Спосіб одержання препарату похідних хімотрипсин-трипсинподібних протеолітичних ферментів для парентерального введення

Спосіб одержання препарату похідних хімотрипсин-трипсинподібних протеолітичних ферментів для парентерального введення, який відрізняється тим, що гідролітичний центр ферменту шактивовано ХІМІЧНОЮ модифікацією чи мутагенною заміною амінокислотних залишків з групи "протонного реле" ферменту (пстидину-57, аспарагінової кислоти-102 та серину-195 згідно з Винахід належить до біотехнологм та медицини і являє собою спосіб одержання препарату похідних протеолітичних ферментів трипсинового ряду для внутрішньо судинного та парентерального введення як засобу контролю тканинного протеолізу під час лікування та профілактики захворювань, пов'язаних з дисбалансом протеолітичних та активаційних процесів, як то - набряк, запалення, порушення імунної та гемостатичної систем, онкозахворювання, тощо Відомо, ЩО серинові протеїнази відіграють важливу роль у регуляції великої КІЛЬКОСТІ фізіологічних процесів [1] Зокрема, одна з головних функцій серинових протеїназ трипсинового ряду (трипсину, тромбіну, плазміну, тканинного активатору плазміногену, урокінази та інших) полягає у перетворенні численних білкових проформ (проферментів, профакторів, тощо) у активні форми завдяки конформаційним змінам, спричиненим обмеженим ферментативним гідролізом молекули проформи по так званим ділянкам активаційного розщеплення Ділянки активаційного розщеплення більшості відомих па сьогодні білкових проформ структурно подібні між собою та відповідають субстратній специфічності протеїназ трипсинового ряду [2] Надмірна активність протеолітичних ферментів обмежується білковими інгібіторами протеїназ та чутливою до утворених фермент-шпбиторних комплексів імунною системою організму [3] Порушення балансу між активацією та інгібуванням протеїназ трипсинового ряду зумовлює численні патологи, як то - набряк, запалення, порушення імунної та гемостатичної систем, онкозахворювання, тощо [1] Один з ПІДХОДІВ до нормалізації протеолітичноактиваційного дисбалансу полягає у введенні в організм охідних трипсину зі штучно зменшеними гідролітичними властивостями при повністю чи частково збереженій здатності до зв'язування ділянок активаційного розщеплення ВІДПОВІДНИХ білкових проформ, тобто конкурентного блокування останніх До аналогів поданого винаходу належить спосіб отримання групи препаратів системної ензимотерапм, призначених для перорального введення капсульованих комбінацій ферментних препаратів тваринного та рослинного походження з резорбцією частини ферментів у кровообіг після розчинення капсульних оболонок у нижній ДІЛЯНЦІ тонкої кишки [4] Недоліки способу-аналогу полягають у відносно малому перетворенні ферментів у тератогенні деградовані форми під час резорбції у кровообіг, що спричинює до необхідності введення великих кількостей ферментів [5], наявності гідролітичної активності, що обумовлює можливість побічних процесів, високій вартості курсу лікування В якості прототипу вибрано спосіб одержання призначеного для внутрішньо судинного введення препарату трипсин-подібних протеолітичних ферментів, що полягає у попередній протеолітичній взаємній обмеженій деградації вихідних ферментів з групи трипсин, хімотрипсин, папаш та бромелаш за рН 6 7 ± 2 3 при 37°С протягом 30-180 хвилин ПОСЛІДОВНІСТЮ (Х-хімотрипсину) (О со о ю 50369 [6] Обмежена протеолітична деградація ферментів запобігає надмірній гідролітичній та активаторній дії препарату, створює можливість нормалізації аісгиваційного дисбалансу в організмі Мала імуногенність обмежено деградованих форм дозволяє досягти бажаного терапевтичного ефеїсгу за умов внутрішньо судинного введення значно менших, ніж у способі-аналозі, кількостей ферментних препаратів Недоліки способу-прототипу полягають у частковому збереженні активаційної активності деградованими ферментними формами, істотному зменшенні зв'язуючих властивостей деградованих похідних та в зумовленій надмірним гідролізом повній інактивації частини ферментів Задача винаходу полягає в розробці способу отримання придатного до внутрішньосудинного введення препарату трипсин-подібних протеолітичних ферментів, позбавленого зазначених для отримуваного у спосіб-протопип препарату недоліків, тобто отриманні препарату з повністю збереженими зв'язуючими властивостями за повного пригнічення гідролітичних при якомога більш повній утилізації ферментного препарату Поставлена задача вирішується завдяки інактивації гідролітичного центру ферменту за збереження зв'язуючих властивостей та структури ХІМІЧНОЮ модифікацією чи мутагенною заміною амінокислотних залишків з групи "протонного реле" ферменту (пстидину-57, "аспарагінової кислоти-102 та серину-195 згідно ПОСЛІДОВНОСТІ ахімотрипсину [7]) Відомо, ЩО часткова чи повна мутагенна заміна зазначених амінокислот призводить до практично повного знищення гідролітичних властивостей ферменту [8, 9] При цьому структура та зв'язуючи властивості ферменту лишаються практично незмінними Подібний же ефект досягається за вибіркової хімічної модифікації амінокислот гідролітичного центру [10-13] На відміну від способу-прототипу, що полягає в отриманні та внутрішньо судинному введенні підданих попередній обмеженій взаємній протеолітичній деградації вихідних ферментів з групи трипсин, хімотрипсин, папаш та бромелаш, отримувані у запропонований спосіб ферментні препарати повністю позбавлені гідролітичної та активаторної дії за збереження зв'язуючих властивостей та структури вихідних ферментів Отримувані у запропонований спосіб препарати за умов внутрішньо судинного введення не виявляють помітної імунної реакції та не викликають активації білків крові, чим усуваються побічні негативні ефекти та зумовлюється можливість застосування препарату в якості внутрішньо судинного лікарського засобу Мала імуногенність отримуваних у запропонований спосіб препаратів дозволяє проводити їх клінічне застосування в широкому діапазоні умов щодо концентрацій, доз, часу введення, тощо В порівнянні зі способом-аналогом запропонований ПІДХІД ДОЗВОЛЯЄ ДОСЯГТИ необхід ного терапевтичного ефекту завдяки значно меншим кількостям ферментного препарату, чим запобігаються можливі побічні ефекти та істотно зменшується вартість лікарського курсу Тим самим розроблено спосіб одержання придатних до парентерального введення мало імуно генних та малотоксичних препаратів похідних протеолітичних ферментів хімотрипсин-трипсинового ряду, що можуть бути використані для підвищення ефективності терапії обумовлених дисбалансом тканинного та судинного протеолізу патологічних процесів Спосіб одержання препарату та дослідження його дії визначається ВІДПОВІДНО ДО наведених прикладів Приклад 1 Отримання анпдротрипсину Інактивацію гідролітичного центру серинових протеїназ хімотрипсин-трипсинового ряду за збереження структури та зв'язуючих властивостей отримуваного похідного розглянуто на прикладі анпдротрипсину - підданого ХІМІЧНІЙ модифікації ртрипсину з перетворенням серину-195 каталітичної тріади на депдроаланш [10] Обробку фермента феніл-метил-сульфоніл-фторидом до 2 - 3 ВІДСОТКІВ активності порівняно до вихідної проводять згідно [11] Епімнацію феніл-сульфонільної групи у лужному середовищі та афінно-хроматографічне виділення похідного білка на пара-амшобензамідин-сефарозі проводять згідно до [12] Отримуваний білок діалізують проти 0 001 н соляної кислоти та піддавають ліофільній сушці Кінцевий препарат являє собою білий гігроскопічний порошок зі вмістом білку не нижче 94 ВІДСОТКІВ Гомогенність отриманого препарату визначають за допомогою ДСН-гель-електрофорезу у поліакриламідному гелі [14] Приклад 2 Протипухлинна та антиметастатична дія ОНКОЛОГІЧНІ захворювання відносяться до найпоширеніших патолопй, пов'язаних з надмірною активаційною дією серинових протеїназ [1] Протипухлинну та антиметастатичну дію препарату розглянуто на прикладі пригнічення метастазування та росту карцином Л'юіс [15] Мишам лінії С57В1/6 з перещепленою карциномою Л'юіс вводять препарат у дозі 250мг/кг внутрішньовенне з інтервалом 48 годин 8 разів, починаючи з сьомої доби після перещеплення Досягнуто гальмування росту первинної пухлини на 42 6% порівняно до контролю, пригнічення метастазування на 64 4% за КІЛЬКІСТЮ та 73 5% за сумарним об'ємом метастатичного ураження Побічних імуногенних ефектів не спостерігали Приклад 3 Дослідження токсичності отриманого препарату Оцінку гострої токсичності отриманого у захищуваний спосіб препарату трипсинподібних серинових протеїназ проводять згідно до ГОСТ 12 1 007-76 [16] Розрахунок значень токсичності проводять з використанням методу Лігфільда-Уїлкінсона [17] В дослідах на мишах ЛД Л становила 388мг/кг, на кролях - 76мг/кг в порівнянні до 277мг/кг та 47мг/кг для отриманого у спосібпрототип деградованого ферментативного комплексу [6] За умов разового введення дози, що дорівнює 20 відсоткам від ЛД45, будь-яких побічних негативних ефектів не спостерігали Наведені результати свідчать про малу токсичність отримуваного у запропонований спосіб препарату та його придатність до внутрішньо судинного введення Одержаний у запропонований спосіб препарат має низьку імуногенність, що дозволяє досягти пролонгованої дії препарату, дає 50369 змогу обмежити КІЛЬКІСТЬ введень та зумовлює збереження ефективності дії препарату протягом всього курсу Таким чином, запропонований винахід дає змогу одержати ефективний терапевтичний засіб для лікування та профілактики захворювань, пов'язаних з дисбалансом в регуляції активності протеолітичних ферментів Захищуваний спосіб дає змогу різко знизити імуногенність та токсичність кінцевого препарату Отримуваний у запропонований спосіб препарат дозволяє отримувати бажаного терапевтичного ефекту за допомогою істотно менших кількостей препарату, що веде до зниження вартості курсу Застосування позбавлених гідролітичної дії похідних серинових поотеїназ серинового ряду з повністю збереженими зв'язуючими властивостями та структурою вихідних ферментів знижує ймовірність порічних ефектів, збільшує час перебування препарату в кровоносному руслі та дає змогу різко зменшити разову та курсову дози препарату Посилання 1 Patthy L Evolution of the proteases of blood coagulation and fibrmolysis assembly from modules/ /Cell - 1 9 8 5 - 4 1 , №3 - P 657 - 6 6 3 2 Веревка С В О структурном подобии участков активационных и расщеплений белковпредшествеников реактивным центрам серпинов/ /Укр биохим журн - 1 9 9 5 - 67, №5 - С 24 - 28 3 Mast A , Enghiljd J , Pizzo S , Salvesen G Analysis of the Plasma Elimination Kinetics and Confprmational Stabilities of Native, Protemasecomplexed, and Reactive-site Cleaved Serpms/ /Biochemistry -1991 - 30, №6 - P 1 7 2 3 - 1 7 3 0 4 Теоретические основы системной энзимотерапии /в кн Системная энзимотерапия Теоретические основы, опыт клинического применения, под ред К Н Веремееьнко, К Н Коваленко Киев, издво "Морион", 2 0 0 0 г , С 7 - 1 1 5 5 Системная энзимотерапия Исследования и клиническая практика / под ред К Ноуза, 3 Масиновски и Р Мухова - изд-во Медицинского общества по изучению энзимов, Мюнхен-Прага - 1994 56С 6 Волоков О , Качалов М , Бітяговський М Спосіб одержання препарату трипсин-подібних протеолі тичних ферментів для внутрішньо судинного введення / Патент №38270А (Україна) від 15 05 2001 Пріоритет від 14 06 2000 7А61К31/195 Публікація 15 05 2001, Бюллетень №4, II ч , 2001 р 7 Blow D , Birkoft J , Hartley B Role of the buried acid group in the mechanism of action of chymotrypsm/ /Nature - 1 9 6 9 - 2 2 1 , №5178 - P 337 -340 8 Craik С , Roczmak S , Langman С , Rutter W The catalytic role of the active site aspartic acid in senne proteases//Science - 1 9 8 7 - 237, №4817 - P 909 913 9 Carter P , Wells J Dissecting the catalytic triad of a senne protease/ / Nature - 1988 - 332, №6164 P 564 - 568 10 Femstem G , Feeney R Interaction of inactive derivatives of chymotrypsm and trypsm with protein inhibitors/ /J Biol Chem - 1966 - 2 4 1 , №22 P 5183-5189 11 Ako H , Ryan C, Foster R The purification by affinity chromatography of a protemase inhibitor binding species of anhydro-chymotrypsm/ /Biochem Biophys Res Comuns - 1972 - 46, №4 - P 1639 1645 12 Ashton R, Sheraga H Preparation and characterization of anhydrothrombin/ /Biochemistry 1995 -35, №-- -P 6454-6463 13 Hokosawa K, Omshi T, Shima M , et al Preparation of anhydrothrombin and characterization of its interaction with natural thrombm substrates/ /Biochem J -2001 - 354, №2 -P 309-313 14 Weber K, Osborn D The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfatepolyacnlamide gel electrophoresis/ /J Biol Chem 1969 - 244, №16 - P 4406 - 4412 15 Dumont P , Abessi G and Jeger R Ineffectivness of micarene, a fibrmolytic agent, alone or in combination with chemoterapeutic agents on spontaneously methastazmg munae tumors/ /Clm Exp Methastasis -1983 - 1 , № 4 - P 349 - 357 16 ГОСТ 12 1007-76 Вредные вещества, классификация и общин требования безопасности - М -1990 - С 5 17 Беленький М Д Элементы количественной оценки фармакологического эффекта, - Л Медицина -1963 - 152с ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71