Спосіб лікування грипу інгібіторами протеолітичних ферментів

Реферат: Спосіб лікування грипу, при якому застосовують інгібітори протеолітичних ферментів UA 85068 U (54) СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ГРИПУ ІНГІБІТОРАМИ ПРОТЕОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ UA 85068 U UA 85068 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до області медицини, переважно до області вірусології. Відомий спосіб лікування грипу за допомогою інгібіторів нейрамінінідази вірусу грипу: озельтамівіру і занамівіру (Кисельов О.І., Єршов Ф.І., Биков А.Т., Покровський В.І.) Пандемія грип 2009/2010: противірусна терапія і тактика лікування. - СПб., 2010. - 97 с., www.Wikipedia.org/neiraminidasa/ Недоліком цього способу є те, що вказані лікувальні засобі викликають ряд побічних дій, таких як нудоту, блювання, діарею і ряд психічних розладів: порушення свідомості, галюцинації, психози і звикання. Відомий спосіб лікування грипу за допомогою інгібіторів білка М2, так званих амантадинів амантадину і ремантадину, які блокують протонні насоси в чутливих до вірусу грипу клітин і тим самим перешкоджають проникненню вірусу в клітини (Киселев O.I. і інші - 2010; Грип - Вікіпедія; Єршов Ф.І., Романцов М.Г. Противірусні препарати в педіатрії. - М., 2005; Єршов Ф.І. Противірусні препарати. Довідник (Вид. 2-е). - М., 2006) Недоліком цього засобу є те, що ці засоби активні тільки відносно вірусу грипу типу А і не активні відносно грипу типа В. При прийомі всередину у пацієнтів в 14 % випадків виникають болі в животі, у 3-6 % виникає сонливість, безсоння, головний біль, запаморочення, порушення зору, дратівливість, парестезії, тремор, судоми. І головним недоліком вказаних протигрипозних засобів є формування резистентності вірусів грипу. Як вважає академік Кисельов О.І., немає підстав бути задоволеними результатами клінічного застосування цих препаратів, оскільки не забезпечується радикальний ефект в результаті ОРВІ і грип продовжують залишатися малоконтрольованими інфекціями. В основу даної корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб лікування грипозної інфекції на базі іншого механізму, який використовується вірусом грипу при його репродукції в чутливих клітках, а саме, вважаючи можливу роль системи протеолітичних ферментів і їх інгібіторів. На той час - 1972-1974 pp. - час нашого світового пріоритету, метою наукової роботи, яка спланована особисто автором цієї корисної моделі в 1972 році, керівником лабораторії біохімії Одеського НДІ вірусології і епідеміології ім. І.І. Мечникова, і незабаром була виконана, була поставлена задача вивчити значення системи протеолітичних ферментів і їх інгібіторів при грипі. Мова йде про тем-карти 1972-1974 pp. (1, 2, 3), публікації в НІР і ОКР в 1972 г (4). Основним задумом наукових досліджень автора, які були встановлені в основу корисної моделі було ліквідовувати недоліки наведених способів лікування грипу В результаті проведених широких наукових досліджень в 1972-1974 pp., a потім продовжених в 1975-1980 і в 1985 pp., були одержані зовсім нові дані, які показали, що інгібітори протеолітичних ферментів трипсину і трипсиноподібних ферментів гальмують репродукцію вірусів грипу типу А і Б в культурі клітин тканини хоріоналантоїсних оболонок курячого ембріона (ХАО), а також підвищують виживання чутливих до вірусу грипу експериментальних тварин білих мишей при зараженні їх смертельними дозами різних штамів патогенних вірусу грипу. Таким чином експериментально вперше був доведений факт гальмування /блокади/ інгібіторами протеолітичних ферментів Е-АМІНОКАПРОНОВОЇ КИСЛОТОЮ, КОНТРИКАЛОМ, ЦАЛОЛОМ, СОЙОВИМ ІНГІБІТОРОМ ТРИПСИНУ і іншими репродукції вірусів грипу штамів АО/32 /H0N1/, А2/Вікторія/35/72 /H3N2/, А2/Вікторія/36/73 /H3N2/, вірус грипу В В/Японія, вірус хвороби Ньюкасла /ВХН ШТАМ Ла-Сота, А/Гонконг/1/68 /H3/N2/, а також проявляють лікувальний ефект при зараженні білих мишей смертельною дозою вірусу грипу. Ці результати депоновані у вигляді трьох наукових звітів в Одеському НДІ вірусології ім. І.І. Мечникова в Одесі (4-6). Нижче ми приводимо основні результати досліджень, які підтверджують приклад здійснення справжньої корисної моделі. Приклад здійснення 1 Гальмування репродукції міксовірусів Е-АМІНОКАПРОНОВОЇ КИСЛОТОЮ /Е-АКК/ в культурі тканини /ХАО/. Для цього шматочки ХАО, прикріплені до шкаралуп, заражали падаючими 10-кратними концентраціями вірусів. При титруванні інфекційної активності вірусу підтримуюче середовище не містило інгібіторів (контроль) або містило інгібітор в певній концентрації. Після 48-годинної інкубації зараженої культури при +36 градусів Цельсія (віруси грипу серотипу А І ВБН) або при +33 град. (вірус грипу серотипу В) для визначення наявності вірусу по РГА шкаралупу видаляли, а в лунки з вірусовмісним підтримуючим середовищем додавали 0,1 мл 5 % суспензії курячих еритроцитів. Інфекційну активність вірусів розраховували методом Кербера в модифікації І.П. Ашмаріна (7) і виражали в log ТІД 50/0,1 мл. 1 UA 85068 U 5 10 15 20 Встановлено, що Е-АКК гальмує репродукцію всіх досліджених штамів вірусу грипу серотипів А і В І ВХН (вірусу хвороби Ньюкасла) в культурі ХАО (див. таблицю 1 і Фіг. 1). Особливо чітко противірусна дія інгібітору протеаз Е-АКК виявлялося при використовуванні препарату в дозі 30 мг/мл. Подальше дослідження впливу інгібіторів протеолізу на репродукцію вірусу грипу проводили на штамі АО/32 (H0N1), оскільки він міг бути використаний в дослідах при вивченні дії інгібіторів протеаз на протікання летальної грипозної інфекції у мишей. І хоча вищеописаний метод встановлення противірусних властивостей препарату є загальноприйнятим і рекомендований в Методичних вказівках ВНДІ грипу МЗ СРСР "Методи випробування і оцінки противірусної активності нових препаратів відносно вірусу грипу". - Л., 1973, проте не можна виключити, що при цьому паралелізм між інфекційністю знову синтезованого вірусу і його гемаглютинуючою активністю може порушуватися випробовуваною речовиною (наприклад, за рахунок синтезу неінфекційного, але гемаглютинуючого вірусу, або інфекційного вірусу без поверхневої оболонки, тобто без гемаглютиніну). Щоб виключити можливість такого спотворення ми дослід модифікували таким чином. Однакову дозу вірусу, що заражає, вносили в 10 паралельних проб культури ХАО, що містять (дослід) або не містять інгібітор (контроль). Через 8 або 24 годин інкубації при +36 °C культуральну рідину з 10 паралельних окремих контрольних і окремо дослідних зразків об'єднували і концентрацію інфекційного вірусу визначали на нормальній культурі ХАО, використовуючи по 6 зразків на кожне 10-кратне падаюче розведення вірусу. Така постановка досліду також дозволяє понизити витрату досліджуваного препарату і в результаті об'єднання матеріалу з лунок сприяє нівеляції випадкових змін і накопиченню і посиленню закономірних. Таблиця 1 Гальмуючий вплив Е-амінокапронової кислоти /Е-АКК/ в концетрації 30 мг/мл на репродукцію міксовірусів в культурі ХАО Дослідний вірус Репродукція (по даних РГА) вірусу, використаного t° Інфекційна x в наступних розведеннях інкубації - активність Група -8 -9 10 впродовж 10 вірусу в ІД -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 10 10 10 10 10 10 10 10 10 48 год. 50/мл xx Вірус грипу контр. А2/Вікторія/35/72 дослід Вірус грипу контр. А2/ПортЧалмерс/73 дослід Вірус грипу контр. А0/32 дослід Вірус грипу контр. В/Японія дослід ВХН штам контр. Ла-Сота дослід 36 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 н/д н/д н/д 10/10 2/10 3/10 0/10 0/10 0/10 0/10 36 10/10 10/10 10/10 8/10 7/10 1/10 0/10 н/д н/д н/д 36 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 4/10 0/10 н/д н/д н/д 36 10/10 9/10 6/10 1/10 н/д 36 н/д н/д н/д н/д н/д н/д 18/18 18/18 18/18 18/18 18/18 8/10 8/10 5/10 0/18 18/18 14/18 10/18 5/18 6/18 5/10 3/10 1/10 0/18 7,1 3,0 6,1 2,8 6,9 3,1 4 3 3 4,1 2,5 3 9,6 5,35 4 х - Відношення числа проб з виявленим синтезом вірусного потомства до загального числа заражених культур xx - не досліджували 25 30 35 lgTm 50/0,1 мл У вказаній модифікації досліджували противірусну ефективність різних за походженням і механізму дії інгібіторів протеолітичних ферментів. Інгібітори використовували у високих концентраціях: Е-АКК - 30 мг/мл, соєвий інгібітор трипсину Кунітца 2 мг/мл, контрикал - 500 АТрЕ/мл, Триелін - 500 од/мл. При цьому заздалегідь переконувалися, що інгібітори протеаз у вказаних концентраціях не мають вируліцидної дії відносно позаклітинного вірусу, а також не чинять впливу на здатність тканини репродукувати вірус при її попередній обробці з подальшим видаленням препаратів перед зараженням вірусом. Результати дії інгібіторів протеолітичних ферментів протягом одного (протягом 8 годин) або декількох циклів репродукції вірусу грипу АО/32 (протягом 24 годин) в культурі тканини представлені в таблицях 2 і 3 і на Фіг. 2-4. Дані дослідів, поставлених у вказаній модифікації, 2 UA 85068 U 5 10 15 20 свідчать про достовірний характер гальмуючого репродукцію вірусу грипу дії всіх випробуваних інгібіторів протеолітичних ферментів (р0,05 7,96 >0,05 9 UA 85068 U Таблиця 4.4 Показники ефективності 1 % і 15 % розчинів Е-АКК, що парентерально вводять, при експериментальному грипі у мишей по даних досліду № 8 при констатації на 8-й і 14-й дні після зараження Показники n Інфікованим тваринам ін'єктували 0,85 % р-н NaCl 15 % 1 Е-АКК Триелін 500 АтрЕд/мл 45 59 40 на 8-й день на 14-й день на 8-й день на 14-й день на 8-й день на 14-й день % летальності М±m 49 %±7,6 % 49 %±7,6 % 79 %±6,2 % 14 %±6,1 % 77,5 %±9,7 % 25 %±6,9 % 72 %±7,1 % t 3,16 0,22 3,32 0,69 Р >0,05 >0,05 Перевищення в % летальності в 31 % 2% 21 % 69 % контрольній групі над дослідною Різниця в %, при якій розбіжності не 20 % 15 % 24 % 18 % випадкові Коефіцієнт кумулятивної 0,77 0,51 0,94 0,62 0,91 0,61 виживаності Індекс захисту в % 6,15 % 1,96 % 49 % 8,25 % по 4-хрестовій +++ ++ системі Середній інкубаційний 8,2 дня 8,8 дня 9,1 дня період 2 Критерій X >0,05 >0,05 Тест медіани 2 X 1,76 2,39 Р >0,05