Молекула днк, що кодує протеїн tgf-b-родини, вектор, l-клітина, протеїн tgf-b-родини, спосіб його отримання, фармацевтична композиція, моноклональне антитіло

1. Молекула ДНК, кодирующая протеин TGFb-семейства и содержащая: а) часть, кодирующую зрелый протеин и, в случае необходимости, другие функциональные части, следующей нуклеотидной последовательности: (19) (21) 96020469 (22) 09.08.1994 (24) 16.04.2001 (31) P 4326829.3, Р 4418222.8, Р 4420157.5 (32) 10.08.1993, 25.05.1994, 09.06.1994 (33) DE, DE,DE (46) 16.04.2001, Бюл. № 3, 2001 р. (72) Хьоттен Гертруд , DE, Найдхардт Хельге , DE, Пауліста Мі хель , DE (73) БІОФАРМ ГЕЗЕЛЛЬШАФТ ЦУР БІОТЕХНОЛОГІШЕН ЕНТВІКЛУНГ ФОН ФАРМАКА МБХ, DE 35624 б) нуклеотидную последовательность, сооответствующую последовательности из п. 1 (а) в силу вырожденности генетического кода, соответствующую нуклеотидной последовательности, которая кодирует протеин согласно следующей последовательности или функциональные части из нее: 2 35624 в) нуклеотидную последовательность, гибридизирующуюся с одной из последовательностей из пп. (а), (б) при условии, что молекула ДНК по п. (в) кодирует, по меньшей мере, полностью следующую часть зрелого протеина TGF-b-семейства: 10 20 30 40 50 MP 50 CSRKALHVNF KDMGWDDWII APLEYEAFHC EGLCEFPLRS HLEPTNH AVI 60 70 80 90 100 MP 52 QTL MNSMDPE STPPTCCVPT RLSPISILFI DSANNVVYKQ YED MVVESCG CR 2. Вектор HindIII-MP52/p AВWN, отличающийся тем, что он содержит по меньшей мере МР52последовательность, начинающуюся с н уклеотида 576 и заканчивающуюся нуклеотидом 2278 в последовательности по п. 1(а). 3. L-клетка, представляющая собой мышиный фибробласт, трансформированная вектором по п. 2. 4. Протеин TGF-b-семейства, который кодируется ДНК-последовательностью по п. 1, отличающийся тем, что он содержит аминокислотную последовательность по п. 1 (б) или, в случае необходимости, ее функционально активные части. 5. Протеин по п. 4, отличающийся тем что он используется при показаниях ангиогенеза. 6. Способ получения протеина TGF-b-семейства, который кодирует ДНК-молекулы по п. 1, отличающийся тем, что такую ДНК вводят в вектор, с которым трансформируется клетка-хозяин с образованием клетки-хозяина, содержащей вектор, культивируют в клетке-хозяине в условиях, которые позволяют экспрессию протеина, и получают выделяют) TGF-b протеин из клетки и/или надосадочной жидкости (супернатанта) культуры. 7. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере один протеин по п. 4 в качестве активно действующего вещества в эффективном количестве, В случае необходимости, вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами, разбавителями или наполнителями, пригодная для формирования соединительной ткани, костей и/или хрящей, включая укрепление зубных имплантантов, и при показаниях ангиогенеза. 8. Фармацевтическая композиция по п. 7, отличающаяся тем, что активное вещество нанесено на природный или синтетический матричный материал и/или интегрировано в него. 9. Фармацевтическая композиция по одному из пп. 7-8, отличающаяся тем, что матричный материал представляет собой биосовместимый, биологически разрушаемый in vivo пористый материал. 10. Моноклональное антитело или фрагмент антитела, отличающееся тем, что оно связывает протеин по п. 4. Настоящее изобретение относится к новому фактору роста / ди фференциации TGF-b-семейства и кодирующим его ДНК-последовательностям. TGF-b--семейство факторов роста, к которому относятся родственные BMP, TGF и ингибину протеины (Roberts и Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology, 95 (1990), 419-472), особенно уместно для широкой области медицинских методов лечения и применений. Эти факторы пригодны в способах, которые относятся к заживлению ран и регенерации тканей. Далее, некоторые члены TGF-b--семейства индуцируют рост тканей, в особенности рост костей, и поэтому играют центральную роль при индуцировании развития хрящей и костей. Wozney (Progress in Growth Factor Research, 1, (1989), 267-280 и Vale и др. (Handbook of Experimental Pharmacology, 95 (1990), 211-248) описывают различные факторы роста, как например, таковые, которые являются родственными группе BMP (костно-морфогенетические протеины) и группе ингибина. Члены этих групп обладают значительным структурным сходством. Предшественник протеина состоит из аминоконцевой сиг нальной последовательности, пропептид- и карбоксиконцевой последовательности примерно из 110 аминокислот, которая отщепляется от предшественника и представляет собой зрелый протеин. Далее, ее члены определяются путем гомологии аминокислотных последовательностей. Зрелый протеин содержит высококонсервативные последовательности, в особенности семь цистеиновых остатков, которые консервативны у членов семейства. TGF-b--образные протеины представляют собой многофункциональные, гормонально активные факторы роста. Они обладают также родственными биологическими активностями, как, например, хемотактическое притяжение клеток, стимулирование дифференциации клеток и индуцирование пролиферации тканей, как например, хрящевы х или костных тканей. В патенте США № 5 013 649 раскрыты ДНК-последовательности которые кодируют остеоиндуктивные протеины, обозначаемые как ВМР-2, а из патентных заявок США № 179 101 и № 170 197 известны ВМРпротеины: BMP-1 и BMP-3. Далее, многие типы клеток в состоянии синтезировать TGF-b-об 3 35624 разные протеины, и практически все клетки содержат TGF-b-рецепторы. В целом, эти протеины различаются по своей структуре, что приводит к значительным вариациям в их точной биологической функции. Кроме того, они были выявлены в различных видах тканей и на различных стадиях развития. Следовательно, они могут иметь различия в отношении их специфической функции, например, необходимой клеточной физиологической среды, продолжительности их жизни, их локализации, их потребности во вспомогательных факторах и их устойчивости к деструкции. Итак, хотя и описываются многочисленные протеины, которые обладают в отношении тканей индуктивным, в особенности остео-индуктивным, потенциалом, их естественные задачи в организме и - еще важнее - их медицинскую применимость еще необходимо детально исследовать. С большой вероятностью предполагается наличие еще неизвестных членов TGF-bсемейства, которые важны для остеогенеза или для дифференциации/индукции других видов тканей. Однако, большая трудность при выделении этих новых TGF-b-образных протеинов состоит в том, что их функции еще недостаточно точно могут быть описаны для разработки биологического анализа с целью их распознавания. С другой стороны, ожидаемая гомология нуклеотидных последовательностей для известных членов семейства слишком незначительна, чтобы сделать возможным скрининг с помощью классических методов гибридизации нуклеиновых кислот. Однако, дальнейшее выделение и характеристика новых TGFb-образных протеинов необходимы, чтобы получить другие протеины дифференцирования и индукцирования, которые удовлетворяют всем желательным медицинским требованиям. Эти факторы могут найти применение в медицине при лечении (заживлении) повреждений и при лечении дегенеративных заболеваний костных и/или других видов тканей, как например, тканей почки или печени. В патентной заявке РСТ/ЕР93/00350 указана нуклеотидная и аминокислотная последовательность для TGF-b-протеина МР-52, причем указана соответствующая зрелому пептиду последовательность и большая часть соответствующей пропептиду МР-52 последовательности. Полная последовательность пропептида МР-52 не раскрыта. Положенная в основу настоящего изобретения задача состоит в том, чтобы получить ДНКпоследовательности, которые кодируют новые члены семейства TGF-b-протеинов с митогенным и/или дифференцирующе-индуктивным, например, остеоиндуктивным, потенциалом. В частности, задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы получить полную ДНК- и аминокислотную последовательность TGF-протеина МР-52. Эта задача решается благодаря молекуле ДНК, которая кодирует протеин TGF-b-семейства и включает: а) кодирующую зрелый протеин часть (участок) и, в случае необходимости, другие функциональные части указанной в SEQ ID № 1 нуклеотидной последовательности; б) нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности из п. (а) в рамках дегенерации генетического кода; в) аллельное производное соответствующей последовательностям из п.п. (а) и (б) нуклеотидной последовательности; или г) гибридизирующуюся с одной из последовательностей (а), (б) или (в) последовательность; при предположении, что молекула ДНК согласно п. (г) содержит по меньшей мере одну часть кодирующую зрелый протеин TGF-b-се-мейства. Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к предмету п.п. 2-10 формулы изобретения. Дальнейшие признаки и преимущества изобретения следуют из описания предпочтительных вариантов осуществления и рисунков. Ниже кратко описываются протоколы (схемы) последовательностей и рисунки. В SEQ ID № 1 представлена полная нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующей TGF-b-протеин МР-52. ATG-Стартовый кодон начинается с нуклеотида 640. "Старт" зрелого протеина начинается после нуклеотида 1782. В SEQ ID № 2 представлена полная аминокислотная последовательность TGF-b-протеина МР-52, которая производится от указанной в SEQ ID № 1 нуклеотидной последовательности. На фиг. 1 представлено сравнение аминокислотной последовательности МР-52 с некоторыми членами семейства ВМР-протеинов с началом на первом из семи сохранившихся цистеиновых остатков. Знак * означает, что аминокислота одинакова во всех сравниваемых протеинах; знак + означает, что аминокислота совпадает по меньшей мере в одном из протеинов по сравнению с МР-52. На фиг. 2 представлены нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных праймеров, которые применяются в настоящем изобретении, и сравнение этих последовательностей с известными членами TGF-b-семейства. М обозначает А или С; S обозначает С или G; R обозначает А или G; и К обозначает G или Т. "2а" обозначает последовательность праймера OD; "2b" обозначает последовательность праймера OID. Настоящее изобретение охватывает по меньшей мере кодирующую зрелый протеин часть и, в случае необходимости, функциональную часть указанной в SEQ ID № 1 нуклеотидной последовательности, а также последовательности, которые соответствуют этой последовательности в рамках вырожденности генетического кода, и аллельные производные таких последовательностей. Далее, настоящее изобретение охватывает также последовательности, гибридизирующиеся с такого рода последовательностями, при предположении, что такая молекула ДНК содержит часть, кодирующую зрелый протеин TGF-b-семейства. Понятие "функциональная часть" в смысле настоящего изобретения означает часть протеина, которая в состоянии действовать, как, например, часть сигнального пептида, пропептида, соответственно, зрелого протеина, т.е. выполнять по меньшей мере одну из биологических функций естественных частей протеина МР-52. Кодирующая зрелую часть протеина область простирается от нуклеотидов 1783-2142 указанной 4 35624 в SEQ ID № 1 последовательности. В случае необходимости, молекула ДНК может еще содержать функциональные части указанной в SEQ ID № 1 последовательности, а именно кодирующие сигнальную и/или пропептидную часть нуклеотидные последовательности. Особенно предпочтительно молекула ДНК содержит последовательность сигнальной и пропептидной части и часть зрелого протеина, т. е. нуклеотиды 640-2142 указанной в SEQ ID № 1 последовательности. С другой стороны, молекула ДНК, наряду с кодирующей зрелый протеин частью, может также содержать еще функциональные сигнальные и/или пропептидные части других протеинов, в особенности, други х протеинов TGF-b-семейства, например, вышеуказанных ВМР-протеинов. Соответствующие нуклеотидные последовательности можно представить из вышеуказанных ссылок, на раскрытие которых здесь ссылаются. Далее, настоящее изобретение включает также молекулу ДНК, такую, как указанная выше, которая дополнительно между нуклеотидами 1270 и 1271 указанной в SEQ ID № 1 последовательности содержит некодирующую интронную последовательность. Эта интронная последовательность содержится в депонированной в DSM плазмиде SKL 52 (НЗ) МР 12, которая имеет геномную последовательность нуклеиновых кислот МР-52. Изобретение также охватывает кодированную фагом l15.1 кДНК-последовательность МР-52протеина. Эта последовательность начинается с нуклеотида 321 указанной в SEQ ID № 1 последовательности. Хотя аллельные, вырожденные и гибридизирующие последовательности, которые входят в настоящее изобретение, имеют структурные различия на основании незначительных изменений в нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности, кодированные такого рода последовательностями протеины обладают в основном такими же полезными свойствами, которые принципиально делают возможным их использование для таких же целей в медицине. Согласно настоящему изобретению, под термином "гибридизация" подразумевают обычные условия гибридизации, предпочтительно условия, при которых концентрация соли 6 х SSC при 6266°С, с последующей, осуществляемой в течение 1 часа, промывкой с помощью 0,6 х SSC, 0,1% SDS, при 62-66°С. Особенно предпочтительно термин "гибридизация" относится к строгим условиям гибридизации с концентрацией соли 4 х SSC при 62-66°С, с последующей, осуществляемой в течение 1 часа, промывкой с помощью 0,1 х SSC, 0,1% SDS при 62-66°С. Предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются ДНКпоследовательности, определения которых даны выше, которые получают от позвоночных животных, предпочтительно млекопитающих, таких как, например, свинья, коровы, и грызунов, как, например, крысы или мыши и, в особенности, от приматов, как например, люди. Особенно предпочтительной формой осуществления настоящего изобретения является указанная в SEQ ID № 1 и обозначаемая как МР-52 последовательность. Транскрипты МР-52 получа ются из эмбриональной ткани и кодируют протеин, который проявляет значительную гомологию аминокислот по отношению к зрелой части ВМРобразных протеинов (см. фиг. 1). Протеиновые последовательности BMP 2 (= BMP 2A) и BMP 4 (= BMP 2B) описаны Worney и др., Science, 242 (1988), 1528-1534. Соответствующие последовательности ВМР5, ВМРб и ВМР7 описаны Celeste и. др., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA, 87, (1990), 98439847. Некоторые типичные гомологичные последовательности, которые специфичны для известных BMP-последовательностей, находятся также в пропептидной части МР-52, в то время как другие части предшественника МР-52 имеют значительные различия с BMP-предшественниками. Следующим предметом настоящего изобретения является вектор, который содержит по меньшей мере одну копию предлагаемой согласно изобретению молекулы ДНК. В такого рода векторе предлагаемая согласно изобретению ДНКпоследовательность предпочтительно оперативно связана с последовательностью, контролирующей экспрессию. Такие векторы пригодны для получения TGF-b-образных протеинов в стабильно- или временно- трансформированных клетках. Для трансформации и последующего культивирования можно применять различные системы животных, растений, грибов и бактерий. Предлагаемые согласно изобретению векторы предпочтительно содержат необходимые для репликации в клеткехозяине последовательности и автономно реплицируемы. Далее, предпочтительно применение векторов, которые содержат селектируемые маркерные гены, благодаря чему может быть доказана трансформация клетки-хозяина. Другим предметом изобретения является клетка-хозяин, которая трансформирована с помощью предлагаемой согласно изобретению ДНК или предлагаемого согласно изобретению вектора. Примеры пригодных клеток-хозяев включают различные эукариотные и прокариотные клетки, как, например, Е. coli, клетки насекомых, клетки растений, клетки млекопитающих и грибы, как, например, дрожжи. Следующим предметом изобретения является протеин TGF-b-семейства, который кодируется ДНК-последовательностью по п. 1 формулы изобретения. Предлагаемый согласно изобретению протеин предпочтительно содержит указанную в SEQ ID № 2 аминокислотную последовательность или, в случае необходимости, ее функциональные части и обладает такими биологическими свойствами как, например, индуцирование пролиферации клеток ткани, в особенности остеоиндуцирование, и/или митогенные способности, которые могут быть пригодны для терапевтического применения. Вышеуказанные признаки протеина могут изменяться в зависимости от образования гомодимеров или гетеродимеров. Такие структуры могут оказаться также пригодными для клинических применений. Биологические свойства предлагаемых согласно изобретению протеинов, в особенности митогенный и остео-индуктивный потенциал, можно определять, например, путем испытания согласно Seyedin и др., PNAS, 82 (1985), 2267-2271; или Sampath и Reddi, PNAS, 78 (1981), 7599-7603. 5 35624 Другим предметом настоящего изобретения является способ получения протеина TGF-b-семейства, который отличается тем, что культивируют трансформированную с помощью предлагаемой согласно изобретению ДНК или предлагаемого согласно изобретению вектора клеткухозяина и TGF-b-протеин получают из клетки и/или надосадочной жидкости после культивирования. Такой способ включает культивирование трансформированной клетки-хозяина в пригодной питательной среде и очистку полученного TGF-bобразного протеина. Таким образом, способ позволяет получить достаточное количество желательного протеина для использования в медицине при лечении или в тех случаях, где употребляют методы с использованием культуры клеток, при которых необходимы факторы роста. Клеткой хозяином может быть бактерия, как, например, Bacillus или Е.соїі; гриб, как правило, дрожжи; клетка растения, как, например, табак, картофель или Arabidopsis; или клетка животного, в особенности линия клеток позвоночного животного, как, например, Мо-, COS- или СНО-линии клеток; или линия клеток насекомых. Еще одним следующим предметом настоящего изобретения является приготовление фармацевтических композиций, которые содержат фармацевтически эффективное количество предлагаемого согласно изобретению TGF-b-протеина в качестве биологически активного вещества. В случае необходимости, такая композиция включает фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество, разбавитель или наполнитель. Такая фармацевтическая композиция может применяться при заживлении ран и регенерации тканей, а также при лечении повреждений костей, хрящей, соединительных тканей, кожи, слизистой оболочки, эпителия или зубов и в случае зубных имплантатов, либо индивидуально, либо в комбинации с другими биологически активными веществами, например, с другими протеинами TGF-bсемейства или факторами роста, как, например, EGF (эпидермальный фактор роста) или PDGF (происходящий от тромбоцитов фактор роста). Далее, такую фармацевтическую композицию можно применять для предупреждения заболеваний, например, для предупреждения остеопороза и артроза. Другим возможным клиническим применением предлагаемого согласно изобретению TGF-b-образного протеина является использование в качестве супрессора иммунной реакции для избежания отторжения трансплантатов органов или использование в связи с ангиогенезом. Предлагаемую согласно изобретению фармацевтическую композицию можно также применять для профилактики или в косметической хирургии. Далее, применение композиции не ограничивается людьми, и ее можно применять также в случае лечения животных, в особенности, домашних животных. Наконец, дальнейшим предметом изобретения является антитело, которое может специфически связываться с предлагаемыми согласно изобретению протеинами, или такого рода фрагмент антитела (например, Fab или Fab1). Способы получения такого специфического антитела или фрагмента антитела хорошо известны среднему специалисту. Предпочтительно такое антитело представляет собой моноклональное антитело. Такие антитела или фрагменты антител могут быть пригодны также для диагностических методов. Далее изобретение более наглядно иллюстрируется следующими примерами. Пример 1 Выделение МР-52 1.1. Полную РНК выделяют из человеческой эмбриональной ткани (в возрасте 8-9 недель) по методу Chirgwin и др., Biochemistry, 18 (1979), 5294-5299. Поли (А+)-РНК отделяют от полной РНК путем олиго (dТ)-хроматографии согласно инструкциям изготовителя (Stratagene Poly (A) Quick- колонки). 1.2. Для реакции обратной транскрипции 1-2,5 мкг поли (А+)-РНК в течение 5 минут нагревают при 65°С и быстро охлаждают льдом. Реакционная смесь содержит 27 ед. PHK-Guard (Pharmacia), 2,5 мкг олиго (dT) 12-18 (Pharmacia), 5 x буфер (250 ммоль/л Трис/НСІ, рН = 8,5; 50 ммоль/л МgСІ2; 50 ммоль/л ДТТ (дитиотреитола); 5 ммоль/л любого дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфа та), 600 ммоль/л KCI) и 20 ед. AMV обратной транскриптазы (Boehringer Mannheim) на 1 мкг поли (А+)-РНК. Реакционную смесь (25 мкл) инкубируют в течение 2-х часов при 42°С. 1.3. Указанные на фиг. 2 дезоксинуклеотидные праймеры OD и OID получают на автоматическом ДНК-синтезаторе (Biosearch). Очистку осуществляют путем денатурирующего электрофореза на полиакриламидном геле и выделения основной полосы из геля путем изотахофореза. Путем сравнения последовательностей нуклеиновых кислот известных членов TGF-b-семейства и выбора областей с самым высоким сохранением проектируют олигон уклеотиды. Сравнение этих областей представлено на рис. 2. Для облегчения клонирования оба нуклеотида содержат сайты рестрикции EcoRI и OD содержит дополнительно сайт рестрикции Ncol на своем 5'-конце. 1.4. В случае полимеразной цепной реакции (PCR-реакции) применяют 20 нг соответствующей поли (А+)-РНК кДНК из исходного материала. Реакцию осуществляют в объеме 50 мкл, и он содержит 1 х PCR-буфер (16,6 ммоль/л (NH4)2S04; 67 ммоль/л Трис/НСІ, рН = 8,8; 2 ммоль/л МgСІ2; 6,7 мкмоль/л ЭДТК, 10 ммоль/л Р- меркаптоэтанола; 170 мкг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота (Gibco); 200 мкмоль/л любого дНТФ (Pharmacia); 30 пкмоль каждого олигонуклеотида (OD и OID) и 1,5 ед. Taq-полимеразы (Ampli Taq, Perkin Elmer Cetus). Реакционную смесь покрывают парафином и осуществляют 40 циклов полимеразной цепной реакции. Продукты полимеразной цепной (РСR)реакции очищают путем экстракции с помощью фенола с хлороформом и концентрируют п утем осаждения этанолом. 1.5. Продукт полимеразной цепной реакции расщепляют с помощью рестрикционных ферментов SphI (Pharmacia) и ALwNI (BioLabs) соответственно инструкциям изготовителя. 1.6. Продукты рестрикционного расщепления фракционируют путем электрофореза на агарозном геле. После окрашивания с помощью этидиумбромида нерасщепленные продукты амплифи 6 35624 кации вырезают из геля и выделяют путем экстракции фенолом. Полученную ДНК затем очищают путем двукратной экстракции фенолом с хлороформом. 1.7. После осаждения этанолом одну четвертую или одну пятую часть выделенной ДНК реамплифицируют, причем используют такие же условия, как и для первичной амплификации, за исключением того, что число циклов уменьшают до 13. Продукты реамплификации (повторной амплификации) очищают, разрезают с помощью таких же ферментов, как указанные выше, и неразрезанные продукты, как пояснено выше для продуктов амплификации, выделяют из агарозных гелей. Стадию реамплификации (повторной амплификации) повторяют дважды. 1.8. После последнего выделения из геля продукты амплификации расщепляют благодаря 4 ед. EcoRI (Pharmacia) при рекомендуемых изготовителем условиях. Одну четвертую часть смеси после рестрикции легируют с расщепленным с помощью EcoRI вектором pBluescript II + SK + (Stratagene) После легирования 24 клона анализируют далее путем секвенирования. Расщепленный с помощью AlwNI и SphI образец дает новую последовательность, которая обозначается как МР-52. Др угие клоны содержат преобладающие ВМРб-последовательности и один клон содержит ВМР7-последовательность. Клон на З'-конце дополняют кДНК согласно подробно описанному Frohmann методу (Amplifications, опубликовано Perkin-EImer Corp., Issue 5 (1990), с. 11-15). Такую же эмбриональную мРНК, которая была применена для выделения первого фрагмента МР-52, подвергают обратной транскрипции как описано выше. Амплификацию осуществляют при применении адаптерного праймера (AGAATTCGC ATGCC ATGGTCGACG) и внутреннего праймера (CTTGAGTACGAGGCTTTCCACTG) МР-52-последовательности. Продукты амплификации реамплифицируют при применении перекрывающего адаптерного праймера (ATTCGCATGCC ATGGTCGACGAAG) и перекрывающего внутреннего праймера (GGAGCCCACGAATC ATGCAGTC A) МР-52-последовательности. Продукты реамплификации после рестрикционного расщепления с помощью Ncoi, клонируют в расщепленный таким же образом вектор [pUC 19 (Pharmacia № 27-4951-01) с одним измененным составным мультиплетным участком клонирования, который содержит единственный сайт рестрикции Ncoi], секвенируют. Клоны характеризуют путем соединения внахлестку их последовательности с З'концом известной МР-52-последовательности. Один из них используют в качестве зонда для скрининга человеческого геномного банка генов (Stratadene № 946203) согласно описанному подробно Ausubel и др. методу (Current Protocol in Molecular Biology, опубл. Greene Publishing Associates und Wiley-lntersience (1989)). Из 8.105 lфагов выделяют фаг (l2.7.4), который содержит вставку примерно из 20 кб и депонирован в DSM под номером 7387. Этот клон, наряду с последовательностью, выделенной из мРНК путем описанных методов амплификации, содержит другие, несущие информацию последовательности на 5'конце. Для анализа путем секвенирования, Hind III фрагмент длиной примерно 7,5 кб субклонируют в разрезанный таким же образом вектор (Bluescript SK, Stratagene № 212206). Эта, обозначаемая как SKL52 (НЗ) МР12, плазмида также хранится в DSM под номером 7363. Представленная в SEQ ID № 1, несущая информацию последовательность происходит от фага l2.7.4. ATG в положении 640 представляет собой первый ATG в рамке считывания (в положении 630 появляется стопкодон). На основании указанной последовательности нужно предполагать, что при этом речь идет о стартовом кодоне для трансляции. Геномная ДНК содержит интрон длиной примерно 2 кб между парами оснований 1270 и 1271 SEQ ID № 1. Последовательность интрона не показана. Правильность места сплайсинга подтверждается путем секвенирования продукта амплификации, который происходит от кДНК, содержащий эту область. Эти, несущие информацию последовательности получают с помощью незначительно модифицированного метода, который подробно описан Frohman (Амплификации, опубликовано Perkin-Elmer-Corporation, Issue 5, (1990), с. 11-15). Такую же эмбриональную РНК, которую использовали для изолирования З'-конца МР-52, подвергают обратной транскрипции при применении внутреннего, ориентированного в 5'-направлении, праймера МР-52-последовательности (ACAGC AGGTGGGTGGTGTGGACT). Поли-А-конец (хвост) присоединяют к 5'-концу первой кДНК-нити при применении концевой трансферазы. Осуществляют двухстадийную амплификацию, сначала путем применения состоящего из олиго-dT и адаптерной последовательности праймера (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC (Т 16 и, вовторых, при применении адаптерного праймера (AGAATTCGC ATGCC ATGGTCGACG) и вн утреннего праймера (CCAGCAGCCCATCCTTCTCC) МР52-последовательности. Продукты амплификации реамплифицируют при применении такого же адаптерного праймера и перекрывающего (соединяющегося внахлестку) внутреннего праймера (TCCAGGGCACTAATGTC AAAC ACG) МР-52-последовательности. Затем продукты реамплификации повторно амплифицируют при применении перекрывающего адаптерного праймера (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) и перекрывающего внутреннего праймера (ACTAATGTC AAACACGTACCTCTG) МР-52-последовательности. Продукты повторной амплификации с помощью гладких концов клонируют в вектор (Bluescript, SK, Stratagene № 212206), который расщеплен с помощью EcoSV. Клоны характеризуют путем перекрывания их последовательности с помощью ДНК фага l2.7.4. Далее, кДНК-банк, полученный из РНК человеческих фибробластов и клонированный в фаге lgt 10, подвергают скринингу. При этом исследуют 2 х 106 фагов, используя в качестве радиоактивного зонда фрагмент геномной МР-52-ДНК величиной примерно 1 кб (2-ой экзон вплоть до сайта рестрикции Hind III в неподвергнутой трансляции З'-области). Выделяют 17 пятен (зон гемолиза) сме-си, которые дополнительно исследуют с помощью PCR при применении праймеров из 5'-3'области МР-52-последовательности. После этого 7 35624 выбирают и разъединяют 8 стерильных пятен. кДНК выделяют из фага путем частичного расщепления с помощью EcoRI и клонируют в также расщепленный с помощью EcoRI Bluescript-вектор. Секвенирование одной из результирующи х плазмид SK52L15.1MP25 показывает, что самый длинный фаг. (15.1) начинается с нуклеотида № 321 SEQ ID № 1. Далее, путем секвенирования подтверждается место сплайсинга (нуклеотид 1270). Плазмида SKL 52 (НЗ) МР12 хранится под номером 7353 в DSM (немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток, Mascheroder Weg 1b, 38124, Braunschweig) с 10 декабря 1992 г. Фаг. l2.7.4. хранится под номером 7387 в DSM с 13 января 1993 г. Плазмида SK52L15.1MP25 хранится под номером 8421 в DSM с 16 июля 1993 г. Пример 2 Экспрессия МР-52 Для экспрессии МР-52 испытывают различные системы. Применение вирусов осповакцины в качестве системы экспрессии исчерпывающе описано в Current Protocols в Molecular Biology (Ausubel и др., Greene Publishing Asociates and Wileylntercience, Wiley and Sons), сокращенно называемых СР, в главе 16, часть 16.15-16.18, которое может служить руководством для специалиста в дальнейшем. Система основана на том, что чужеродные ДНК при применении определенных векторов путем гомологичной рекомбинации можно интегрировать в геном вируса осповакцины. Для этой цели, используемый вектор содержит ТК (тимидинкиназа) ген из генома осповакцины. Для того, чтобы сделать возможной селекцию в отношении рекомбинантных вирусов, вектор далее содержит E.coli-ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза-ген (gpt) (Falkner и др., J. Virol., 62 (1988), 1849-1854). В этот вектор клонируют кДНК со всей кодирующей областью МР-52. кДНК происходит от плазмиды SK52L15.1MP25 (DSM, номер 8421), которую, для удаления большой части не подвергнутой трансляции 5'-области, однако, сначала подвергают делению и промежуточно клонируют. Для этого плазмиду SK52L15.1MP25 линеаризируют с помощью Sail и 5'-конец последовательно подвергают делеции с помощью набора Exo 111/Mung Bean (Stratagene #200 300) согласно указаниям изготовителя. После рестрикции с помощью ВатН1 в разной степени подвергшиеся делению МР-52-кДНК на агарозогеле отделяют от остаточного вектора, изолируют и согласно стандартным методам (Sambrook и др., Molecular Cloning 2-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) промежуточно клонируют в подвергнутий рестрикции с помощью EcoRV и ВатН1 pBluescript II SK-векгор (Stratagene # 212206) (p. SK52S). Все рестрикции осуществляют согласно указаниям изготовителя. Дополнительное секвенирование с помощью секвеназы (USB/Amersham #70770) дает, между прочим, клон, который начинается с нуклеотида 576 в SEQ ID № 1 (на 64 пары оснований удален от стартового кодона). Из него за счет рестрикции с помощью Sail и Sad изолируют кДНК-вставку и клонируют в таким же образом расщепленный вектор для рекомбинации в осповакцине. Результирующую пла змиду (pBP!MP52S) хранят в DSM (под номером 9217) с 24 мая 1994 г., и используют для получения рекомбинантных вирусов осповакцины. Для этого до 80% конфлюэнтных 143В клеток (HuTK-, ATCC CRL 8303) в чашках для культур диаметром 35 мм инфицируют с помощью вируса вакцины оспы дикого типа в 2 мл PBS (фосфатнобуферного рассола) в течение 30 минут при комнатной температуре и при встряхивании, по случаю (1 вирус на 10 клеток). После отсасывания надосадочной жидкости и добавки 2 мл питательной среды (MEM, Gibco BRL # 041-01095) инкубируют в течение 2-х часов при 37°С. Среду затем удаляют, и трансформации этих клеток достигают с помощью 100 нг pBP1MP52S, 2 мкг носителя ДНК (телячья вилочковая железа, Boehringer Mannheim # 104175) и 10 мкл липофектина (Gibco BRL #18292-011) в 1 мл MEM в течение 15 часов при 37°С. После добавки 1 мл MEM с 20% FCS (Gibo BRL #011-06290) инкубируют в течение следующи х 24-х часов при 37°С и лизированные клетки затем замораживают. gpt-Селекцию на ксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазе и изоляцию и амплификацию отдельных рекомбинантных вирусов осуществляют по существу как описано в части 16.17 СР, с тем различием, что применяют РК-13 клетки (ATCC CCL 37). Интеграцию МР52-кДНК в вирусный геном подтверждают путем анализа при использовании блоттинг-метода по Саузерну и дот-блоттинга (СР, часть 16.18). Рекомбинантный вирус используют для экспрессионных анализов в линии клеток 143В (НиТк-, ATCC CRL, 8303, человек). Конфлюэнтные клетки инфицируют с помощью количества вирусов, соответствующего количеству клеток, в течение 45 минут при 37°С и затем добавляют соответствующую питательную среду (MEM, Gibco BR L #041-01095) с 10% FCS и пенициллин/стрептомицина (1:500, Gibco BRL #043051404). Спустя 6 часов при 37°С удаляют среду, клетки промывают дважды с помощью, например, HBSS (Gibci BRL #042-04180М) и добавляют питательную среду (например, MEM) без FCS. После продуцирования в течение 20-22-х часов собирают надосадочную жидкость культуры клеток. Анализ экспрессии осуществляют п утем вестернблоттинга по стандартным методам (СР, часть 10.8). Для этого протеины осаждают из 100-500 мкл надосадочной жидкости культуры клеток путем добавки эквивалентного объема ацетона и инкубации по меньшей мере в течение 1 часа на льду и отделяют п утем центрифугирования. После повторного суспендирования осадка в заданном буфере (7 М мочевины, 1% SDS, 7 ммоль д и гидрофосфата натрия, 0,01% бромфенолового синего и, в случае необходимости, 1% b-меркаптоэтанола) осуществляют разделение на 15%-ном полиакриламидном геле. В качестве маркерных протеинов используют предварительно окрашенный стандарт по молекулярной массе протеина (Gibco BRL #26041-020). Перенос на PVDFмембрану (Immobilon #IPVH00010) и блокирование мембраны осуществляют стандартными методами. Для обнаружения МР-52 на мембране получают поликлональные антитела против МР-52 как 8 35624 в случае кур, так и также в случае кроликов. Для этого зрелую часть МР-52 с 6 гистидинами на Nконце экспрессируют в Е.соП и очи щают, как например, описано Hochuli и др. (BIO/Technology, 6, 1321-1325 (1988)). С помощью обоих антител можно обнаруживать специфически экспрессию МР-52, причем димерный МР-52 менее эффективно распознается, чем мономерный. Для вестернблоттинга, согласно фиг. 3, применяют куриные антитела, которые специфически очищены путем ПЭГ-преципитации (Thalley и др., (ВІО/Technology, 8, 934-938 (1990)) и через связанный с мембраной антиген (зрелый МР-52 с 6 гистидинами) (18, 17; Sambrook и др., Molecular Cloning, 2-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). В качестве второго антитела используют антикуриный IgG с присоединенной щелочной фосфатозой (Sigma A 9171). Обнаружение осуществляют с помощью набора для определения протеина Tropix Western-Light (Sen/a #WL10RC), согласно указаниям изготовителя. Вестерн-блоттинг на фиг. 3 показывает, что только в случае рекомбинантных вирусов, но не в случае вир усов дикого типа (без интегрированной чужеродной ДНК), появляются специфические для МР-52 полосы. Экспрессия МР-52 приводит к секретированному протеину с проявляющейся в геле при невосстанавливающих условиях молекулярной массой приблизительно 25 кДа. При восстанавливающих условия х протеин с 14-15 кДа проникает в гель. Эти результаты показывают, что МР-52 экспримируется как димерный зрелый протеин. В случае появляющихся при вестерн-блоттинг-анализе слабых полос в области выше 60 кДа речь идет, вероятно, об остатках неразрезанных протеинов-предшественников. Поведение в отношении проникания к тому же подтверждают получаемые из SEQ ID № 2 теоретические молекулярные массы, сообразно с чем зрелый мономерный МР-52 имеет величину 13.6 кДА. Экспрессию МР-52 и расщепление протеинапредшественника до зрелого МР-52 можно обнаружить в различных линиях клеток. Испытывали клетки С127 (АТСС CRL 1616, мышь), ВНК21 (АТСС CCL, 10, хомяк), МРС-5 (АТСС CCL 171, человек) и ЗТ6 Swiss albino (АТСС CCL ,96, мышь). Экспрессия и расщепление до зрелого МР-52 показана также в другой эукариотной системе экспрессии. Для этого кДНК МР-52 (начинающуюся с нуклеотида 576) клонируют в плазмиду экспрессии pSG5 (Strotagene #216201). Плазмиду pSK52 подвергают рестрикции с помощью Сlа 1 и Хbа1 и путем обработки Т4-полимеразой делают тупыми выступающие концы МР-52-вставки. Клонирование в подвергнутый рестрикции и также с тупыми концами за счет обработки с помощью Т4полимеразы вектор pSG5 осуществляют стандартными методами. Все ферментативные реакции осуществляют согласно указаниям изготовителя. Правильную ориентацию МР-52-вставки обеспечивают за счет рестрикционного анализа и дополнительного секвенирования с помощью Т7праймера (Stragene #300302). Результирующую плазмиду pSG52s (хранится с 17.05.1994 в DSM под номером 9204) можно котрансформировать с помощью вектора, который кодирует выбираемый маркер, как например, ген устойчивости G418, чтобы получить стабильные линии клеток. Для этой цели pSG52s котрансформируют вместе с плазмидой р3616 (хранится в DSM под номером 9203 с 17,05.1994 г.) в 1.929-клетки (АТСС CCL1, мышь) с помощью липофектина (Gibco BRL #18292-011), согласно указаниям изготовителя. Селекцию с помощью G418 осуществляют согласно известным специалисту методам (СР, часть 9.5) и приходят к линии клеток, которая в вестернблоттинге продуцирует обнаруживаемый зрелый МР-52. Другой вектор экспрессии для МР-52 получают при применении плазмиды pABWN (Niwa и др., Gene, 108. (1991), 183-200; и рис. 4), который предоставлен в распоряжение доктором Miya zaki. Для этого Hind Ill-фрагмент из плазмиды pSK52s, который начинается с нуклеотида 576 в SEQ ID № 1, изолируют и выступающие концы затупляют путем обработки с помощью фрагмента Кленова. Путем лигирования адаптера в оба конца фрагмента вводят сайт рестрикции Not 1. Адаптер: AGCGGCCGCT TCGCCGGCGA Вектор pABWN подвергают рестрикции с помощью Xho 1, также обрабататывают фрагментом Кленова и дефорфорилируют с помощью кишечной щелочной фосфатазы теленка (Boehringer Mannheim). Этот фосфорилированный адаптер дополнительно лигируют, так, что теперь возможна вставка МР 52-фрагмента после рестрикции с помощью Not 1 в генерированное Not 1 место разреза вектора. Результирующий вектор экспрессии ниже обозначается как Hind III-MP 52/pABWN. Все осуществляемые реакции клонирования проводят по стандартным методам (например, СР, часть 3.16). Структура Hind lll-MP 52/pABWN-вектора экспрессии подтверждается путем секвенирования и получения карты рестрикции. Hind III-MP 52/pABWN содержит МР 52-последовательность, начинающуюся с нуклеотида 576 и заканчивающуюся нуклеотидом 2278 в SEQ ID №1. Hind III-MP 52/pABWN трансфицируют в Lклетки (мышиные фибробласты), и оттуда получают стабильные трансформанты. Для этого, смотря по обстоятельствам, 4 мкг плазмиды (Hind III-MP 52/pABWN или pABMN) трансфицируют в 5 х 105 L-клеток, находящихся в чашках для культур диаметром 6 см, при применении 20 мкл реактива Lipofect AMINE (Gibco BRL #18324-012). Для этой цели раствор А (4 мкг соответствующей плазмиды ДНК в 200 мкл OPTI-MEM 1 (Gibco BRL #31985 )) осторожно смешивают с раствором В (20 мкл реактива Lipofect AMINE в 200 мкл OPTI-MEM 1) и при комнатной температуре в течение 45 минут инкубируют для образования комплекса ДНКлипосомы. Во время этой процедуры клетки промывают один раз с помощью 2 мл OPTI-MEM 1. Для каждой трансфекции в сосуд с ДНКлипосомным комплексом вводят 1,6 мл OPTIMEM 1. Раствор осторожно перемешивают и, таким образом, переслаивают промытые клетки. Клетки инкубируют с разбавленным комплексом в течение 5 часов при 37°С в СО2- содержащем инкубаторе. После инкубации добавляют 2 мл DMEM 9 35624 (Gibco BRL, модифицированная Dulbecco Eagleсреда) с 20% FCS. Спустя 24 часа после трансфекции среду заменяют свежей DMEM с 10% FCS. Спустя 48 часов после начала трансфекции клетки переносят в чашки для культур диаметром 10 см. Спустя 72 часа после начала трансфекции с концентрации 800 мкг/мл начинается селекция G 418. Стабильные клоны появляются спустя 1-2 недели. 5 мл кондиционированной DMEM с или без FCS получают от конфлюэнтных трансформантов, которые выросли в течение 3-х дней в чашке для культуры диаметром 10 см. Трансфецированные 2-мя различными надосадочными жидкостями культур клеток (Hindlll-MP52/pABWN и pABWN) клетки, а также лизаты клеток исследуют путем вестерн-блоттинга. При этом в кондиционированной среде, а также в лизатах трансфецированных с помощью Hindlll-MP52/pABWN клеток найден зрелый МР-52. Клоны клонируют далее и продуцирующие МР-52 клетки, смотря по обстоятельствам, выбирают согласно вестерн-блоттинганализу. Оценки из вестерн-блоттинг-анализов показывают МР52-продуцирование вплоть до 1 мг/л. Пример 3 Биологическая активность МР-52 Для того, чтобы обнаружить биологическую активность МР-5 и доказать полезность настоящего изобретения для применений в медицине с целью избежания и/или лечения заболеваний костей, осуществляют различные эксперименты in vitro и in vivo. 1. Испытание in vitro 1.1. Так как усиление синтеза гликозаминогликана (GAG) в хондроцитах после TGF-bстимуляции описано (Hiraki и др., Biochimica et Biophysica Acta, 969 (1988), 91-99), исследуют, оказывает ли такое же влияние МР52. При применении надосадочных жидкостей культур клеток (DMEM с 10% FCS), продуцирующих МР52 трансформантов L-клеток (трансфекция с помощью Hind lll-MP52/pABWN), изучают хондрогенную активность МР-52 в первичных культура х из зародышевых конечностей крыс. Для этой цели используют 4 конечности крысиных плодов в возрасте 16 дней. После трипсинирования полученные клетки в F-12-среде (питательная смесь Hamis F-12, Gibco BRL # 21700), содержащей 10% FCS, помещают на покрытые коллагеном типа 1 пластины с 24-мя лунками в количестве 3 х 105 клеток и культивируют примерно 2 дня вплоть до конфлюэнции. К 500 мкл питательной среды (F-12-среда с 10% FCS), в зависимости от обстоятельств, добавляют 56 мкл кондиционированной среды (КМ) трансфектантов за счет Hind ІІІ-МР52/рАВWN-L-клеток, трансфектантов за счет pABWN-L-клеток или только среду (DMEM с 10% FCS). Через промежуток времени 0, 3, 6 и 9 дней применяют F-12-среду с 10% FCS, а также соответствующие добавки. Все три дня осуществляют перемену среды с соответствующими добавками. Затем следующие 2 дня культуру культивируют в F-12-среде без FCS в присутствии соответствующи х добавок (кондиционированные среды, соответственно, контрольная среда) и после этого добавляют 35S-сульфат за 6 часов. Инкорпорированную в полисахариды 35S определяют после проназа-Е-переваривания и преципитации, как описано Hiraki и др. (Biochimica et Biophisica Acta, 969, (1988), 91-99)). Таблица 1 Радиоактивность (cpm/лунка) KM трансфектантов KM трансфектантов L-клеток за счет L-клеток за счет pABWN Hind lll-MP52/pABWN 3865±120 4879±422 4154±29 8223±275* 3310±115 9890±1260* 3633±167 7520±160* Число стадий DMEM (10% FCS) контрольных клеток 2 5 8 11 3720±114 4188±135 3546±160 3679±218 Величина относится к ±S.E.M. для 3 или 4 культуральных смесей. *: р < 0,01 vs DMEM и KM трансфектантов Lклеток, полученных с помощью pABWN (многократный t-тест Scheffe). Как видно из табл. 1 надосадочные жидкости культур клеток продуцирующих МР52 трансфектантов значительно стимулируют синтез GAG по сравнению с чистой питательной средой (DMEM с 10% FCS) или надосадочной жидкостью культуры L-клеток, трансфецированных с помощью pABWN. Это показывает, что МР52 может стимулировать дифференциацию хондроцитов. 1.2. Описанный эффект некоторых членов ВМРсемейства представляет собой усиление активности щелочной фосфатазы (ALP-активности) в остеобластах. Клональные линии клеток крыс ROBC26 (С-26) причисляют к остеобластам относительно ранней стадии созревания (Yamoguchi и др., Calcif. Tissue Int. 49 (1991), 221-225). Для остеоиндуктивных протеинов, как, например, BMP-2, описана способность усиливать ALP-активность: Yamaguchi и др., J. Cell. Biol. 113 (1991), 881-687. Влияние МР52 на С26-клетки исследуют следующим образом. С26-Клетки в количестве 3 х 104 клеток на лунку высевают на пластину с 24-мя лунками и культивируют в среде а-МЕМ. (Gibco BRL) с 10% FCS вплоть до конфлюэнции. На 1 лунку добавляют 56 мкл надосадочной жидкости культуры продуцирующи х МР52 трансфектантов L-клеток (Hindlll-MP52/pABWN), соответственно, надосадочной жидкости трансфектантов L-клеток, полученных с помощью pABWN, или только надосадочной жидкости культуры (DMEM с 10% FCS) L-клеток к 500 мкл среды культуры клеток С-26. Замену среды с соответствующими добавками осуществляют все три дня. ALP-Активность в экстрактах клеток определяют спустя 0, 3, 6, 9 и 12 дней с помощью стандартных способов, базирую 10 35624 щи хся на п-нитрофенил-фосфате в качестве субстрата, как, например, описано Takuwa и др. (Am. J. Physiol. 257 (1989), E797-E803). Таблица 2 ALР-активность (нмоль/мин) на лунку KM трансфектантов KM трансфектантов L-клеток за счет L-клеток за счет pABWN Hind lll-MP52/pABWN 41,8±2,8 41,8±2,8 125,8±2,3 181,3±14,2* 119,3±6,4 258,0±8,3* 110,1±2,8 258,4±10,6* 125,3±6,0 237,8±11,0* Число стадий DMEM (10% FCS) инкубаций контрольных L-клеток 0 3 6 9 12 41,8±2,8 136,3±3,7 129,0±7,8 121,2±3,2 121,2±3,2 Значения относятся к± S. D. для 4 культуральных смесей. *: р < 0,01 vs DMEM и КМ трансфектантов Lклеток, получаемых за счет pABWN (многократный t-тест Scheffe). Как следует, из табл. 2, ALP-активность значительно усиливается за счет добавки МР52 по сравнению с чистой средой DMEM с 10% FCS и средой инфицированных с помощью pABWN Lклеток. Этот результат показывает, что МР52 может способствовать не только дифференциации хондроцитов, но также дифференциации и созреванию остеобластов. Другая линия клеток остеобластов (МСЗТЗЕ1, мышь), которая, как описано Takuwo и др. (Biochem. Biophys. Res. Corn., 174 (1991), 96-101), путем обработки BMP-2 показывает увеличение ALP-активности, после инкубации с кондиционированной средой продуцирующи х МР52 трансфектантов L-клеток (Hind lll-MP52/pABWN) или со средой после продуцирования МР52 за счет инфекции рекомбинантными вирусами осповакцины не показывает никакого изменения ALP-активности. Это указывает на то, что МР52 обладает отчасти специфичностью клетки, отклоняющейся от ВМР2. Различные функции, обусловленные разными целевыми участками отдельных членов TGF-bсемейства, могут иметь большую пригодность в медицине. 2. Эксперименты по in vivo. 2.1. Наиболее четко высказанная возможность исследования развития костей базируется на эктопическом остеогенезе in vivo. Его можно индуцировать, например, путем имплантации деминерализованной костной матрицы (Urist, Science, 150 (1965), 893- 899). Путем комбинации неактивной матрицы с индуцирующими остеогенез протеинами можно индуцировать такой же процесс, который описан, например, Sampath и др. (PNAS*, 78 (1981, 7599-7603). Этот процесс остеогенеза похож на таковой эмбрионального интрахондрального остеогенеза и лечения костей во взрослом состоянии. Таким образом, этот метод дает возможность исследовать протеины на их способность к индуцированию остеогенеза in vivo. (*) означает Proc. Natl. Acad. Sci., США Для такого эксперимента МР52-протеин, который получают путем экспрессии в системе осповакцины (см. пример 2), частично очищают и имплантируют. Для этой цели 143В-клетки (НuТк-, АТСС CRL 8303) выращивают в ча шках для культивирования и микролитражных емкостях вплоть до конфлюэнции и, как описано в примере 2 для анализов путем экспрессии, инфицируют с помощью рекомбинантных вирусов, промывают и оставляют аккумулировать примерно в течение 20 часов МР52 в MEM (Gibco BRL, примерно 1 мл на 106 клеток). В качестве контроля осуществляют такое же приготовление путем инфекции с помощью вирусов дикого типа. Надосадочную жидкость культуры клеток (кондиционированная среда) каждого приготовления (смеси) собирают и центрифугируют (40000 х g в течение 30 минут при 4°С). Для удаления вирусов надосадочные жидкости фильтруют через неорганические фильтры (величина пор 0,1 мкм, Whatman, Anotop 25). В ходе о характеризовывания МР-52 смогли обнаружить, что этот протеин связывается с гепарин-сефарозой. Это поведение используют для частичной очистки. Для этой цели отфильтрованную и отцентрифугированную кондиционированную среду доводят до конечной концентрации 50 ммоль ТРИС рН = 7,0; 100 ммоль NaCI и 6 моль мочевины и загружают в колонку с гепарином (НіТгар™, Pharmacia #17-0407-01), которая уравновешена буфером А (50 ммоль ТРИС рН = 7,0, 100 ммоль NaCI и 6 моль мочевины). Нагруженную колонку промывают буфером А и с помощью линейного градиента до 100% буфера В (50 ммоль ТРИС рН = 7,0, 600 ммоль NaCI и 6 моль мочевины) при скорости истечения 0,5 мл/мин, элюируют в течение 50 минут (2,5 мл на фракцию). Применение мочевины необязательно. Путем вестерн-блоттинг-анализа (см. пример 2) можно дополнительно проверять, что МР52-элюируется воспроизводимо в основном в 2 фракциях при концентрации NaCI примерно 250-400 ммоль. Аликвоты этих фракций также, согласно инструкциям изготовителя, проверяют с помощью окрашенных серебром 15%-ных полиакриламидных гелей (Silver Stain-ll, Daiichi #SE140000) и объединяют. Сопоставимые фракции, после очистки от кондиционированной среды после инфекции с помощью вирусов дикого типа, также объединяют после анализа в окрашенных серебром гелях. Из дальнейших исследований в отношении МР52 следует, что МР52 также связывается с гидроксиапатитом. Поэтому, в принципе, можно достигать дополнительной очистки при использовании колонки с гидроксиапатитом, соответственно, заменять колонку с гепарином (например, BIORAD, Есопо-рас НТР). Для дальнейших очисток 11 35624 возможны также другие, известные специалисту методы, как, например, колонки с гельситами (Gelseiebsoulen), колонки с ионообменниками, аффинные колонки, колонки с хелатами металлов или колонки, базирующиеся на гидрофобных взаимодействиях. Предварительно очищенный путем хроматографии на гепаринсефарозе МР52-протеин, или еще загрязняющие протеины, которые находятся также в инфицированных диким типом надосадочных жидкостях культуры клеток, очищают далее с помощью обращенной фазы ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии). Для этой цели СЗ-колонку (Aquapore RP 300, Applied Biosystems, размер частиц: 7 мкм; величина пор: 300 А) уравновешивают с помощью 10 % буфера В (буфер А: 0,1% три фтор уксусной кислоты; буфер В : 90 % ацетонитрила, 0,1 % трифторуксусной кислоты). После загрузки колонки объединенными, содержащими МР52 фракциями гепариновую колонку промывают большим количеством 10 % буфера В. Связанный протеин элюируют с помощью следующи х градиентов : 10-50 % буфера В в течение 20 минут и 50-100 % буфера В в течение 50 минут. Фракции по 500 мкл собирают и анализируют как путем вестерн-блоттинг-анализа, так и в окрашенных серебром гелях. МР52Протеин при выбранных условиях элюир уется примерно в области 55-65 % ацетонитрила. Фракции с МР52 объединяют. То же самое осуществляют с соответствующими фракциями из контрольной очистки надосадочной жидкости инфицированных вирусами дикого типа клеток. Также частично очищенный МР52-Протеин в определенной путем вестерн-блоттинг-анализа концентрации 50 нг/мл показывает отчетливое повышение ALP-активности на RОВ-С26-клетках после трех стадий инкубации. Частично очищенный МР52-Протеин или контрольный протеин из частично очищенных соответствующим образом надосадочных жидкостей культур клеток после инфекции вирусами дикого типа, реконструируют с матрицей и имплантируют крысам, чтобы доказать способность к хондро- и остеогенезу. В принципе должны быть применимы различные, известные специалисту матричные материалы, т.е. природные (также модифицированные) и синтетически полученные матрицы, предпочтительно, однако, биосовместимые биологически разрушаемые in vivo пористые материалы. В этих экспериментах применяют костную матрицу крыс, которая по существу приготовлена подобно тому, как описано Sampath и др. (PNAS, 80 (1983), 65916595). Крысиные кости (бедро и большеберцовая кость) деминерализуют в течение 24-х часов в 0,6 М HCI и затем удаляют еще имеющийся костный мозг. После промывки с помощью воды и обезжиривания в течение 3-х часов в смеси хлороформа с метанолом (1:1) кости высушивают на воздухе, в глубоко замороженном состоянии размалывают при низкой температуре в мельнице и отделяют путем просеивания частицы с размером 400-1000 мкм. После этого матрицу в течение 7 дней при комнатной температуре экстрагируют в 4 М гуанидин-НСІ в присутствии ингибиторов протеазы. После обильных промывок водой матрицу лиофили зируют и хранят при 4°С. Ни одна из обработанных таким образом матриц не проявляет никакой индуктирующей кости активности. Протеин, используя различные известные специалисту методы, можно комбинировать с проэкстрагированной костной матрицей. МР52-Протеин и, соответственно, контрольный протеин, который очищен, как при использовании гепарин-сефарозы, так и обращенной фазы ВЭЖХ, в растворе ацетонитрила с трифторуксусной кислотой, после элюирования объединяют в количестве по 25 мг матрицы на имплантат, хорошо смешивают, замораживают при низких температурах и лиофилизируют. Для имплантации связанного с матрицей МР52 используют крыс (Wistar) в возрасте примерно 3 месяца, которых приводят в состояние наркоза путем внутримышечной инъекции наркотического средства (0,2 мл Rompun (Bayer), смешанные с 0,5 мл Ketanest 50 (Parke Davis)) в количестве 0,14 мл на 100 г. веса тела. Для имплантатов приготовляют с двух сторон карманы в брюшных мышцах (ниже грудной клетки, начиная примерно на 0,5 см ниже самой нижней реберной дуги). Связанный с матрицей МР52 (примерно 24 мкг согласно определению по вестерн-блоттинганализу), а также соответственно связанные с матрицей контрольные протеины увлажняют с помощью 0,9 %-ного раствора хлорида натрия (Delta Pharma) и переносят в мышечные карманы. Мышечные карманы, а также необходимые разрезы кожи затем зашивают. Иммунитет крыс подавляют с помощью циклоспорина A (Sandimmun). Спустя 18 или 26 дней имплантаты извлекают из крыс и фиксируют для гистологических исследований. Так как имплантат с МР52 после 26 дней уже позволяет предполагать макроскопическое образование костей, то его помещают в метилметакрилат для приготовления тонких пленок; другие имплантаты помещают в парафин. Минерализованные хрящевые и костные ткани чернят согласно способу окраски von Kossa (Romeis В., Mikroskopische Technik, изд. Воск Р.; Urban und Schwarzenberg; Munchen, Baltimore, Wien (1989)). При окрашивании с помощью трихром-красителей согласно Masson-Goldner (Romeis В.; Mikroskopische Technik, изд., Воск Р.; Urban und Schwarzenberg; Munchen, Baltimore, Wien(1989) минерализованная костная ткань и коллаген окрашиваются в слегка зеленый цвет, остеоид окрашивается в красный, а цитоплазма приобретает красновато-коричневую окраску. К имплантатам из обеих крыс применяют оба способа окрашивания. С помощью обоих способов окрашивания в случае обоих подопытных животных можно доказать отчетливый хондро- и остеогенез в имплантатах, которые содержат МР52. Соответствующие имплантаты с контрольным протеином не показывают никакого хондро- и остеогенеза. Доля предстадий хряща с хондроцитами и хрящевыми областями с начинающимся образованием внеклеточной матрицы и ее минерализация в концентрических кругах в имплантате с МР52 спустя 18 дней выше, чем в таковом спустя 26 дней. Однако, также в имплантате спустя 18 дней уже обнаруживаются зрелые костные ткани с векториальным образованием остеоида, а также отдельные остео 12 35624 циты в кости. Далее, распознаваемы замкнутые косточки с начинающимся образованием костного мозга. В случае имплантата спустя 26 дней также еще обнаруживаются хрящевые области с начинающимся образованием матрицы и кальцинозом, доля окрашенной в зеленый цвет минерализованной костной ткани с остеоцитами и остеоидными краями, однако, отчетливо увеличена. Также в этом имплантате обнаруживается образование костного мозга с единичными случаями жировых клеток. Для наглядности, на рис. 5 показано получаемое путем окраски (von Kossa) образование костного материала из всего имплантата спустя 26 дней. На рис. 6 показан маленький вырез из того же самого имплантата после окрашивания по Masson-Goldner. Видны активные кости с ободком (краем) из кубоидальных остеобластов и в отдельных "вмурованных" остеобластах распознаваемы остеоиды. Далее, видны отдельные остеоциты в минерализованной костной ткани (в подлинном препарате окрашено зеленым). Также обнаруживается образование костного мозга. Опыт показывает, что рекомбинантно полученный МР52, один, в комбинации с матрицей, в состоянии индуцировать интрахондральный остеогенез. Для подтверждения результатов осуществляют другой тест эктопического остеогенеза при применении трансформантов за счет МР52 Lклеток. Продуцирующие MP52 (трансфецированные с помощью Hind lll-MP52/pABWN) и непродуцирующие МР52 (трансфецированные с помощью pAB.WN) L-клетки (1 х 106 клеток) вводят путем инъекции с обеих сторон мышц бедра самцам голых мышей, взятым по три. Спустя 3 недели всех животных умерщвляют, мышцы бедра отделяют и исследуют и х как с помощью рентгеновского излучения с низкой энергией, так и гистопатологически. Как представлено в табл. 3, анализ путем рентгеновского излучения показывает плотный материал в местах инъекции в мышечную ткань всех продуцирующих MP52 L-кпеток. С помощью гистологических исследований можно установить простой хондрогенез и кальцинозный хондрогенез в мышцах. Также эти результаты подтверждают, что MP52 может индуцировать интрахондральный остеогенез. Таблица 3 Продуцирующие МР52 клетки (Hide Ш-МР52/ pABWN) Контрольные клетки (pABWN) 3/3 0/3 3/3 0/3 3/3 0/3 Плотный материал в случае рентгеновского анализа Хондроциты в случае гистологии Кальцинозный хондрогенез в случае гистологии Проведенные эксперименты подтверждают, что МР52-протеин стимулирует образование хрящей из недифференцированных мезенхимных клеток, а также дифференциацию и созревание остеобластов. Это приводит к интрахондральному остеогенезу, который эквивалентен индукционному каскаду при эмбриональном остеогенезе, и излечиванию (срастанию) костей при переломах. Указанные в опытах условия нужно рассматривать в качестве иллюстрации МР52-активности, а не как ограничение изобретения, которое может быть также исследовано и охарактеризовано в другой форме. Для указанных в заявке линий клеток и плазмид в качестве приложения даются материалы, из которых очевидны подтверждающие данные. SEQ ID NO. 1 Вид последовательности: нуклеиновая кислота Название и происхождение: МР-52-ДНК Длина: 2703 нуклеотида 13 35624 14 35624 SEQ ID NO: 2 Вид последовательности: аминокислотная последовательность Название и происхождение:МР-52-протеин Длина:501 АК 15 35624 Фиг. 1 16 35624 Фиг. 2а Фиг. 2в 17 35624 Фиг. 3 М - предварительно окрашенный маркер по молекулярной массе протеина с указанными кающимися молекулярными массами (Gibco BRL # 26041 - 020); 1 - надосадочная жидкость культуры клеток (100 мкл) после инфекции: с помощью рекомбинантных вирусов (со вставленной Мр52-кДНК) при восстанавливающих (1 % b - меркптоэтанола) условиях; 2 - надосадочная жидкость культуры клеток (100 мкл) после инфекции вирусами дикого типа (без вставленной чужеродной -ДНК) при восстанавливающих (1 % b - меркаптоэтанола) условиях; 3 - надосадочная жидкость культуры клеток (500 мкл) после инфекций с помощью рекомбинантных вирусов (со вставленной МР 52-кДЖ) при невосстанавливающих условия х; 4 - надосадочная жидкость культуры клеток (500 мкл) после инфекции вирусами дикого типа (без вставленной чужеродной ДНК) при невосстанавливающих условиях. Фиг. 4 18 35624 Фиг. 5 Разрез всего имплантата (после имплантации в течение 26 дней), окрашенный согласно von Kossa. Минерализованная ткань отчетливо выделяется - черная - по сравнению с окружающей мышечной тканью. Фиг. 6 Вырез из имплантата (после имплантации в течение 26 дней), окрашенный согласно Mass on-GoIdner. 1 - край из остеобластов (в оригинале розовый); 2 - остеоид (в оригинале красный); 3 - минерализованная костная ткань (в оригинале зеленая) с остеоцитами ( в оригинале розовые); 4 - костный мозг (в оригинале от светло розового до оранжевого). 19 35624 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 20