Синтез g-ліноленової кислоти під дією дельта-6-десатурази

1 Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая дельта-6-десатуразу из Borago officmahs, которая соответствует нуклеотидной последовательности SEQ ID No 4 2 Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует дельта-6-десатуразу, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID No 5 3 Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп 1-2 4 Вектор по п 3, встроенный в клетку 5 Вектор по п 4, отличающийся тем, что указанная клетка является клеткой животного, бактериальной клеткой, растительной клеткой или грибковой клеткой 6 Экспрессирующий вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по любому из пп 12, которая функционально связана с промотором и, необязательно, с сигналом терминации, способным вызвать экспрессию генного продукта указанной выделенной нуклеиновой кислоты 7 Экспрессирующий вектор по п 6, отличающийся тем, что промотором является промотор дельта-6-десатуразы, промотор карбоксилазы Anabaena, промотор гелиантинина, промотор глицинина, промотор напина, промотор 35S из CaMV или тканеспецифичный промотор гелиантинина 8 Экспрессирующий вектор по п 6, отличающийся тем, что промотор является конститутивным или тканеспецифичным 9 Экспрессирующий вектор по п 6, отличающийся тем, что сигналом терминации является сигнал терминации Synechocystis, сигнал терминации нопалинсинтазы или сигнал терминации семени 10 Экспрессирующий вектор по любому из пп 6-9, встроенный в клетку 11 Экспрессирующий вектор по п 10, отличающийся тем, что указанная клетка является клеткой животного, бактериальной клеткой, растительной клеткой или грибной клеткой 12 Способ получения растения с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты (GLA), который включает (a) трансформацию растительной клетки выделенной нуклеиновой кислотой по любому из пп 12, и (b) регенерацию растения с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты (GLA) из указанной растительной клетки 13 Способ по п 12, отличающийся тем, что указанным растением является подсолнечник, соя, кукуруза, табак, арахис, морковь или маслиничный рапс 14 Способ получения растения с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты (GLA), который включает (a) трансформацию растительной клетки вектором по любому из пп 3, 6-9, и (b) регенерацию растения с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты (GLA) из указанной растительной клетки 15 Способ по п 14, отличающийся тем, что указанным растением является подсолнечник, соя, кукуруза, табак, арахис, морковь или маслиничный рапс 16 Способ индукции получения гаммалиноленовой кислоты (GLA) в организме с низким содержанием или полным отсутствием гаммалиноленовой кислоты, который включает трансформацию указанного организма выделенной нуклеиновой кислотой по любому из пп 1-2 О О 00 00 (О 17 Способ индукции получения гаммалиноленовой кислоты (GLA) в организме с низким содержанием или полным отсутствием гаммалиноленовой кислоты, который включает трансформацию указанного организма вектором по любому из пп 3, 6-9 18 Способ индукции получения гаммалиноленовой кислоты (GLA) в организме с низким содержанием или полным отсутствием гаммалиноленовой кислоты и линолевой кислоты (LA), который включает трансформацию указанного организма выделенной нуклеиновой кислотой по любому из пп 1-2 и выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей дельта-12-десатуразу 19 Способ по п 18, отличающийся тем, что указанная выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая дельта-6-десатуразу, содержит нуклеотиды 44-1390 SEQID No 4 20 Способ индукции получения октадекатетраеновой кислоты в организме с низким содержанием или полным отсутствием гамма-линоленовой кислоты, который включает трансформацию указанного организма выделенной нуклеиновой кислотой по любому из пп 1-2 Линолевая кислота (18 2)(1_А) превращается в гамма-линоленовую кислоту (18 3)(GLA) под действием такого фермента, как Д6-десатураза Когда этот фермент или кодирующую его нуклеиновую кислоту вводят в клетки, синтезирующие линолевую кислоту, образуется гамма-линоленовая кислота Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, содержащим ген Д6десатуразы Более конкретно, в объем этого изобретения входят нуклеиновые кислоты, содержащие промоторы, кодирующие области и терминальные области генов Дб-десатуразы Настоящее изобретение далее относится к рекомбинантным конструкциям, содержащим кодирующую область Дб-десатуразы в функциональном сочетании с разнородными регуляторными последовательностями Нуклеиновые кислоты и рекомбинантные конструкции по данному изобретению полезны для получения гамма-линоленовой кислоты в трансгенных организмах Ненасыщенные жирные кислоты, такие как линолевая кислота (СівД912) и а-линоленовая кислота (СівД 91215 ) является важными пищевыми компонентами, которые не могут быть синтезированы в организме позвоночных животных, так как клетки позвоночных животных могут создавать двойные связи в Д9-положении жирных кислот, но не могут создавать дополнительные двойные связи между двойной связью в Д9-положении и метильным концом цепи жирной кислоты Поскольку они являются предшественниками других продуктов, линолевая и а-линоленовая кислоты являются важными жирными кислотами, источником которых обычно являются растения В организме 61880 4 21 Способ по п 20, отличающийся тем, что указанным организмом является бактерия, гриб, растение или животное 22 Способ индукции получения октадекатетраеновой кислоты в организме с низким содержанием или полным отсутствием гамма-линоленовой кислоты, который включает трансформацию указанного организма вектором по любому из пп 3, 6-9 23 Способ по п 22, отличающийся тем, что указанным организмом является бактерия, гриб, растение или животное 24 Способ получения растения с повышенной холодоустойчивостью, который включает (a) трансформацию растительной клетки выделенной нуклеиновой кислотой по любому из пп 12, и (b) регенерацию указанного растения с повышенной холодоустойчивостью из указанной трансформированной растительной клетки 25 Способ по п 24, отличающийся тем, что указанным растением является подсолнечник, соя, кукуруза, табак, арахис, морковь или маслиничный рапс млекопитающих линолевая кислота превращается в у-линоленовую кислоту (GLA, СівД 6 9 1 2 ), которая в свою очередь превращается в арахидоновую кислоту (20 4), особенно важную жирную кислоту, так как она является основным предшественником большинства простагландинов Линолевая кислота вследствие конечного превращения в гамма-линоленовую кислоту и арахидоновую кислоту удовлетворяет потребности организма в гамма-линоленовой кислоте и арахидоновой кислоте Однако существует определенная зависимость между потреблением насыщенных жиров и вероятностью возникновения гиперхолестеринемии, атеросклероза и других клинических нарушений, которые влекут за собой ишемическую болезнь сердца, в то время как потребление ненасыщенных жиров способствует снижению содержания холестерина в крови и уменьшению вероятности заболевания атеросклерозом Терапевтические преимущества пищевой гамма-линоленовой кислоты, вероятно, связаны с тем, что эта кислота является предшественником арахидоновой кислоты и, таким образом, способствует синтезу простагландина Поэтому гораздо полезнее включать в рацион питания ненасыщенную гамма-линоленовую кислоту, чем линолевую кислоту Однако гаммалиноленовая кислота отсутствует практически во всех возделываемых сельскохозяйственных культурах Линолевая кислота превращается в гаммалиноленовую кислоту под действием такого фермента, как Д6-десатураза Д6-десатураза, фермент из более чем 350 аминокислот, имеет мембраносвязывающую область и активный центр для 61880 десатурации жирных кислот Если этот фермент ввести в клетки, которые эндогенно синтезируют линолевую кислоту, а не гамма-линоленовую кислоту, то происходит образование гаммалиноленовой кислоты Настоящее изобретение, предусматривая ген, кодирующий Д6-десатуразу, позволяет получить трансгенные организмы, которые содержат функциональную Д6-десатуразу и синтезируют гамма-линоленовую кислоту Помимо возможности синтеза гамма-линоленовой кислоты в больших количествах, настоящим изобретением предусматриваются новые пищевые источники гамма-линоленовой кислоты Настоящее изобретение включает выделенные гены Дб-десатуразы В частности, выделенные гены содержат промоторы Дб-десатуразы, кодирующие области и терминальные области Настоящее изобретение далее включает экспрессирующие векторы, содержащие промотор Дб-десатуразы, кодирующую область и терминальные области Следующим аспектом данного изобретения являются экспрессирующие векторы, содержащие кодирующую область Дб-десатуразы в функциональном сочетании с разнородными регуляторными областями, то есть с элементами, не выделяемыми из гена Дб-десатуразы Настоящим изобретением предусматриваются также клетки и организмы, содержащие векторы по данному изобретению, и потомство таких организмов Очередным аспектом настоящего изобретения предусматривается выделенная бактериальная Д6-десатураза Предусматривается также выделенная растительная Д6-десатураза Еще одним аспектом данного изобретения является способ получения растений с более высоким содержанием гамма-линоленовой кислоты Настоящим изобретением предусматривается также способ получения холодоустойчивых растений На фиг 1 изображены профили водорастворимости для выведенных аминокислотных последовательностей Дб-десатуразы Synechocystis (часть А) и Д12-десатуразы (часть В) Предполагаемые области, пронизывающие мембрану, обозначены сплошными линиями Гидрофобный индекс высчитан для окна, вмещающего 19 аминокислотных остатков [Kyte, et al (1982) J Molec Biol 157] На фиг 2 изображены профили газожидкостной хроматографии для Anabaena дикого типа (часть А) и трансгенного типа (часть В) На фигЗ дано схематическое изображение карт космид cSy75, cSy13 и Csy7 с перекрывающимися областями и субклонами Исходные области субклонов Csy75, Csy75-3,5 и Csy7 обозначены пунктирными диагональными линиями Инактивированные сайты рестрикции указаны в скобках На фиг 4 изображены профили газожидкостной хроматографии для табака дикого типа (часть А) и трансгенного типа (часть В) На фиг 5А изображена ДНКпоследовательность кДНК Дб-десатуразы, выде ленной из бурачника На фиг5В изображена белковая последовательность открытой рамки считывания в кДНК Дбдесатуразы, выделенная из бурачника Показаны три аминокислотных элемента, характерных для десатураз, которые в порядке следования представляют собой липидный блок, металлический блок 1 (metal box 1) и металлический блок 2 (metal box 2) На фиг 6 изображена дендрограмма, показывающая сходство Дб-десатуразы бурачника с другими мембраносвязанными десатуразами Аминокислотная последовательность Дб-десатуразы бурачника сравнивается с десатуразами других известных типов на основании данных, приведенных в Gene Works (IntelhGenetics) Числовые данные соответствуют относительным филогенетическим расстояниям между сравниваемыми подгруппами На фиг 7 представлена карта рестрикции 221 Д6 NOS и 121 Д6 NOS На карте рестрикции 221 Д6 NOS остальной части плазмиды является рВ1221, а на карте рестрикции 121 Д6 NOS остальной частью плазмиды является рВИ21 На фиг 8 изображены профили газожидкостной хроматографии для мнимотрансфецированных (часть А) и трасфецированных 221 Д6 NOS (часть В) клеток моркови Показаны положения, соответствующие 18 2, 18 За и 18 Зу (GLA) На фиг 9 изображены профили газожидкостной хроматографии для нетрансформированного табачного листа (часть А) и табачного листа, трансформированного 121 Д6 NOS Показаны положения 18 2, 18 3а, 18 3у (GLA) и 18 4 На фиг 10 изображены профили газожидкостной хроматографии для нетрансформированных семян табака (часть А) и семян табака, трансформированных 121 Д6 NOS Показаны положения 18 2, 18 3а, 18 3y(GLA) В объем настоящего изобретения входят выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие Д6десатуразу Для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей Д6-десатуразу, из организма, синтезирующего гамма-линоленовую кислоту, выделяют ДНК Указанным организмом может быть, например, животная клетка, некоторые грибы (например, Mortierella), некоторые бактерии (например, Synechocystis) и некоторые растения (бурачник, Oenothera, смородина) Геномную ДНК можно выделить с помощью различных методов, хорошо известных специалистам в этой области, например, с помощью метода, описанного Самбруком и др (Sambrook et al) (1989) в справочнике Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY Выделенную ДНК делят на фрагменты с помощью физических методов или ферментативного расщепления и клонируют в соответствующем векторе, например, бактериофаге или космидном векторе, в соответствии с любым хорошо известным методом из целого ряда методов, представленных в справочных материалах, таких как справочник Самбрука и др (1989) Особое внимание в этом изобретении уделено экспрессирующим векторам, содержащим ДНК по настоящему изобретению ДНК, кодирующую Д6-десатуразу, можно 61880 идентифицировать посредством анализа приобретения функции Вектор, содержащий фрагментарную ДНК, переносят, например, путем инфицирования, трансконъюгирования, трансфекции в организм-хозяин, который синтезирует линолевую кислоту, а не гамма-линоленовую кислоту Используемый в этом описании изобретения термин "трансформация" означает включение посторонней ДНК в клетку-хозяин Методы введения рекомбинантной ДНК в организм-хозяин известны специалистам в этой области, и с ними можно ознакомиться, например, в справочнике Самбрука и др(1989) Синтез гамма-линоленовой кислоты этими организмами (то есть приобретение функции) определяют, например, газовой хроматографией или другими методами, известными специалистам в этой области Организмы, которые стали синтезировать гамма-линоленовую кислоту, то есть приобрели новую функцию в результате введения вектора, определяются как экспрессирующие ДНК, кодирующую Д6-десатуразу, причем указанную ДНК выделяют из организмов Выделенную ДНК можно снова разделить на фрагменты, клонировать в экспрессирующих векторах и функционально исследовать с помощью вышеуказанных методов с целью более точного определения ДНК, кодирующей Д6-десатуразу В качестве примера, иллюстрирующего настоящее изобретение, случайную ДНК выделяют из цианобактерии Synechocystis, входящей в Коллекцию культур Пастера (РСС) 6803 и Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) 27184, клонируют в космидном векторе и вводят путем трансконъюгирования в штамм цианобактерии Anabaena РСС 7120, АТСС 27893, не синтезирующих гамма-линоленовой кислоты Синтез гамма-линоленовой кислоты из линолевой кислоты Anabaena контролируют посредством газовой хроматографии, после чего выделяют соответствующий фрагмент ДНК Выделенную ДНК секвенируют с помощью методов, хорошо известных специалистам в этой области, которые описаны, например, в справочнике Самбрука и др (1989) В соответствии с настоящим изобретением выделяют молекулы ДНК, содержащие гены Дбдесатуразы В частности, из цианобактерии Synechocystis была выделена ДНК длиной 3,588 тысяч пар нуклеотидов (т п н), содержащая ген Дб-десатуразы Была определена нуклеотидная последовательность ДНК длиной 3,588т п н , которая представлена в последовательности с индификационным No 1 Открытые рамки считывания, определяющие потенциальные кодирующие области, находятся в нуклеотидах с 317 по 1507 и в нуклеотидах с 2002 по 3081 Чтобы установить нуклеотиды, имеющие непосредственное отношение к кодированию Дб-де-сатуразы, фрагмент ДНК длиной 3,588т п н , который определяет активность Дб-десатуразы, расщепляют на два подфрагмента, каждый из которых содержит только одну открытую рамку считывания Фрагмент ORF1 содержит нуклеотиды с 1 по 17046, а фрагмент ORF2 содержит нуклеотиды с 1705 по 3588 Каждый фрагмент субклонируют в прямой и обратной ориентации в коньюгированном экспрессирующем 8 векторе (АМ542, Wolk et al [1984] Proc Natl Acad Sci USA 81, 1561), который содержит промотор карбоксилазы цианобактерии Полученные конструкции (то есть ORF1(F), ORF1(R), ORF2(F) и ORF2(R) конъюгируют со штаммом Anabaena дикого типа РСС 7120 с помощью стандартных методов (см , например, Wolk et al (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81, 1561) Конъюгированные клетки штамма Anabaena идентифицированы в виде зеленых колоний Neo на коричневом фоне погибающих неконъюгированных клеток после выращивания в течение двух недель на селективной среде (стандартные минеральные среды BG11N, содержащие 30мкг/мл неомицина в соответствии с описанием Rippka et al ,(1979) J Gen Microbiol 111, 1) Зеленые колонии выделяют и выращивают в селективных жидких средах (BG11N+15MKr/Mn неомицина) Липиды экстрагируют стандартными методами (например, по методу Dahmar et al (1989) Journal of American Oil Chemical Society 66, 543) из полученных трансконъюгантов, содержащих конструкции OEF1 и ORF2 с прямой и обратной ориентацией Для сравнения липиды экстрагируют также из других культур Anabaena и Synechocystis Метиловые эфиры жирных кислот анализируют посредством газожидкостной хроматографии, например, с использованием газожидкостного хроматографа Тгасог-560, оборудованного ионизационным детектором с водородным пламенем и капилярной колонкой Результаты газожидкостной хроматографии приведены в таблице 1 Таблица 1 Присутствие С18 жирных кислот в цианобактериях трансгенного и дикого типов Источник 180 181 182 y18 3 a18 3 184 Anabaena (дикий тип) + + + + Anabaena+ORF1 (F) + + + + Anabaena+ORF1 (R) + + + + Anabaena+ORF2(F) Anabaena+ORF2(R) + + + + Synechocystis (дикий + + + + тип) Как показывает газожидкостная хроматография, штамм Anabaena, не синтезирующий гаммалиноленовую кислоту, приобретает функцию синтеза гамма-линоленовой кислоты, когда путем трансконъюгирования в него вводят конструкцию, содержащую ORF2 с прямой ориентацией Трансконъюгаты, содержащие конструкции с ORF2 с обратной ориентацией относительно промотора карбоксилазы, или ORF1 с любой ориентацией, не синтезируют гамма-линоленовой кислоты Этот анализ показывает, что только одна открытая рамка считывания (ORF2) во фрагменте 1884 комплементарной пары гетероциклических оснований ДНК кодирует Д6-десатуразу Фрагмент 1884 комплементарной пары гетероциклических оснований ДНК представлен в виде последовательностей с идентификационным No 3 Это подтверждается полным сходством профилей водорастворимости у Дб-десатуразы и Д12-десатуразы [Wada et al (1990) Nature 347], как показано на 61880 10 декатетраеновая кислота обычно присутствует в рыбьем жире и в некоторых видах растений семейства Boragmaceae (Craig et al [1964] J Amer Oil Chem Soc 41, 209-211, Gross et al [1976] Can J Flant Sci 56, 659-664) В трансгенных организмах по настоящему изобретению октадекатетраеновая кислота образуется в результате дальнейшей десатурации а-линоленовой кислоты под действием Дб-десатуразы или десатурации гаммалиноленовой кислоты под действием Д12десатуразы 359 аминокислот, кодируемых ORF2, то есть открытой рамкой считывания, кодирующей Д6десатуразу Synechocystis, представлены в виде Выделенные нуклеиновые кислоты, кодируюпоследовательности с индентификационным No 2 щие Д6-десатуразу, можно идентифицировать в Открытая рам ка сч иты ван ия, код и рующая Д6других организмах, синтезирующих гаммадесатуразу бурачника, представлена в последовалиноленовую кислоту, с помощью анализа приобтельности с идентификационным No 5 Настоящее ретения функции, описанного выше, или с помоизобретение далее включает другие нуклеотидщью методов гибридизации нуклеиновых кислот с ные последовательности, которые кодируют амииспользованием выделенной нуклеиновой кислонокислоты последовательности с идентификациты, которая кодирует Synechocys t i s или Д6онным No 2 и в последовательности с десатуразу бурачника в виде зонда гибридизации идентификационным No 5 Специалисты в этой Методы клонирования генома и кДНК хорошо изобласти могут легко идентифицировать такие повестны специалистам в этой области, и настояследовательности, которые появляются, наприщим изобретением предполагается их применемер, в результате вырожденности генетического ние Зонд гибридизации может содержать всю кода Кроме того, специалисты в этой области с последовательность ДНК, описываемую как попомощью описанного выше анализа приобретения следовательность с идентификационным No 1 или функции могут определить более мелкие субпоследовательность с идентификационным No 4, фрагменты фрагментов, содержащих открытые либо рестрикционныи фрагмент или другой фраграмки считывания, которые кодируют Д6мент ДНК, включающий олигонуклеотидный зонд десатуразу Методы клонирования гомологичных генов путем Настоящее изобретение включает любой таперекрестной гибридизации известны специаликой полипептидный фрагмент Дб-десатуразы и стам в этой области, и с ними можно ознакомитьнуклеиновых кислот, которые сохраняют активнося, например, в работе Самбрука (1989) и Белца и сти в отношении превращения линолевой кислоты др (Beltz et al) (1983) Methods in Enzymology 100, в гамма-линоленовую кислоту 266 В соответствии с другим аспектом настоящего В соответствии с другим методом идентифиизобретения вектор, содержащий нуклеиновую кации гена Дб-десатуразы в организме, синтезикислоту по данному изобретению, или более мелрующем гамма-линоленовую кислоту, создают кий фрагмент, содержащий промотор, кодирую+ библиотеку кДНК из поли-А РНК, выделенной из щую последовательность и терминальную обполирибо-сомной РНК Чтобы удалить многочисласть гена Дб-десатуразы переносят в организм, ленные зкспрессируемые гены из популяции например, цианобактерий, у которых промотор ДбкДНК, кДНК или их фрагменты, соответствующие десатуразы и терминальные области являются многочисленным генам кДНК, используют в виде функциональными Поэтому данным изобретенизондов гибридизации для библиотеки кДНК Неем предусматриваются организмы, синтезируюгибрид изирующиеся зоны удаляют, полученные щие рекомбинантную Д6-десатуразу Еще одним бактериальные колонии используют для инокуляаспектом данного изобретения является выдеции жидких культур и секвенируют Например, ленная Д6-десатураза, которую можно выделить в чтобы удалить другие кДНК запасного белка сечистом виде из рекомбинантных организмов с помян из библиотеки кДНК, полученной из поли сомощью стандартных методов очистки белков (Намной РНК бурачника, типы кДНК, соответствуюпример, см Ausubel et al [1987] Current Protocols щие сильно экс-прессированным запасным in Molecular Biology, Green Publishing Associates, белкам семян, сначала гибридизируют с библиоNew York) текой кДНК "Выделенную" библиотеку ДНК затем Векторы, содержащие ДНК, кодирующую Д6используют для получения меток экспрессированных последовательностей (ETSs), которые примедесатуразу, также входят в объем настоящего няют для сканирования базы данных, такой как изобретения Специалистам в этой области должGenBank, с целью идентификации потенциальных но быть понятно, что можно сконструировать содесатураторов ответствующие векторы, вызывающие экспрессию кодирующей последовательности Дб-десатуразы в Трансгенные организмы, которые приобретаряде организмов Наиболее предпочтительными ют функцию синтеза гамма-линоленовой кислоты являются реплицируемые экспрессирующие векв результате введения ДНК, кодирующей Дторы Описываемые здесь реплицируемыми эксдесатуразу, также приобретают функцию синтеза прессирующими векторами являются молекулы октадекатетраеновой кислоты (18 4 А 6 9 1 2 1 5 ) Октафиг1, (А) и (В) Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением из бурачника (Boraso officinahs) можно выделить кДНК, содержащую ген Дб-десатуразы Была определена нуклеотидная последовательность кДНК длиной 1,685 тысячи пар нуклеотидов (т п н), которая представлена на фиг5А (последовательность с индентифици-кационным No 4) Инициирующий кодон ATG и терминирующий кодон подчеркнуты Аминокислотная последовательность, соответствующая открытой рамке считывания в Д6-десатуразе бурачника, представлена на фиг5В (последовательность с идентификационным No 5) 12 11 61880 ДНК или РНК, созданные для контролируемой цифичный промотор, функционально связанный с экспрессии требуемого гена, то есть гена Д6кодирующей областью Дб-десатуразы и далее десатуразы Этими векторами предпочтительно функционально связанный с конститутивным или являются плазмиды, бактериофаги, космиды или тканеспецифичным терминатором или сигналом вирусы Настоящим изобретением предполагаеттерминации наполинсинтазы ся применение шаттл-векторов, например, опиВ частности, такие регуляторные элементы, санных Волком и др (Wolk et al) (1984) Proc Natl как гелиантинин, описываемые в одновременно Acad Sci USA, 1561-1565 и Бастосом и др (Busрассматриваемой заявке на патент США tos e t a l ) (1991) JBactenol 174 7525-7533 СамNo 682354, поданной 8 апреля 1991 г, которая брук и др (1989), Goeddel, ed (1990) Methods in включена в это описание изобретения в качестве Enzymology 185 Academic Press, и Perbal (1988) A ссылки, являются промоторными элементами, Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and служащими для экспрессии Дб-десатуразы по наSons, Inc , дают подробный обзор векторов, в костоящему изобретению торые можно вводить и экспрессировать нуклеиМодификации рассматриваемых нуклеотидновую кислоту, кодирующую данную Д6ных последовательностей или регуляторных эледесатуразу Такие векторы содержат также послементов, выполняющих здесь функции, входят в довательности нуклеиновых кислот, которые могут объем данного изобретения Такие модификации влиять на экспрессию нуклеиновых кислот, кодивключают вставки, замены и делеции, в частности, рующих Д6-десатуразу Элементы последовазамены, которые отражают вырожденность генетельности, способные вызывать экспрессию гентического кода ного продукта, включают промоторы, энхансеры, Стандартные методы конструирования гибпредшествующие активирующие последовательридных векторов хорошо известны специалистам ности, сигналы терминации транскрипции и сайты в этой области и описываются в приводимых ссыполиаденилирования Настоящим изобретением лочных материалах, таких как справочник Сампредусматриваются как конститутивные, так и ткабрука и др (1989), или в любом из множества рунеспецифичные промоторы Для трансформации ководств по лабораторным исследованиям, растительных клеток особый интерес представлякоторые относятся к технологии получения рекомет промотор 35S вируса мозаичной болезни цветбинантной ДНК и имеют широкое применение ной капусты (CaMV) и промоторы, активизируемые Существует целый ряд способов, предназначенво время созревания семян растений Все эти ных для лигирования фрагментов ДНК, выбор копромоторы и элементы, регулирующие транскрипторых зависит от характера концов фрагментов цию, в отдельности или в сочетании, рассматриДНК Кроме того, в объем настоящего изобретеваются с целью их использования в данных репния входят гибридные векторы, в которые включелицирующих векторах и известны специалистам в ны элементы нуклеотидной последовательности, этой области Промотор CaMV 355 описывается, облегчающие клонирование, экспрессию или пронапример, Restrepo et al (1990) Plant Cell 2, 987 В цессинг, например, последовательнообъем настоящего изобретения входят также гести, кодирующие сигнальные пептиды, последованетически сконструированные и мутированные тельности, кодирующие KDEL, которая регуляторные последовательности необходима для удерживания белков в эндоплазматическом ретикулуме, или последовательности, Специалисты в этой области способны опрекодирующие транзитные пептиды, которые наделить векторы и регуляторные элементы, приправляют Д6-десатуразу в хлоропласт Такие погодные для экспрессии в определенной клеткеследовательности известны специалистам в этой хозяине Например, для экспрессии Д6области Оптимизированный транзитный пептид десатуразы в цианобактериях пригоден вектор, описывается, например, Van len Broeck et al содержащий промотор из гена, кодирующего кар(1985) Nature 313, 358 Прокариотические и эукабоксилаэу вида Anabaena, функционально свяриотические сигнальные последовательности занную с кодирующей областью Дб-десатуразы и описываются, например, Michel is et al (1982) Ann далее функционально связанную с сигналом терRev Microbiol 36, 425 минации вида Synechocystis Термин "функционально связанный" в этом контексте означает, что Дальнейшим аспектом настоящего изобретепромоторные и терминаторные последовательнония предусматриваются организмы, неявляющиести обеспечивают эффективную регуляцию трансся цианобактериями или растениями, которые крипции В качестве другого примера можно присодержат ДНК, кодирующую Д6-десатуразу по вести вектор, пригодный для экспрессии Дбданному изобретению Трансгенными организмадесатуразы в трансгенных растениях, который ми, входящими в объем настоящего изобретения, может содержать характерную для семян промоявляются бактерии, цианобактерии, грибы, растеторную последовательность, выделяемую из гения и животные Выделенную ДНК по настоящему лиантинина, напина или глицинина, функциональизобретению можно ввести в клетку-хозяин с поно связанных с кодирующей областью Дбмощью известных методов, например, инфициродесатуразы и далее функционально связанных с вания, трансфекции, трансформации и транссигналом терминации семени или сигналом терконъюгирования Методы переноса ДНК по минации наполинсинтазы Еще одним примером настоящему изобретению в такие организмы шиможет служить вектор, служащий для экспрессии роко известны и описываются в справочных матеДб-десатуразы в растениях, который может сориалах, таких как работа Самбрука и др (1989) держать конститутивный промотор или тканеспеИзвестны разнообразные методы трансформации растений Ген Дб-десатуразы можно ввести 14 13 61880 в растения с помощью процедуры-регенерации мированную растительную клетку, обычно в кульлистового диска, описанной Horsch et al (1985) туре каллусных тканей или на листовом диске, Science 227, 1229 Можно использовать другие регенерируют в полностью трансгенном растении методы трансформации, такие как культивировас помощь методов, хорошо известных специалиние протопласта (Horsch et al (1984) Science 223, стам в этой области (например, Horsch et al 496, DeBlock et al (1984) EMBO J 2, 2143, Barton (1985) Science 227, 1129) В соответствии с предet al (1983) Cell 32, 1033), которые также входят в почтительным вариантом осуществления изобреобъем данного изобретения В соответствии с тения трансгенным растением является подсолпредпочтительным вариантом осуществления нечник, рапс (oie seed rape), кукуруза, табак, настоящего изобретения растения трансформиарахис или соя Поскольку потомство трансфорруют с помощью векторов, выделенных из Agroмированных растений наследует ДНК, кодируюbacterium Однако существуют другие методы, щую Д6-десатуразу, семена или черенки транспозволяющие ввести гены Дб-десатуразы по наформированных растений используют для стоящему изобретению в растительные клетки сохранения линии трансгенных растений Такие альтернативные методы включают биобалНастоящим изобретением далее предусматлистические способы (Klein et al (1987) Nature ривается способ получения трансгенных растений 327, 70), электропорацию, опосредованный химис повышенным содержанием гамма-линоленовой ческими веществами ввод ДНК и использование кислоты Этот способ включает введение ДНК, вирусов или пыльцы в качестве векторов кодирующей Аб-десатуразу, в растительные клетПри необходимости в случае применения меки с низким содержанием или полным отсутствием тода трансформации гены Дб-десатуразы по нагамма-линоленовой кислоты, которые содержат стоящему изобретению можно ввести в растилинолевую кислоту, и регенерацию растений с тельный трансформирующий вектор, например, повышенным содержанием гамма-линоленовой бинарный вектор, описанный Bevan (1984) Nucleic кислоты из трансгенных клеток В частности, такие Acids Res,12, 8111 широко распространенные сельскохозяйственные Растительные трансформирующие векторы культуры, как соя, рапс, кукуруза, арахис и табак, можно получить путем изменения натуральной рассматриваются в качестве трансгенных оргасистемы переноса гена Agrobacterium tumefaciens низмов, но не ограничиваются ими Природная система включает плазмиды, индуциНастоящим изобретением далее предусматрующие образование опухолей (Ті) и содержащие ривается способ получения трансгенных организбольшой сегмент, известный как Т-ДНК, который мов, содержащих гамма-линоленовую кислоту переносится в трансформированные растения Этот способ включает введение ДНК, кодирующей Другой сегмент Ti-плазмиды, vir область, имеет Д6-десатуразу, в организмы с низким содержанинепосредственное отношение к переносу Т-ДНК ем или полным отсутствием гамма-линоленовой Область Т-ДНК ограничена концевыми повторами кислоты, но содержащие линолевую кислоту В В модифицированных бинарных векторах удалесоответствии с другим вариантом осуществления ны гены, индуцирующие образование опухолей, и настоящего изобретения предусматривается спофункции vir области используются для переноса соб, который включает введение одного или нечужеродной ДНК, ограниченной граничными поскольких экспрессирующих векторов, содержащих следовательностями Т-ДНК Т-область содержит ДНК, кодирующую Д12-десатуразу и Д6также селективный маркер для устойчивости к десатуразу, в организмы, не содержащие ни гамантибиотикам и множественный сайт клонировама-линоленовой кислоты, ни линолевой кислоты ния, предназначенный для ввода последовательВ соответствии с этим способом у организмов, не ностей для переноса Такие сконструированные содержащих ни линолевой кислоты, ни гаммаштаммы известны как "обезвреженные" линоленовой кислоты, вызывают синтез линоле("disarmed") штаммы A tumefaciens и обеспечивавой кислоты путем экспрессии Д12-десату-разы, ют эффективную трансформацию последовательпосле чего синтезируют гамма-линоленовую киностей, ограниченных Т-областью, в ядерные геслоту в результате экспрессии Дб-десатуразы номы растений Экспрессирующие векторы, содержащие ДНК, Листовые диски со стерилизованной поверхкодируючую Д12-десатуразу или Д12-десатуразу и ностью инокулируют "обезвреженным" видо А Д6-десатуразу, можно получить с помощью метоtumefaciens, содержащим чужеродную ДНК, кульдов рекомбинантных ДНК, известных специалитивируют в течение двух дней, а затем переносят стам в этой области (Sambrook et al 1989), и с на среду, содержащую антибиотик Трансформипомощью последовательности Д12-десатуразы, рованные проростки выбирают после укоренения опубликованной в научной литературе (Wada et al в среде, содержащей соответствующий антибио[1990] Nature (London) 347, 200-203 Кроме того, тик, переносят в почву и регенерируют настоящее изобретение позволило установить, Другим аспектом настоящего изобретения что нуклеотиды 2002-3081 последовательности с предусматриваются трансгенные растения или идентификационным No 1 кодируют Д12потомство этих растений, содержащее ДНК по десатуразу цианобактерий Поэтому эту последоданному изобретению В объем настоящего изовательность можно использовать для получения бретения входят как однодольные, так и двудольцелевых экспрессирующих векторов В частности, ные растения Растительные клетки трансформитакие широко распространенные сельскохозяйструют выделенной ДНК, кодирующей Д6венные культуры, как подсолнечник, соя, рапс, десатуразу, с помощью любого из описанных выкукуруза, арахис и табак, рассматриваются в качеше методов трансформации растений Трансфор 15 61880 16 стве трансгенных организмов, но не ограничивасодержат значительные количества линолевои ются ими кислоты, предшественника гамма-линоленовой Настоящее изобретение далее относится к кислоты (фигура 2, таблица 2) Библиотеку космид способу повышения холодоустойчивости растеSynechocystis, описанную в примере 2, конъюгиний Чувствительность к охлаждению может быть руют в Anabaena (РСС 7120) с целью идентифисвязана с фазовым переносом липидов в клеточкации трансконъюгантов, синтезирующих гамманых мембранах Температура фазового переноса линоленовую кислоту Клетки Anabaena выращизависит от степени ненасыщенности жирных кивают до полулогарифмической фазы в жидкой слот в липидах мембраны, поэтому увеличение среде BG11N+ и повторно суспендируют в такой степени ненасыщенности, например, путем ввеже среде до конечной концентрации, равной при9 дения Дб-десатуразы с целью превращения линомерно 1х10 клеткам на мл Культуру Е coh RP4 в левой кислоты в гамма-линолено-вую кислоту, полулогарифмической фазе (Burkard et al [1979] может сделать растение холодоустойчивым или J Gen Microbiol,114, 341-348), выращенную в срепонизить чувствительность к охлаждению Поэтоде Луриа, содержащей ампициллин, промывают и му настоящим изобретением предусматривается вновь суспендируют в свежей среде Луриа После введение ДНК, кодирующей Д6-десатуразу, в расэтого Anabaena и RP4 смешивают и равномерно тительные клетки и регенерация растений с пораспределяют по планшетам со средой BG11N+, вышенной холодоустойчивостью из указанных содержащей 5% среды Луриа Геномную библиотрансформированных растительных клеток В сотеку космид помещают на планшеты со средой ответствии с предпочтительным вариантом осуЛуриа, содержащие 50мкг/мл ка-намицина и ществления настоящего изобретения такими рас17,5мкг/мл хлорамфеникола, повторяя эту процетениями являются подсолнечник, соя, рапс, дуру дважды, а затем помещают на планшеты со кукуруза, арахис или табак средой BG11N+, содержащей Anabaena и RP4 После инкубации в течение 24 часов при темпераНастоящее изобретение далее проиллюстритуре 30°С вводят подслой из 30мкг/мл неомицина, ровано следующими примерами и продолжают инкубацию при температуре 30°С Пример 1 до появления трансконъюгатов Отдельные трансШтаммы и условия культивирования конъюгаты отделяют после конъюгирования и выSynechocystis (РСС 6803, АТСС 27184), Апаращивают в 2мл жидкой среды BG11N+ с 15мкг/мл baena (РСС 7120, АТСС 27893 и Synechoccus неомицина Метиловые эфиры жирных кислот (РСС 7942, АТСС 33912) выращивают фотоавтополучают из культур дикого типа и культур, сотрофическим путем при температуре 30°С в среде держащих пулы из десяти трансконъюгатов, выBGIIN+(Rippka et al [1979] J Gen Microbiol 111,1полняя следующую процедуру Дикие и трансген61) под светом ламп накаливания (60цЕ m 2 S 1) ные цианобактериальные культуры отделяют Отбирают космиды и плазмиды и культивируют их центрифугированием и дважды промывают дисв штамме Eschenchia coh DH5a в среде Луриа, тиллированной водой Метиловые эфиры жирных дополненной антибиотиками в стандартных конкислот экстрагируют из этих культур, как это опицентрациях, как описано в работе Mamatis et al сано в работе Dahmer et al (989) J Amer Oil (1982) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Chem Soc 66, 543-548, и анализируют посредстSpring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York вом газожидкостной хроматографии с помощью хроматографа Тгасог-560, оборудованного иониПример 2 зационным детектором с водородным пламенем и Создание геномной библиотеки космид штамкапиллярной колонкой (30м х 0,25мм связанного ма Synechocystis FSOT Superox II, Alltech Associates Inc , IL) Для Всю геномную ДНК, полученную из штамма идентификации жирных кислот служат значения Synechocystis (РСС 6803) частично расщепляют с времени удержания и ко-хроматографии эталонов помощью Sau3A и фракцинируют в градиенте (предоставленных компанией Sigma Chemical Co ) концентрации сахарозы (Ausubel et al [1987] CurСредний состав жирных кислот определяют в виrent Protocols in Molecular Biology, Greene Publishде отношений пиковой области каждой С18 жирing Associates and Wiley Interscience, New York) ной кислоты, нормализованной в отношении внутФракции, содержащие фрагменты ДНК длиной от реннего эталона 30 до 40т п н отбирают и лигируют в дефосфорилированный сайт BamHI космидного вектора, Типичные профили газожидкостной хроматоpDUCA7 (Buikema et al [1991] J Bactenol 173, графии показаны на фиг 2 На этой фигуре изо1879-1885) Лигированную ДНК упаковывают in бражены метиловые эфиры С18 жирных кислот vitro, как описано Ausubel et al (1987), и упакованПики идентифицируют путем сравнения значений ный фаг культивируют в культуре Е coh DH5a, современи элюирования с известными эталонами держащей плазмиду pRL528 клетки-помощника метиловых эфиров жирных кислот и подтверждасинтеза метилазы Aval и Есо4711, как это описано ют путем газовой хроматографии и массBuikema et al (1991) Произвольно выделяют в спектрометрии На фиг2А показаны результаты общей сложности 1152 колонии и помещают отгазожидкостно хроматографии жирных кислот дельно на двенадцать 96-луночных титрационных Anabaena дикого типа Стрелкой показано время микропланшетов миграции гамма-линоленовой кислоты На фиг2В Пример 3 изображен профиль хроматографии жирных киЭкспрессия гамма-линоленовой кислоты в слот транконъюгатов Anabaena с рАМ542+1 8F Anabaena с приобретением функции Выявлено два пула, синтезирующих гаммаAnabaena (РСС 7120), нитевидные цианобаклиноленовую кислоту (из 25 пулов, представляютерии, не имеют гамма-линоленовой кислоты, но 18 17 61880 щих 250 транконъюгатов) Отдельные трансконъСубфрагменты Nhel/Hindlll переносят в конъюгаты каждого пула, давшего положительные реюгальный экспрессирующий вектор АМ542 с прязультаты в отношении гамма-линоленовой кисломой и обратной ориентацией в отношении промоты, анализируют на синтез гамма-линоленовой тора, представляющего собой карбоксилазу кислоты, определяют два независимых транконъцианобактерий, и вводят в Anabaena путем конъююгата, AS13 и AS75, по одному из каждого пула, гирования Трансконъюгаты, содержащие фрагкоторые синтезируют значительные количества мент длиной 1,8т п н с прямой ориентацией гамма-линоленовой кислоты и содержат космиды, (AM542-1.8F), позволяют получить значительные cSy13 и cSy75 (фигура 3) Перекрывающиеся косколичества гамма-линоленовой кислоты и октадемиды образуют область длиной примерно 7,5т п н катетраеновой кислоты (фигура 2, таблица 2) Фрагмент Nhel длиной 3,5т п н космиды cSy75 Трансконъюгаты, содержащие другие конструкции, вновь клонируют в векторе pDUCA7 и переносят в а также обратно ориентированный фрагмент длиAnabaena, в результате чего имеет место экспресной 1,8т п н или прямо и обратно ориентировансия гамма-линоленовой кислоты с приобретением ный фрагмент длиной 1,7тпн, не синтезируют функции (таблица 2) гамма-линоленовую кислоту на детектируемых уровнях (таблица 2) Два субфрагмента Nhel/Hindlll (1,8 и 1,7т п н) из фрагмента Nhel длиной 3,5т п н космиды cSy75-3,5 субклониру-ют в "pBLUESCRIPT" (Stratagene) (фигура 3) с целью секвенирования Используют стандартные методы молекулярной биологии, описанные Maniatis et al, (1982) и Ausubel et al (1987) Дидезоксисиквенирование (Sanger et al [1977] Proc Natl Acad Sci USA 74, 5463-5467) плазмиды pBSI, 8 выполняют с помощью "секвеназы" (United States Biochemical) в отношении обеих цепей, используя специальные олигонуклеотидные затравки, синтезированные лабораторией прогрессивных технологий синтеза ДНК (Биологический факультет, Техасский университет) Анализ последовательности ДНК производят с помощью программного обеспечения GCG (Мадисон, шт Винсконсин) в соответствии с описанием Devereux et al (1984) Nucleic Acids Res 12, 387-395 На фигуре 2 профиль С18 жирной кислоты экстракта из Anabaena дикого типа (фигура 2А) сравнивается с профилем Anabaena трансгенного типа, содержащим фрагмент космиды cSy75-3,5 длиной 1,8т п н с прямой ориентацией (фигура 2В) Газожидкостная хроматография метиловых эфиров жирных кислот, полученных из фрагмента АМ542-1 8А, позволила выявить пик со временем удержания, идентичным такому же показателю у подлинного эталона гамма-линоленовой кислоты Анализ этого пика посредством газовой хроматографии и масс-спектрометрии (GC-MS) подтвердил наличие аналогичной картины фрагментации по массе, что и в контрольной пробе гаммалиноленовой кислоты Anabaena трансгенного типа с изменными уровнями полиненасыщенных жирных кислот аналогичен дикому типу по скорости роста и морфологии Таблица 2 Состав С18 жирных кислот в цианобактериях дикого и трансгенного типа Штамм Жирная кислота (%) 182 18 3(а) 180 Дикий тип Synechocystis (вид РСС6803) Anabaena (вид РСС7120) Synechococcus (вид РСС7942) Трансконъюгаты Anabaena cSy75 cSy75-3,5 pAM542-1,8F pAM542-1,8R pAM542-1,7F pAM542-1,7R Трансформанты Synechococcus pAM854 РАМ854-Д1' рАМ854-Д° рАМ854-Д°и Д " 181 13,6 2,9 20,6 4,5 24,8 79,4 54,5 37,1 3,8 4,3 4,2 7,7 2,8 2,8 24,4 27,6 13,9 23,1 27,8 25,4 27,8 4,0 18,2 42,7 72,2 43,2 81,8 25,3 18 0, стеариновая кислота, 18 1, олеиновая кислота, 18 2, линолевая кислота, 18 3(а), линоленовая кислота, 18 3(у),у-линоленовая кислота, 18 4, октадекатетраеновая кислота Пример 4 Трансформация Synechococcus генами Д6 и Д12 десатуразы 18 3(у) 184 35,2 27,3 22,3 18,1 12,1 38,4 36,1 42,3 9,1 3,2 19,1 30,8 33,3 29,6 27,9 40,4 25,4 12,5 6,4 25,4 46,0 19,5 16,5 Третью космиду, cSy7, содержащую ген Д12десатуразы, выделяют путем скрининга геномной библиотеки Synechocystis олигонуклеотидом, синтезированным из опубликованной в литературе последовательности гена Д12-десатураэы Synechocystis (Wada et al [1990] Nature (London) 347, 200-203) В этой космиде идентифицируют 19 61880 фрагмент Aval длиной 1,7тпн, содержащий ген Д12-десатуразы и используют его в качестве зонда для демонстрации того, что космида cSy13 помимо гена Дб-десатуразы содержит также ген Д12десатуразы (фигура 3) Геномный анализ по методу саузерн - блоттинга далее показывает, что гены как Д6-, так и Д12-десатуразы уникальны в геноме Synechocystis в том отношении, что оба функциональных гена, имеющих отношение к десатурации С18 жирных кислот, близко связаны в геноме Synec-hocystis Одноклеточные цианобактерии Synechococcus (РСС 7942) не имеют ни ленолевой кислоты, ни гамма-линоленовой кислоты (3) Гены Д12 и Дбдесатуразы клонируют отдельно и вместе в шаттл-векторе рАМ854 (Bustos et al [1991] J Bactenol 174, 7525-7533), который содержит последовательности, необходимые для интеграции чужеродной ДНК в геном Synechococcus (Golden et ai [1987] Methods in Enzvmol 153, 215231) Synechococcus трансформируют этими генными конструкциями и отбирают колонии, трансформируют этими генными конструкциями и отбирают колонии Метиловые эфиры жирных кислот экстрагируют из Synechococcus трансгенного типа и анализируют посредством газожидкостной хроматографии В таблице 2 показано, что основными жирными кислотами Synechococcus дикого типа являются стеориновая кислота (18 0) и олеиновая кислота (181) Цианобактерии Synechococcus, трансформированные рАМ854-Д12, помимо основных жирных кислот ситезируют линолевую кислоту (18 2) Трансформанты, полученные с помощью рАМ854- Д6 и Д12, синтезируют как линолеат, так и гамма-линоленовую кислоту (таблица 1) Эти результаты свидетельствуют о том, что цианобактерии Synechococcus, содержащий гены Д12 и Дб-десатуразы, способны создавать вторую двойную связь в Д12-положении и третью двойную связь в Дб-положении С18 жирных кислот Однако у трансформанта, содержащего рАМ854- Д6, не обнаружено изменений в составе жирных кислот, что указывает на то, что при отсутствии субстрата, синтезируемого Д12-десатура-зой, Д6-десатураза не проявляет активности Этот эксперемент далее подтверждает, что фрагмент Nhel/Hmdlll длиной 1,8т п н (фигура 3) содержит как кодирующую, так и промоторную области гена Дб-десатуразы Synechocystis Цианобактерии Synechococcus трансгенного типа с измененными уровнями полиненасыщенных жирных кислот аналогичны дикому типу по скорости роста и морфологии Пример 5 Нуклеотидная последовательность Дбдесатуразы Определяют нуклеотидную последовательности фрагмента cSy75-3,5 длиной 1,8т п н Идентифицируют открытую рамку считывания, кодирующую полипептид 359 аминокислот (фигура 4) С помощью анализа на водорастворимость КайтаДулитла (Kyte et al [1982] J Мої Biol 157,105-132) идентифицируют две области гидрофобных аминокислот, которые могут представлять трансмембранные домены (фигура 1А) кроме того, про 20 филь водорастворимости Дб-десатуразы аналогичен Д12-десатуразы (IB, Wada et al) и 9десатураз (Thiede et al [1986] J Biol Chem 261, 13230-13235) Однако сходство последовательностей между Д6 и Д12-десатуразой Synechocystis составляет менее 40% на уровне нуклеотидов и примерно 18% на уровне аминокислот Пример 6 Перенос Дб-десатуразы цианобактерии в табак Ген Дб-десатуразы цианобактерии активируют в растительном экспрессирующем векторе и переносят в табак с помощью методов переноса генов, опосредственного Agrobactenum Для гарантии того, что перенесенная десатураза должным образом экспрессирована в листьях и развивающихся семенах и что продукт гена десатуразы введен в эндоплазматический ретикулум или хлоропласт, конструируют различные полигенные экспрессирующие кластеры с открытой рамкой считывания Д-десатуразы Synechocystis Компоненты этих кластеров включают (і) промотор 35S или семяспецифичный промотор, полученный из гена гелиантинина подсолнечника, с целью экспрессии гена Дб-десатуразы во всех тканях растения или только в развивающихся семенах, (м) предполагаемый сигнальный пептид из гена экстенсина моркови или гена гелиантинина подсолнечника для введения вновь синтезированной Дбдесатуразы в эндоплазматический ретикулум (ER), (ш) сигнальную последовательность сохранения полости эндоплазматического ретикулума (KDEL) у СООН-конца открытой рамки считывания Дб-десатуразы и (iv) оптимизированный транзитный пептид, служащий для ввода Дб-десатуразы в хлоропласт Промотор 35S является производным pRTL2, описанным Restrepo et al Последовательность оптимизированного транзитного пептида описана Van de Broeck et al (1985) Сигнальный пептид экстенсина моркови описан Chen et al (1985) EMBO J9, 2145 Получают трансгенные растения табака, содержащие рекомби-нантный ген десатуразы цианобактерии, представляющий собой ген Дбдесатуразы Synechocystis, связанный с последовательностью сохранения эндоплазматического ретикулума (KDEL) и сигнальным пептидом экстенсина, стимулируемого промотором CaMV 35S Амплификации геномной ДНК трансгенного табака, образуемые в результате полимеразной цепной реакции, показывают, что ген Дб-десатуразы включен в геном табака Метиловые эфиры жирных кислот, полученные из листьев этих трансгенных растений табака, экстрагируют и анализируют посредством газожидкостной хроматографии Эти трансгенные растения табака накапливают значительные количества гамма-линоленовой кислоты (фигура 4) На фигуре 4 показаны метиловые эфиры жирных кислот, выявленные газожидкостной хроматографией Пики идентифицированы путем сравнения времени элюирования с известными эталонами метиловых эфиров жирных кислот Таким образом, цианобактериальные гены, участвующие в обмене жирных кислот, можно использовать для генерации трансгенных растений с 22 21 61880 измененными составами жирных кислот Фильтры сушат на воздухе, а затем подвергают воздействию рентгеновской пленки в течение 24 Пример 7 часов с использованием усиливающих экранов Создание библиотеки кДНК бурачника при температуре -80°С Мембраносвязанные полирибосомы выделяют из семян бурачника через 12 дней после опыПример 9 ления в соответствии с протоколом, разработанПроизвольное секвенирование кДНК, выденым для гороха Латкинсом (Latkms) и Девисом ленных из библиотеки мембраносвязанных поли(Davies) (1975 Plant Phys 55 749-756) РНК экстрасом семян бурачника (через 12 дней после опылегируют из полирибосом по методу, описанному ния) Мехлером (Mechler) (1987 Methods in Enzymology Библиотеку кДНК бурачника пассируют на 152 241-248, Academic Press) чашках с низкой плотностью (500 бляшкообра+ зующих единиц на 150мм чашках Петри) НаибоПоли-А РНК выделяют из РНК мембраносвялее распространенные кДНК запасного белка сезанных полирибосом, используя гранулы Ohgotexмян вычленяют путем скрининга с dT (Qiagen) Соответствующую кДНК получают, использованием ранее идентифицированных соиспользуя набор для синтеза кДНК ZAP фирмы ответствующих кДНК Негибридизирующие бляшStratagene Библиотеку кДНК создают в векторе ки вырезают, используя процедуру вырезания и ламбда ZAP II (Stratagene), используя набор для реагенты фирмы Stratagene Полученные бактесинтеза вектора ламбда ZAP II Первичную бибриальные колонии используют для инокуляции лиотеку упаковывают в упаковочный экстракт Giжидких культур и секвенируют либо вручную, либо gapack II Gold (Stratagene) Эту библиотеку исс помощью автоматического секвенатора ABI Капользуют для синтеза меток ждую кДНК секвенируют один раз и метят послеэкспрессированных последовательностей (EST) и довательности, состоящие из 200-300 пар основапоследовательности, соответствующие этим метний Все секвенирование выполняют по методу кам, используют для сканирования базы данных циклического секвенирования (Epicentre) ПолучеGenBank но более 300 меток экспрессированных последоПример 8 вательностей Каждую метку последовательности Протокол гибридизации сравнивают с базой данных GenBank с помощью Зонды гибридизации для скрининга библиотекомпьютерной программы BLASTX и идентифицики кДНК бурачника получают путем синтеза слуруют ряд генов липидного обмена, включая Д6чайной праймированной ДНК, описанного Ausubel десатуразу et al (1994 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, NY), при этом они соответстПоиски в базе данных с использованием клона вуют ранее идентифицированной кДНК экспрескДНК, обозначенного mbp-65, с помощью просированного запасного белка семян Невключенграммы BLASTX и базы данных GemBank привели ные нуклеотиды удаляют в осадительной колонке к выявлению значительной совместимости с Д6G-50 (Boehnnger Manheim) Зонд денатурируют десатуразой Synechocystis Однако установлено, для гибридизации путем кипячения на водяной что этот клон не является полной кДНК Полную бане в течение 5 минут с последующим быстрым кДНК выделяют, используя mbp-65 для скрининга охлаждением на льду Фильтры для гибридизации библиотеки мембраносвязанных полисом бурачпредварительно гибридизируют при температуре ника 60°С в течение 2-4 часов в растворе для предгибОпределяют последовательность выделенной ридизации (6-кратный раствор хлорида и цитрата кДНК (фиг5А, последовательность с идентификанатрия (SSC) [Mamatis et al 1984 Molecular Cloning ционным No,4) и белковую последовательность A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor открытой рамки считывания (фиг5В, последоваLaboratory], содержащий 1-кратный раствор Дентельность с идентификационным No 5) сравнивахартса, 0,05% пирофосфата натрия, 100мкг/мл ют с другими известными десатуразами, испольденатурированной ДНК спермы лосося) Денатузуя программу сравнительного анализа первичной рированный зонд добавляют в раствор гибридиструктуры белков Geneworks ((IntelhgGenetics) зации (6-кратный раствор хлорида и цитрата нафиг 2) Этот анализ показывает, что данная кДНК трия, 1-кратный раствор Денхарта, 0,05% является геном Дб-десатуразы бурачника пирофосфата натрия, 100мкг/мл денатурированБудучи схожей с известными десатуразами ной ДНК спермы лосося) и инкубируют, перемедругих растений, Д6-десатураза бурачника имеет шивая при температуре 60°С в течение ночи определенные отличия, показанные на дендроФильтры промывают в 4-, 2- и 1-кратных раствограмме, изображенной на фиг 6 Кроме того, сраврах SET по 15 минут в каждом при температуре нение аминокислотных последовательностей, ха60°С 20-кратный исходный раствор SET состоит рактерных для десатураз, в частности, тех, из 3 молей NaCI, 0,4моля трис-основания, которые участвуют в связывании металлов (ме20ммолей 1\1а2ЭДТК-2Н2О 4-кратный промывочталлический блок 1 и металлический блок 2), поный раствор SET состоит из 4-кратного раствора зволяет выявить различия, существующие между SET, 12,5ммоля РО4, рН 6,8 и 0,2% додецилсульД6-десатуразой бурачника и десатуразами других фата натрия 2-кратный промывочный раствор растений (таблица 3) SET состоит из 2-кратного раствора SET, 12,5ммоля РСч, рН 6,8 и 0,2% додецилсульфата Д6-Десатураза бурачника отличается от цианатрия 1-кратный промывочный раствор SET сонобактериальной формы не только всей последостоит из 1-кратного раствора SET, 12,5 ммоля вательностью (фиг 6), но также и липидным блоНО2, рН 6,8 и 0,2% додецилсульфата натрия ком, металлическим блоком 1 и металлическим блоком 2 аминокислотных частей (таблица 3) Как 23 61880 показано в таблице 3, все три части являются новыми в последовательности Только металлический блок 2 Дб-десатуразы бурачника имеет некоторое сходство с металлическим блоком 2 Дбдесатуразы Synechocystis Помимо этого, Д6-десатураза бурачника отличается также от другого гена десатуразы бурачника, Д12-десатуразы Р1-81 является полной кДНК, которая идентифицирована на основе анализа меток экспрессированных последовательностей, и 24 демонстрирует большое сходство с Д12десатуразой Arabidopsos (Fad 2) Сравнение липидного блока, металлического блока 1 и металлического блока 2 аминокислотных частей (таблица 3) у Д6- и Д12-десатураз бурачника показывает, что в этих областях имеет место незначительная степень подобия Расположение этих двух последовательностей на дендрограмме, изображенной на фиг 6, показывает, насколько далеки эти два гена друг от друга Таблица 3 Сравнение обычных аминокислотных частей в мембраносвязанных десатуразах Десатураза Бурачник Д6 Synechocystis Д6 Arab, хлоропласт Д15 РисД15 Глицинхлоропласт Д15 Arab fad2(A15) Brassicafad3 (Д15) Бурачник Д12 (PI-81)* Arab fad2(A12) Arab, хлоропласт Д12 Глицинпластида Д12 Шпинат пластидный n-6 Synechocystis Д12 Anabaena Д12 Аминокислотная часть Липидный блок Металлический блок 1 WIGHDAGH (послед No 6) HNAHH (послед No 12) NVGHDANH (послед No 7) HNYLHH (послед No 13) VLGHDCGH (послед No 8) HRNHH (послед No 14) VLGHDCGH (послед No 8) HRTHH (послед No 14) VLGHDCGH (послед No 8) HRTHH (послед No 14) VLGHDCGH (послед No 8) HRTHH (послед No 14) VLGHDCGH (послед No 8) HRTHH (послед No 14) VIAHECGH (послед No 9) HRRHH (послед No 15) VIAHECGH (послед No 9) HRRHH (послед No 15) VIGHDCAH (послед No 10) HDRHH (послед No 16) VIGHDCAH (послед No 10) HDRHH (послед No 16) VIGHDCAH (послед No 10) HDQHH (послед No 17) VVGHDCGH (послед No 11) HDHHH (послед No 18) VLGHDCGH (послед No 8) HNHHH (послед No 19) Металлический блок 2 FQIEHH (послед No 20) HQVTHH (послед No 21) HVIHH (послед No 22) HVIHH (послед No 22) HVIHH (послед No 22) HVIHH (послед No 22) HVIHH (послед No 22) HVAHH (послед No 23) HVAHH (послед No 23) HIPHH (послед No 24) HIPHH (послед No 24) HIPHH (послед No 24) HIPHH (послед No 24) HVPHH (послед No 25) * PI-81 является полной кДНК, которая идентифицирована на основании анализа меток экспрессированной последовательности и демонстрирует большое сходство с Д12-десатуразой Arbidopsis (fad2) Пример 10 Конструкция 2221 A6NOS для переходной экспрессии Вектор рВ1221 (Jefferson et al 1987 EMBO J 6 3901-3907) получают для лигирования расщеплением с помощью BamHI EcolCR I (Promega), что позволяет вырезать кодирующую область GUS, не повреждая промотор 35S и терминатор NOS кДНК Дб-десатуразы бурачника вырезают из плазмиды Блюскрипта (Stratagene) путем расщепления с помощью BamHI Xhol Конец Xhol дефосфолируют, используя фрагмент Кленова Этот фрагмент затем клонируют в сайтах BaraHI/EcolCR I вектора рВ1221, получая 221 Д ^ О Э ( ф и г 7 ) В 221 A6NOS стальной частью (скелетом) рестрикционной карты, изображенной на фиг 7, является вектор рВ1221 Пример 11 Конструкция 121 Д 6 NOS для стабильной трансформации Вектор pBI121 (Jefferson et al 1987 EMBO J 6 3901-3907) получают для лигирования расщеплением с помощью BamHI и EcolCR I (Promega), что позволяет вырезать кодирующую область GUS, не повреждая промотор 35S и терминатор NOS кДНК Дб-десатуразы бурачника вырезают из плазмиды Блюскрипта (Stratagene) путем расщепления с помощью BamHI и Xhol Конец Xhol дефосфолируют, используя фрагмент Кленова Этот фрагмент затем клонируют в сайтах BamHI/EcolCR I вектора рВИ21, получая 121 A6NOS (фиг 7) В 121 A6NOS остальной частью (скелетом) рестрикционной карты, изображенной на фиг 7 является вектор рВИ 21 Пример 12 Переходная экспрессия Всю работу, связанную с протопластами, выполняют в стерильном вытяжном шкафу Один мл упакованных клеток суспензии моркови расщепляют в 30мл плазмолизующего раствора (25г/л КСІ, 3,5г/л СаСІ2-Н2О, Юммолей MES, рН 5,6 и 0,2моля маннитола) с 1% целлюлозы, 0,1% пектолиазы и 0,1% дрейсалазы в течение ночи в темноте при комнатной температуре Высвобожденные протопласты фильтруют через сито с отверстиями 150цт и гранулируют центрифугированием (ЮОх г, 5 минут), после чего дважды промывают в плазмирующем растворе Протопласты подсчитывают в двухкамерном гемоцитомере ДНК трансфецируют в протопласты путем обработки полиэтиленгликолем в соответствии с описанием Нунберга и Томаса (Nunberg and Tomas, 1993, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, В R Ghck and J E Thompson, eds , pp 241-248), используя 106 протопластов и 50-70мкг плазмидной ДНК (221 Д6 NOS) Протопласты культивируют, встряхивая, в 5мл MS-среды, дополненной 0,2 моля маннитола и Змкл 2,4-дихлорфеноксиуксусной 25 61880 26 кислоты, в темноте в течение 48 часов зано в таблице 4 Пример 13 Стабильная трансформация табака Таблица 4 Конструкцию на основе плазмидного вектора 6 b 121 Д NOS используют для трансформации табаЖирная кислота Xanthi pBI121A NOS ка (Nicotiana tabacum cv xanthi) посредством 180 4,0% 2,5% Agrobactenum в соответствии со стандартными 181 13% 13% процедурами (Horsh et al , 1985, Science 227 1229182 82% 82% 1231, Bogue et al , 1990 Мої Genet 221 49-57) за 2,7% 18 3y(GLA) исключением того, что исходные трансформанты 0,82% 1,4% 18 3а выбирают на ЮОмкг/мл канамицина Пример 14 Приведенные выше результаты показывают, Получение и анализ метиловых эфиров жирчто гамма-линоленовая кислота включена в трианых кислот (FAME) цилглицериды и семян трансгенного табака, соТкани, взятые из трансфецированных протодержащего Д6-десатуразу бурачника пластов и трансформированных растений табака Перечень последовательностей замораживают в жидком азоте и лиофилизуют в (1) Общая информация течение ночи Метиловые эфиры жирных кислот (і) Заявитель Рон-Поуленк Агрохими получают в соответствии со способом, описанным (м) Название изобретения Синтез гаммаДагмером и др (Dahmer et al , 1989, J Amer Oil линоленовой кислоты под действием ДбChem Soc 66 543-548) В некоторых случаях расдесатуразы творитель снова выпаривают и метиловые эфиры (ш) Количество последовательностей 25 жирных кислот еще раз суспендируют в этилаце(iv) Почтовый адрес тате и один раз экстрагируют деионизированной (A) Получатель Scully, Scott, Murphy & Presser водой для удаления водорастворимых загряз(B) Улица 400 Garden City Plaza няющих примесей Метиловые эфиры жирных (C) Город Garden City кислот анализируют посредством газовой хромо(D) Штат New York тографии на колонке J & W Scientific DB-wax (дли(E) Страна United States на 30м, внутренний диаметр 0,25мм, пленка тол(F) Почтовый индекс 11530 щиной 0,25мкм) (v) Компьютерное представление Пример анализа переходного состояния при(A) Тип среды Гибкий диск веден на фиг 8, который позволяет выявить сово(B) Компьютер IBM PC-совместимый купность из трех независимых трансфекций До(C) Операционная система PC-DOS/MS-DOS бавление кДНК Дб-десатуразы бурачника (D) Программное обеспечение Patentln Reсоответствует появлению гамма-линоленовой lease 1 0, версия 1 25 кислоты, которая является одним из возможных (vi) Данные о текущей заявке продуктов Дб-десатуразы (A) Номер заявки На фигурах 9 и 10 изображены профили газо(B) Дата регистрации 30 декабря 1994г вой хроматографии эфиров жирных кислот, выде(C) Классификация ленных соответственно из тканей листа и семени (VIM) Информация о поверенном и патентном контрольных и трансформированных растений агенте табака На фигуре 9А изображен профиль ткани (A) Имя Прессер Леопольд листа табака дикого типа (xanthi), на фигуре 9В (B) Регистрационный номер 19827 изображен профиль ткани листа табака, транс(C) Справочный и реестровый номер формированного с помощью Дб-десатуразы бу8383ZYXW1 рачника при транскрипционной регуляции, осуще(їх) Информация о телесвязи ствляемой промотором 35S CaMV (pBI (A) Телефон (516)742-4343 6 121 Д NOS) Пики соответствуют 18 2, 18 Зу (гам(B) Телефакс (516)742-4366 ма-линоленовая кислота), 18 3а и 18 4 (октадека(C) Телекс 230 901 SANS UK ноновая кислота) На Фигуре 10А показан профиль (2) Данные о последовательности с идентигазовой хроматографии семян табака дикого типа, фикационным No 1 на фигуре 10В изображен профиль ткани семени (і) Характеристики последовательности растения табака, трансформированного с помо(A) Длина 3588 пар оснований щью pBI 121A 6 NOS Пики соответствуют 18 2, (B) Тип нуклеиновая кислота 18 Зу (гамма-линоленовая кислота) и 18 3а Отно(C) Тип цепи оба сительное распределение С-is жирных кислот в (D) Топология линейная контрольных и трансгенных семенах табака пока(м) Тип молекулы ДНК (геномная) 27 61880 28 (їх) Отличительные особенной и: (A) Названне/определптсль. CDS (B) Положение: 2002..3081 (xi) Описание последовательности с идентификационным No. 1: G T G C C A T A G T CCTTGAATTT G C A T T A C A G C G A T T A CA C A C GGC AG G CTCG C CG C C TTCGA £0 T C C C T C C T G T ATCGTTTGTT C A C T C C G G A A G T A A A C C G AT GAT TA A C AG C T G T A C TT G C C 120 CACCTTGCCA GACCACGTTA GTTTGAGTGT TTCCGCCCTG GCGGCCCCGA ТПТГҐССТТ 180 TGCGGCTTTG GGCAATCAGG CGATCGGGCA ATTGCGTTTG TTTGACCAGA CTTGGCCCAT 24 0 TCAGGAAATT GTCATTCACC AAGACCATCC CTGGCTCAAT TTACCCCTGG CGGATTTATG 300 GGATGATCCG AGCCGAATGT TGATCTATTA CCTACCGGCC CACAGTGAAA CGGATTTAGT ЗЄО AGGCGCAGTG GTGAATAATT TAACGTTGCA ATGTGGGGAC CATTTAATAG TGGGACAAAA 420 ACCCCAACCC AAGACCAAAC GGCGATCGCC 7TGGCGCAAA ТГТТССАААС TGATTACCAA 4 80 CCTGCGGGAG TATCAGCGGT ATGTCCAACA GGTGATATGG GTGGTGTTGT TTTTATTGTT 540 GATGATTTTT CTGGCCACCT TCATCTACGT TTCCATTGAT CAACATATTG CCCCAGTGGA 600 CGCGTTGTAT TTTTCCGTGG GCATGATTAC CGGGGCCGGT GGCAAGGAAG AGGTGGCCGA fiSO AAAGTCCCCC GATATCATCA AAGTATTCAC AGTGGTGATG ATGATCGCCG GGGCGGGGGT 720' GATTGGTATT TGTTATGCCC TACTGAATGA ТГТСАТССТТ GGCACJTCGCT TTAGTCAGTT 780 TTTGGATGCG GCCAAGTTAC CCGATCGCCA TCACATCATC ATTTGTGGGC TGGGGGGAGT S^O GAGCATGGCC ATTATTGAAG AGTTAATTCA CCAGGGCCAT GAAATTGTGG TAATCGAAAA 900 GGATACAGAT AATCGTrTCT TGCATACGGC CCGCTCCCTG GGGGTGCCCG TAATTGTGGA 960 QGATGCCCGC CTAGAAAGAA CGTTGGCCTG CGCCAATATC AACCGAGCCG AAGCCATTGT 1020 GGTGGCCACC AGCGACGACA CCGTTAACTT GGAAATTGGC CTAACTGCCA "AGGCGATCGC 10SO CCCTAGCCTG CCAGTGGTGT TGCGTTGCCA GGATGCCCAG TTTAGCCTGT CCCTGCAGGA 114 0 AGTATTTGAA TTTGAAACGG TGCTTTGTCC GGCGGAATTG GCCACCTATT CCTTTGCGGC 120Q GGCGGCCCTG GGGGGCAAAA TTTTGGGCAA CGGCATGACC GATGATTTGC TGTGGGTAGC 1260 CCTAGCCACC TTAATCACTC CTAACCATCC CTTTGCCGAC CAATTGGTTA AAATTGCAGC 13 20 CCAAAAGTCT GATTTCGTTC CCCTCTATCT AGAACGGGGT GGCAAAACCA TCCATAGCTG 13 80 GGAATTATTG GGTACCCATC TCGACTCTGG AGACGTGTTG TATTTAACCA TGCCCGCCAC 14 40 TGCCCTAGAG CAACTTTGGC GATCGCCCCG TGCCACTGCT GATCCTCTGG ACTCTTTTTT 1500 29 61880 ЗО GGTTTAGCAT GGGGGGATGG AACTCTTGAC TCGGCCCAAT GGTGATCAAG AAAGAACGCT 1560 TTGTCTATGT TTAGTATTTT TAAGTTAACC AACAGCAGAG GATAACTTCC AAAAGAAATT 1620 AAGCTCAAAA AGTAGCAAAA TAAGTTTAAT TCATAACTGA GTTTTACTGC TAAACAGCGG 1ЄЄ0 TGCAAAAAAG TCAGATAMA TAAAAGCTTC ACTTCGGTTT TATATTGTGA CCATGGTTCC 1740 CAGGCATCTG CTCTAGGGAG TTTTTCCGCT GCCTTTAGAG AGTATTTTCT CCAAGTCGGC 1300 TAACTCCCCC ATTTTTAGGC AAAATCATAT ACAGACTATC CCAATATTGC CAGAGCTTTG I860 ATGACTCACT GTAGAAGGCA GACTAAAATT 1320 CTAGCAATGG ACTCCCAGTT GGAATAAATT TTTAGTCTCC CCCGGCGCTG GAGTTTTTTT GTAGTTAATG GCGGTATAAT GTGAAAGTTT 19S0 TTTATCTATT TAAATTTATA A ATG СТА АСА GCG GAA AGA ATT AAA TTT ACC Met Leu T h r A l a G l u Arg H e Lye Phe T h r 1 5 10 2031 CAG AAA CGG GGG TTT CGT CGG GTA СТА AAC CAA CGG GTG GAT GCC TAC G i n Lye Arg GLy Phe Arg Arg V a l Leu Asn G i n Arg Val Aep A l a T y r 15 20 2S 2079 TTT GCC GAG CAT GGC CTG ACC CAA AGG GAT AAT CCC TCC ATG TAT CTG Phe Ala Glu H i s Gly Leu T h r G i n Arg A s p Asn P r o S e r Met T y r Leu 30 35 40 2127 AAA ACC CTG ATT ATT GTG CTC TGG TTG TTT TCC GCT TGG GCC TTT GTG Lye Thr Leu lie lie Val Leu Trp Leu Phe Ser Ala Trp Ala Phe Val 45 50 55 2175 CTT TTT GCT CCh GTT ATT TTT CCS GTG CGC СТА CTG GGT TGT ATG GTT Leu Phe Ala Pro Val H e Phe Pro Val Arg Leu Leu Gly Cys Met Val 60 Є5 70 2223 TTG GCG АТС GCC TTG GCG GCC TTT TCC "ПС AAT GTC GGC CAC GAT GCC Leu Ala H e Ala Leu Ala Ala Phe Ser Phe Asn Val Gly His Asp Ala - 75 вО 85 90 2271 AAC CAC AAT GCC TAT TCC TCC AAT CCC CAC АТС AAC CGG GTT CTG GGC Aen His А Й П Ala Tyr Ser Ser Asn Pro His H e Asn Arg Val Leu Gly 9S 100 105 231Э ATG ACC TAC GAT TTT GTC GGG TTA TCT AGT TTT CTT TGG CGC TAT CGC Met Thr Tyr Asp Phe Val Gly Leu Ser Ser Phe Leu Trp Arg Tyr Arg 110 US 120 2 3 67 CAC AAC TAT TTG CAC CAC ACC TAC ACC AAT ATT CTT GGC CAT GAC GTG His Asn Tyr Leu His Uia Thr Tyr Thr Asn H e Leu Gly His Asp Val 125 130 135 24IS GAA АТС CAT GSA GAT GGC GCA GTA CGT ATG AGT CCT GAA CAA GAA CAT Glu H e His Gly Asp Gly Ala Val Arg Met; Ser Pro Glu Gin Glu His 140 145 150 24 63 61880 32 31 GTT GGT ATT TAT CGT TTC CAG CAA TTT TAT ATT TGG GGT TTA TAT CTT Val Gly H e Туг Arg Phe Gin Gin Phe Tyr H e Trp Gly Leu Tyr Leu 155 160 165 170 2511 TTC ATT CCC TTT TAT TGG TTT CTC TAC GAT GTC TAC СТА GTG CTT AAT Phe H e Pro Phe Tyr Trp Phe Leu Туг Авр Val Tyr Leu Val Leu Asn П5 180 185 25S9 AAA GGC AAA TAT CAC GAC CAT AAA ATT CCT CCT TTC CAG CCC СТА GAA Lya Gly Lys Tyr His Asp His Lys H e Pro Pro Phe Gin Pro Leu Glu 190 195 200 2607 TTA GCT AGT TTG СТА GGG ATT AAG СТА TTA TGG CTC GGC TAC GTT TTC Leu Ala Ser Leu Leu Gly H e Lys Leu Leu Trp Leu Gly Tyr Val Phe 205 210 215 2655 GGC TTA CCT CTG GCT CTG GGC TTT TCC ATT CCT GAA СТА ТТЛ ATT GGT Gly Leu Pro Leu Ala Leu Gly Phe Ser H e Pro Glu Val Leu H e Gly 220 225 230 2703 GCT TCG GTA ACC TAT ATG ACC TAT GGC АТС GTG GTT TGC ACC АТС TTT Ala Ser Val Thr Tyr Met Thr Tyr Gly H e Val Val Cys Thx H e Phe 235 240 245 250 2751 ATG CTG GCC CAT GTG TTG GAA TCA ACT GAA TTT CTC ACC CCC GAT GGT Met Leu Ala His Val Leu Glu Ser Thr Glu Phe Leu Thr Pro Asp Gly 255 2S0 2S5 2799 GAA TCC GGT GCC ATT GAT GAC GAG TGG GCT ATT TGC CAA ATT CGT ACC Glu Ser Gly Ala H e Asp Asp Glu Trp Ala H e Cys Gin H e Arg Thr 270 275 2flO 2B47 ACG GCC AAT TTT GCC ACC AAT AAT CCC TTT TGG AAC TGG TTT TGT GGC Thr Ala Asn Phe Ala Thr Asn Asn Pro Phe Trp Asn Trp Phe Cys Gly 2&5 2&0 295 28Э5 GGT TTA AAT CAC CAA GTT ACC CAC CAT CTT TTC CCC AAT ATT TGT CAT Gly Leu Aan His Gin Val Thr Ніє His Leu Phe Pro Asn H e Cys His 300 305 3X0 2943 ATT CAC TAT CCC CAA TTG GAA AAT ATT ATT AAG GAT GTT TGC CAA GAG H e Hie Tyr Pro Gin Leu Glu А Б П Н е H e Lys Asp Val Cya-Gln Glu 315 320 325 330 2Э91 TTT GGT GTG GAA TAT AAA GTT TAT CCC ACC TTC AAA GCG GCG АТС GCC Phe Gly Val Glu Tyr Lys Val Tyr Pro Thr Phe Lya Ala Ala H e Ala 335 340 345 3039 TCT AAC TAT CGC TGG СТА GAG GCC ATG GGC AAA GCA TCG TGACATTGCC Ser Aen Tyr Arg Trp Leu Glu Ala Met Gly Lys Ala Ser 350 355 360 30B8 TTGGGATTGft. AGCAAAATGG CAAAATCCCT CGTAAATCTA TGATCGAAGC CTTTCTGTTG CCCGCCGA-CC AAATCCCCGA TGCTGACCAA AGGTTGRTGT TGGCATTGCT CCAAACCCAC 320B 33 61880 m Pro 34 35 Gin 61880 36 Gin Phe Туг lie Trp Gly Leu Тут Leu Phe lie Pro Phe Tyr Trp 165 170 175 Phe I>eu Туг Asp Val Tyr Leu Val Leu Авті Lys Gly Lys Tyr His Asp 180 IBS 190 His Lys lie Pro Pro Phe Gin Pro Leu Glu Leu Ala Ser Leu Leu Gly 195 200 205 lie Lys Leu Leu Trp Leu Gly Tyr Val Phe Gly Leu Pro Leu Ala Leu 210 215 220 Gly Phe Ser H e Pro Glu Val Leu lie Gly Ala Ser Val Thr Tyr Mat 225 230 235 240 Thr Tyr Gly H e Val Val Cys Thr H e Phe Met Leu Ala His Val Leu 245 250 255 Glu Ser Thr Glu Phe Leu Thr Pro Asp Gly Glu Ser Gly Ala H e Asp 260 265 270 Asp Glu Trp Ala lie Cys Gin H e Arg Thr Thr Ala Asn Phe Ala Thr 275 280 .• 285 Asn Asn Pro Phe Trp Aen Trp Phe Cys Gly Gly Leu Asn His Gin Val 2Э0 2Э5 300 Thr His His Leu Phe Pro Ash H e Cys His H e His Tyr Pro Gin Leu 305 310 315 320 Glu Aen H e H e Lye Asp Val Cys Gin Glu Phe Gly Val Glu Tyr Lys 325 330 Val Tyr Pro Thr "Phe Lys Ala Ala H e Ala Ser Asn Tyr Arg Trp Leu 340 34S 350 Glu Ala Met Gly Lye Ala Ser 355 (2) Данные о последовательности с идентификационным No. 3: - . •* (і) Характеристики последовательности: (A) Длина: 1884 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Тип цепи: оба . (D) Топология: линейная (ii) Тип молекулы: ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No. 3: AGCTTCACTT CGGTTTTATA TTGTGACCAT GGTTCCCAGG CATCTGCTCT AGGGAGTTTT 60 TCCGCTGCCT TTAGAGAGTA ТТТТСТССАА GTCGGCTAAC ТСССССАТТТ TTAGGCAAAA 120 37 61880 38 TCATATACAG ACTATCCCAA TATTGCCAGA GCTTTGATGA CTCACTGTAG AAGGCAGACT 160 AAAATTCTAG CAATGGACTC CCAGTTGGAA ТАААТТТГТА GTCTCCCCCG GCGCTGGAGT 24 0 TTTTTTGTAG TTAATGGCGG TATAATGTGA AAGTTTTTTA TCTATTTAAA TTTATAAATG 300 CTAACAGCGG AAAGAATTAA ATTTACCCAG AAACGGGGGT TTCGTCGGGT ACTAAACCAA 360 CGGGTGGATG CCTACTTTGC CGAGCATGGC CTGACCCAAA GGGATAATCC CTCCATGTAT 42Q CTGAAAACCC TGATTATTGT GCTCTGGTTG TTTTCCGCTT GGGCCTTTGT GCTTTTTGCT 480 CCAGTTATTT TTCCGGTGCG CCTACTGGGT TGTATGGTTT TGGCGATCGC CTTGGCGGCC 540 TTTTCCTTCA ATGTCGGCCA CGATGCCAAC CACAATGCCT ATTCCTCCAA TCCCCACATC 600 AACCGGGTTC TGGGCATGAC CTACGATTTT GTCGGGTTAT CTAGTTTTCT TTGGCGCTAT 660 CGCCACAACT ATTTGCACCA CACCTACACC AATATTCTTG GCCATGACGT GGAAATCCAT 720 GGAGATGGCG CAGTACGTAT GAGTCCTGAA CAAGAACATG TTGGTATTTA TCGTTTCCAG 1B0 CAATTTTATA TTTGGGGTTT ATATCTTTTC ATTCCCTTTT ATTGGTTTCT CTACGftTGTC 840 TACCTAGTGC TTAATAAAGG CAAATATCAC GACCATAAAA TTCCTCCTTT CCAGCCCCTA 900 GAATTAGCTA GTTTGCTAGG GATTAAGCTA TTATGGCTCG GCTACGTTTT CGGCTTACCT 960 CTGGCTCTGG GCTTTTCCAT TCCTGAAGTA TTAATTGGTG CTTCGGTAAC CTATATGACC 1020 TATGGCATCG TGGTTTGCAC CATCTTTATG CTGGCCCATG TGTTGGAATC AACTGAATTT 1080 CTCACCCCCG ATGGTGAATC CGGTGCCATT GATGACGAGT GGGCTATTTG CCAAATTCGT 1140 ACCACGGCCA ATTTTGCCAC CAATAATCCC TTTTGGAACT GGTTrrGTGG CGGTTTAAAT 1200 CACCAAGTTA CCCACCATCT TTTCCCCAAT ATTTGTCATA TTCACTATCC CCAATTGGAA 12 Є0 AATATTATTA AGGATC3TTTG CCAAGAGTTT GGTGTGGAAT ATAAAGTTTA TCCCACCTTC 1320 '"AAAGCGGCGA TCGCCTCTAA CTATCGCTGG CTAGAGGCCA TGGGCAAAGC ATCGTGACAT 13Э0 TGCCTTGGGA TTGAAGCAAA ATGGCAAAAT CCCTCGTAAA TCTATGATCG AAGCCTTTCT 144 0 GTTGCCCGCC GACCAAATCC CCGATGCTGA CCAAAGGTTG ATGTTGGCAT TGCTCCAAAC 1500 CCACTTTGAG GGGGTTCATT GGCCGCAGTT TCAAGCTGAC CTAGGAGGCA AAGATTGGGT 1560 GATTTTGCTC AAATCCGCTG GGATATTGAA AGGCTTCACC ACCTTTGGTT TCTACCCTGC 1620 TCAATGGGAA GGACAAACCG TCAGAATTGT TTATTCTGGT GACACCATCA CCGACCCATC 16S0 CATGTGGTCT AACCCAGCCC TGGCCAAGGC TTGGACCAAG GCCATGCAAA TTCTCCACGA П40 GGCTAGGCCA GAAAAATTAT ATTGGCTCCT GATTTCTTCC GGCTATCGCA CC7ACCGATT \S00 39 61880 40 TTTGAGCATT TTTGCCAAGG AATTCTATCC ССАСГАТСТС CATCCCACTC CCCCGCCTGT I860 ACAAAATTTT ATCCATCAGC TAGC 1BB4 (2) Данные о последовательности с идентификационным No. 4: (і) Характеристики последовательности; (A) Длина 1685 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Тип иепи' оба CD) ТОПОЛОПІЯ линейная (іі) Тип молекулы. ДНК (геномная) (хі) Описание послеяо&ателъности с идентификационным No. 4: 60 AATATCTGCC ТАСССТСССА AAGAGAGTAG ТСАТТТТТСА TCAATGGCTG СТСАААТСАА 120 GAAATACATT ACCTCAGATG AACTCAAGAA CCACGATAAA CCCGGAGATC TATGGATCTC ІВ0 GATTCAAGGG AAAGCCTATG ATGTTTCGGA TTGGGTGAAA GACCATCCAG GTGGCAGCTT 240 TCCCTTGAAG AGTCTTGCTG GTCAAGAGGT AACTGATGCA TTTGTTGCAT TCCATCCTGC 200 CTCTACATGG AAGAATCTTG ATAAGTTTTT CACTGGGTAT TATCTTAAAG ATTACTCTGT 360 TTCTGASGTT TCTAAAGATT ATAGGAAGCT TGTGTTTGAG ТГГТСТАААА TGGGTTTGTA 42Q TGACAAAAAA GGTCATATTA TGTTTGCAAC TTTGTGCTTT ATAGCAATGC TGTTTGCTAT 4BQ GAGTGTTTAT GGGGTTTTGT TTTGTGAGGG TGTTTTGGTA CATTTGTTTT CTGGGTGTTT 540 GATGGGGTTT СТТТйСАГГС AGAGTGGTTG GATTGGACAT GATGCTGGGC ATTATATQGT 6QG AGTGTCTGAT TCAAGGCTTA ATAAGTITAT GGGTATTTTT GCTGCAAATT GTCTTTCAGG 660 AATAAGTATT GGTTGGTGGft AATGGAACCA TAATGCACAT CACATTGCCT GTAATAGCCT 720 TpAATATGAC CCTGATTTAC AATATATACC ATTCCTTGTT GTGTCTTCCA TTCACTCACC TCTCATTTCT ATGAGAAAAG GTTGACTTrT GACTCTTTAT^CAAGATTCTT 780 TGTAAGTTAT CAACATTGGA CATTTTACCC TATTATGTGT GCTGCTAGGC TCAATATGTA 840 TGTACAATCT CTCATAATGT TGTTGACCAA GAGAAATGTG TCCTATCGAG CTCAGGAACT 900 CTTGGGATGC CTAGTGTTCT CGATTTGGTA CCCGTTGCTT GTTTCTTGTT TGCCTAATTG 5Є0 GGGTGAAAGA ATTATGTTTG TTATTGCAAG TTTATCAGTG ACTGGAATGC AACAAGTTCA 1020 GTTCTCCTTG AACCACTTCT CTTCAAGTGT TTATGTTGGA AAGCCTAAAG GGAATAATTG 1080 GTTTGAGAAA CAAACGGATG GGACACTTCJA CATTTCrTGT CCtCCTTGGA TGGATTGGTT 1140 TCATGGTGGA TTGCAATTCC AAATTGAGCA TCATTTGTTT CCCAAGATGC CTAGATGCAA 1200 41 61880 42 CCTTAGGAAA ATCTCGCCCT ACGTGATCGA GTTATGCAAG AAACATAATT TGCCTTACAA 1260 TTATGCATCT TTCTCCAAGG CCAATGAAAT GACACTCAGA ACATTGAGGA ACACAGCATT 1320 GCAGGCTAGG GATATAACCA AGCCGCTCCC GAAGAATTTG GTATGGGAAG CTCTTCACAC 13BO TCATGGTTAA AATTACCCTT AGTTCATGTA ATAATTTGAG ATTATGTATC TCCTATGTTT 1440 GTGTCTTGTC TTGGTTCTAC TTGTTGGAGT CATTGCAACT TGTCTTTTAT GGTTTATTAG 1500 ATGTTTTTTA ATATATTTTA GAGGTTTTGC ТТТСД.ТСТСС ATTATTGATG AATAAGGAGT 1560 TGCATATTGT CAATTGTTGT GCTCAATATC TGATATTTTG GAATGTACTT TGTACCACTG 1620 TGTTTTCAGT TGAAGCTCA7 GTGTACTTCT ATAGACTTTG TTTAAATGGT TATGTCATGT lfiBD TATTT 169 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No. 5: (і) Характеристики последовательности: (A) Длина1 448 аминокислот (B) Тип: аминокислота (D) Топология: линейная (ii) Тип молекулы: ДНК (геномная) _ (xi) Описание последовательности с идентификационным No, 5: Met Ala Ala Cln l i e Lys Lya Туг l i e Thr S e r Asp Glu Leu Lye Asn I S 10 15 His Asp Lys Pro Gly Asp L&u Trp H e Ser l i e Gin Gly Lys Ala Туг •20 25 30 Asp Val Ser Asp Trp Val Lys Asp Н І Б Pro Gly Gly Ser Phe Pro Leu 35 40 ' 45 Lys Ser Leu Ala Gly Gin Glu Val Thr Asp Ala Phe Val Ala Phe His 50 55 60 Pro Ala Ser Thr Trp Lys Asn Leu Asp Lys Phe Phe Thr Gly Туг Туг 65 70 IS B0 Leu Lys Asp Tyr Ser Val Ser Glu Val Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu 85 90 95 Val Phe Glu Phe Ser Lys Met Gly Leu Tyr Asp Lya Lys Gly His H e 100 105 110 Met Phe Ala Thr Leu Cys Phe lie Ala Met Leu Phe Ala Met Ser Val 115 120 125 Tyr Gly Val Leu Phe Cys Glu Gly Val Leu Val His Leu Phe Ser Gly 130 135 140 43 61880 44 Cys Leu Met Gly Phe Leu Trp lie Gin Ser Gly Trp lie Gly His Asp X4S ISO I 5 5 1 6 0 Ala Gly His Tyr Met Val Val Ser Asp Ser Arg Leu Asn Lys Phe Met 165 170 П5 Gly lie Phe Ala Ala Авп Cys Leu Ser Gly lie Ser lie Gly Trp Trp 1B0 165 1Э0 Lya Trp Asn His Авп Ala 195 НІБ НІБ H e 200 Ala Cys Asn Ser Leu Glu Tyr 205 Asp Pro Asp Leu Gin Tyr lie Pro Phe Leu Val Val Ser Ser Lys Phe 210 215 220 Phe Gly Ser Leu Thr Ser His Phe Tyr Glu Lya Arg Leu Thr Phe Asp 225 230 235 240 Ser Leu Ser Arg Phe Phe Val Ser Tyr Gin Hie Trp Thr Phe Tyr Pro 245 250 255 lie Met Сув Ala Ala Arg Leu Asn Met Tyr Val Gin Ser Leu H e 260 2SS 270 Met Leu Leu Thr Lys Arg Asn Val Ser Tyr Arg Ala Gin Glu Leu Leu Gly 275 2S0 2B5 Cys Leu Val Phe Ser lie Trp Tyr Pro Leu Leu Val Ser Сув Leu Pro 290 295 300 ABn Trp Gly Glu Arg H e Met Phe Val lie Ala Ser Leu Ser Val Thr 305 310 315 320 Gly Met Gin"Gin Val Gin Phe Ser Leu Asn Ній Phe Ser Ser Ser Val 325 330 335 Tyr Val Gly Lys Pro Lys Gly Asn Asn Trp Phe Glu Lys Gin Thr Asp 340 345 350 Gly Thr Leu Аєр Tie Ser Cys Pro Pro Trp Met Asp Trp Phe His Gly 355 360 365 Gly Ser Gin Phe Gin H e 370 Glu His His Leu Phe Pro Lys Met Pro Arg 375 3B0 Cya Aan Leu Arg Lye H e Ser Pro Tyr Val H e Glu Leu Cys Lye Lys 3BS 390 395 400 Hie Asn Leu Pro Tyr Asn Tyr Ala Ser Phe Ser Lys Ala Asn Glu Met 405 410 415 Thr Leu Arg Thr Leu Arg Asn Thr Ala Leu Gin Ala Arg Asp H e 420 425 430 Thr Lys Pro Leu Pro Lys Aan Leu Val Trp Glu Ala Leu His Thr His Gly 435 440 443 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 6 (і) Хараісгеристики последовательности (A) Длина 8 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (и) Тип молекулы ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с иденти фикационным No 6 Trp lie Gly His Asp Ala Gly His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 7 (і) Характеристики последовательности (А) Длина 8 аминокислот (В) Тип аминокислота 45 (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 7 Asn Val Gly His Asp Ala Asn His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 8 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 8 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 8 Val Leu Gly His Asp Cys Gly His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 9 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 8 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (и) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 9 Val lie Ala His Glu Cys Gly His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 10 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 8 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 10 Val lie Gly His Asp Cys Ala His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 11 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 8 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 11 Val Val Gly His Asp Cys Gly His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 12 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 5 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 12 His Asn Ala His His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 13 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 6 аминокислот (B) Тип аминокислота 61880 46 (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 13 His Asn Туг Leu His His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 14 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 5 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 14 His Arg Thr His His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 15 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 5 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (и) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 15 His Arg Arg His His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 16 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 5 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 16 His Asp Arg His His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 17 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 5 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 17 His Asp Gin His His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 18 (і) Характеристики последовательности (А) Длина 5 аминокислот (Б) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 18 His Asp His His His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 19 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 5 аминокислот (B) Тип аминокислота 47 61880 (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 19 His Asn His His His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 20 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 6 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 20 Phe Gin lie Glu His HIS 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 21 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 6 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (и) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 21 His Gin Val Thr His His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 22 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 5 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с иденти Комп'ютерна верстка Т Чепелєва 48 фикационным No 22 His Val lie His His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 23 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 5 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 23 His Val Ala His His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 24 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 5 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 24 His lie Pro His His 1 5 (2) Данные о последовательности с идентификационным No 25 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 5 аминокислот (B) Тип аминокислота (D) Топология линейная (и) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности с идентификационным No 25 His Val Pro His His 1 5 Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119