР і FAD були змодельовані в їх вузлах сполучення. Потім ця модель була підпорядкована цілком 5000 циклам енергетичної мінімізації. Все компп'ютерне моделювання було виконано в IRIS Indigo Elan R4000 Workstation from Silicon graphics Co. Інтерактивне молекулярне моделювання і енергомінімізація виконані, використовуючи Quanta/CHARMm 4.0 from Molecular Simulations Inc. На цьому етапі конформація була стабільна, показано, що наприклад, що контакти Ван дер Ваальса ослаблювались не дуже сильно. Результати показані схематично на Фігурі 3. Характеристика прогнозованої AHAS-структури Огляд модельованої AHAS-структури, описаної вище, виявляє, що більшість складок протеїну зсередини енергетично помірні, а більшість гідрофільних бічних ланцюжків доступні для розчинників. Поверхня β-шарів гладенька і узгоджується з пересічними ділянками, які скріплюють їх. Модель AHAS-димеру була генерована дублюванням координат енергетично мінімізованих AHASмономерів і накладанням двох копій на дві РОХ-підгрупи, використовуючи пари Сa-координат як окрему вирівнювальну схему. Поліпептидні ланцюжки складок AHAS, подібні складкам трьох доменів, складених з шости-пасмових паралельних β-шарів ядра, оточеного довгими "петлями" та a-спіралями. Дві підгрупи складені так, що перший домен однієї підгрупи закривається ближче до сполучених кофакторів доменів 2 і 3 іншої підгрупи. Розчинна поверхня залишається між підгрупами. Цей вузол, який окреслюється злиттям трьох доменів, пропонується як місце входу для субстрату. Це також можливе місце сполучення для гербіцидів. Внутрішня поверхня сполучного вузла обмежена кофакторами. Тіазол з ТРР розміщений на його дні. Домен 3 сприяє внутрішній поверхні вузла короткими a-спіралями, які лежать на осях в напрямі до пірофосфату ТРР, компеснсованого фосфатними часточками з діполярним моментом. Ці критичні спіралі, які починаються з G498, "вкручують" радикали в закритий контакт з ТРР і закінчюються F507, мають три відомі мутаційні ділянки для сульфонілсечовинної стійкості: V500, W503, F507 (див. пат. США №5,013,659, №5,141,870, №5,378,824). В сфері 1 петлі окреслені як P48-S52 (між β-лінією 2 іa-спіраллю 2), звернені до W503-мутації, в яких є стійкість емідазолінонів. Радикали з Y47 до G50 також контактують з ТРР. Ця петля суміжна з Р184 до Q189, інші, які зв'язані місцями β-шари домену 1 з β-лініями, зв'язаними з доменом 2, повертає. В межах вузла, недалеко від початку, є велика ділянка домену 1, що взаємодіє з додатковим видовженням домену 2. Радикали 125-129 та 133-137 домену 1 і радикали 304-313 домену 2 виходять на поверхню вузла. Оберт з T96-G100 лежить між вузлами 125-129 і ТРР. Подальше видовження домену З і двох ділянок омену дає лінію сполучення на протилежних кутах вузла. Радикали 572, 575, 582 і 583 домену 3 оперізують поверхню вузла з боків. Залишкова частина внутрішньої поверхні вузла окреслена великими FAD і петлями, L278-G282, які контактують з ізоалоксазіновими кільцями FAD. Структурні моделі AHAS-протеїну можуть бути також використані для раціональної розробки гербіцидів або AHAS-інгібіторів. 2. Моделювання гербіцидів в місцях сполучень Imazethapyr, активний імідозолінон в PURSUITâ, був впроваджений в місце сполучення, використовуючи інтерактивні молекулярні графіки (Фигура 4). К185 був вибраний як "якір" для взаємодії з карбоксильною групою, (мідозолінонова NH-CO група була встановлена до формування водневих зв’язків до G50 і А51. Метилскладові imazethapyr закривали V500 на основі малої a-спіралі. Ізопропільна група, можливо, сполучалась гідрофобними радикалами з амінокислотами в районі радикалів 125-135, що стимулювало внутрішню поверхню вузла. Кільця піридину більш ймовірно "сендвічувались" між А134 чи F135, F507 чи W503. W503 також взаємодіє з імідозоліновою кільцевою системою. Подібним прийомом сульфонілсечовинні гербіциди були модельовані у вигляді ділянки, що частково перекрита описаними імідозоліноновими зв'язками. Перекриття сульфонілсечовинних і імідозолінонових зв'язків зумовлює їх конкуренцію і досягнення мутантних показників, які визначають мутантність в кукурудзі, W503L, і можуть узгоджувати стійкість обох гербіцидів. В цих моделях більшість відомих мутантних ділянок, узгоджених з сульфонілсечовинною гербіцидною стійкістю, тобто G50, А51, К185, V500, W503, F507, є в закритому контакті на межі гербіцидів. Р126 і А51 потрібні для підтримки К185 бічної гілки в місці генерування гідрофобних пор. S582 - місце для специфічної імідозолінонової стійкості, віддалене від району сполучення і локалізоване в місці настільки слабкої гомології, що можливі навіть якісь зміни в складі. Місце сполучення FAD має малу гомологію між AHAS і POX; S582 - це радикал, що обумовлює стійкість кукурудзи і знаходиться у тісному контакті з активним місцем вузла. Гадають, що FAD і ділянки петель плавно виходять з третього домену, захоплюючи радикали від 278 до 285 (похила на Фігурі 4), а петля з S582 є складкою між спіраллю в позиціях від 499 до 507 і від 278 до 285. D305, відома ще як стійка ділянка, закриває FAD і модулює взаємодію між доменами 1 і 2. М280 може втягуватися в розміщення спіралі в позиціях від 498 до 507 або прямо в зв'язок інгібітору. М280 і D305 також можуть вплітатися в зв'язок інгібітора, якщо домени 1 і 2 частково закривають один одного. 3. Вибір мутацій Специфічні амінокислотні радикали точно націлені на входження в мутації первинного ряду AHAS. Ці амінокислоти вибирають, виходячи з того, що коли їхні радикалимодифіковані, то це буде причиною зміни (тобто погрішності) чистоти гербіцидного сполучного вузла. Це не означає, що мутаційні позиції радикалів всередині і зовні вузла можуть змінювати її конфігурацію. Вибір цільових місць для мутації досягається використанням молекулярних моделей, описаних вище. Для прикладу, згідно з моделлю, аргінін в позиції 128 (R на Фігурі 1, користуючись однолистовим кодом для амінокислот) локалізується недалеко від входу субстрату -гербіцид-сполучний вузол має великий ступінь конформаційної свободи, що дозволяє брати участь в транспорті змішаних гербіцидів в сполучний вузол. Таким чином, ці радикали заміщуються аланіном, в обох видах, та довгим гідрофобним ланцюжком. (Результуюча мутація позначена R128A). Мутації охоплюють прості заміщення, які суміщають природний нетиповий ряд з іншою амінокислотою. Вибірково мутації можуть викликати вилучення або додавання однієї чи більше амінокислот, переважно до 5, в цьому місці. Доданий ряд може охоплювати ряд амінокислот з інших протеїнів, або повний ряд синтетики. Далі, більш, ніж одна мутація і/або більш, чим один тип мутації, може вводитися в єдиний поліпептид. 4. Орієнтований мутагенезис DNA кодування AHAS може проводится так, щоб вводити бажані мутації. Мутагенезис проводиться, використовуючи методи стандартні, описані, наприклад, Higuchi, R., Recombinant PCR, In. M.A. Innis та ін., ред., PCR Protcols: a guide to Methods and Applications, Academic Press, pp.177-183, 1990. 5. Отримання і очистка варіантів Мутантний або варіантний AHAS ряд клонується на DHA визначному векторі (див. приклад 3) і впроваджується в зручну клітину, наприклад, Е.СоІі. Переважно, DHA, кодована AHAS, вводиться в ідентичний регулярний елемент, та варіант AHAS виражається як частина об'єднаного протеїну, наприклад, глютатіон-Sтрансферази, легко очищуваної (див. приклад 3 нижче). Варіант AHAS очищується, використовуючи придатну хроматографію або інші відомі зручні методи. "Очистка" AHAS-поліпептиду передбачає його ізоляцію в формі, що дозволяє вимірювати ферментну активність без перешкод з боку інших компонентів клітини поліпептиду. 6. Випробування ферментних властивостей Очищені варіантні AHAS можуть бути випробовані відносно таких трьох властивостей: а) каталітична активність при конверсії пірувату до ацетолактату (виражається в одиницях/мг чистої AHAS, де одиниця активності - 1мкмоль виходу/годину), або конденсації пірувату і 2-гектобутирату до ацетогідроксибутирату (вираженого в одиницях/мг чистого AHAS, де одиниця активності - 1ммоль ацетогідроксибутирату/годину); б) рівень інгібування гербіциду, наприклад, імідозолінону (позначеного як ІС50, концентрації, при якій інгібується 50% активного ферменту); в) селективна стійкість гербіцидів. Індекс селективності визначається як складова стійкості мутантів до імідозолінонів відносно природного ферменту, поділена на складову стійкості мутанту до інших гербіцидів також відносно природного ферменту. Складова стійкості до гербіцидів відносно природних ферментів виражається як ІС50 варіанту, поділеного на ІС 50 природного випадкового типу. Індекс селективності (S.I.) позначається наступним рівнянням: S.I= ІС50 варіанту для гербіциду А/ ІС50 випадкового типу для герб.В ІС50 варіанту для гербіциду А/ ІС50 з випадкового типу для герб.В Зручні випробувальні системи, що дають рішення, але не обмежують їх, детальніше описані нижче, в прикладі 4. 7.а Оцінка зручності варіантів Ферментні властивості варіанту AHAS-поліпептидів порівнюються з довільним природним типом AHAS. Переважно даються результати мутацій в AHAS варіанті поліпептиду, що зберігає in vitro ферменту активність в напрямку пірувату або пірувату і 2-кетобутирату, тобто конверсію пірувату в ацетолактат або конденсацію до ацетогідроксибутирату (розраховуючи на біологічну активність в організмі), не враховуючи каталітичну активність, більш стійку до вибраних гербіцидів, ніж довільна природна AHAS. Подаються такі типові варіанти AHAS: (і) При відсутності гербіциду (а) каталітична активність підтримує достатню життєздатність клітини, в якій йде процес; або (б) каталітична активність в комбінації з гербіцид-стійким AHAS-варіантним протеїном також відбувається в клітині, яка може бути подібною або відрізняється від первинного AHAS-варіанту протеїну, який забезпечує життєздатність цієї клітини, де згадана клітина потребує AHAS-активатора для своєї життєдіяльності; і (іі) каталітична активність, що більш стійка щонайменше до одного гербіциду, ніж AHAS довільного природного типу, і що відносно більш стійка до гербіциду(ів) порівняно з AHAS довільного природного типу. Таким чином, будь-який специфічний AHAS-варіант протеїну не потребує абсолютної каталітичної активності, необхідної для підтримки життєздатності клітини, але мусить мати каталітичну активність в кількості, достатній для досягнення життєздатності клітини (один чи в комбінації з додатковими копіями AHASваріанту і/або з іншими AHAS-варіантами протеїнів. Наприклад, каталітична активність може бути піднята до мінімально припустимих рівнів введенням множинних копій варіанту кодованого гену в клітину або введенням гену, який надалі включає відносно сильний промотор для підвищення продуктивності варіанту. Більше значення для стійкості має те, що каталітична активність варіанту знижується гербіцидами, але в меншому розмірі, ніж у випадку довільного природного типу AHAS. Більш стійкий варіант AHAS зберігає достатню каталітичність для підтримки життєздатності клітини, рослини, організму там, де помітна концентрація якогось гербіциду, на відміну від довільного природного типу AHAS, не здатного на це. Переважно каталітична активність при відсутності гербіциду(ів) менше ніж 5%, частіше більше ніж 20% каталітичної активності довільного AHAS при відсутності гербіциду(ів). Ще частіше AHAS-варіанти більш стійкі до імідозолінону, ніж до інших гербіцидів, таких як гербіциди на базі сульфонілсечовини, хоча при деяких застосуваннях селективність не має переваг. У випадку імідозолінон-стійких варіантів AHAS здебільшого AHAS-варіантний протеїн має: (і) каталітичну активність при відсутності згаданого гербіциду більше ніж 20% від активності згаданого випадкового природного AHAS; (іі) каталітичну активність, відносно більш стійку в присутності імідозолінонових гербіцидів порівняно з довільними типами AHAS; і (ііі) каталітичну активність, відносно більш чутливу в присутності сульфонілсечовинних гербіцидів порівняно з імідозоліноновими гербіцидами. Здебільшого гербіцид-стійкі AHAS-варіанти демонструють мінімальну специфічну активність приблизно 20одиниць/мг або не інгібуються імідозолінонами, та їх індекс селективності коливається від 1.3 до 3000 відносно інших гербіцидів. Не обмежуючись теорією, можна припустити, що систематичне і повторне застосування цих методів стосовно довільних чи інших цільових AHAS-протеїнів дасть в результаті продукування AHAS-варіантів з високою ферментною активністю і стійкістю до одного чи більше класів гербіцидів. Наприклад, мутація ряду довільних AHAS в особливій позиції дає можливість амінокислоті утворити мутант, який виявляє високий ступінь гербіцидної стійкості, а також значне падіння ферментної активності відносно пірувату або пірувату і 2кетобутирату. При іншому застосуванні цього методу початкові або цільові AHAS-поліпептиди будуть спрацьовувати аналогічно. Раціональне проектування включає в себе заміщення амінокислот в оригінальних мутантних позиціях і/або додавання чи вилучення амінокислот у визначених точках чи ділянках в очікуванні гербіцидної стійкості або досягненні високого рівня ферментної активності. Структуроване раціональне проектування гербіцидної стійкості AHAS-протеїнів дає багато переваг над способами мутагенезису "навмання" (випадково). Наприклад, коли заміщення відповідної амінокислоти іншою відбувається з заміщенням більше ніж одного нуклеотиду всередині codon, ймовірність проходження практично корисного процесу - нульова. Навпаки, навіть подвоєні чи потроєні зміни в нуклеотидному ряді всередині codon можуть бути легко виконані, якщо користуватися раціональним проектуванням. Наприклад, одна раціонально задумана мутація для отримання селективної імідозолінонової стійкості потребує перехід від аргініну до глютамату. Аргінін кодований CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG, в той час як глютамат кодований GAA і GAG. Оскільки ні один з аргінін-кодонів не взаємодіє з GA, то ця мутація потребує подвійного обміну сусідніх нуклеотидів, яка трапляється рідко, використовуючи випадкові мутагенезиси, які однаково непередбачувані і неповторні. Хоча мутаційний ряд може бути покращений випадковими мутагенезисами, зміни в нуклеотидному ряді завжди будуть мати місце в AHAS-гені за відсутності попередньої орієнтації мутації. Це збільшує шанс одержати невдалу мутацію, яка заважатиме ферментній активності. Схоже на те, що важко буде, використовуючи випадкові мутагенезиси, відшукати в складовій амінокислоті заміщення, вилучення або заміщення/вилучення таку мутацію, яка забезпечувала б гербіцидну стійкість зі збереженням каталітичної активності. Вилучення мутацій, які обумовлюють гербіцидну стійкість, також малоймовірне, якщо користуватись випадковими мутагенезисами. Для збереження AHAS-каркасу - а відповідно і каталітичної активності - вилучення мутацій повинно йти на малих ділянках і в триплетах. Але раціональна структура відносно легко і точно формується при заміщенні чи вилученні мутацій дубльованої амінокислоти. Далі, різні мутагени, використані у випадковому мутагенезисі, дають специфічні типи мутацій. Наприклад, азид натрію спричиняє заміщення мутацій в рослинах, в той час як опромінення має тенденцію до вилучення. Згідно з цим два мутагенезисні протоколи повинні використовуватись для отримання множинних комбінацій заміщення/вилучення. Нарешті, цей структурний метод раціонального проектування гербіцид-стіких AHAS-варіантів дозволяє повторно вдосконалювати гербіцид-стійкі мутації, що важко зробити при випадковому мутагенезисі. Ідентифікація місця мутації, стійкого до гербіциду, при випадковому мутагенезисі буває рідко, тому тим цінніша прогнозованість подальшого вдосконалення характеристик мутанту. Таке створення структури, з іншого боку, дозволяє вдосконалювати інструментальну базу визначення місцезнаходження, оточення і функціонування амінокислот в структурній моделі. Метод повторного вдосконалення дозволяє також застосовувати незалежну маніпуляцію трьома важливими властивостями AHAS: рівня стійкості, відбору стійкості і каталітичної дієвості. Наприклад, компенсаторні мутації можуть бути спроектовані в передбачуваній формі. Якщо якась мутація має шкідливий ефект відносно активності ферменту, інша компенсаторна мутація може бути використана для відновлення активності. Для прикладу, зміна заряду сітки всередині домену, коли заряджений радикал вводиться або виводиться мутацією, може бути компенсована введенням іншої мутації. Передбачуваність позиції і типу радикалу(ів) для введення, вилучення чи заміщення в іншому місці з метою відновлення ферментної активності вимагає знань структурно-функціональних співвідношень, що отримуються з описаної тут моделі. 7.б Проектування непиптидних гербіцидів або AHAS-інгібіторів Хімічні чинники, які змінюють і пристосовують активні місця в цільовому протеїні або зв'язки в будь-якій позиції, де можливе уповільнення активності, можуть бути розроблені відомими методами, наприклад, комп'ютерними дизайн-програмами, які допомагають проектувати сполуки, що специфічно реагують з рецепторним місцем. Прикладом такої програми є LUDI (Biosym Технології-Сан-Дієго, СА), див. також Лем та ін., Наука, 263:380, 1994; Томпсон та ін., Журнал медичної хімії, 37:3100, 1994). Сполучний вузол і особливо амінокислотні радикали, визначені як інгібітори сполучення, можуть бути використані як опірні точки для дизайну інгібітору. Розробка вузькоспецифічних гербіцидів має ту перевагу в боротьбі з бур'янами, що можна спонтанно розвивати стійкість до гербіциду на полі, особливо завдяки мутаціям в AHAS-гені. Гербіцид-стійкі AHAS-варіанти: DNA, вектори і поліпептиди Цей винахід охоплює також ізольовані DNA-молекули, що кодують варіантні гербіцид-стійкі AHASполіпептиди. Гени, що кодують AHAS-поліпептиди, згідно з винаходом, можуть бути виділеними з будь-яких зразків, переважно рослинних видів, і мутації гербіцидної стійкості можуть бути включені в еквівалентні позиції всередині цих AHAS-генів. Еквівалентом цієї codon позиції в різних AHAS-генах є функція збереження первинного амінокислотного ряду цього протеїну, а також утримання схожої об'ємної структури. Наприклад, Фігура 5 ілюструє високий ступінь послідовної гомології між AHAS-поліпептидами, виділеними з різних рослинних видів. Ці AHAS-поліпептиди показують 60-70% гомології. Незважаючи на теорію, можна припустити, що на ділянках поліпептиду, що мають добре збережену послідовність, будова молекулярних ланцюжків теж добре збережена. Таким чином, стає можливим використовувати AHAS-кодовані ряди одного виду для молекулярного моделювання введенням планових мутацій в AHAS-ген з іншого виду для повторного вдосконалення і попереднього тестування і, нарешті, введення оптимізованих мутацій в AHAS, виділених вже з третього виду рослин для введення в трансгенічну рослину. В одній серії втілення ці AHAS DNAs кодовані варіанти AHAS-поліпептиду, і переважно кукурудзяного AHAS-поліпептиду з Фігури 1, де поліпептид є модифікований заміщенням чи вилученням передуючих або наступних одного чи більше з Фігури 1 амінокислотних радикалів Р48, G49, S52 М53, Е54, А84, А95, Т96, S97, G98, Р99, G100, А101, V125, R127, R128, М129, І130, G131, Т132, D133, F135, А136, D186, 1187, Т529, Т260, L261, М262, G263, R276, М277, L278, G279, Н281, G282, Т283, V284, G300, V301, R302, F303, D304, R306, V307, Т308, G309, К310, 1311, Е312, А313, F314, А315, S316, R317, А318, К319, І320, Е329, І330, К332, N333, К334, Q335, Т404, G413, V414, G415, А416, Н417, Q418, М419, W420, А421, А422, L434, S435, S436, А437, G438, L439, G440, А441, М442, G443, D462, G468, S469, L471, N473, L477, М479, А495, Н496, L497, G498, М499, V501, Q502, Q504, D505, R506, V508, К509, А510, N511, R512, А513, Н514, Т515, S524, Н572, А573, Е574, Н575, V576, L577, Р578, М579, І580, Р581, G583 та G584, їх функціональні еквіваленти; заміщення або вилучення між Q124 і Η150 (Фігура 1) або їх функціональних еквівалентів; заміщення або вилучення між G300 і D324 (Фігура 1); і будь-які комбінації вищеперерахованого. Мутації, що вводяться в поліпептид на Фігурі 1 або еквівалентним позиціюванням в іншому рослинному AHAS-гені, можуть охоплювати зміни в DNA-ряді, що зумовлюють заміщення однієї чи більше амінокислот або вилучення 5 амінокислотних радикалів-попередників 5 амінокислотних радикалів з поданого вище списку. Відповідні амінокислотні замінники включають, але не обмежують, амінокислоти природного походження. Альтернативно мутації можуть охоплювати такі зміни в DNA-ряді, коли одна чи більше амінокислот додаються в каркас структури або вилучаються. Частіше додавання охоплює від 3 до 30 нуклеотидів, і вилучення - від 3 до 30. Далі, простий мутант поліпептиду може мати в собі більше ніж одну подібну чи відмінну мутацію. Цей винахід охоплює DNA і, відповідно, RNA-ряди, як чутливі, так і нечутливі ряди. Ряди нуклеїнової кислоти, кодовані AHAS-поліпептидами, можуть приєднувати збоку природні AHAS-ряди або поєднуватися з гетерологічними рядами, включаючи промотори, підсилювачі, реакційні елементи, сигнальні ряди, поліаденілатні ряди, інтрони (впроваджувачі), 5'- і 3'- некодовані ділянки і т.д. Далі, нуклеїнові кислоти можуть бути модифіковані для зміни стабільності, розчинності, хімічного сполучення і властивостей. Для прикладу, варіантні AHAS кодованих рядів можуть бути вибірково метильовані. Ряди нуклеїнових кислот цього винаходу також можуть бути модифіковані з помітною здатністю накопичення пошукового сигналу, як прямого, так і непрямого. Зразкові мітки включають радіоізотопи, флюоресцентні молекули, біотин і подібні. Винахід також стосується векторів, охоплюючих нуклеїнові кислоти, кодовані AHAS-варіантами. Велике число векторів, включаючи плазміду і грибкові вектори, описані для виразу варіацій еукаріотинових і прокаріотинових множин. Переважно вектори можуть також включати промотори, здатні сполучатися з AHAS кодованими частинами. Кодовані AHAS можуть бути застосовані, використовуючи зручні вектори і множини клітин, користуючись відкритими тут методами або ж іншими відомими досконалими способами. Приклади зручних векторів - на базі pBIN, pBluescript-вектори, pGEM-вектори. Цей винахід охоплює також обидва варіанти гербіцид-стійких AHAS-поліпептидів або їх пептидних фрагментів. Як пояснено вище, варіант-AHAS поліпептиди можуть бути похідними з кукурудзяного поліпептиду з Фігури 1 або з будь-якого рослинного чи мікробіологічного AHAS-поліпептиду, переважно рослинного AHASполіпептиду. Поліпептиди можуть в подальшому модифікуватись, наприклад сульфацією, ациляцією, глікосиляцією, фосфориляцією та ін. Поліпептиди можуть бути ізольовані від рослин або гетерологічних організмів чи клітин (включаючи бактерії, рослини, комах, дріжджі та клітини ссавців), в які входить і визначається ген, кодований варіантом AHAS-поліпептиду. Далі AHAS-поліпептиди можуть бути модифіковані міткою накопичення пошукового сигналу, прямого чи непрямого, включаючи радіоізотопи, флюоресцентні сполуки і т.д. Хімічно стійкі рослини з варіант-AHAS генами Цей винахід охоплює трансгенічні гени, включаючи насіння, організми і рослини, в яких є гени, кодовані гербіцид-стійкими AHAS варіантами. Необмежені зразки зручних реципіентних рослин представлені в Таблиці 1: Таблиця 1 Реципієнти рослин Загальна назва Кукурудза Родина Трав'янисті Кукурудза зубчаста Трав'янисті Кукурудза крем'яна Трав'янисті Кукурудза pop Трав'янисті Кукурудза м'яка Трав'янисті Кукурудза солодка Трав'янисті Кукурудза солодка Трав'янисті Кукурудза воскова Трав'янисті Латинська назва Zea mays Zea mays dentiformis Zea mays vulgaris Zea mays microsperma Zea mays amylacea Zea mays amylaesaccharata Zea mays saccharate Zea mays Злакові Злакові Злакові ceratina Triticum spelta Triticum durum Triticum turgidum Злакові Triticum spelta Злакові Злакові Злакові Трав'янисті Triticum polonium Triticum turgidum Triticum monococcum Triticum monococcum Triticum aestivum Oryza sativa Трав'янисті Zizania aquatica Пшениця Dinkel Пшениця Duruni Пшениця англійська Пшениця велика спельта Пшениця польська Пшениця пулярка Пшениця зерниста Злакові Пшениця мала спельта Пшениця м'яка Рис Рис американський дикий Злакові Рис австралійський Трав'янисті Рис індійський Рис червоний Рис Tuscarora Рис західноафриканськи й Ячмінь Ячмінь абіссінійський інтермедіатний, також нерегулярний Трав'янисті Трав'янисті Трав'янисті Oryza australiensis Zizanica aquatica Oryza glaberrima Zizania aquatica Трав'янисті Oryza glaberrima Злакові Hordeum vulgare Злакові Hordeum irregulare Ячмінь родовий Злакові Ячмінь безостий Злакові Ячмінь єгипетський Злакові Ячмінь чотирирядний Злакові Ячмінь шестирядний Злакові Ячмінь дворядний Злакові Бавовна Abroma Бавовна американська нагірна Бавовна азіатська (індійська) деревовидна Бавовна бразільська ниркова, Pemambuco Дводольні Бавовна ліванська Мальвові Мальвові Gossypium hirsutum Мальвові Gossypium arboreum Мальвові Бавовна довговолокниста, Мальвові штапельна, морська ісландська Бавовна мексиканська, також Мальвові короткоштапельна Соя, сойові боби Бобові Цукровий буряк Chenopodiaceae Цукрова тростина Деревовидні Томат Пасльонові Томат вишневий Пасльонові Томат загальний Пасльонові Томат смородиновий Томат лушпинний Hordeum spontaneum Hordeum trifurcatum Hordeum trifurcatum Hordeum vulgare polystichon Hordeum vulgare hexastichon Hordeum distichon Abroma augusta Пасльонові Пасльонові Gossypium barbadense brasiliense Gossypium herbaceum Gossypium barbadense Gossypium hirsutum Glycine max Beta vulgaris altissima Argena pinnata Lycopersikon esculentum Lycopersikon esculentum cerasiforme Lycopersikon esculentum commune Lucopersikon pimpinellifolium Physalis ixocarpa Томат гіеновидний Пасльонові Томат гороховидний Пасльонові Томат деревовидний Пасльонові Картопля Пасльонові Картопля іспанська, В'юнкові солодка картопля Рута загальна Злакові Рута гірська Злакові Перець дзвінковий Пасльонові Перець пташиний, також синій, Пасльонові каєнський баклажан Перець Пасльонові шапковидний Перець бичачий ніс, Пасльонові також солодкий Перець-черешня Пасльонові Перець пучковий і червоний пучковий Пасльонові Перець шишковидний Перець козячий, також шпоровидний Перець довгий Пасльонові Пасльонові Пасльонові Перець червоний, Пасльонові також зморшкуватий Перець пікантний червоний Салат-латук садовий Салат-латук, аспарагус, також сельдерей Салат-латук синій Салат-латук синій, також цикорій Салат-латук капустяний, також качанистий Салат ромен, також довголистний ромен Салат-латук складчатий, в'юнкий, січений листяний Сельдерей Пасльонові Складноквітні Solanum incanum Lycopersikon esculentum pyriforme Cyphomandra betacea Solanum tuberosum Ipomoea batatas Sekale cereale Sekale montanum Capsicum annuum grossum Capsicum annuum minimum Capsicum sinense Capsicum annuum grossum Capsicum annuum cerasiforme Capsicum annuum fasciculatum Capsicum annuum conoides Capsicuum frutescens Capsicuum frutescens longum Capsicuum annuum abbeviatum Capsicuum annuum conoides Lactuca sativa Складноквітні Lactuca sativa asparagina Складноквітні Lactuca perennis Складноквітні Lactuca pulchella Складноквітні Lactuca sativa capitata Складноквітні Lactuca sativa longifolia Складноквітні Lactuca sativa crispa ' Парасолькові Apium graveolens dulce Сельдерей бланшований, також Парасолькові садовий Сельдерей з корінців, також Парасолькові ріповидний Баклажан садовий Пасльонові Сорго Люцерна Соргові Бобові Морква Парасолькові Боб в'юнкий Бобові Боб, пагінці Боб бразильский широкий Боб широкий Боб загальний, також французький, Бобові Бобові Бобові Бобові Apium graveolens dulce Apium graveolens rapaceum Solanum melongena All crop Species Medicago sativum Daucus carota sativa Phascolus vulgaris vulgaris Phaseolus aureus Canavalia ensiformis Vicia faba Phaseolus vulgaris білий Боб єгипетський Бобові Боб довгий Бобові Боб крилатий Бобові Овес загальний, деревовидний Овес чорний, також жорсткий, похилений Овес жорсткий Горох, також садовий, зелений, стручковий Горох чорноокий Горох їстівний стручковий Безжилкові Sativa Безжилкові Strigosa Безжилкові Бобові Бобові Бобові Горох сірий Бобові Горох крилатий Бобові Горох складчатий Бобові Соняшник Складноквітні Гарбуз осінній, зимовий Гарбуз, кущовий, також літній Гарбуз тюрбан Dolichos lablab Vigna sesquipedalis Psophocarpus tetragonolobus Дводольні Дводольні Дводольні Огірок Дводольні Огірок африканський, також гіркий Огірок довгий, також дикий Огірок дикий Тополя, Деревовидні Каліфорнійська Тополя європейська чорна Тополя сіра Тополя, Ломбардія Тополя срібнолиста, також біла Тополя, Західний бальзам Тютюн Пасльонові Резуховидка Таля Хрестоквітні Торф'яна трава Торф'яна трава Pisum, sativum sativum Vigna sinensis Pisum sativum axiphium Pisum sativum speciosum Tetragonolobus purpureus Pisum sativum medullare Helianthus annuus Cucurbita maxima Cucurbita pepo melopepo Cucurbita maxima turbaniformis Cucumis sativus Momordica charantia Ecballium elaterium Cucumis anguria Populus trichocarpa Populus nigra Populus canescens Populus italica Populus alba Populus trichocarpa Nicotiana Arabidopsis thaliana Плевел Полевиця інші сім'ї торфотрав'янистих Бобові Конюшина Впровадження варіантних AHAS поліпептидів в трансгенні рослини забезпечує високий рівень стійкості до гербіцидів, включаючи імідозолінонові гербіциди, наприклад, Imazethapyr (PURSUITâ), що дозволяє використовувати ці гербіциди для тривалої культивації трансгенних рослин. Методи введення сторонніх генів в рослини взагалі відомі. Сюди входять, але не є обмежуючими прикладами: Agrobacterium інфікування, бомбардування елементарними частинками, усунення протопластів поліетилен-гліколем (PEG), електропорація протопластів, мікроін'єкція, макроін'єкція, культиваторні ін'єкції, тубове опилення, просочування сухого зерна, лазерна перфорація, електрофорез. Ці методи описані, наприклад, Bjenes та ін., та S.W.Ritchie та ін., в Трансгенні рослини, т.1, Розробка та застосування, ред. S.- D. Kung, R.Wu, Академічна пресса, Inc., Harcourt Brace Jovanjvich, 1993; та LMannonen та ін., Критичні огляди в біотехнології, 14:287-310, 1994. В основному втіленні DNA-кодований варіант AHAS, клонований на DNA-векторі, що містить стійкий до антибіотиків маркер-ген і рекомбінатну AHAS DNA з плазмідою, яка входить до Agrobacterium tumefacients з Ті плазмідою. Ця "бінарна векторна система" описана, наприклад, в Патенті США №4.490.838, та в An та ін., Plant Моl. Biol. Manual А3:1-19 (1988). Трансформовані Agrobacterium потім культивуються з листовими дисками від реципієнтної рослини, що призводить до інфікування та трансформації рослинних клітин. Трансформовані рослинні клітини потім культивуються в регенераційному середовищі, яке сприяє утворенню паростків спочатку в присутності відповідного антибіотика для відбору трансформованих клітин, а потім в присутності гербіциду. У вдало трансформованих рослинних клітинах з DNA кодованою гербіцид-стійкою AHAS утворення паростків має місце навіть в присутності гербіциду, який уповільнює утворення паростків з нетрансформованих клітин. Після закріплення присутності варіанту DNA AHAS, використовуючи, наприклад, аналіз реакції ланцюжка полімерази (PCR), трансформовані рослини випробовуються на здатність протистояти гербіцидному окроплению, на схильність до проростання і утворення кореня, на розмноження в присутності гербіциду. Інші застосування Методи і композиції цього винаходу можуть бути використані в раціональному проектуванні гербіцидстійких AHAS-варіантів, які можуть вводитись в рослину для прищеплення рослинам селективної гербіцидної стійкості. Проміжні варіанти AHAS (наприклад варіанти з суб-оптимальною специфічною активністю, але високою стійкістю і селективністю або конверсією) корисні як матриці для проектування вторинної генерації AHAS-варіантів, які зберігають адекватну специфічну активність, високу стійкість і селективність. Гербіцид-стійкі AHAS-гени можуть бути трансформовані в урожайні види в одній чи багатьох зразках з гербіцидною стійкістю. Генна інженерія врожайних сортів зі зниженою чутливістю до гербіцидів: (і) розширює спектр застосування специфічно-ефективних і безпечних для середовища гербіцидів, таких як імідозолінонові, (іі) підвищує комерційну цінність гербіцидів; (ііі) знижує кількість бур'янів на окультурених полях, застосовуючи стійкі до гербіцидів види рослин, з відповідним підвищенням врожайності; (iv) підвищує продаж насіння гербіцидно-стійких росли; (ν) підвищує стійкість врожаю до гербіцидів, вживаних в попередніх посівах; (vi) знижує чутливість до змін в гербіцидних характеристиках, викликаних несприятливим кліматом; (vii) підвищує толерантність до неправильно внесених гербіцидів; Наприклад, можуть культивуватися рослини з внесеним трансгенним AHAS-варіантним протеїном. Врожай може бути очищений за допомогою контролю за бур'янами ефективними кількостями гербіциду, до якого рослини стійкі (завдяки AHAS-варіантному транс-гену), без шкоди для культивованого врожаю. Описані вище DNA-вектори, що кодують гербіцид-стійкі AHAS-варіанти в подальшому можуть бути використані так, що вираження AHAS-варіанту передбачає вибіркову мітку для трансформації клітин вектором. Назначені реципіентні клітини можуть бути в культурі або "in sity", a AHAS-варіантні гени можуть бути використані самі по собі, чи в комбінації з іншими вибірковими мітками. Слід тільки враховувати чутливість реципіентних клітин до цитотоксичних дій споріднених гербіцидів. Перевагою такого втілення є відносно низька вартість і незначна токсичність гербіцидів на базі імідозолінонів, а також можливість застосування в системах, що вимагають DNA опосередкованої трансформації. Переважні втілення. Пояснення на прикладах Наступні приклади ілюструють цей винахід без будь яких обмежень. Приклад 1: Проектування гербіцид-стійких AHAS-варіантів. Локалізовані радикали закривають гербіцидні місця сполучень на моделі, детально описаній вище. Далі вони відбираються для мутагенезису з тим, щоб отримати активний AHAS-поліпептид зі знижною сполучною здатністю гербіцида. Гадалося, що в точках на поверхні вузла можлива взаємодія з іншими радикалами, а також кофакторами і гербіцидами. Наприклад, цілком можливо, що введення позитивно зарядженого радикала(ів) буде заважати розподілу зарядів всередені місця сполучення, результуючи зменшені сили сполучення негативно-зарядженого гербіциду. Були визначені три радикали, найбільш корисні для мутагенезису: (1) F135 - для взаємодії з обома кільцями ізоалоксазину FAD із ароматичної групи гербіцидів. Згідно із стратегією введення більш заряджених радикалів в вузол сполучення, цей радикал був змінений до аргініну. (2) М53 - для контакту зі спіраллю 498-507. Ця спіраль утримує в собі гербіцидно-стійкі мутантні місця, а також втягує в сполучення ТРР. Далі, заміщення глюматинової кислоти в позиції 53 частіше проводилось взаємодією з К185, зниженням міцності сполучення К185 з карбоксилатною групою Imazethapyr. (3) R128 - локалізований недалеко від початку вузла, де відбувається первинне транспортування заряджених гербіцидів всередину сполучного вузла. Цей радикал був змінений до аланіну переміщенням обох своїх зарядів і довгого гідрофобного бокового ланцюжка. Приклад 2: Оріентований мутагенезис AHAS для продуктування гербіцид-стійких варіантів. Arabidopsis AHAS-ген був вставлений в структуру з 3'-кінця кодуванням області глютатіон Sтрансферазного гену в pGEX-2T вектор (фармація). Конструювання вектору в цьому значенні утримує шість амінокислот тромбіну, що виражається глютатіон-S-трансферазним GST/AHAS синтезованим протеїном. Засвоєння тромбіну визначеного синтезованого протеїну відбувається в AHAS-протеїні з N-термінальною стартовою позицією в кінці транзитного пептиду, з радикалом N-термінал гліцину, похідним від тромбін визначеного місця. Кінцевий аміно-залишок розщепленого AHAS-протеїну має вид GLY-Ser-Ser-lle-Ser. Орієнтовані мутації були введені в AHAS-ген цим вектором. Орієнтовані мутації були сконструйовані згідно з PCR-методом Higuchi (Рекомбінантні PCR. в Ma Innis та ін., PCR Протоколи: порадник методів і застосувань, Академічна преса, Сан-Дієго, стор. 177-183, 1990). Два PCR продукти, кожний з яких частково закриває місце мутації, підсилювались. В першій з перекритих ділянок була мутація. Перекриваючи PCR, посилені фрагментами, були скомбіновані, денатуровані і прогріті разом, продукуючи два можливі гетеродуплексні продукти з рецесованими 3'-кінцями. Ці кінці були розтягнуті Taq DNA-полімеразою до отримання фрагменту, що в підсумку мав два перекриті PCR-продукти з бажаною мутацією. Наступне підсилення цього фрагменту тільки двома "зовнішніми" грунтовками дало збагачений продукт "повної довжини". Продукт з мутацією потім був повторно введений в Arabidopsis AHAS-ген pGEX-2T вектором. Приклад 3: Методи вираження і очищення AHAS-варіантів. A. Методи. Ε.Coli (DH5a) клітини трансформувались з pGEX-2T вектором, який мав в собі будь-який кукурудзяний довільного природного типу AHAS-ген (вектор проектування рАС751), Arabidopsis Ser653Asn мутант або Arabidopsis lle401Phe мутант, і вирощувались всю ніч в LB-бульйоні з 50мкг/мл ампіциліну. Нічна культура Ε.Coli розчинялась 1:10 в 1л LВ, 50мкг/мл ампіциліну і 0,1% ν/ν антивспінювача А. Культура інкубувалась при 37°С з перемішуванням до того часу, поки вміст OD600 досяг 0,8. Ізопропілтіогалактоза (IPTG) додавалась при кінцевій концентрації 1мМ, і культура інкубувалась ще 3 години. Клітини були зібрані центрифугуванням при 8,670хg на протязі 10 хвилин в роторі JA-10 і суспендувалися 1/100 оригінальним розчином NTPBS (16мМ Na2HPO4, 4мМ Na2HPO4, 150мМ NaCI, рН7,3). Тритон Х-100 і лізозим додавали в кінцевих концентраціях 1% ν/ν і 100мкг/мл відповідно. Клітини інкубувались при 30°С 15 хвилин, охолоджувались кригою до 4°С і оброблялись ультразвуком 10 секунд на рівні 7 на установці клітинного розщеплення Branson Sonifier, обладнаній мікровідбором проб. Чистий клітинний екстракт оброблявся на центрифузі при 35000хg, 10 хвилин при 4°С. Надосадова рідина відціджувалася і повторно оброблялася на центрифузі. Очистка синтезованих протеїнів виконувалась по модифікованому способу Сміта і Джонсона (Gene 67:3140, 1988). Надосадова рідина підігрівалася до кімнатної температури і проходила крізь колону на 2мл глютатіон-агарозових крапель (сульфідний зв'язок, Sigma), врівноважену в MTPBS. Колона послідовно промивалась MTPBS при кімнатній температурі до відсутності елюенту А280 в MTPBS. Синтезований протеїн далі елюювали, використовуючи розчин 5мМ редукованого глютатіону в 50мМ Tris НСІ рН 8,0. Епюйований синтезований протеїн очищався з приблизно 30 NIH одиницями тромбіну і діалізувався знов 50мМ цитрату рН 6,5 та 150мМ NaCI. Синтезований протеїн всю ніч автоклавувався при кімнатній температурі. Автоклавовані зразки діалізувались проти MTPBS і проходили двічі крізь глютатіон-агарозові колони, врівноважені з MTPBS, пересуваючи вивільнений глютатіон-трансферазовий протеїн. Протеїнова фракція, яка не зв'язалася в колоні, збиралась і концентрувалась ультрафільтрацією на фільтрі YM10 (Amicon). Концентровані зразки направлялись в 1,5x95cм Sephacryl S-100 гель-фільтраційну колону, врівноважену гель-фільтраційним буфером (50мМ HEPES, 150мМ NaCI, рН 7,0). 2мл фракцій були зібрані при швидкості витікання 0,14мл/хв. Ферментна стабільність випробовувалась зберіганням ферменту при 4°С в гель-фільтраційному буфері з домішкою 0,02%. Ферментні властивості довільних типів і варіантів AHAS, вироблених з Е.СоІі, вимірювались модифікованим методом Singh та ін. (Anal. Biochem 171:173-179, 1988) як далі: Реакційну суміш, що містить 1Х AHAS зразковий буфер (50мМ HEPES рН 7,0, 100мМ пірувату, 10мМ МgСІ 2, 1мМ тіамін пірофосфату (ТРР) та 50мкМ флавін аденін динуклеотиду (FAD)) було отримано розчиненням в 2Х зразкового буферу або додаванням концентрованого ферменту до 1Х AHAS зразкового буфера. Всі зразки були з Imazethapyr та з 5% внесенням DMSO в пристуності Imazethapyr в зразковій суміші 50% DMSO розчину. Всі проби були доведені до об'єму 250мкл при 37°С в мікротитрованій посудині. Після 60хвилинної реакції накопичений ацетолактат вимірювався колориметрично, як описано Singh та ін. Anal. Biochem, 171:173-179, 1988). Кукурудзяний AHAS, виділений з рАС751, як описано в прикладі 3, дуже активний в конверсії пірувату до ацетолактату. Взагалі AHAS-активність залежить від присутності кофакторів FAD і ТРР в середній пробі. Коли ж в середню пробу додавали тільки FAD, то активність не виявлялась. Активність очищеного ферменту з тільки одним ТРР була менше 1% від активності, зафіксованої в присутності ТРР і FAD. Нормально, коли AHAS, присутній в сирих рослинних екстрактах, дуже лабільний, особливо при відсутності субстратів і кофакторів. Навпаки, очищений AHAS бактеріальної визначеної системи показує не меншу каталітичну активність, ніж при зберіганні один місяць при 4°С в 50мМ HEPES рН 7,0, 150мМ NaCI, 0,02% NaN3 в присутності чи без FAD і ТРР. Далі, не спостерігалось видимої деградації продуктів при зберіганні препаратів при розчиненні в SDS-PAGE гелі. Нижче, в таблиці 2, показана специфічна активність довільних типів AHAS М124Е, R199A і f206R варіантів. Як визначено з вирівнювань Фігури 5, М124Е мутація в Arabidoposis AHAS - еквівалентна кукурудзяній М23Е мутації, R199A мутація Arabidopsis - еквівалентна кукурудзяній R128A мутації і F206R мутація Arabidopsis еквівалентна кукурудзяній мутації F1354R. Мутації, розроблені на кукурудзяній структурній моделі, були використані для ідентифікації еквівалента амінокислоти в Arabidopsis AHAS-гені дводольних; одночасно вони були введені в цей ген та тестовані в ньому. Це переміщення та введення раціонально розроблених гербіцидних мутацій в Arabidopsis AHAS-гені дводольних може полегшувати оцінку гербіцидної стійкості рослин. Таблиця 2 Специфічна активність Специфічна активність (Дикий) Wild-Type Met124GLU Arg199Ala Phe206Arg 99,80 9,15 86,30 5,07 % каталітичної активності в порівнянні з природним типом 100,00 9,16 86,50 5,10 Мутація R199A має високий рівень каталітичної активності (табл. 2) доти, поки проявляє значний рівень стійкості до Imazethapyr (Фігура 7). Важливо, що ці варіанти залишаються дуже чутливими до сульфонілсечовини (Фігура 8). Таким чином, цей варіант відповідає критерію високої специфічної активності і селективної гербіцидної стійкості. Навпаки, заміщення М124Е дає майже повну стійкість до Imazethapyr (Фігура 7), але одночасно дуже зменшує каталітичну активність (табл. 2). Відносно стійкості до імідозолінону цей варіант виявляє високу чутливість до сульфонілсечовини (Фігура 8), надаючи хороші шанси для створення мутації з селективною стійкістю. Заміщення амінокислот іншими кислотами (крім глютамінової} може також підвищувати каталітичну активність. F206R заміщення дає результати, подібні до М124Е-варіанту, але з гіршою селективною стійкістю. Приклад 5: Вторинне покращення AHAS гербіцид-стійких варіантів, використовуючи раціональне проектний підхід. Змінюючи радикал 124 в AHAS від Met до Glu, як описано в прикладі 4, досягаємо підвищеної стійкості до імідозолінону та зниженої ферментної активності до 9,2%. Модель кукурудзяної AHAS-структури, описана вище, потребує, щоб Met (еквівалент Arabidopsis Met124 радикалу) взаємодіяв з серією гідрофобних радикалів на поверхні a-спіралі, яка походить з окремої підгрупи, але є в тісному контакті з Met53. Таким чином, гідрофобна взаємодія між Met53 і радикалами на спіралі може стабілізувати підгрупу/сполучення підгруп і структуру активного місця. Припускається, що заміщення гідрофобних Met-радикалів на заряджені глютаматні радикали, ймовірно, дуже дестабілізує міжпідгрупні гідрофобні взаємодії, що призведе до втрати каталітичної активності. Базуючись на цьому структурно-функціональному аналізі, активний оригінальний Arabidopsis Met124Glu (еквівалент кукурудзяного Met53Glu) мутант ферменту був повторно заміщений більш гідрофобною амінокислотою (Не). Гідрофобна природа бокової гілки Не спричинює відновлення активності (специфічна активність 102, еквівалентна 102% природної активності), але значний розмір бокової гілки Не підтримує значний рівень стійкості до імідозолінону (Фігура 9). Для порівняння, заміщення гістидинового радикалу в цій позиції викликає в AHAS-варіанті активність 42,5, еквівалентну 42,6% природної активності. Цей мутант все ж демонструє високий рівень стійкості до PURSUITâ (Фігура 10). Приклад 6: Вторинне покращення AHAS гербіцид-стійких варіантів, використовуючи раціональний проектний підхід. Інший приклад вторинного покращення використовує методи цього винаходу, застосовуючи Arg128Ala варіант. Структурна модель кукурудзяного AHAS передбачає, що ARG128 радикал на кінці гербіцидного сполучного вузла сприяє "стіканню" заряджених субстратів і гербіцидів в сполучний вузол та в активні місця. Радикал ARG128, віддалений від ТРР складової, яка зв'язує первинні піруватні молекули реакційним механізмом AHAS, пояснює, чому заміщення Arabidopsis AHAS Arg199 (еквівалент кукурудзяного Arg128) аланіном обумовлює малу каталітичну активність ферменту. Структурна модель вказує на можливість підняття рівня стійкості з одночасним досягненням високого рівня каталітичної активності. На цій підстав вторинне вдосконалення мутації було виконано заміною позитивно зарядженого радикалу аргініну на негативно заряджений радикал глютаміну. Мутований таким чином фермент був стійким до PURSUITâ, зберігаючи високий рівень активності (специфічна активність 114, еквівалентна 114% природної активності), див. Фігуру 11. Приклад 7: Рівнозначність AHAS-похідних ріаних видів в структурованому раціональному проектуванні гербіцид-стійких AHAS-варіантів. Структурована модель тривимірної структури AHAS будується з AHAS-ряду мутації в AHAS однодольних, похідних з кукурудзи (див. вище). Введені мутації в AHAS, виділених з дводольних, таких як Arabidopsis, та рядів AHAS, виділених з однодольних та дводольних, вирівнюються, використовуючи GAP і PILEUP програми (Генетична комп'ютерна група, 575 Sequence Drive, Медисон, WI 53711). Еквівалентні позиції визначені з генерованого на комп'ютері вирівнювання. Потім мутації введені в AHAS-ген дводольних так, як описано вище. Наступне впровадження мутанту AHAS-протеїну в Е.СоІі і оцінка його біохімічних властивостей (тобто специфічной активності і стійкості до гербіцидів), введення мутант-гену в рослину дводольних проводиться методами трансформації рослин, що описані вище. Приклад 8: Продукування гербіцид-стійких рослин трансформацією з раціонально спроектованими AHASгенами. DNA конструкції: Раціонально побудовані AHAS-варіанти з вираженими Е.СоІі векторами були використані як джерело DNA-обмежених фрагментів для пересування еквівалентно обмеженого фрагменту в Arabidopsis AHAS гені. Цей ген присутній в 5,5kb генному DNA-фрагменті з Arabidopsis AHAS-промотором, Arabidopsis AHAS кінцевим рядом та 5'- і 3'-бічної DNA. Після проходження DNA крізь місце мутації була підтверджена присутність власних мутацій, цілий 5,5kb фрагмент з кожної плазміди був вмонтований в pBIN рослинний трансформаційний вектор (Mogen, Лейден, Нідерланди). Рослинний трансформаційний вектор мав складовою неоміцин фосфортрансфераза II (nptll) канаміцин стійкий ген, керований 35S капустяним мозаїчним вірусним промотором, фінальна векторна конструкція показана на Фігурі 12. Вектори, які складаються з Arabidopsis AHAS генів з Met124Fle, Met124His, Arg199Glu мутацій (відповідно до Met53lle, Vet53His і Arg128Glu мутаціій в кукурудзяному AHAS-ряді, як показано на Фігурі 1) були позначені відповідно pJK002, pJK003, pJK004. Кожний з цих векторів був трансформований в Agrobacterium tumefaciens фільтр LBA4404 (R&D Life Technologies, Gaithersburg, MD) використовуючи методи трансформації, описані в An. та ін., Plant Мої. Biol. Manual. А3:1-19, 1988. Рослинна трансформація: Лист-дискова трансформація з Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38 була виконана так, як описано Horsch та ін. (Наука, 227:1229-1231, 1985) з деякими модифікаціями. Листяні диски вирізались з рослин в стерильних умовах і сокультивувалися "вверх дном" в Murashige Skoog середовищі (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 2-3 дні при 25°С в темряві з Agrobacterium tumefaciens, які мали в собі плазміди рJKOO3 і pJKOO4. Листки були висушені і перенесені для регенерації в середовище Murashige Skoog з вітаміном В5, що містить домішки 1мг/л бензиладеніну і 0,1мг/л 1-нафтил-оцтової кислоти, 100мг/л канаміцину, 500мг/л цетотаксиму (все отримано від Sigma). Перш за все були відібрані канаміцин-стійкі трансформанти, оцінені npt11 -геном, присутнім у векторі трансформації. Паростки з листяних дисків вирізались і поміщались в свіже Murashige Skood гормон-вільне середовище з цефотаксимом та канаміцином. Гербіцидна стійкість "in vivo". Канаміцин-стійкі тютюнові паростки поміщались в середовище з 0,25мкМ Imazethapyr. При такій концентрації імізодолінонового гербіциду нетрансформовані тютюнові паростки (з ендогенного природного AHAS) були не здатні почати формування корінців. Навпаки, укорінювання і ріст спостерігались на тютюнових паростках, трансформованих AHAS мутантними генами. Корінці з листків, трансформованих Met124lle і Arg199Glu мутантними генами, показані на Фігурі 1. Далі рослини, трансформовані Met124lle і Arg199Glu мутантними генами, були стійкі до подвійного оприскування (100г/га) Imazethapyr (Фігура 13). Початковий ріст кореня трансформованих рослин в пристуності гербіциду, поведінка рослини після оприскування гербіцидом доводить, що раціонально спроектовані гербіцид-стійкі гени обумовлюють гербіцидну стійкість "in vivo". Пошук раціонально спроектованих генів для гербіцид-стійкого тютюну. Геномова DNA була ізольована від AHAS-трансформованих тютюнових рослин, а присутність Arabidopsis AHAS варіантних генів перевірялась PCR-аналізом. Були використані відмінності між нуклеотидними рядами Arabidopsis AHAS-гену і двома тютюновими AHAS-генами для проектування PCR-попередників, які підсилюють тільки Arabidopsis ген в тютюновій геномовій підкладці. Були знайдені раціонально спроектовані гербіцид-стійкі гени, що видно з збільшення власних розмірів DNA фрагменту, який відповідає за гербіцидну стійкість рослин. В нетрансформованих тютюнових рослинах сигнал PCR не помітний. Відділення трансформованих AHAS-генів. Для демонстрації відділення раціонально спроектованих AHAS-генів з трансформованих рослин були виконані тести. Насіння розміщувалось у вільному від гормонів середовищі Murashige-Skoog з 2,5мкл PURSUITâ та 100мкМ канаміцину. На утворених сіянцях візуально візначались стійкість і чутливість до гербіцидів. Оскільки тютюнові рослини диплодні, слід чекати, що потомки самоопилюваних рослин будуть розподілятися як 3:1=стійкі:чутливі, даючи 1 сіянець, гомозигозний для стійкого AHAS-гену, 2 сіянці, гетерогозні для стійкого AHAS-гену і 1 сіянець малостійкого AHAS-гену. Результати вказують на те, що стійкі AHAS-гени розділяються у співвідношенні 3:1, і це підтверджує думку, що гербіцидна стійкість залежить від єдиної, домінантної копії раціонально спроектованого AHAS-гену. Ці результати вказують на те, що раціонально спроектовані гербіцид-стійкі AHAS-гени можуть бути використані для отримання рослин з гербіцидною стійкістю під час росту "in vivo". Приклад 9: Отримання рослин, перехресіно-стійких до різних гербіцидів, трансформуванням з раціонально-спроектованими AHAS-генами. Тютюнові рослини, трансформовані раціонально спроектованими AHAS-генами, як описано в прикладі 8, біли випробувані на перехресну стійкість до інших гербіцидів, CL 299, 263 (також відомого як імазамокс). Тести на пророщення були виконані на насінні, зібраному з попередників трансформантів, що мали в своєму складі Met124lle, Met124His і Arg199Glu Arabidopsis AHAS варіантні гени, в присутності чи без 2,5мкМ CL 299, 263 (Фігура 15). Така концентрація гербіциду спричинила сильну затримку росту і вибілювання диких тютюнових рослин. Рослини, трансформовані з Met124His AHAS-геном, показали високий рівень стійкості (Фігура 15). Arg199GIu трансформанти показали середній рівень стійкості, в той час як Met124lle показав малу стійкість (Фігура 15). На всі патенти, застосування, статті, публікації і тест-методи, згадані вище, є посилання. Може бути запропоновано багато варіантів цього винаходу, що запропонований в деталях, висвітлених в поданому вище описі. Очевидні варіації з усією повнотою визначені в межах формул, що додаються.