Гуманізоване антитіло проти епірегуліну

Реферат: Винахід стосується антитіла проти епірегуліну, яке демонструє цитотоксичну активність та нейтралізуючу активність проти ракових клітин, що експресують епірегулін людини. UA 115046 C2 (12) UA 115046 C2 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Цей винахід стосується способів лікування раку, агентів для інгібування проліферації ракових клітин та протиракових агентів. Попередній рівень техніки Рак – це лідируюча причина смертності в індустріалізованих країнах. За останні 50 років з метою лікування раку було розроблено багато хіміотерапевтичних агентів. Більшість хіміотерапевтичних агентів можна розподілити на алкілуючі агенти, антиметаболіти, антрацикліни, рослинні алкалоїди, інгібітори топоізомерази та протипухлинні агенти. Усі ці фармацевтичні агенти впливають на ділення клітин або синтез ДНК та зумовлюють терапевтичні ефекти через механізм, який діє певним чином. Ефективність певного хіміотерапевтичного агента різниться для різних видів раку або пацієнтів або різниться залежно від періоду дії для окремих пацієнтів. У ракових клітинах, які піддаються дії хіміотерапевтичних агентів, розвивається резистентність до цих хіміотерапевтичних агентів, та подібно до цього часто розвивається перехресна резистентність до ряду інших протиракових агентів. Крім того, з метою контролювання побічних ефектів, які є наслідком руйнування здорових клітин цими хіміотерапевтичними агентами через вищезгаданий механізм цих агентів, дозування та застосування агентів часто обмежується. Замість традиційних хіміотерапевтичних агентів нещодавно почали розробляти націлені на молекули ліки, які улучають у молекули, які експресуються специфічно на ракових клітинах. З появою цих націлених на молекули ліків можна уникнути побічних ефектів, притаманних традиційним хіміотерапевтичним агентам, та стають здійсненними способи лікування раку, які сприяють підвищенню якості життя ракових пацієнтів. Такі націлені на молекули ліки включають низькомолекулярні фармацевтичні агенти, а також фармацевтичні агенти з високою молекулярною масою, такі як антитіла. Терапевтичні антитіла – це молекули, які є невід'ємно присутніми у тілі, та їх перевага полягає у низькій токсичності щодо живих організмів, а також у тому, що вони демонструють терапевтичні ефекти, специфічно руйнуючи клітини-мішені за допомогою механізму дії, відмінного від механізму низькомолекулярних фармацевтичних агентів, такого як цитотоксична активність, опосередкована ефекторними функціями. Отже, багато терапевтичних антитіл нещодавно з'явилося на ринку. Терапевтичні антитіла, що націлені на епірегулін, який надзвичайно високо експресується при раку товстої кишки, аденокарциномі легеня, раку підшлункової залози, раку шлунку та раку нирки, описано як антитіла, які специфічно руйнують клітини-мішені за допомогою механізму дії, відмінного від механізму низькомолекулярних фармацевтичних агентів, такого як цитотоксична активність, опосередкована такими ефекторними функціями (патентний документ 1). Специфічно, внаслідок вимірювання активності комплемент-залежної цитотоксичності (CDC) та активності антитіло-залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (ADCC) антитіл проти епірегуліну виявили, що антитіла проти епірегуліну мають активність CDC та активність ADCC стосовно клітин, що експресують епірегулін. Крім того, було визначено, що антитіла проти епірегуліну мають ефекти інгібування проліферації ракових клітинних ліній внаслідок нейтралізуючої дії. Крім того, на підставі вищезгаданих результатів виявили, що антитіла проти епірегуліну є ефективними для діагностики, профілактики та лікування різних первинних та метастатичних видів раку. Будь-який новий фармацевтичний агент-кандидат, включаючи протиракові агенти, такі, які описано вище, повинен пройти жорсткі випробування до того, як він стане комерційно доступним. Наприклад, ці випробування розділяють на доклінічні випробування та клінічні випробування. Зазвичай, останні далі розділяються на випробування фази І, випробування фази ІІ та випробування фази ІІІ, та їх здійснюють на пацієнтах-людях, проте попередні дослідження виконуються із застосуванням тварин. Зазвичай, метою доклінічних досліджень є демонстрування того, що ліки-кандидати є сильними, а також ефективними та безпечними. Специфічно, цілями цих досліджень на тваринах є демонстрування того, що фармацевтичний агент не є канцерогенним, мутагенним або тератогенним, а також зрозуміти фармакокінетику фармацевтичного агента. Клінічні дослідження з введенням людям тестового фармацевтичного агента дозволяються лише тоді, коли під час доклінічних досліджень встановлено безпечність та ефективність тестового фармацевтичного агента відносно тварин. У багатьох випадках дія низькомолекулярного тестового фармацевтичного агента (наприклад, нового протиракового агента, що походить від антрацикліну) у тварин може стати індикатором для передбачених дій фармацевтичного агента, коли його вводять людям. Отже, загальні дані, отримані в ході таких доклінічних досліджень, можуть з високим ступенем ймовірності передбачити дії, які будуть відбуватися, коли його будуть вводити людям. Проте, таку ймовірність передбачення не отримують для кожного типу тестового фармацевтичного 1 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 агента; та ймовірність передбачення на підставі результатів доклінічних досліджень, та можливість того, що фармацевтичні агенти-кандидати будуть ухвалені, суттєво знижуються під час клінічних досліджень. Зазвичай, антитіла можуть функціонувати через надзвичайно специфічне розпізнавання молекул-мішеней, які зазвичай є білковоподібними. У більшості випадків тестові фармацевтичні агенти-антитіла є моноклональними антитілами, та вони розпізнають тільки єдину ділянку або єдиний епітоп на молекулі-мішені. Оскільки моноклональні антитіла звичайно мають високу функцію ідентифікації мішені, антитіла стали кандидатами, які представляють великий інтерес для розробки фармацевтичних агентів, проте, з іншого боку, ця функція ідентифікації у деяких випадках ускладнює доклінічні дослідження. Це зумовлюється тим, що існують видоспецифічні варіації у послідовностях молекул-мішеней, що зв'язуються з цими антитілами. Наприклад, моноклональне антитіло, які специфічно розпізнає молекулу Y через епітоп Х у людей та зв'язується з цією молекулою, буде тестуватися стосовно відповідного епітопу Х" у відповідній молекулі-мішені (ортолог) Y" у тому виді тварин, що застосовується у доклінічних дослідженнях, проте Х" може бути відмінним від Х, що є присутнім у відповідній молекулі-мішені у людей. Отже, часто моноклональне антитіло не може специфічно розпізнати ортолог Y" та зв'язатися з молекулою. Навіть серед груп моноклональних антитіл, які мають реактивність до антигенів людей та приматів, існує багато прикладів антитіл, які реагують тільки з гомологами антигенів людини та шимпанзе. Наприклад, такі випадки спостерігали для моноклональних антитіл проти CD3. Одним з найбільш широко використовуваних специфічних до комплексів CD3 моноклональних антитіл, яке має більш за все визначених властивостей, є ОКТ-3. ОКТ-3 реагує з CD3 шимпанзе, але не реагує з гомологами CD3 інших приматів, таких як макаки-резус, або з CD3 собак (непатентний документ 2). З іншого боку, існують приклади моноклоналоних антитіл, які розпізнають резус-антигени, але не розпізнають їхні ортологи людини. Прикладом в цій групі є FN-18, яке є моноклональним антитілом проти CD3, що походить від макаки-резус (непатентний документ 2). Було запроваджено декілька стратегій, щоб подолати проблеми, які виникають під час доклінічних випробувань на тваринах та які є наслідком високої специфічності таких моноклональних антитіл. Перший відомий підхід – це виконання доклінічних досліджень на тестових фармацевтичних засобах-антитілах із застосуванням моделі-шимпанзе. Шимпанзе – це найближчі генетичні родичі людей, та, оскільки їхній геном має 99 % ідентичність з геномом людини, дуже ймовірно, що різні варіанти молекули-мішені, що специфічно зв'язується з тестовим фармацевтичним засобом-антитілом у шимпанзе, є ідентичними до варіантів цієї молекули у людей. Фактично, Schlereth et al. визначили, що варіанти CD3 є спільними у людей та шимпанзе (непатентний документ 3). Отже, вважають, що ризик того, що ця молекула не буде розпізнаватися тестовим фармацевтичним засобом-антитілом у шимпанзе, є низьким. Проте, дослідження із застосуванням шимпанзе є дуже дорогими, та вони також мають етичні проблеми. Крім того, оскільки шимпанзе – це тварини під загрозою зникнення, та кількість тварин, яку можна застосовувати в експериментах, є жорстко обмеженою, такі доклінічні дослідження на шимпанзе не застосовуються під час розробки більшості тестових фармацевтичних засобів-антитіл. Другий підхід – це підхід, який полягає в адаптації молекули, що застосовується у доклінічних дослідженнях, до тварини, яка застосовується у дослідженнях. При цьому підході під час доклінічних досліджень отримують необхідну інформацію щодо безпечності, конструюючи так зване "сурогатне" антитіло для введення тваринам, використовуваним у дослідженнях. Зазвичай, таке сурогатне антитіло – це антитіло, яке специфічно розпізнає у тестовій тварині її ортолог молекули-мішені, яка зв'язується з несурогатним антитілом (актуальним тестовим фармацевтичним засобом-антитілом для людей), та воно є антитілом, яке було модифіковано так, щоб воно зв'язувалося з цим ортологом. Отже, при підході із застосуванням "сурогатного" антитіла слід окремо розробляти дві різні молекули: клінічний тестовий фармацевтичний агент та доклінічний тестовий фармацевтичний агент, який слід застосовувати у доклінічних дослідженнях на певному виді тварин та який має цільову специфічність, яка відповідає клінічному фармацевтичному агенту, та безпечність якого та їй подібне слід дослідити. Великий недолік цього сурогатного підходу полягає у тому, що сурогатне антитіло для доклінічних досліджень – це модифікований продукт клінічного тестового фармацевтичного засобу-антитіла. Отже, дані, отримані у ході доклінічних досліджень із застосуванням сурогатного антитіла, часто не можна застосовувати безпосередньо до людей. Отже, можливість передбачення результатів клінічних досліджень на основі результатів доклінічних досліджень із застосуванням таких підходів, може знизитися. Вищезгаданий підхід адаптує тестовий фармацевтичний агент так, що він стає придатним 2 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для тварини, яку застосовують у доклінічних дослідженнях. З іншого боку, інші відомі підходи адаптують тварин, що застосовуються у доклінічних дослідженнях, до фармацевтичного агентакандидата, який слід вводити людям. Прикладом адаптування тварини тесту до тестового фармацевтичного засобу-антитіла, призначеного для введення людям, є отримання трансгенної тварини, яка експресує молекулу людини, з якою специфічно зв'язується тестовий фармацевтичний засіб-антитіло, замість молекули, що не походить від людини, притаманній тому виду тварини, що використовується у дослідженні. У цьому способі очікують, що тестовий фармацевтичний агент-антитіло, який вводиться під час доклінічних досліджень, буде зв'язуватися з антигеном людини у трансгенній тварині, що використовується у дослідженні. Наприклад, у дослідженні, яке виконували Bugelski et al., доклінічне оцінювання безпечності здійснювали на моноклональному антитілі keliximab із застосуванням трансгенних мишей з CD4 людини для того, щоб передбачити довготривале лікування ревматоїдного артриту у пацієнтів-людей. Keliximab - це моноклональне антитіло, яке має специфічність до CD4 людей та шимпанзе. Bugelski et al. дійшли висновку, що застосування трансгенної миші, яка експресує білок людини, забезпечує корисним альтернативним способом для досліджень, які здійснюються на шимпанзе із застосуванням біологічних фармацевтичних засобів, які мають обмежену міжвидову специфічність. Проте, отримання трансгенних тварин для цілей випробування потребує багато часу та коштів, оскільки необхідно виконати багато роботи. Документи попереднього рівня техніки Патентні документи [Патентний документ 1] WO2008/047723 Непатентні документи [Непатентний документ 1] J.Med.Primatol. (1986) 15, 441-451 [Непатентний документ 2] J.Med.Primatol.(2001) 40, 141-147 [Непатентний документ 3] Cancer Immunol.Immunother. 2006 May; 55(5), 503-14 [Непатентний документ 4] Hum.Exp.Toxicol. (2000) 19, 230-243. Суть винаходу Проблеми, які слід розв'язати за допомогою винаходу Цей винахід стосується антитіл проти епірегуліну, які демонструють міжвидову реактивність між тваринами, які не є людьми, та людьми. Цей винахід далі стосується антитіл проти епірегуліну з пригніченим хімічним розпадом. Цей винахід також стосується антитіл проти епірегуліну зі зниженою ізоелектричною точкою. Крім того, цей винахід стосується антитіл проти епірегуліну зі зниженою кількістю агрегату. Крім того, цей винахід стосується фармацевтичних композицій або терапевтичних агентів для лікування раку, які включають вищезгадані антитіла проти епірегуліну. Цей винахід також стосується способів отримання вищезгаданих антитіл проти епірегуліну. Засоби для розв'язання проблем Автори цього винаходу визначили, що відношення зв'язувальної активності з епірегуліном, виділеним з яванських макак, до зв'язувальної активності з епірегуліном людини зростає внаслідок заміщення залишком аргініну амінокислотного залишку у послідовності варіабельної ділянки гуманізованого антитіла ЕР27, яке інгібує зростання ракових клітин, демонструючи цитотоксичну активність та нейтралізуючу активність проти ракових клітин, які експресують епірегулін людини. Більш специфічно, автори цього винаходу побудували антитіла проти епірегуліну, які демонструють міжвидову реактивність між людьми та яванськими макаками, які не є тваринами-людьми. Крім того, антитіла проти епірегуліну з пригніченим хімічним розпадом було побудовано шляхом відповідного заміщення амінокислотних залишків у послідовності варіабельної ділянки гуманізованого антитіла ЕР27. На додаток до цього, антитіла проти епірегуліну зі зниженою ізоелектричною точкою будо побудовано шляхом відповідного заміщення амінокислотних залишків у послідовності варіабельної ділянки гуманізованого антитіла ЕР27. Антитіла проти епірегуліну зі зниженою кількістю агрегату було побудовано шляхом відповідного заміщення амінокислотних залишків у послідовності варіабельної ділянки гуманізованого антитіла ЕР27. Автори цього винаходу виявили, що антитіла проти епірегуліну, які мають ці властивості, демонструють ефекти інгібування росту внаслідок нейтралізуючої активності та цитотоксичної активності на ракових клітинних лініях. Крім того, на підставі вищезгаданих результатів автори цього винаходу визначили, що антитіла проти епірегуліну є ефективними для лікування різних первинних та метастатичних видів раку, що, у свою чергу, свідчить про виконання цього винаходу. Більш специфічно, цей винахід стосується наступного: [1] антитіло проти епірегуліну, яке є антитілом, що зв'язується з епітопом, який зв'язується з 3 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитілом проти епірегуліну, яке включає гіперваріабельні ділянки (CDR) варіабельної ділянки важкого ланцюга за SEQ ID NO: 9, 10 та 11 та гіперваріабельні ділянки (CDR) варіабельної ділянки легкого ланцюга за SEQ ID NO: 12, 13 та 14, де антитіло характеризується тим, що воно має менше відношення значення KD для епірегуліну мавп за SEQ ID NO: 170 (cEREG KD) до значення KD для епірегуліну людини за SEQ ID NO: 34 (hEREG KD) (cEREG KD/hEREG KD) порівняно з відношенням cEREG KD/hEREG KD антитіла проти епірегуліну, яке включає гіперваріабельні ділянки (CDR) варіабельної ділянки важкого ланцюга за SEQ ID NO: 9, 10 та 11 та гіперваріабельні ділянки (CDR) варіабельної ділянки легкого ланцюга за SEQ ID NO: 12, 13 та 14; [2] антитіло за [1], де cEREG KD/hEREG KD становить менш ніж 40; [3] антитіло за [1], де cEREG KD/hEREG KD становить менш ніж 10; [4] антитіло за [1], де cEREG KD/hEREG KD становить менш ніж 6; [5] антитіло за [1], де cEREG KD/hEREG KD становить менш ніж 4; [6] антитіло за будь-яким одним від [1] до [5], яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає CDR1 важкого ланцюга за SEQ ID NO: 9, CDR2 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 та 100, та CDR3 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110 та 11; та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка включає CDR1 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 163, 68, 67 та 12, CDR2 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 71, 69 та 13, та CDR3 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 164, 48, 47 та 14; [7] антитіло за будь-яким одним від [1] до [5], яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116 та 115, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57 та 29; [8] антитіло проти епірегуліну, вибране з переліченого нижче: (1) антитіло проти епірегуліну, яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49 та 38; (2) антитіло проти епірегуліну, яке включає варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57 та 29; та (3) антитіло проти епірегуліну, яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49 та 38, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57 та 29; [9] антитіло за будь-яким одним від [6] до [8], яке включає константну ділянку важкого ланцюга за SEQ ID NO: 26; [10] антитіло за будь-яким одним від [6] до [9], яке включає константну ділянку легкого ланцюга за SEQ ID NO: 27; [11] антитіло за будь-яким одним від [1] до [10], яке має нейтралізуючу активність; [12] антитіло за будь-яким одним від [1] до [11], яке має цитотоксичність; [13] антитіло за [12], де цитотоксичність – це CDC та/або ADCC; [14] антитіло за будь-яким одним від [1] до [12], де інгібітор росту або цитотоксична речовина зв'язані з антитілом; [15] антитіло за [14], де антитіло – це низькомолекулярне антитіло; [16] антитіло за будь-яким одним від [12] до [15], де константна ділянка важкого ланцюга за SEQ ID NO: 26 включає принаймні одне заміщення амінокислоти на позиції, вибраній з групи, що складається з: 230, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 273, 275, 299, 302, 313, 323, 325, 328 та 332, згідно з нумерацією EU; [17] вектор, який включає полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає CDR1 важкого ланцюга за SEQ ID NO: 9, CDR2 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 та 100, та CDR3 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110 та 11; [18] вектор за [17], який включає полінуклеотид, що кодує константну ділянку важкого 4 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ланцюга за SEQ ID NO: 26; [19] вектор, який включає полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка включає CDR1 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 163, 68, 67 та 12, CDR2 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 71, 69 та 13, та CDR3 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 164, 48, 47 та 14; [20] вектор за [19], який включає полінуклеотид, що кодує константну ділянку легкого ланцюга за SEQ ID NO: 27; [21] вектор, який включає: (1) полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає CDR1 важкого ланцюга за SEQ ID NO: 9, CDR2 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 та 100, та CDR3 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110 та 11; та (2) полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає CDR1 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 163, 68, 67 та 12, CDR2 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 71, 69 та 13, та CDR3 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 164, 48, 47 та 14; [22] вектор, який включає: (1) полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає CDR1 важкого ланцюга за SEQ ID NO: 9, CDR2 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 та 100, та CDR3 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110 та 11, та полінуклеотид, що кодує константну ділянку важкого ланцюга за SEQ ID NO: 26; та (2) полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка включає CDR1 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 163, 68, 67 та 12, CDR2 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 71, 69 та 13, та CDR3 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 164, 48, 47 та 14, та полінуклеотид, що кодує константну ділянку легкого ланцюга за SEQ ID NO: 27; [23] вектор, який включає полінуклеотид за [18] або [22], який включає мутований нуклеотид, який кодує константну ділянку важкого ланцюга з принаймні одним заміщенням амінокислоти на позиції, вибраній з групи, що складається з 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 та 440, згідно з нумерацією EU, у константній ділянці важкого ланцюга за SEQ ID NO: 26; [24] клітина-хазяїн, яка включає вектори за [17] та [19], вектори за [18] та [20] або вектор за [21] або [22]; [25] клітина-хазяїн, яка включає вектор за [23]; [26] клітина-хазяїн за [25], де спроможність додавати фукозу до цукрового ланцюга у клітиніхазяїні є низькою; [27] клітина-хазяїн за [26], де клітина-хазяїн з низькою спроможністю додавати фукозу до цукрового ланцюга – це клітина-хазяїн з дефіцитом одного або більше функціональних білків, вибраних з групи, що складається з фукозилтрансферази, транспортера фукози, GMD (GDPманоза-4,6-дегідратази), Fx(GDP-кето-6-дезоксиманоза-3,5-епімераза, 4-редуктази) та GFPP (GDP-β-L-фукоза пірофосфорилази); [28] клітина-хазяїн за [25], де клітина-хазяїн має спроможність утворювати розподільну пополам структуру N-ацетилглюкозаміну на цукровому ланцюзі; [29] клітина-хазяїн за [28], де клітина-хазяїн, яка має спроможність утворювати розподільну пополам структуру N-ацетилглюкозаміну на цукровому ланцюзі, - це клітина-хазяїн, яка має активність β(1,4)-галактозилтрансферази та включає вектор, який включає полінуклеотид, що кодує функціональний домен локалізації Гольджі Гольджі-резидентного поліпептиду; [30] клітина-хазяїн за [29], яка включає вектор, який включає полінуклеотид, що кодує функціональний домен локалізації Гольджі, вибраний з групи, що складається з домену локалізації манозидази ІІ, домену локалізації β(1,2)-N-ацетилглюкозамінілтрансферази І, домену локалізації β(1,2)-N-ацетилглюкозамінілтрансферази ІІ, домену локалізації манозидази І та домену локалізації α1-6 стрижневої фукозилтрансферази; та полінуклеотид, що кодує злитий поліпептид, який включає каталітичний домен β(1,4)-галактозилтрансферази; 5 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [31] клітина-хазяїн за будь-яким одним від [24] до [30], де клітина-хазяїн вибрана з групи, що складається з клітини СНО, клітини ВНК, клітини NS0, клітини SP2/0, мієломної клітини YO, мієломної клітини миші P3 × 63, клітини PER, клітини PER.C6, клітини НЕК293 та клітини гібридоми; [32] спосіб отримання антитіла за будь-яким одним від [1] до [16], який включає узяття клітини-хазяїна за будь-яким одним від [24] до [31] з культурального розчину; [33] антитіло, отримане за способом за [32]; [34] антитіло за [33], де агент інгібування росту або цитотоксична речовина зв'язані з антитілом; [35] фармацевтична композиція, яка включає антитіло за будь-яким одним від [1] до [16], або за [33], або за [34] як активний інгредієнт; [36] терапевтичний агент для лікування раку або агент для пригнічення рецидиву раку або метастазу, який включає антитіло за будь-яким одним від [1] до [16], або за [33], або за [34] як активний інгредієнт; [37] терапевтичний агент для лікування раку або агент для пригнічення рецидиву раку або метастазу за [36], де рак – це будь-який вид раку, вибраний з групи, яка складається з раку товстої кишки, аденокарциноми легеня, раку підшлункової залози, раку шлунка та раку нирки; [38] терапевтичний агент для лікування раку або агент для пригнічення рецидиву раку або метастазу за [37], де рак товстої кишки – це слабо диференційований рак товстої кишки, середньо диференційований рак товстої кишки або добре диференційований рак товстої кишки; та [39] терапевтичний агент для лікування раку або агент для пригнічення рецидиву раку або метастазу за будь-яким одним від [36] до [38], де суб'єкт, якому вводиться терапевтичний агент для лікування раку, - це суб'єкт, який є носієм ракових клітин, які експресують білок епірегуліну та які виявлено у виділеному тканинному зразку. Цей винахід також стосується способів пригнічення проліферації клітин, способів профілактики або лікування раку та способів пригнічення рецидиву або метастазу раку, при цьому вони включають етап введення суб'єктові антитіла цього винаходу або антитіла, отриманого згідно зі способом виготовлення цього винаходу. Крім того, цей винахід стосується застосування антитіла цього винаходу або антитіла, отриманого за способом виготовлення цього винаходу, у виробництві агентів для інгібування проліферації клітин, агентів для профілактики або лікування раку або агентів для пригнічення рецидиву або метастазу раку. Цей винахід також стосується антитіл цього винаходу або антитіл, отриманих за способом виробництва цього винаходу, для застосування під час пригнічення проліферації клітин, профілактики або лікування раку, пригнічення рецидиву або метастазу раку. Крім того, цей винахід стосується способів отримання агентів для інгібування проліферації клітин, агентів для профілактики або лікування раку або агентів для пригнічення рецидиву або метастазу раку, при цьому вони включають етап використання антитіла цього винаходу або антитіла, отриманого за способом виробництва цього винаходу. Стислий опис ілюстративного матеріалу Фігура 1 демонструє графік, на якому зображено відношення афінності кожного антитіла до епірегуліну людини (значення KD кожного антитіла / значення KD химерного антитіла ЕР27). Незважаючи на те, що умовне позначення назви антитіла описується тільки назвою варіабельної ділянки, фігура зображує результати тесту антитіл, які містять константні ділянки G1d важкого ланцюга та каппа легкого ланцюга. Фігура 2 демонструє графік, на якому зображено відношення афінності кожного з антитіл (значення KD для епірегуліну мавпи / значення KD епірегуліну людини). Незважаючи на те, що умовне позначення назви антитіла описується тільки назвою варіабельної ділянки, фігура зображує результати тесту антитіл, які містять константні ділянки G1d важкого ланцюга та каппа легкого ланцюга. Фігура 3 демонструє графік, на якому зображено відношення афінності кожного антитіла до епірегуліну людини (значення KD кожного антитіла / значення KD химерного антитіла ЕР27). Фігура 4 демонструє графік, на якому зображено відношення афінності кожного з антитіл (значення KD для епірегуліну мавпи / значення KD епірегуліну людини). Фігура 5 демонструє графік, на якому зображено активність ADCC кожного антитіла (специфічна швидкість вивільнення кальцеїну АМ (Calcein-AM)). Фігура 6 демонструє графік, на якому зображено нейтралізуючу активність кожного антитіла у термінах швидкості інгібування проліферації клітин BAF_EGFR, залежної від епірегуліну людини. Фігура 7 демонструє графік, на якому зображено нейтралізуючу активність кожного антитіла 6 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у термінах швидкості інгібування проліферації клітин BAF_EGFR, залежної від епірегуліну мавпи. Фігура 8 демонструє графік, на якому зображено активність кожного антитіла щодо пригнічення in vivo росту пухлини людини у термінах протипухлинної активності на мишачих моделях, яким трансплантували ракові клітини людини. Фігура 9 – це зображення, яке демонструє електрофоретичні картини епірегуліну людини (hsEREG-His) та епірегуліну мавпи (cysEREG-His). Фігура 10 демонструє результати флуоресцентного забарвлення клітин, кожна з яких експресує різні кількості білка епірегуліну, імуногістологічного забарвлення мишей, яким трансплантували ці клітини. Фігура 11 демонструє графік, на якому зображено активність ADCC проти клітин, кожна з яких експресує різні кількості білка епірегуліну. Фігура 12 демонструє графік, на якому зображено активність інгібування росту пухлини людини in vivo у термінах протипухлинної активності на мишачих моделях, яким трансплантували клітини, кожна з яких експресує різні кількості білка епірегуліну. Фігура 13 представляє фотографії, на яких зображено експресію епірегуліну у клінічних випадках слабо диференційованого раку товстої кишки. Фігура 14 демонструє діаграму, на якій зображено ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 Glycomab проти онкогенезу стовбурових клітин раку товстої кишки PLR123, та яка демонструє ефективність ліків проти метастазу раку товстої кишки. Фігура 15 демонструє діаграму, на якій зображено ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 Glycomab проти легеневого метастазу стовбурових клітин раку товстої кишки PLR123, та яка демонструє ефективність ліків проти метастазу стовбурових клітин раку товстої кишки. Фігура 16 демонструє графік, на якому зображено ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 Glycomab проти слабо диференційованого раку товстої кишки із застосуванням моделі слабо диференційованого раку товстої кишки COL-53-JCK. Фігура 17 демонструє графік, на якому зображено ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 Glycomab проти середньо диференційованого раку товстої кишки із застосуванням моделі середньо диференційованого раку товстої кишки PLR379. Фігура 18 демонструє фотографії, на яких зображено експресію епірегуліну у клінічних випадках аденокарциноми легеня. Фігура 19 демонструє графік, на якому зображено активність ADCC (специфічна швидкість вивільнення кальцеїну АМ (Calcein-AM)) гуманізованого антитіла ЕР27 Glycomab проти клітинної лінії аденокарциноми легеня людини Calu-3. Фігура 20 демонструє графік, на якому зображено ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 Glycomab проти аденокарциноми легеня із застосуванням моделі аденокарциноми легеня Calu-3. Фігура 21 демонструє, що кон'югат антитіло-ліки, який включає гуманізоване антитіло ЕР27 Glycomab, засвоюється у клітинах клітинної лінії DLD-1, які експресують епірегулін, та спричиняє руйнування клітин проти клітинної лінії DLD-1. Варіант здійснення винаходу Цей винахід стосується антитіл проти епірегуліну, які демонструють міжвидову реактивність між тваринами, які не є людьми, та людьми. Цей винахід далі стосується антитіл проти епірегуліну з пригніченим хімічним розпадом. Цей винахід також стосується антитіл проти епірегуліну зі зниженою ізоелектричною точкою. Крім того, цей винахід стосується антитіл проти епірегуліну зі зниженою кількістю агрегату. Крім того, цей винахід стосується фармацевтичних композицій або терапевтичних агентів для лікування раку, які включають вищезгадані антитіла проти епірегуліну. Цей винахід також стосується способів отримання вищезгаданих антитіл проти епірегуліну. Визначення та докладний опис нижче наведено з метою сприяти розумінню цього винаходу, проілюстрованого у цьому описі. Визначення Амінокислоти У цьому описі винаходу амінокислоти описуються одно- або трилітерними кодами, або обома способами, наприклад, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I або Val/V. Амінокислоти, які містяться в амінокислотних послідовностях цього винаходу, можуть зазнавати посттрансляційної модифікації (наприклад, модифікація N-кінцевого глютаміну в піроглютамінову кислоту шляхом піроглютамілування, що є добре відомим для фахівців у 7 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 галузі). Природно, що такі посттрансляційно модифіковані амінокислоти включено в амінокислотні послідовності цього винаходу. Антигени Антитіла, запропоновані цим винаходом, зв'язуються з епірегуліном, як з антигеном. Епірегулін – це мембраннозв'язаний білок епідермального фактору росту. Його амінокислотну послідовність розкрито у GenBank Accession Number NP_001423 (SEQ ID NO: 167). У цьому винаході визначення епірегуліну включає як білок повної довжини, так і його фрагменти. Термін "фрагменти" позначає поліпептиди, які включають будь-яку ділянку епірегуліну, та вони можуть не мати функції природного епірегуліну. Приклад фрагментів включає фрагмент, який включає зовнішньоклітинну ділянку епірегуліну. Позиції від 30 до 118 амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 167 відповідають зовнішньоклітинній ділянці епірегуліну. Позиції від 119 до 140 в амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 167 відповідають трансмембранній ділянці. У цьому описі винаходу епірегулін може бути позначеним як EREG, та ці терміни застосовуються як синоніми. Термін "епітоп" означає антигенну детермінанту в антигені та позначає ділянку антигену, з якою зв'язується антиген-зв'язувальний домен антитіла проти епірегуліну, описаного в цьому описі винаходу. Отже, наприклад, епітоп можна визначити згідно з його структурою. Альтернативно, епітоп можна визначити на підставі антиген-зв'язувальної активності антитіла проти епірегуліну, яке розпізнає цей епітоп. Коли антиген – це пептид або поліпептид, тоді епітоп можна визначити на основі амінокислотних залишків, що утворюють цей епітоп. Альтернативно, коли епітоп – це цукровий ланцюг, тоді цей епітоп можна визначити на підставі його специфічної структури цукрового ланцюга. Лінійний епітоп – це епітоп, первинна амінокислотна послідовність якого розпізнається так, як епітоп, що складається з ряду послідовних амінокислот у первинній амінокислотній послідовності. Такий лінійний епітоп зазвичай містить принаймні три та більш звичайно принаймні п'ять, наприклад, приблизно від 8 до 10 або від 6 до 20 амінокислот в його специфічній послідовності. На відміну від лінійного епітопу "конформаційний епітоп" - це епітоп, у якому первинна амінокислотна послідовність, що містить епітоп, не є тільки єдиною детермінантою епітопу, що розпізнається (наприклад, первинна амінокислотна послідовність конформаційного епітопу необов'язково розпізнається антитілом, яке визначає епітоп). Конформаційні епітопи можуть містити більшу кількість амінокислот порівняно з лінійними епітопами. Антитіло, що розпізнає конформаційний епітоп, розпізнає тривимірну структуру пептиду або білка. Наприклад, коли молекула білка згортається та утворює тривимірну структуру, тоді амінокислоти та/або головні ланцюги поліпептиду, які утворюють конформаційний епітоп, стають в рядок, та епітоп стає таким, що може розпізнаватися антитілом. Способи визначення конформацій епітопу включають, проте не обмежуються ними, наприклад, рентгенівську кристалографію, двовимірний ядерний магнітний резонанс, сайт-специфічне спін-мічення та електронний парамагнітний резонанс. Дивись, наприклад, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.). Зв'язувальна активність Приклади способу підтвердження зв'язування антитіла з епірегуліном або, більш специфічно, епітопом, присутнім у молекулі епірегуліну, наведено далі, проте спосіб не обмежується наступними способами, та будь-який фахівець у галузі може відповідним чином застосовувати відомі способи для вимірювання антиген-зв'язувальної активності антитіла. Наприклад, чи розпізнає антитіло проти епірегуліну лінійний епітоп у молекулі епірегуліну, можна підтвердити, наприклад, так, як згадується далі. Лінійний пептид, який включає амінокислотну послідовність, яка утворює зовнішньоклітинний домен епірегуліну, синтезують для здійснення вищезгаданої мети. Пептид можна синтезувати хімічними способами або отримати із застосуванням способів генної інженерії, застосовуючи ділянку, що кодує амінокислотну послідовність, яка відповідає зовнішньоклітинному домену у кДНК, яка кодує епірегулін (приклади включають CR541887 (SEQ ID NO: 169), та таку як послідовність кДНК та NM_001432, та таку як послідовність мРНК). Після цього антитіло проти епірегуліну оцінюють щодо його активності зв'язування з лінійним пептидом, який включає амінокислотну послідовність, яка утворює зовнішньоклітинний домен. Наприклад, іммобілізований лінійний пептид можна застосовувати як антиген при ЕЛАЙЗА, щоб оцінити активність зв'язування антитіла з пептидом. Альтернативно, активність зв'язування з лінійним пептидом можна оцінити на підставі рівня, на якому лінійний пептид інгібує зв'язування антитіла з клітинами, що експресують епірегулін. Ці тести можуть продемонструвати активність зв'язування антитіла з лінійним пептидом. 8 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Чи розпізнає антитіло проти епірегуліну конформаційний епітоп, можна визначити наступним способом. Для вищевказаної цілі готують клітини, що експресують епірегулін. Можна визначити, що антитіло проти епірегуліну розпізнає конформаційний епітоп, коли воно міцно зв'язується з клітинами, що експресують епірегулін, після контактування з ними, проте несуттєво зв'язується з іммобілізованим лінійним пептидом, який включає амінокислотну послідовність, яка утворює зовнішньоклітинний домен епірегуліну. У цьому описі винаходу вираз "несуттєво зв'язується" означає, що зв'язувальна активність становить 80 % або менше, зазвичай 50 % або менше, переважно 30 % або менше та особливо переважно 15 % або менше, порівняно з активністю зв'язування з клітинами, що експресують епірегулін людини. Способи визначення активності зв'язування антитіла проти епірегуліну з клітинами, що експресують епірегулін, включають, наприклад, способи, описані в "Antibodies: A Laboratory Manual" (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Специфічно, оцінку можна здійснювати на основі принципу ЕЛАЙЗА або сортування флюоресцентноактивованих клітин (FACS), застосовуючи при цьому клітини, що експресують епірегулін, як антиген. У форматі ЕЛАЙЗА активність зв'язування антитіла проти епірегуліну з клітинами, що експресують епірегулін, можна оцінити кількісно, порівнявши рівні сигналів, генерованих ферментативною реакцією. Специфічно, антитіло тесту додають до планшета ЕЛАЙЗА, на якому іммобілізовано клітини, що експресують епірегулін. Після цього антитіло тесту, зв'язане з клітинами, виявляють, застосовуючи мічене ферментом антитіло, яке розпізнає антитіло тесту. Альтернативно, коли застосовується FACS, тоді готують серію розведень антитіла тесту, та титр зв'язування антитіла для клітин, що експресують епірегулін, можна визначити, щоб порівняти активність зв'язування антитіла тесту з клітинами, що експресують епірегулін. Зв'язування антитіла тесту з антигеном, що експресується на поверхні клітин, суспендованих у буфері або йому подібному, можна визначити, застосовуючи проточний цитометр. Відомі проточні цитометри включають, наприклад, наступні пристрої: TM FACSCanto II TM FACSAria TM FACSArray TM FACSVantage SE TM FACSCalibur (усі є торговельними марками BD Biosciences) EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (усі є торговельними марками Beckman Coulter). Переважні способи оцінювання активності зв'язування антитіла проти епірегуліну з епірегуліном включають, наприклад, наступний спосіб. По-перше, клітини, що експресують епірегулін, вступають в реакцію з антитілом тесту, а потім їх забарвлюють FITC-міченим вторинним антитілом, яке розпізнає антитіло тесту. Антитіло проти епірегуліну тесту відповідним чином розводять придатним буфером, щоб отримати антитіло у бажаній концентрації. Наприклад, антитіло можна застосовувати у концентрації, яка становить діапазон від 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Після цього інтенсивність флюоресценції та кількість клітин визначають із застосуванням FACSCalibur (BD). Інтенсивність флюоресценції, визначена шляхом аналізу із застосуванням CELL QUEST Software (BD), тобто, середнє геометричне значення, відображає кількість антитіла, зв'язаного з клітинами. Тобто, зв'язувальну активність антитіла тесту, яке представлено кількістю зв'язаного антитіла тесту, можна визначити шляхом вимірювання середнього геометричного значення. Чи використовує антитіло проти епірегуліну такий самий епітоп, що й інше антитіло, можна визначити на основі конкурування між двома молекулами для одного й того ж епітопу. Конкурування між антитілами можна визначити, застосовуючи епітоп-перехресний конкурентний аналіз або йому подібне. Наприклад, конкурентний аналіз ЕЛАЙЗА є переважним епітопперехресним конкурентним аналізом. Специфічно, при епітоп-перехресному конкурентному аналізі білок епірегуліну, іммобілізований у комірках мікротитраційного планшета, заздалегідь інкубують у присутності або відсутності конкуруючого антитіла-кандидата, а потім до нього додають антитіло тесту. Кількість антитіла тесту, зв'язаного з білком епірегуліну у комірках, непрямо корелює зі зв'язувальною активністю конкуруючого антитіла-кандидата, яке конкурує за зв'язування з тим же епітопом. Тобто, чим вище афінність антитіла-конкурента для того ж самого епітопу, тим нижче активність зв'язування антитіла тесту з комірками, покритими білком епірегуліну. Кількість антитіл тесту, зв'язаних з комірками за допомогою білка епірегуліну, можна легко 9 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначити за допомогою мічення антитіла заздалегідь. Наприклад, мічене біотином антитіло вимірюється за допомогою кон'югату авідину/пероксидази та відповідного субстрату. Зокрема, епітоп-перехресний конкурентний аналіз, при якому застосовуються ферментні мітки, такі як пероксидаза, називається "конкурентним аналізом ЕЛАЙЗА". Антитіло можна також мітити іншими речовинами мічення, які сприяють виявленню або вимірюванню. Специфічно, відомими є радіоактивні мітки, флуоресцентні мітки тощо. Коли конкуруюче антитіло-кандидат може блокувати зв'язування антитіла з епірегуліном принаймні на 20 %, переважно принаймні на 20 – 50 % та більш переважно принаймні на 50 % порівняно зі зв'язувальною активністю у контрольному експерименті, який здійснюється у відсутності антитіла-конкурента, тоді визначають, що антитіло тесту суттєво зв'язується з тим самим епітопом, зв'язаним з антитілом-конкурентом, або конкурує за зв'язування з тим самим епітопом. Коли структуру епітопу, зв'язаного з антитілом проти епірегуліну, вже визначили, тоді можна визначити, чи ділять між собою антитіло тесту та контрольне антитіло спільний епітоп, шляхом порівняння активності зв'язування двох антитіл з пептидом, отриманим шляхом введення амінокислотних мутацій у пептид, який утворює епітоп. Для того, щоб вимірити вищезгадану активність зв'язування, наприклад, активність зв'язування антитіла тесту та контрольного антитіла з лінійним пептидом, у який вводиться мутація, порівнюють у вищезгаданому форматі ЕЛАЙЗА. Окрім способів ЕЛАЙЗА активність зв'язування з мутантним пептидом, зв'язаним з колонкою, можна визначити за допомогою гідродинамічного дослідження та контрольних антитіл у колонці, а потім здійснити кількісну оцінку антитіла, елюйованого у розчин елюювання. Відомі способи адсорбції мутантного пептиду до колонки, наприклад, у формі злитого пептиду GST. Альтернативно, коли ідентифікований епітоп – це конформаційний епітоп, тоді наступним способом можна визначити, чи ділять між собою тестове антитіло та контрольне антитіло спільний епітоп. По-перше, отримують клітини, що експресують епірегулін, та клітини, що експресують епірегулін з мутацією, введеною в епітоп. Антитіло тесту та контрольне антитіло додають до клітинної суспензії, отриманої внаслідок суспендування цих клітин у відповідному буфері, такому як PBS (фосфатно-сольовий буфер). Після цього клітинні суспензії відповідним чином промивають буфером, та до них додають FITC-мічене антитіло, яке розпізнає антитіло тесту та контрольне антитіло. Інтенсивність флюоресценції та кількість клітин, забарвлених міченим антитілом, визначають із застосуванням FACSCalibur (BD). Антитіло тесту та контрольне антитіло відповідним чином розводять із застосуванням придатного буферу та їх застосовують при бажаній концентрації. Наприклад, їх можна застосовувати у концентрації, яка становить діапазон від 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Інтенсивність флюоресценції, визначена шляхом аналізу із застосуванням CELL QUEST Software (BD), тобто середнього геометричного значення, відображає кількість міченого антитіла, зв'язаного з клітинами. Тобто, зв'язувальну активність антитіла тесту та контрольного антитіла, яка представлена кількістю міченого антитіла, яке є зв'язаним, можна визначити шляхом вимірювання середнього геометричного значення. У вищеописаному способі можна визначити, наприклад, наступним способом, чи антитіло "не зв'язується суттєво з клітинами, що експресують мутантний епірегулін". По-перше, антитіло тесту та контрольне антитіло, зв'язані з клітинами, що експресують мутантний епірегулін, забарвлюють міченим антитілом. Після цього визначають інтенсивність флюоресценції клітин. Коли FACSCalibur застосовується для виявлення флюоресценції шляхом проточної цитометрії, тоді можна проаналізувати визначену інтенсивність флюоресценції, застосовуючи CELL QUEST Software. З середніх геометричних значень у присутності та відсутності антитіла значення порівняння (ΔGeo-Mean) можна розрахувати згідно з наступною формулою (Формула 1), щоб визначити коефіцієнт підвищення інтенсивності флюоресценції, як результат зв'язування антитілом. Формула 1 ΔGeo-Mean=Geo-Mean (у присутності антитіла)/Geo-Mean (у відсутності антитіла), де GeoMean означає середнє геометричне. Значення порівняння середніх геометричних значень (значення ΔGeo-Mean для молекули мутантного епірегуліну), яке визначено завдяки вищеописаному аналізу та яке відображає кількість антитіла тесту, зв'язаного з клітинами, що експресують мутантний епірегулін, порівнюється зі значенням порівняння ΔGeo-Mean, яке відображає кількість антитіла тесту, зв'язаного з клітинами, що експресують епірегулін. У цьому випадку концентрації антитіла тесту, яке застосовується для визначення значень порівняння ΔGeo-Mean для клітин, що експресують епірегулін, та клітин, що експресують мутантний епірегулін, особливо переважно регулюються 10 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 так, щоб вони були рівними або по суті рівними. Антитіло, про яке підтверджено, що воно розпізнає єпітоп в епірегуліні, застосовується як контрольне антитіло. Якщо значення порівняння ΔGeo-Mean антитіла тесту для клітин, що експресують мутантний епірегулін, є меншим ніж значення порівняння ΔGeo-Mean антитіла тесту для клітин, що експресують епірегулін, на принаймні 80 %, переважно 50 %, більш переважно 30 % та особливо переважно 15 %, тоді антитіло тесту "суттєво не зв'язується з клітинами, що експресують мутантний епірегулін". Формулу для визначення Geo-Mean (середнього геометричного) значення описано в інструкції користувача CELL QUEST Software (BD biosciences). Коли порівняння показує, що значення порівняння є по суті еквівалентними, тоді можна визначити, що епітоп для тестового та контрольного антитіл проти епірегуліну є одним і тим самим. Антитіла У цьому описі винаходу термін "антитіло" означає природний імуноглобулін або імуноглобулін, отриманий внаслідок часткового або повного синтезу. Антитіла можна виділити з природних джерел, таких як природно-виникаючі плазма та сироватка, або з культуральних надосадових рідин гібридом, що виробляють антитіло. Альтернативно, антитіла можна частково або повністю синтезувати, застосовуючи способи, такі як генетична рекомбінація. Переважні антитіла включають, наприклад, антитіла ізотипу імуноглобуліну або підкласу, що належить до нього. Відомі імуноглобуліни людини включають антитіла наступних дев'яти класів (ізотипів): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE та IgM. З цих ізотипів антитіла цього винаходу включають IgG1, IgG2, IgG3 та IgG4. Способи отримання антитіла з бажаною зв'язувальною активністю є відомими для фахівців у галузі. Нижче наведено необмежувальний приклад, який описує спосіб отримання антитіла, яке зв'язується з епірегуліном (антитіло проти епірегуліну). Антитіла проти епірегуліну можна отримати як поліклональні або моноклональні антитіла, застосовуючи відомі способи. Антитіла проти епірегуліну, які переважно отримують, - це моноклональні антитіла, що походять від ссавців. Такі похідні від ссавців моноклональні антитіла включають антитіла, отримані завдяки гібридомам або клітинам-хазяїнам, трансформованим вектором експресії, який є носієм гена антитіла, за допомогою способів генної інженерії. "Гуманізовані антитіла" або "химерні антитіла" включено до моноклональних антитіл цього винаходу. Гібридоми, що виробляють моноклональні антитіла, можна отримати, застосовуючи відомі способи, наприклад так, як описано далі. Специфічно, ссавців імунізують традиційними способами імунізації, застосовуючи білок епірегулін як сенсибілізуючий антиген. Отримані імунні клітини зливають з відомими батьківськими клітинами, застосовуючи традиційні способи злиття клітин. Після цього гібридоми, які виробляють антитіло проти епірегуліну, можна вибрати шляхом скринінгу з метою виявлення моноклональних клітин, які виробляють антитіло, яке зв'язується з епітопом у молекулі епірегуліну, застосовуючи при цьому традиційні способи скринінгу. Специфічно, моноклональні антитіла отримують так, як описано далі. По-перше, ген епірегуліну людини, нуклеотидна послідовність якого розкрита у SEQ ID NO: 169, можна експресувати, щоб отримати білок епірегуліну людини, зображений у SEQ ID NO: 167, який буде застосовуватися як сенсибілізуючий антиген для отримання антитіла. Тобто, послідовність гена, яка кодує епірегулін людини, вставляється у відомий вектор експресії, та відповідні клітинихазяїни трансформуються цим вектором. Бажаний білок епірегуліну людини очищують від клітин-хазяїнів відомими способами. Для того, щоб отримати розчинний епірегулін людини з культуральних надосадових рідин, наприклад, поліпептид, що включає амінокислоти на позиціях від 30 до 118 у поліпептидній послідовності епірегуліну людини SEQ ID NO: 167, або білок, включений в амінокислоти на позиціях від 30 до 108, показаний як SEQ ID NO: 34. Очищений природний білок епірегуліну людини можна також застосовувати як сенсибілізуючий антиген. Очищений білок епірегуліну можна застосовувати як сенсибілізуючий антиген для імунізації ссавців. Частковий пептид епірегуліну можна також застосовувати як сенсибілізуючий антиген. У цьому випадку частковий пептид можна отримати за допомогою хімічного синтезу на основі амінокислотної послідовності епірегуліну людини або шляхом вставлення часткового гена епірегуліну людини у вектор експресії для експресії. Альтернативно, частковий пептид можна отримати внаслідок деградації білка епірегуліну людини протеазою. Довжина та ділянка часткового пептиду епірегуліну людини не обмежується особливими варіантами здійснення. Переважну ділянку можна довільно вибрати з амінокислотної послідовності на амінокислотних позиціях від 30 до 118 або на позиціях від 30 до 108 в амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 11 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 167. Кількість амінокислот, які утворюють пептид, який слід застосовувати як сенсибілізуючий антиген, переважно становить принаймні 5 або більше, наприклад, 6 або більше, або 7 або більше. Більш специфічно, як сенсибілізуючий антиген можна застосовувати пептид з 8 – 50 залишків, більш переважно з 10 – 30 залишків. Для сенсибілізуючого антигену альтернативно можна застосовувати злитий білок, отриманий внаслідок злиття бажаного часткового поліпептиду або пептиду білка епірегуліну з іншим поліпептидом. Наприклад, фрагменти антитіла Fc та пептидні мітки переважно застосовують, щоб отримати злиті білки, які будуть застосовуватися як сенсибілізуючі антигени. Вектори для експресії таких злитих білків можна побудувати внаслідок злиття генів рамки, які кодують два або більше бажаних поліпептидних фрагментів, або внаслідок вставлення злитого гена у вектор експресії, як описано вище. Способи отримання злитих білків описано у Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Способи отримання епірегуліну, який слід застосовувати як сенсибілізуючий антиген, та способи імунізації із застосуванням епірегуліну специфічно описано у WO 2008/047723 тощо. Не існує особливого обмеження щодо ссавців, яких слід імунізувати сенсибілізуючим антигеном. Проте, бажано вибирати ссавців з урахуванням їх сумісності з батьківськими клітинами, які слід застосовувати для злиття клітин. Зазвичай, переважно застосовують гризунів, таких як миші, щури та хом'ячки, кролів та мавп. Вищезгаданих тварин імунізують сенсибілізуючим антигеном за відомими способами. Способи імунізації, які зазвичай виконуються, включають, наприклад, внутрішньочеревну або підшкірну ін'єкцію сенсибілізуючого антигену ссавцям. Специфічно, сенсибілізуючий антиген відповідним чином розводиться PBS (фосфатно-сольовим буфером), фізіологічним сольовим розчином або їм подібним. Якщо бажано, то традиційний ад'ювант, такий як повний ад'ювант Фрейнда, змішують з антигеном, та суміш емульгують. Після цього сенсибілізуючий антиген вводять ссавцеві декілька разів з інтервалами від 4 до 21 дня. Відповідні носії можна застосовувати при імунізації сенсибілізуючим антигеном. Зокрема, коли низькомолекулярний частковий пептид застосовується як сенсибілізуючий антиген, тоді для імунізації іноді є бажаним зчепити пептид сенсибілізуючого антигену з білком носія, таким як альбумін або гемоціанін лімфи равлика. Альтернативно, гібридоми, які виробляють бажане антитіло, можна отримати, застосовуючи ДНК-імунізацію, як згадується далі. ДНК-імунізація – це спосіб імунізації, який сприяє імуностимуляції внаслідок експресії сенсибілізуючого антигену у тварині, імунізованій внаслідок введення ДНК вектора, побудованої для того, щоб дозволити експресію гена, що кодує білок антигену, у тварині. На відміну від традиційних способів імунізації, при яких антиген білка вводиться тваринам, які підлягають імунізації, очікують, що ДНК-імунізація буде мати переваги у наступному: імуностимуляцію можна здійснити, зберігаючи при цьому структуру мембранного білка, такого як епірегулін; та немає необхідності в очищенні антигену для імунізації. Для того, щоб отримати моноклональне антитіло цього винаходу із застосуванням ДНКімунізації, по-перше, ДНК, що експресує білок епірегуліну, вводять тварині, яка підлягає імунізації. ДНК, що кодує епірегулін, можна синтезувати за відомими способами, такими як ПЛР. Отриману ДНК вставляють у відповідний вектор експресії, а потім цей вектор вводять тварині, яка підлягає імунізації. Вектори експресії, які переважно застосовуються, включають, наприклад, комерційно доступні вектори експресії, такі як pcDNA3.1. Вектори можна вводити в організм, застосовуючи традиційні способи. Наприклад, ДНК-імунізацію виконують, застосовуючи генну гармату, щоб ввести частинки золота, покриті вектором експресії, в клітини у тілі тварини, що підлягає імунізації. Антитіла, що розпізнавали епірегулін, можна також отримати за способами, описаними в WO 2003/104453. Після імунізації ссавця описаним вище способом підвищення титру антитіла, що зв'язується з епірегуліном, підтверджується у сироватці. Після цього імунні клітини беруть у ссавця, а потім піддають їх клітинному злиттю. Зокрема, як імунні клітини переважно застосовують спленоцити. Клітину мієломи ссавців застосовують як клітину, яку слід злити з вищезгаданими імунними клітинами. Клітини мієломи переважно включають придатний маркер відбору для скринінгу. Маркер відбору надає клітинам характеристики для їх виживання (або загибелі) при специфічних умовах у культурі. Як маркери відбору відомими є дефіцит гіпоксантин-гуанін фосфорибозилтрансферази (далі скорочується як дефіцит HGPRT) та дефіцит тимідинкінази (далі скорочується як дефіцит ТК). Клітини з дефіцитом HGPRT або ТК мають чутливість до гіпоксантин-аміноптерин-тимідину (далі скорочується як чутливість НАТ). НАТ-чутливі клітини не 12 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть синтезувати ДНК у середовищі відбору НАТ, та, як наслідок, вони гинуть. Проте, коли клітини зливаються зі здоровими клітинами, тоді вони можуть продовжити синтез ДНК, застосовуючи реутилізаційний шлях здорових клітин, та внаслідок цього вони можуть зростати навіть у середовищі відбору НАТ. Клітини з дефіцитом HGPRT та ТК можна вибирати у середовищі, що містить 6-тіогуанін, 8азагуанін (далі скорочується як 8AG) або 5’-бромдезоксиуридин, відповідно. Здорові клітини гинуть, оскільки вони залучають ці аналоги піримідину в свої ДНК. Між тим, клітини, які мають дефіцит цих ферментів, можуть вижити у середовищі відбору, оскільки вони не можуть залучати ці аналоги піримідину. Крім того, маркер відбору, який позначається як резистентність до G418 та який є наслідком гена резистентності до неоміцину, надає резистентності до 2дезоксистрептамінових антибіотиків (аналоги гентаміцину). Відомі різні типи клітин мієломи, які є придатними для злиття клітин. Наприклад, можна переважно застосовувати клітини мієломи, які включають наступні клітини: P3(P3 × 63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550); P3 × 63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7); NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519); MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415); SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270); FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21); S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323); R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133) тощо. Злиття клітин між імуноцитами та клітинами мієломи переважно здійснюється за допомогою відомих способів, наприклад, за допомогою способу Kohler and Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46). Більш специфічно, злиття клітин можна виконувати, наприклад, у традиційному культуральному середовищі у присутності агента, який сприяє злиттю клітин. Агенти, що сприяють злиттю клітин, включають, наприклад, поліетиленгліколь (ПЕГ) та вірус Сендай (HVJ). Якщо необхідно, допоміжну речовину, таку як диметилсульфоксид, також додають, щоб покращити ефективність злиття. Відношення імунних клітин до клітин мієломи можна визначити на свій власний розсуд, переважно, наприклад, одна клітина мієломи на кожен від одного до десяти імуноцитів. Культуральні середовища, які слід застосовувати для злиття клітин, включають, наприклад, середовища, які є придатними для росту клітинних ліній мієломи, такі як середовище RPMI1640 та середовище МЕМ, та інше традиційне культуральне середовище, яке застосовується для цього типу клітинної культури. Крім того, до культурального середовища можна переважно додавати інші конглютиніни сироватки, такі як фетальна теляча сироватка (FCS). Для злиття клітин попередньо визначені кількості вищезгаданих імунних клітин та клітин мієломи змішуються належним чином у вищезгаданому культуральному середовищі. Після цього розчин ПЕГ (наприклад, середня молекулярна маса становить приблизно від 1000 до 6000), попередньо нагрітий до приблизно 37 °C, додають до середовища у концентрації зазвичай від 30 % до 60 % (маси/об'єму). Все це обережно змішують, щоб отримати бажані злиті клітини (гібридоми). Після цього відповідне культуральне середовище, згаданевище, поступово додають до клітин та отриману суміш неодноразово центрифугують, щоб видалити надосадову рідину. Таким чином можна видалити агенти злиття клітин та агенти, які не є бажаними для росту гібридом. Отримані таким чином гібридоми можна відібрати шляхом культивування, застосовуючи традиційне середовище відбору, наприклад, середовище НАТ (культуральне середовище, що містить гіпоксантин, аміноптерин та тимідин). Клітини, відмінні від бажаних гібридом (незлиті клітини), можна вбити, продовжуючи культивування у вищезгаданому середовищі НАТ протягом достатнього періоду часу. Зазвичай, цей період становить від декількох днів до декількох тижнів. Після цього гібридоми, що виробляють бажане антитіло, піддають скринінгу та поодинці клонують за традиційними способами граничного розведення. Отримані таким чином гібридоми можна відібрати, застосовуючи середовище відбору на основі маркера відбору, який має мієлома, яка застосовується у злитті клітин. Наприклад, клітини з дефіцитом HGPRT або ТК можна відібрати шляхом культивування, застосовуючи середовище НАТ (культуральне середовище, що містить гіпоксантин, аміноптерин та тимідин). Специфічно, коли НАТ-чутливі клітини мієломи застосовуються для злиття клітин, тоді клітини, які успішно злилися зі здоровими клітинами, можуть вибірково проліферуватися у середовищі НАТ. Клітини, відмінні від бажаних гібридом (незлиті клітини) можна вбити, продовжуючи 13 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 культивування у вищезгаданому середовищі НАТ протягом достатнього періоду часу. Специфічно, бажані гібридоми можна відбирати шляхом культивування зазвичай протягом періоду від декількох днів до декількох тижнів. Після цього гібридоми, що виробляють бажане антитіло, піддають скринінгу та поодинці клонують традиційними способами граничного розведення. Бажані антитіла можна переважно відбирати та поодинці клонувати за способами скринінгу на основі відомої реакції антиген-антитіло. Наприклад, моноклональне антитіло, що зв'язує епірегулін, може зв'язуватися з епірегуліном, який експресується на клітинній поверхні. Таке моноклональне антитіло можна піддати скринінгу шляхом сортування флюоресцентноактивованих клітин (FACS). FACS – це система, яка оцінює зв'язування антитіла з клітинною поверхнею, аналізуючи клітини, які контактували з флуоресцентним антитілом, за допомогою лазерного променя та вимірюючи флюоресценцію, яка випромінюється з окремих клітин. Для скринінгу за допомогою FACS гібридом, які виробляють моноклональне антитіло цього винаходу, по-перше, отримують клітини, що експресують епірегулін. Клітини, які переважно застосовують для скринінгу, - це клітини ссавців, у яких епірегулін експресується примусово. З метою контролю активність антитіла зв'язуватися з епірегуліном на клітинній поверхні можна вибірково визначити, застосовуючи нетрансформовані клітини ссавців як клітини-хазяїни. Специфічно, гібридоми, що виробляють моноклональне антитіло проти епірегуліну, можна виділити шляхом вибору гібридом, які виробляють антитіло, яке зв'язується з клітинами, змушеними експресувати епірегулін, проте не з клітинами-хазяїнами. Альтернативно, активність антитіла зв'язуватися з іммобілізованими клітинами, що експресують епірегулін, можна оцінити на підставі принципу ЕЛАЙЗА. Наприклад, клітини, що експресують епірегулін, іммобілізуються на комірках планшета для ЕЛАЙЗА. Культуральні надосадові рідини гібридом контактують з іммобілізованими клітинами у комірках, та виявляють антитіла, які зв'язуються з іммобілізованими клітинами. Коли моноклональні антитіла походять від мишей, тоді антитіла, зв'язані з клітинами, можна виявити, застосовуючи антитіло проти мишачого імуноглобуліну. Гібридоми, які виробляють бажане антитіло, яке має антигензв'язувальну спроможність, вибираються шляхом вищезгаданого скринінгу, та їх можна клонувати способом граничного розведення або йому подібним. Отримані таким способом гібридоми, що виробляють моноклональне антитіло, можна пропустити крізь традиційне культуральне середовище та зберігати у рідкому азоті протягом тривалого періоду часу. Вищеописані гібридоми культивують традиційним способом, та бажані моноклональні антитіла можна отримати з культуральних надосадових рідин. Альтернативно, гібридоми вводять у та вирощують у сумісних ссавцях, та моноклональні антитіла отримують з асцитів. Попередній спосіб є придатним для отримання антитіл з високою чистотою. Можна також переважно застосовувати антитіла, які кодуються генами антитіла, які клонуються з клітин, які виробляють антитіла та які описано вище. Клонований ген антитіла вставляється у відповідний вектор, та потім вектор вводиться у хазяїна, щоб експресувати антитіло, яке кодується геном. Способи виділення генів антитіл, вставлення генів у вектори та трансформації клітин-хазяїнів вже розроблено, наприклад, Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767-775). Способи отримання рекомбінантних антитіл є також відомими та їх описано далі. Наприклад, кДНК, яка кодує варіабельну ділянку (V-ділянку) антитіла проти епірегуліну, отримують з клітин гібридоми, які експресують антитіло проти епірегуліну. Для цього суцільну РНК спочатку екстрагують з гібридом. Методи, які застосовуються для екстрагування мРНК з клітин, включають, наприклад: спосіб ультрацентрифугування гуанідину (Biochemistry (1979) 18(24), 5294-5299), та спосіб AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156-159). Екстраговані мРНК можна очистити, застосовуючи набір для очищення мРНК mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience) або йому подібне. Альтернативно, також комерційно доступні набори для екстрагування суцільної мРНК безпосередньо з клітин, такі як набір для очищення мРНК QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience). мРНК можна отримати з гібридом, застосовуючи такі набори. кДНК, які кодують V-ділянку антитіла, можна синтезувати з отриманих мРНК, застосовуючи зворотну транскриптазу. кДНК можна синтезувати, застосовуючи набір синтезу кДНК AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Co.) або йому подібне. Крім того, набір ампліфікації SMART RACE cDNA (Clontech) та спосіб 5’-RACE на основі ПЛР (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932) можна відповідним чином застосовувати для синтезу та ампліфікації кДНК. У такому процесі синтезу кДНК відповідні ділянки рестрикційних 14 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ферментів, описані далі, можна вводити в обидва кінці кДНК. Фрагмент кДНК, який представляє інтерес, очищують з отриманого продукту ПЛР, а потім його зшивають з векторною ДНК. Таким способом будують рекомбінантний вектор, та його вводять в E. Coli або їй подібну. Після відбору колонії бажаний рекомбінантний вектор можна отримати з утворюючої колонії E. coli. Після цього визначається, чи має рекомбінантний вектор нуклеотидну послідовність кДНК, яка представляє інтерес, у ході тесту за відомим способом, таким як спосіб обриву дидезоксинуклеотидного ланцюга. Спосіб 5’-RACE, при якому застосовуються праймери для ампліфікації гена варіабельної ділянки, традиційно застосовується для виділення гена, що кодує варіабельну ділянку. Поперше, бібліотеку кДНК 5’-RACE будують за допомогою синтезу кДНК, застосовуючи РНК, екстраговані з клітин гібридом, як матрицю. Комерційно доступний набір, такий як набір ампліфікації кДНК SMART RACE, відповідним чином застосовується для синтезування бібліотеки кДНК 5’-RACE. Ген антитіла ампліфікують шляхом ПЛР, застосовуючи отриману бібліотеку кДНК 5’-RACE як матрицю. Праймери для ампліфікації гена антитіла миші можна побудувати на основі відомих послідовностей гена антитіла. Нуклеотидні послідовності праймерів різняться залежно від підкласу імуноглобуліну. Отже, переважно, щоб підклас визначали заздалегідь, застосовуючи комерційно доступний набір, такий як набір ізотипування моноклонального антитіла миші Iso Strip (Roche Diagnostics). Специфічно, наприклад, праймери, які дозволяють ампліфікувати гени, які кодують важкі ланцюги γ1, γ2a, γ2b та γ3 та легкі ланцюги κ та λ застосовуються для виділення генів, що кодують IgG миші. Зазвичай, праймер, який гібридизується до області константної ділянки, близької до варіабельної ділянки, застосовується як 3’-бічний праймер для ампліфікації гена варіабельної ділянки IgG. Між тим, праймер, приєднаний до набору для побудови бібліотеки кДНК 5" RACE, застосовується як 5’-бічний праймер. Продукти ПЛР, ампліфіковані таким способом, застосовуються для зміни форми імуноглобулінів, які складаються з комбінації важких та легких ланцюгів. Бажане антитіло можна вибрати, застосовуючи епірегулін-зв'язувальну активність імуноглобуліну зі зміненою формою, як індикатор. Коли метою є виділити антитіло проти епірегуліну, тоді більш переважно, щоб зв'язування антитіла з епірегуліном було специфічним. Антитіло, що зв'язується з епірегуліном, можна скринувати, наприклад, за наступними етапами: контактування клітини, що експресує епірегулін з антитілом, яке включає V-ділянку, кодовану кДНК, виділеною з гібридоми; виявлення зв'язування антитіла з клітиною, що експресує епірегулін; та вибір антитіла, яке зв'язується з клітиною, що експресує епірегулін. Відомі способи виявлення зв'язування антитіла з клітинами, що експресують епірегулін. Специфічно, зв'язування антитіла з клітинами, що експресують епірегулін, можна виявити за допомогою вищеописаних способів, таких як FACS. Іммобілізовані зразки клітин, що експресують епірегулін, відповідним чином застосовуються для оцінки зв'язувальної активності антитіла. Переважні способи скринінгу антитіл, які застосовують зв'язувальну активність як індикатор, також включають способи пенінгу, які застосовують фагові вектори. Способи скринінгу, які застосовують фагові вектори, є переважними, коли гени антитіла виділяються з бібліотек підкласів важкого ланцюга та легкого ланцюга з популяції клітин, які експресують поліклональне антитіло. Гени, що кодують варіабельні ділянки важкого ланцюга та легкого ланцюга, можна зшити за допомогою послідовності відповідного лінкера, щоб утворити одноланцюговий Fv (scFv). Фаги, які презентують scFv на своїй поверхні, можна отримати шляхом вставлення гена, який кодує scFv, у фаговий вектор. Фаги контактують з антигеном, що представляє інтерес. Після цього ДНК, яка кодує scFv, що має зв'язувальну активність, яка представляє інтерес, можна виділити шляхом узяття фагів, зв'язаних з антигеном. За необхідністю цей процес можна повторювати, щоб збагатити scFv, який має зв'язувальну активність, що представляє інтерес. Після виділення кДНК, яка кодує V-ділянку антитіла проти епірегуліну, яке представляє інтерес, кДНК перетравлюється рестрикційними ферментами, які розпізнають ділянки рестрикції, введенні в обидва кінці кДНК. Переважні рестрикційні ферменти розпізнають та розщеплюють нуклеотидну послідовність, яка виникає у нуклеотидній послідовності гена антитіла з низькою частотою. Крім того, ділянку рестрикції для ферменту, який виробляє липке закінчення, переважно вводять у вектор, щоб вставити одну копію перетравленого фрагмента у правильній орієнтації. кДНК, що кодує V-ділянку антитіла проти епірегуліну, перетравлюється, як описано вище, а потім цей продукт вставляється у відповідний вектор експресії, щоб побудувати вектор експресії антитіла. У цьому випадку, якщо ген, який кодує константну ділянку 15 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (С-ділянку) антитіла, та ген, який кодує вищезгадану V-ділянку, зливаються у рамці, тоді отримують химерне антитіло. У цьому описі винаходу вираз "химерне антитіло" означає, що походження константної ділянки є відмінним від походження варіабельної ділянки. Отже, окрім гетерохимерних антитіл миші/людини алохимерні антитіла людини/людини включено в химерні антитіла цього винаходу. Вектор експресії химерного антитіла можна побудувати шляхом вставлення гена вищезгаданої V-ділянки в вектор експресії, який вже має константну ділянку. Специфічно, наприклад, послідовність розпізнавання для рестрикційного ферменту, який вирізає ген вищезгаданої V-ділянки, можна відповідним чином розташувати на боці 5" вектора експресії, який несе ДНК, яка кодує константну ділянку (С-ділянку) бажаного антитіла. Вектор експресії химерного антитіла будується шляхом злиття у рамці двох генів, перетравлених такою самою комбінацією рестрикційних ферментів. Для того, щоб отримати моноклональне антитіло, яке зв'язується з епірегуліном, гени антитіла вставляються у вектор експресії так, що гени експресуються під контролем ділянки регуляції експресії. Ділянка регуляції експресії для експресії антитіла включає, наприклад, енхансери та промотори. Крім того, відповідну сигнальну послідовність можна приєднати до аміно-закінчення, так щоб експресоване антитіло виділялося назовні клітин. У прикладах, описаних далі, пептид, що має амінокислотну послідовність MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 168), застосовується як сигнальна послідовність. Між тим, можна приєднати інші відповідні сигнальні послідовності. Експресований поліпептид розщеплюється на карбоксильному кінці (Скінці) вищезгаданої послідовності, та отриманий поліпептид виділяється назовні клітин як зрілий поліпептид. Після цього відповідні клітини-хазяїни трансформуються вектором експресії, внаслідок чого отримують рекомбінантні клітини, які експресують ДНК, що кодує антитіло проти епірегуліну. ДНК, які кодують важкий ланцюг (Н-ланцюг) антитіла та легкий ланцюг (L-ланцюг) антитіла, окремо вставляються у різні вектори експресії, щоб експресувати ген антитіла. Молекулу антитіла, яка має Н- та L-ланцюги, можна експресувати шляхом спільної трансфекції тієї самої клітини-хазяїна векторами, у які гени H-ланцюга та гени L-ланцюга відповідним чином вставлені. Альтернативно, клітини-хазяїни можна трансформувати сигнальним вектором експресії, у який вставлено ДНК, які кодують Н- та L-ланцюги (дивись WO 1994/011523). Існують різні відомі комбінації клітин-хазяїнів / вектора експресії для отримання антитіла шляхом введення генів виділеного антитіла у відповідні хазяїни. Усі ці системи експресії можна застосовувати для того, щоб виділити антиген-зв'язувальні домени цього винаходу. Відповідні еукаріотичні клітини, які застосовуються як клітини-хазяїни, включають клітини тварин, клітини рослин та клітини грибів. Специфічно, клітини тварин включають, наприклад, наступні клітини: (1) клітини ссавців: CHO, COS, мієлома, нирки хом'ячка (ВНК), HeLa, Vero, ембріональної нирки людини (НЕК) 293 або їм подібне; (2) клітини земноводних: овоцити Xenopus або їм подібне; та (3) клітини комах: sf9, sf21, Tn5 або їм подібне. Крім того, як рослинна клітина, відома система експресії гена антитіла, яка застосовує клітини, що походять з роду Nicotiana, така як Nicotiana tabacum. Клітини з калюсних культур можна відповідним чином застосовувати для трансформації рослинних клітин. Крім того, як клітини грибів можна застосовувати наступні клітини: дріжджі: рід Saccharomyces, наприклад Saccharomyces cerevisiae, та рід Pichia, наприклад Pichia pastoris; та міцеліальні гриби: рід Aspergillus, наприклад Aspergillus niger. Крім того, також відомі системи експресії гена антитіла, які застосовують прокаріотичні клітини. Наприклад, коли застосовуються бактеріальні клітини, тоді у цьому винаході можна придатним чином застосовувати клітини E. Coli, клітини Bacillus subtilis та їм подібні. Вектори експресії, які несуть гени антитіла, які представляють інтерес, вводяться в ці клітини шляхом трансфекції. Трансфектовані клітини культивуються in vitro, та бажане антитіло можна отримати з культури трансформованих клітин. Окрім вищеописаних клітин-хазяїнів можна також застосовувати трансгенні тварини для отримання рекомбінантного антитіла. Тобто, антитіло можна отримати з тварини, у яку вводиться ген, що кодує антитіло, що представляє інтерес. Наприклад, ген антитіла можна побудувати як злитий ген шляхом вставлення у рамку у ген, який кодує білок, який специфічно виробляється у молоці. Козлячий β-казеїн або йому подібне можна застосовувати, наприклад, як білок, що виділяється у молоці. Фрагменти ДНК, які містять злитий ген, у який вставлено ген антитіла, впорскуються в ембріон козла, а потім цей ембріон вводиться у козу-самку. Бажані антитіла можна отримати як білок, злитий з молочним білком з молока, яке виробляється трансгенною козою, народженою від кози – реципієнта ембріона (або її потомства). Крім того, 16 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для того, щоб збільшити об'єм молока, яке містить бажане антитіло, вироблене трансгенною козою, якщо необхідно, трансгенній козі можна вводити гормони (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702). Коли описане в цьому описі винаходу антитіло проти епірегуліну вводиться людині, тоді антиген-зв'язувальний домен, що походить з генетично рекомбінантного антитіла, яке штучно модифікували для зменшення гетерологічної антигенності проти людини, та йому подібного, можна відповідним чином застосовувати як антиген-зв'язувальний домен цього антитіла. Такі генетично рекомбінантні антитіла включають, наприклад, гуманізовані антитіла. Ці модифіковані антитіла відповідним чином отримують за допомогою відомих способів. Варіабельна ділянка антитіла, яка застосовується для отримання антиген-зв'язувального домену антитіла проти епірегуліну, описаного в цьому описі винаходу, зазвичай утворюється трьома гіперваріабельними ділянками (CDR), які відокремлюються чотирма каркасними ділянками (FR). CDR – це ділянка, яка по суті визначає зв'язувальну специфічність антитіла. Амінокислотні послідовності CDR є надзвичайно різноманітними. З іншого боку, амінокислотні послідовності, які утворюють FR, часто мають високу ідентичність навіть серед антитіл з різною специфічністю зв'язування. Отже, зазвичай, специфічність зв'язування певного антитіла можна ввести в інше антитіло шляхом трансплантації CDR. Гуманізоване антитіло також називається антитілом людини зі зміненою формою. Специфічно, відомі гуманізовані антитіла, отримані внаслідок трансплантації CDR антитіла тварини, яка не є людиною, такого як антитіло миші, до антитіла людини, та їм подібні. Також відомі загальні способи генної інженерії для отримання гуманізованих антитіл. Специфічно, наприклад, ПЛР розширення перекривання є відомим способом для трансплантації CDR антитіла миші до FR людини. При ПЛР розширення перекривання нуклеотидна послідовність, яка кодує CDR антитіла миші, яку слід трансплантувати, додається до праймерів для синтезування FR антитіла людини. Праймери отримують для кожної з чотирьох FR. Зазвичай вважають, що коли CDR миші трансплантують до FR людини, тоді вибір FR людини, яка має високу ідентичність з FR миші, є переважним для підтримання функції CDR. Тобто, зазвичай переважно застосовувати FR людини, яка включає амінокислотну послідовність, яка має високу ідентичність з амінокислотною послідовністю FR, прилеглої до мишачої CDR, яку слід трансплантувати. Нуклеотидні послідовності, які підлягають зшиванню, будують так, щоб вони були з'єднаними одна з іншою у рамці. FR людини окремо синтезують, застосовуючи відповідні праймери. Внаслідок цього отримують продукти, у яких ДНК, яка кодує мишачу CDR, приєднується до окремих ДНК, які кодують FR. Нуклеотидні послідовності, які кодують мишачу CDR кожного продукту, будують так, щоб вони перекривалися одна з іншою. Після цього реакцію синтезу комплементарного ланцюга здійснюють для того, щоб гібридизувати ділянки CDR, що перекриваються, продуктів, синтезованих із застосуванням гена антитіла людини як матриці. FR людини зшиваються послідовностями CDR миші за допомогою цієї реакції. Ген V-ділянки повної довжини, у якому зрештою зшиті три CDR та чотири FR, ампліфікується із застосуванням праймерів, які гібридизують до його 5’- або 3’-кінця та які додаються з придатними послідовностями розпізнавання рестрикційних ферментів. Вектор експресії для гуманізованого антитіла можна отримати внаслідок вставлення ДНК, отриманої, як описано вище, та ДНК, яка кодує С-ділянку антитіла людини, у вектор експресії, так що вони зшиються у рамці. Після того, як рекомбінантний вектор трансфектується у хазяїна, щоб отримати рекомбінантні клітини, ці рекомбінантні клітини культивують, та ДНК, яка кодує гуманізоване антитіло, експресується для того, щоб отримати гуманізоване антитіло у клітинній культурі (дивись Європейську патентну публікацію No. EP 239400 та Міжнародну патентну публікацію No.WO 1996/002576). За допомогою якісного або кількісного вимірювання та оцінювання антиген-зв'язувальної активності гуманізованого антитіла, отриманого за описаним вище способом, можна придатним чином вибрати FR антитіла людини, які дозволять CDR утворити сприятливу антигензв'язувальну ділянку при зшиванні через CDR. Якщо необхідно, амінокислотні залишки у FR можна замістити так, щоб CDR антитіла людини зі зміненою формою утворили відповідну антиген-зв'язувальну ділянку. Наприклад, мутації амінокислотної послідовності можна ввести у FR, застосовуючи спосіб ПЛР, який застосовується для трансплантації мишачої CDR у FR людини. Більш специфічно, мутації послідовності часткового нуклеотиду можна ввести до праймерів, які гібридизують до FR. Мутації нуклеотидної послідовності вводяться у FR, синтезовані із застосуванням таких праймерів. Мутантні послідовності FR, які мають бажані характеристики, можна вибрати шляхом вимірювання та оцінювання активності мутантного антитіла з заміщеною амінокислотою, щоб зв'язати з антигеном за допомогою вищезгаданого 17 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 способу (Cancer Res. (1993) 53: 851-856). Альтернативно, бажані антитіла людини можна отримати шляхом імунізації трансгенних тварин, які мають увесь репертуар генів антитіла людини (дивись WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735), способом ДНК-імунізації. Крім того, також відомі способи отримання антитіл людини шляхом пенінгу із застосуванням бібліотек антитіл людини. Наприклад, V-ділянка антитіла людини експресується як одноланцюгове антитіло (scFv) на поверхні фагу за допомогою способу фагового відображення. Можна вибрати фаги, які експресують scFv, яке зв'язується з антигеном. Послідовність ДНК, яка кодує V-ділянку антитіла людини, яка зв'язується з антигеном, можна визначити, проаналізувавши гени вибраних фагів. Визначається послідовність ДНК scFv, що зв'язується з антигеном. Вектор експресії отримують шляхом зливання послідовності V-ділянки у рамці з послідовністю С-ділянки бажаного антитіла людини та вставлення цього продукту у відповідний вектор експресії. Вектор експресії вводять у клітини, відповідні для експресії, такі, як описано вище. Антитіло людини можна отримати шляхом експресії гена, що кодує антитіло людини, у клітинах. Ці способи є вже відомими (дивись WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388). Окрім способів, описаних вище, для виділення генів антитіла можна відповідним чином застосовувати способи клонування В-клітин (ідентифікація кожної послідовності, що кодує антитіло, клонування та її виділення; застосування у побудові вектора експресії для отримання кожного антитіла (IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4 особливо); та їм подібне) так, як описано у Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) або у WO2008/081008. Нумерація EU та нумерація за Kabat Згідно зі способами, що застосовуються у цьому винаході, амінокислотні позиції, приписані CDR та FR антитіла, позначаються згідно з нумерацією за Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 та 1991)). У цьому описі винаходу амінокислоти варіабельної ділянки антитіла проти епірегуліну позначаються згідно з нумерацією за Kabat, проте амінокислоти константної ділянки позначаються згідно з нумерацією EU на основі амінокислотних позицій за Kabat. Зміни амінокислот Відомі способи, такі як сайт-спрямований мутагенез (Kunkel et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) та ПЛР розширення перекривання, можна відповідним чином застосовувати для модифікації амінокислот в амінокислотних послідовностях антитіл. Крім того, різні способи можна також застосовувати як спосіб зміни для заміщення амінокислот тими амінокислотами, що є відмінними від природних амінокислот (Annu. Rev. Biophys. Biomol.Struct. (2006) 35, 225249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Наприклад, можна відповідним чином застосовувати систему безклітинної трансляції (Clover Direct (Protein Express)), яка містить тРНК, зшиту з неприродною амінокислотою на тРНК амберного супресора, які є комплементарними до кодону UAG (амбер-кодону), який є стоп-кодоном. Як застосовується в цьому описі винаходу, коли описується позиція амінокислотної зміни, значення терміна "та/або" включає кожну комбінацію, де "та" й "або" відповідним чином комбінуються. Специфічно, наприклад, вираз "амінокислота(-и) на позиції (позиціях) 33, 55 та/або 96 є заміщеними" включає наступне варіювання амінокислотних змін: амінокислоти (амінокислот) на (а) позиції 33, (b) позиції 55, (с) позиції 96, (d) позиціях 33 та 55, (е) позиціях 33 та 96, (f) позиціях 55 та 96 та (g) позиціях 33, 55 та 96. Зниження імуногенності Переважно, передбачена імуногенність антитіла цього винаходу у людині-хазяїні є зниженою. Вираз "низька імуногенність" означає, що протягом достатнього для досягнення терапевтичної ефективності часу антитіло не індукує гуморальну імунну реакцію у принаймні більшості окремих пацієнтів, які отримують кількість антитіл достатню, щоб знизилася б ефективність тривалого введення антитіла. Рівень імуногенності у людей можна передбачити, застосовуючи програму Propred для передбачення зв'язування головного комплексу гістосумісності (МНС) класу ІІ (http://www.imtech.res.in/raghava/propred), застосовуючи аналіз 1 % порогового значення усіх алелей. Інші програми, які можна застосовувати, включають: -Rankpep (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) та -Epibase (Algonomics proprietary software: algonomics.com). У порівнянні з початковою донорською молекулою молекули зі зниженою імуногенністю або не містять пептидів, або містять їх зменшену кількість, про які передбачається, що вони 18 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язуються з алелями МНС класу ІІ, які надзвичайно високо експресуються у популяції-мішені (Flower et al., Drug Discov. Today (2004) 9(2), 82-90). Функціональний аналіз зв'язування МНС класу ІІ можна виконувати шляхом генерування перекриваючих пептидів, які відповідають білку, який представляє інтерес, та тестування їхньої спроможності спричиняти активацію Т-клітин (аналіз проліферації Т-клітин) або заміщення відомого пептиду, що зв'язується з МНС класу ІІ - пептидом-репортером (Hammer J et al., J. Exp. Med. (1994) 180, 2353-2358). Декілька способів можна застосовувати, щоб знизити імуногенність антитіл проти епірегуліну цього винаходу. Переший спосіб – це гуманізувати вищезгадані антитіла. Більш специфічно, в антитіло людини імплантуються ділянки CDR антитіла проти епірегуліну, виділеного з тварини, яка не є людиною, такої як миша. Для того, щоб підтримувати або підсилювати зв'язування з епірегуліном, амінокислотний залишок (залишки) каркасної ділянки (каркасних ділянок) можна додатково замістити так, щоб CDR гуманізованого антитіла проти епірегуліну утворювали відповідні антиген-зв'язувальні ділянки. Необмежувальний варіант здійснення CDR антитіла проти епірегуліну цього винаходу, виділеного з мишей, включає CDR1 важкого ланцюга (HCDR1) за SEQ ID NO: 9, CDR2 важкого ланцюга (HCDR2) за SEQ ID NO: 10 та CDR3 важкого ланцюга (HCDR3) за SEQ ID NO: 11. Крім того, необмежувальний варіант здійснення CDR антитіла проти епірегуліну цього винаходу, виділеного з мишей, включає CDR1 легкого ланцюга (LCDR1) за SEQ ID NO: 12, CDR2 легкого ланцюга (LCDR2) за SEQ ID NO: 13 та CDR3 легкого ланцюга (LCDR3) за SEQ ID NO: 14. Необмежувальний варіант здійснення FR антитіла людини цього винаходу включає FR1 важкого ланцюга (HFR1) за SEQ ID NO: 1, FR2 важкого ланцюга (HFR2) за SEQ ID NO: 2, FR3 важкого ланцюга (HFR3) за SEQ ID NO: 3 та FR4 важкого ланцюга (HFR4) за SEQ ID NO: 4. Крім того, необмежувальний варіант здійснення FR антитіла людини цього винаходу включає FR1 легкого ланцюга (LFR1) за SEQ ID NO: 5, FR2 легкого ланцюга (LFR2) за SEQ ID NO: 6, FR3 легкого ланцюга (LFR3) за SEQ ID NO: 7 та FR4 легкого ланцюга (LFR4) за SEQ ID NO: 8. Необмежувальний варіант здійснення варіабельної ділянки гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу включає варіабельну ділянку важкого ланцюга за SEQ ID NO: 15. Крім того, необмежувальний варіант здійснення варіабельної ділянки гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу включає варіабельну ділянку легкого ланцюга за SEQ ID NO: 16. Крім того, необмежувальний варіант здійснення FR антитіла людини цього винаходу включає FR1 важкого ланцюга (HFR1) за SEQ ID NO: 17 та FR3 важкого ланцюга (HFR3) за SEQ ID NO: 18. Крім того, необмежувальний варіант здійснення FR антитіла людини цього винаходу включає FR2 легкого ланцюга (LFR2) за SEQ ID NO: 20, FR3 легкого ланцюга (LFR3) за SEQ ID NO: 21 та FR3 легкого ланцюга (LFR3) за SEQ ID NO: 23. Необмежувальний варіант здійснення варіабельної ділянки гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу включає варіабельну ділянку важкого ланцюга за SEQ ID NO: 19. Крім того, необмежувальний варіант здійснення варіабельної ділянки гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу включає варіабельну ділянку легкого ланцюга за SEQ ID NO: 22 або 24. Крім того, необмежувальний варіант здійснення FR гуманізованого антитіла цього винаходу включає FR3 важкого ланцюга (HFR3) за SEQ ID NO: 35 та FR3 важкого ланцюга (HFR3) за SEQ ID NO: 36. Необмежувальний варіант здійснення варіабельної ділянки гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу включає варіабельну ділянку важкого ланцюга за SEQ ID NO: 37 або 38. Другий спосіб – це спосіб будування зміненої послідовності зі зниженою імуногенністю за допомогою аналізу зміненої послідовності з амінокислотними змінами в амінокислотній послідовності антитіла проти епірегуліну із застосуванням вищезгаданої програми передбачення зв'язування МНС класу ІІ. Придатні необмежувальні приклади ділянки (ділянок) амінокислотної зміни (амінокислотних змін) для зниження імуногенності антитіла проти епірегуліну цього винаходу включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 87 та/або 101, згідно з нумерацією за Kabat, в послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 38. Крім того, переважні необмежувальні приклади ділянки амінокислотної зміни для зниження імуногенності антитіл проти епірегуліну включають амінокислоту на позиції 24, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 29. Переважний приклад необмежувального варіанту здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення (амінокислотних заміщень) включає заміщення Ser (S) для амінокислоти на позиції 87 та/або заміщення Tyr(Y) або Phe(F) для амінокислоти на позиції 101, 19 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 38. Крім того, переважний приклад необмежувального варіанта здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення включає заміщення Arg(R) для амінокислоти на позиції 24, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 29. Третій спосіб – це спосіб відповідного вибору константної ділянки алотипу IgG1, вибраного серед типу G1m3 (послідовність, отримана внаслідок додавання GK до С-кінця послідовності SEQ ID NO: 31), типу G1m17,1 (SEQ ID NO: 26) та типу G1m17 (послідовність, отримана внаслідок додавання GK до С-кінця послідовності SEQ ID NO: 30), коли відбувається будування антитіла проти епірегуліну, яке включає константну ділянку антитіла IgG1. Відомо, що сумісність між алотипом тваринного виду, якому вводиться фармацевтичний засіб з антитіла, та алотипом цього фармацевтичного засобу з антитіла, впливає на імунні реакції у цього виду тварини (Genes and Immunity (2011) 12, 213-221). Необмежувальний варіант здійснення важкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу зі зниженою імуногенністю включає важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150. Крім того, необмежувальний варіант здійснення легкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу включає легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 29, 57, 58, 80-85, 99, 128-130, 136 та 141. Необмежувальний варіант здійснення гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу зі зниженою імуногенністю включає гуманізовані антитіла проти епірегуліну, які включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150, та легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 29, 57, 58, 80-85, 99, 128-130, 136 та 141. Пригнічення дезамідування, ізомеризації та гідролізу Переважно, щоб дезамідування, ізомеризація та гідроліз пригнічувалися в антитілах проти епірегуліну цього винаходу. Дуже важливо контролювати кількість агрегату у білковому фармацевтичному засобі, коли враховується контроль якості та вплив на ефективність та імуногенність ліків (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714). Зазвичай, на утворення агрегату впливає як колоїдна стабільність, яка зумовлюється оточенням білкового розчину, так і конформаційна стабільність, яка зумовлюється структурою білка (J. Pharm Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315). Умови, ефективні для колоїдної стабільності, можна отримати за допомогою скринінгу концентрації антитіла або рН, типу буферного розчину, іонної сили, добавок та їм подібного, звернувшись до регламентації щодо фармацевтичного складу антитіла. З іншого боку, конформаційна стабільність частково залежить від амінокислотної послідовності, та у випадку з антитілами, вважають важливим підтримувати характерні структури, такі як канонічна структура CDR, консенсусні послідовності FR та взаємодія VH/VL та їм подібне (Jung et al., J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716; Xiang et al., J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390; Ewert et al., Methods. (2004) 34 (2), 184-199; Vargas-Madrazo et al., J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3) 113-120 та Morea et al., J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294). Реакція дезамідування означає реакції, які відбуваються неферментативно на бічних аспарагінових та глютамінових ланцюгах, та вона змінює аміди на бічних аспарагінових та глютамінових ланцюгах на карбонові кислоти. Ізомеризація є наслідком утворення проміжної сполуки нестабільного циклічного іміду внаслідок дезамідування аспарагіну або дегідрування аспарагінової кислоти, як результат атаки карбонільної групи, присутній на бічному ланцюзі аспарагіну або аспарагінової кислоти, електронною парою азоту на залишку, розташованому на С-кінці. Ця проміжна сполука змінюється здебільшого на ізоаспарагінову кислоту внаслідок розщеплення, та решта стає аспарагіновою кислотою. У випадку з глютаміном швидкість дезамідування зазвичай становить 1/10 від аспарагіну, проте механізм є по суті таким самим, та для того, щоб реакція продовжувалася потрібні тільки молекули води. Оскільки ці реакції дезамідування та ізомеризації, які відбуваються під час зберігання білків, таких як антитіла, стають причинами вищеописаної гетерогенності, то їх бажано пригнітити до можливого ступеню. Крім того, повідомлялося, що реакції дезамідування легко відбуваються особливо на ділянках, де аспарагін та гліцин є прилеглими один до одного (Asn-Gly) (Geiger et al., J. Biol. Chem. (1987) 262, 785-794). Крім того, повідомлялося, що розщеплення пептидного ланцюга внаслідок реакції гідролізу відбувається в аспарагіновій кислоті, та вважають, що гідроліз відбувається легко у кислотних умовах, особливо у послідовності, де пролін є присутнім на боці С-кінця (Asp-Pro) (Segalas et al., FEBS Letters (1995) 371, 171-175). Для того, щоб пригнітити дезамідування, ізомеризацію та гідроліз, там, де це доречно, 20 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можна здійснити амінокислотні зміни та їм подібне, щоб видалити залишки глютамініл та аспарагініл, які є ділянками, які зазнають дезамідування. Переважний необмежувальний варіант здійснення ділянки дезамідування, видалення якої є особливо ефективним, включає ділянки, де відбувається сприяння реакції дезамідування, або більш специфічно залишок гліцину, залишок аспарагіну або залишок глютаміну у мотивах, позначених як послідовності NG та QG. Заміщення будь-якого з цих амінокислотних залишків (N, Q або G) може помітно пригнітити реакції дезамідування (WO2003/057881, WO2005/067620 або їм подібне). Крім того, коли це є доречним, можна також застосовувати способи отримання антитіл з пригніченою реакцією дезамідування шляхом контролю способу культивування клітин, що виробляють антитіло. Антитіла проти епірегуліну, запропоновані цим винаходом, також включають антитіла проти епірегуліну, до яких застосовано вищезгаданий спосіб пригнічення реакції дезамідування. Необмежувальні приклади ділянок, які зазнають дезамідування, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 31, 52, 54, 56 та/або 101, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 38. Крім того, необмежувальні приклади ділянок, які зазнають дезамідування, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 28, 92 та/або 94, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 29. Необмежувальний варіант здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення (амінокислотних заміщень) переважно включає заміщення Ala (A) для амінокислоти на позиції 31 та/або заміщення Thr (T), Lys (K), Phe (F), Val (V), Arg (R) або Leu (L) для амінокислоти на позиції 55, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 38. Крім того, необмежувальний варіант здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення (амінокислотних заміщень) переважно включає заміщення Glu (E) для амінокислоти на позиції 92 та/або заміщення Arg (R) або Gln (Q) для амінокислоти на позиції 93, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 29. Необмежувальні варіанти здійснення важкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу з пригніченим дезамідуванням, ізомеризацією та гідролізом включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 49-56, 98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150. Крім того, необмежувальні варіанти здійснення легкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу з пригніченим дезамідуванням, ізомеризацією та гідролізом включають легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 57, 58, 128 та 141. Необмежувальні варіанти здійснення гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу з пригніченим дезамідуванням, ізомеризацією та гідролізом включають гуманізовані антитіла проти епірегуліну, які включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 49-56, 98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150, та легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 57, 58, 128 та 141. Модуляція ізоелектричної точки Переважно, ізоелектричні точки антитіл проти епірегуліну цього винаходу модулюються. Способи контролю поверхневого заряду молекули антитіла шляхом змінення амінокислотних залишків, розташованих на поверхні молекули антитіла, відомі як один із способів регулювання періоду напіврозпаду антитіл у плазмі (WO2007/114319 та WO2009/041543). Специфічно, відомо, що зниження значення ізоелектричної точки (рІ) антитіла дає змогу подовжити період напіврозпаду антитіла у плазмі. Навпаки, відомо, що підвищення значення ізоелектричної точки антитіла скорочує його період напіврозпаду у плазмі та покращує властивості антитіла мігрувати у тканині (Vaisitti et al., J. Biol. Regul. Homeost.Agents.(2005) 19 (3-4), 105-112; Pardridge et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (1998) 286 (1), 548-554). З іншого боку, відомо, що протипухлинний ефект антитіла, ізоелектрична точка якого є зниженою, збільшується порівняно з протипухлинним ефектом антитіла до змін (WO2009/041062). рІ білка, такого як антитіло, визначається як рН, при якому поліпептид має ефективний заряд. У цій галузі зазвичай відомо, що розчинність білка буде найнижчою, коли рН розчину є еквівалентним ізоелектричній точці (рІ) білка. Отже, на основі рІ можна визначити розчинність білка при заданому рН, наприклад при рН6. рІ білка є також гарним індикатором для в'язкості білка у рідкому препараті. Висока рІ вказує на високу розчинність та низьку в'язкість (що є особливо важливим для препарату з високою концентрацією). У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу вибирають домени-кандидати, які мають більш високу рІ, ніж попередньо визначене порогове значення. рІ антитіла також відіграє специфічну роль в ефективності ліків та біологічному розповсюдженні антитіла. Наприклад, відомо, що коли рІ антитіла стає високою, тоді локалізація у клітинах та/або назовні судини зростає. Для 21 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 досягнення бажаної цілі необхідно визначити найбільш бажані властивості рІ для певного антитіла. У декількох варіантах здійснення можна отримати антитіла зі значенням рІ, яке становить приблизно 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 або вище. В іншому необмежувальному варіанті здійснення можна вибрати антитіла зі значенням рІ, яке становить приблизно 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0 або менше. Фахівець у галузі зрозуміє, що один єдиний білок може мати багато заряджених форм. Не прив'язуючись до особливої теорії, заряд білка можна модулювати за допомогою ряду механізмів іншої дії; та, без обмежень, приклади таких механізмів включають амінокислотне заміщення (амінокислотні заміщення), утворення катіонів, дезамідування, амінокислотна гетерогенність на С-кінці, фосфорилування, глікозилування та їм подібне. рІ, що застосовується в цьому описі винаходу, визначається як рІ форми з головним зарядом. рІ білка можна визначити різними способами, та, без обмеження, необмежувальний варіант здійснення таких способів включає ізоелектричне фокусування та різні комп'ютерні алгоритми (дивись, наприклад, Bjellqvist et al., Electrophoresis (1993) 14, 1023). У необмежувальному варіанті здійснення рІ визначається із застосуванням системи електрофорезу Pharmacia Biotech Multiphor 2, обладнаної циркуляційним пристроєм з охолоджувальною ванною multi-temp III та електропостачанням EPS 3501 XL. Промислово виготовлений гель Ampholine Gel (Amersham Biosciences, діапазон рІ від 2,5 до 10) завантажується разом з 5 мкг білка. Відносну рІ антитіла визначають, застосовуючи широкодіапазонний маркерний стандарт рІ (Amersham, діапазон рІ: 3 – 10, 8 мкл). Електрофорез виконують в умовах 1500 В та 50 мА протягом 105 хвилин. Після цього гель фіксують, застосовуючи фіксуючий розчин Sigma (5х), розведений до 1х очищеною водою. Гель забарвлюють, застосовуючи Simply Blue Stain (Invitrogen), протягом ночі при кімнатній температурі. Потім гель знебарвлюють, застосовуючи розчин, що складається з 25 % етанолу, 8 % оцтової кислоти та 67 % очищеної води. Ізоелектричну точку визначають на основі стандартної калібрувальної кривої із застосуванням денситометра Bio-Rad. Для того, щоб модулювати ізоелектричну точку антитіла проти епірегуліну цього винаходу, коли це є відповідним, можна здійснити амінокислотні зміни та їм подібне, під час яких відбувається видалення заряджених амінокислот в амінокислотній послідовності антитіла проти епірегуліну або додавання або вставлення заряджених амінокислот до амінокислотної послідовності антитіла проти епірегуліну. Відомо, що серед амінокислот є заряджені амінокислоти. Зазвичай, лізин (К), аргінін (R) та гістидин (Н) відомі як амінокислоти, що мають позитивний заряд (позитивно-заряджені амінокислоти). Аспарагінова кислота (D), глютамінова кислота (Е) та їм подібне відомі як амінокислоти, що мають негативний заряд (негативнозаряджені амінокислоти). Інші амінокислоти відомі як незаряджені амінокислоти. Вищезгаданий "змінений амінокислотний залишок" - це переважно амінокислотний залишок, вибраний відповідним чином з амінокислот або групи (а), або групи (b), які зазнали додавання, вставлення або видалення, проте вони особливо не обмежуються цими амінокислотами: (a) глютамінова кислота (E), аспарагінова кислота (D), (b) лізин (K), аргінін (R), гістидин (H). Коли оригінальний амінокислотний залишок (до зміни) є вже зарядженим, змінення його на незаряджений амінокислотний залишок є також переважним варіантом здійснення цього винаходу. Більш специфічно, зміни у цьому винаході включають (1) заміщення зарядженої амінокислоти незарядженою амінокислотою, (2) заміщення зарядженої амінокислоти протилежно зарядженою амінокислотою порівняно з оригінальною амінокислотою та (3) заміщення незарядженої амінокислоти зарядженою амінокислотою. Необмежувальні приклади позицій, де амінокислоти змінюються, щоб модулювати ізоелектричну точку антитіла проти епірегуліну цього винаходу, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 13, 61, 62, 64, 65, 97 та/або 98, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 38. Крім того, необмежувальні приклади позицій, де амінокислоти змінюють, щоб модулювати ізоелектричну точку антитіла проти епірегуліну цього винаходу, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 24, 55, 56 та/або 107, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 29. Необмежувальний варіант здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення (амінокислотних заміщень) переважно включає заміщення Asn (N) або Lys (K) для амінокислоти на позиції 14, заміщення Asp (D) або Glu (E) для амінокислоти на позиції 61, заміщення Ser (S) або Gln (Q) для амінокислоти на позиції 62, заміщення Asp (D) або Glu (E) для амінокислоти на позиції 64, заміщення Asp (D) або Glu (E) для амінокислоти на позиції 65, заміщення Arg (R) для амінокислоти на позиції 97 та/або заміщення Glu (E) для амінокислоти на позиції 98, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 22 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 38. Крім того, необмежувальний варіант здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення (амінокислотних заміщень) переважно включає заміщення Gln (Q) або Ser (S) для амінокислоти на позиції 24, заміщення Glu (E) для амінокислоти на позиції 55, заміщення Glu (E) для амінокислоти на позиції 56 та/або заміщення Glu (E) для амінокислоти на позиції 106a, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ IDNO: 29. Необмежувальний варіант здійснення важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну цього винаходу з модульованою ізоелектричною точкою включає важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 72-79, 98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150. Крім того, необмежувальний варіант здійснення легкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу з модифікованою ізоелектричною точкою включає легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 80-85 та 99. Необмежувальний варіант здійснення антитіла проти епірегуліну цього винаходу з модульованою ізоелектричною точкою включає антитіла проти епірегуліну, які включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 72-79, 98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150, та легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 80-85 та 99. Покращення стабільності Переважно стабільність антитіл проти епірегуліну цього винаходу є покращеною. Один або більше параметрів, які описують стабільність антитіла, включають значення температури точки плавлення (Tm) домена. Значення Tm антитіла – це відмінний індикатор теплової стабільності антитіла, та воно також може бути індикатором щодо періоду зберігання антитіла. Більш низьке значення Tm вказує на утворення агрегату / нижчу стабільність, проте вище значення Tm вказує на відсутність утворення агрегатів / високу стабільність. Отже, переважно отримати антитіла з високими значеннями Tm. У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу вибираються антитіла зі значеннями Tm, які перебільшують попередньо визначене порогове значення. У деяких варіантах здійснення вибираються антитіла, які мають значення Tm, яке становить принаймні 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C, 95 °C або 100 °C або вище. Точку плавлення (Tm) антитіла можна виміряти за різноманітними стандартними способами, відомими у галузі. Наприклад, Vermeer et al. досліджували розгортання та денатурацію моноклонального мишачого IgG проти щура ізотипу 2b за допомогою диференційної скануючої калориметрії (DSC) та спектроскопії циркулярного дихроїзму (CD) (Biophys. J. (2000) 78, 394404; Colloids Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. (2000) 161, 139-150; J. Colloid Interface Sci. (2000) 225, 394-397; та 2000, Biophys. J. (2000) 79, 2150-2154). Як наслідок, вважають, що згортання та розгортання IgG можна характеризувати двома головними переходами, які перекривають один одного на різних етапах. Бімодальний розподіл, який спостерігається як в експерименті з DSC, так і в експерименті з CD, не залежить від швидкості сканування в експериментах. Виявилося, що два переходи є незалежними, та розгортання було незворотним. Вторинну структуру, а також термодинамічну стабільність Fab та Fc, які були виділені шляхом перетравлення з IgG, порівняли з такими ж самими параметрами первинного імуноглобуліну (Vermeer et al., Biophys. J. (2000) 79, 2150-2154). Було продемонстровано, що два піки, які спостерігалися для первинного IgG, можна віднести до фрагмента Fab та фрагмента Fc, відповідно. Vermeer et al. також показали, що, окрім впливу тепла, на структурне порушення IgG зазвичай може впливати зміна рН (Biophys. J. (2000) 78, 394-404) або взаємодія з гідрофобним оточенням, наприклад, адсорбція на тефлонові поверхні, або взаємодія з поверхневоактивними речовинами (Vermeer et al., 1998, Biochim.Biophys.Acta.(1988) 1425, 1-12; Colloids Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects.(2000) 161, 139-150; J.Colloid Interface Sci. 225 (2000) 394397). У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу Tm антитіла вимірюють, застосовуючи зразок, який містить виділені антитіла. В одному варіанті здійснення Tm антитіла вимірюється із застосуванням VP-DSC (MicroCal, LLC) в умовах, коли швидкість сканування становить 1,0 °C/хвилину, та температурний діапазон становить від 25 °C до 120 °C. Період фільтрування, який становить 8 секунд, можна застосовувати разом з термостатичною витримкою протягом 5 хвилин до початку сканування. У специфічному прикладі зразки отримують внаслідок діалізу в 25 мМ гістидину-HCl з використанням чашок для діалізу Pierce (3,5 кД). Середня концентрація антитіла становить 50 мкг/мл, що визначено внаслідок абсорбції при 280 нм. Точки плавлення визначаються згідно з процедурами виробника, застосовуючи програмне забезпечення Origin, яке постачається разом з системою. Стисло кажучи, численні первинні данні завантажуються з буфером як щодо зразків, так і щодо контролю, щоб вивести теплове рівняння. Після того, як первинні данні віднімаються від термограми зразка, дані 23 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нормалізуються згідно з концентрацією та узгоджуються із застосуванням функції зворотного згортання. В іншому варіанті здійснення стабільність антитіла визначається за допомогою способу, описаного далі. Один або більше вихідних параметрів можуть далі включати параметри, які характеризують стабільність антитіла при одній або декількох різних умовах, вибраних з групи, що складається з різних значень рН, різних температур, різних значень напруження зсуву та різних циклів заморожування / відтаювання. У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу вимірювання методом диференційної скануючої калориметрії (DSC) можна виконувати, застосовуючи прилад Setaram Micro-DSC III (Setaram, Caluire, France). Зразки розташовуються у калориметрі в 1мл комірці для зразка і порівнюються з 1 мл контрольною коміркою, яка містить відповідний холостий розчин. Комірки стабілізують протягом 4 годин при 25 °C усередині калориметра до того, як комірки почнуть нагріватися до кінцевої температури при вибраній швидкості нагрівання. Температуру переходу та ентальпію можна визначити, застосовуючи програмне забезпечення Setaram (Setaram, Version 1.3). У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу криву теплової денатурації/ренатурації можна отримати, застосовуючи спектроскопію циркулярного дихроїзму (CD). Зміни у вторинній структурі IgG, як функцію від температури та/або, наприклад, рН, можна дослідити за допомогою спектроскопії CD (Fasman et al., (Circular Dichroism and the Confonnational Analysis of Biomolecules. (1996) Plenum Press)). Згідно з de Jongh et al. переваги цього способу полягають у тому, що на спектроскопічний сигнал не впливає присутність оточуючого розчину, та що добре визначені процедури є доступними для того, щоб визначити вторинну структуру на основі контрольних спектрів різних структурних елементів (Biochemistry (1994) 33, 14521-14528). Фракції елементів вторинної структури можна отримати зі спектрів CD. У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу вимірювання можна здійснювати на спектрополариметрі JASCO моделі J-715 (JASCO International Co.). Можна застосовувати кварцову кювету з довжиною шляху світла 0,1 см. Регулювання температури можна здійснювати, застосовуючи термопару JASCO PTC-348WI (JASCO International). Термограми записуються із застосуванням термопари Peltier з розрізненням 0,2 °C та часовою константою 16 секунд. Сканограми довжини хвилі у дальній ультрафіолетовій ділянці спектра (розрізнення 0,2 нм) можна отримати шляхом накопичення ряду результатів сканування з придатною швидкістю сканування. Криву теплової денатурації / ренатурації можна також виміряти за допомогою спектроскопічного способу. Коли білок у розчині денатурується у відповідь на нагрівання, тоді молекули утворюють агрегати та розчин сильніше розсіює світло. Агрегація спричиняє зміни в оптичній прозорості зразка, та її можна вимірити шляхом спостереження змін абсорбції видимого або ультрафіолетового світла при визначеній довжині хвилі. У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу флуоресцентну спектроскопію застосовують для отримання кривої теплової денатурації / ренатурації. В одному варіанті здійснення стежать за притаманною білкам флюоресценцією, наприклад, за флюоресценцією, притаманною триптофану. В іншому варіанті здійснення стежать за молекулами флуоресцентного зонда. Способи для виконання експериментів флуоресцентної спектроскопії є добре відомими для фахівців у галузі. Дивись, наприклад, Bashford et al.(Spectrophotometry and Spectrofluorometry: A Practical Approach (1987) 91-114, IRL Press Ltd.), Bell, J. E. (Spectroscopy in Biocheinistry (1981) Vol. I, 155-194, CRC Press), або Brand et al., (Ann. Rev. Biochem. (1972) 41, 843). Щодо біологічної активності композицій антитіла, можна застосовувати різні способи для визначення їх стабільності на основі фізичних та хімічних структур антитіл. Наприклад, для того, щоб дослідити денатурацію антитіл, окрім вищезгаданих способів аналізу доступні способи, такі як поглинання в результаті переносу заряду, флуоресцентна спектроскопія, ЯМР, зменшуючий капілярний гель-електрофорез (rCGE) та/або високоефективна ексклюзійна хроматографія (HPSEC) (наприклад, Wang et al. (J. Parenteral Science &Technology 42 (Suppl.), S4-S26)). Зменшуючий капілярний гель-електрофорез та високоефективна ексклюзійна хроматографія є найбільш звичайними та найпростішими способами визначення утворення білкових агрегатів, продуктів розпаду білка та фрагментів білка. Отже, стабільність композиції, яка включає антитіло проти епірегуліну, запропоноване цим винаходом, можна також оцінити за допомогою цих способів. Для того, щоб модифікувати стабільність антитіл проти епірегуліну цього винаходу можна здійснити відповідні амінокислотні зміни в амінокислотній послідовності антитіл проти епірегуліну. Як про необмежувальний варіант здійснення модифікації стабільності антитіла проти 24 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 епірегуліну цього винаходу, коли антитіло проти епірегуліну – це антитіло IgG1, про амідування С-кінцевої аміногрупи внаслідок видалення С-кінцевого амінокислотного залишку лізину та видалення двох С-кінцевих амінокислот гліцину та лізину, повідомляється як про гетерогенність, що походить з С-кінцевої послідовності важкого ланцюга антитіла IgG людини (G1, SEQ ID NO: 25) (Anal. Biochem. (2007) 360 (1), 75-83). Переважний спосіб для зменшення такої гетерогенності включає зміну внаслідок видалення двох С-кінцевих амінокислот важкого ланцюга, а саме видалення гліцину на позиції 446 та лізину на позиції 447, згідно з нумерацією EU (WO2009/041613). Оскільки бажано, щоб не було гетерогенності, яка походить від С-кінцевої послідовності важкого ланцюга в антитілах проти епірегуліну цього винаходу, то послідовність IgG1, у якій гліцин на позиції 446 та лізин на позиції 447, згідно з нумерацією EU, видаляються (G1d, SEQ ID NO: 26), можна застосовувати як послідовність константної ділянки. Необмежувальний варіант здійснення важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну цього винаходу з покращеною стабільністю включає важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150. Крім того, необмежувальний варіант здійснення легкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу з покращеною стабільністю включає легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 99, 128-130, 136 та 141. Необмежувальний варіант здійснення антитіла проти епірегуліну цього винаходу з покращеною стабільністю включає антитіла проти епірегуліну, які включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137140 та 142-150, та легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 99, 128-130, 136 та 141. Зменшення кількості агрегату Кількість агрегату антитіл проти епірегуліну цього винаходу є переважно зменшеною. Контроль кількості агрегату у білковому фармацевтичному засобі є дуже важливим, коли враховується контроль якості та вплив на ефективність та імуногенність ліків (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714). Зазвичай, на утворення агрегату впливає як колоїдна стабільність, яка зумовлюється оточенням білкового розчину, так і конформаційна стабільність, яка зумовлюється структурою білка (J. Pharm Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315). Бажаних умов, що є ефективними для колоїдної стабільності, можна досягти шляхом скринінгу концентрації антитіла, рН, типу буферного розчину, іонної сили, домішок та їм подібного, звернувшись до регламентації щодо фармацевтичного складу з антитілом. З іншого боку, конформаційна стабільність частково залежить від амінокислотної послідовності, та у випадку з антитілами вважають важливим підтримувати характерні структури, такі як канонічна структура CDR, консенсусні послідовності FR та взаємодія VH/VL та їм подібне (Jung et al., J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716; Xiang et al., J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390; Ewert et al., Methods. (2004) 34 (2), 184-199; Vargas-Madrazo et al., J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3) 113-120, Morea et al., J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294, та Vargas-Madrazo et al., J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3) 113-120). Різні способи можна застосовувати, щоб оцінити стабільність білкових фармацевтичних складів, які містять фармацевтичні склади антитіла, на основі фізичних та хімічних структур білків, а також на основі їх біологічної активності. Наприклад, для дослідження денатурації білків доступні способи, такі як абсорбція в результаті переносу заряду, тепловий аналіз, флуоресцентна спектроскопія, циркуляційний дихроїзм (CD), ЯМР, а також HPSEC, тангенціальна поточна фільтрація (TFF), статичне світлорозсіювання (SLS), інфрачервона спектроскопія на основі перетворення Фур'є (FTIR), індукована сечовиною технологія розгортання білка, притаманна триптофану флюоресценція, диференціальна скануюча калориметрія та технологія зв'язування білка 1-аніліно-8-нафталін сульфонату (ANS). Наприклад, відповідним чином можна застосовувати спосіб, вибраний зі способів, описаних у Wang et al. (J. Parenteral Science &Technology (1988) 42 (Suppl), S4-S26). rCGE та HPSEC є найбільш загальними та найпростішими способами визначення утворення агрегатів білків, розпаду білків та фрагментації білків. Отже, стабільність рідких фармацевтичних складів цього винаходу можна оцінити за допомогою цих способів. Наприклад, стабільність антитіл проти епірегуліну цього винаходу можна оцінити шляхом HPSEC або rCGE, де ділянка піку у відсотках представляє антитіло, яке не розпалося, або фрагмент антитіла, який не розпався. У необмежувальному варіанті здійснення приблизно 250 мкг антитіла (приблизно 25 мкл рідкого фармацевтичного складу, що містить 10 мг/мл вищезгаданого антитіла) впорскується до колонки TosoH Biosep TSKG3000SWXL (7,8 мм х 30 см), обладнаної захисною колонкою TSK SW x1 (6,0 мм х 4,0 см). Антитіло (включаючи фрагменти антитіла) елююють ізократично 0,1 М фосфатом натрію, який містить 0,1 М сульфату натрію та 0,05 % натрію азиду, при витраті потоку від 0,8 до 1,0 мл/хвилину. 25 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Елюйований білок виявляють із застосуванням УФ-абсорбції при 280 нм. Аналітичний стандарт застосовується в аналізі як контрольний, та результати представлено як зона піку мономеру продукту у відсотках порівняно з усіма іншими піками, за виключенням об'ємного піку, що міститься та спостерігається приблизно на 12 – 14 хвилинах. Піки, які елююють раніше ніж пік мономеру, фіксуються як відсоток агрегату. Для того, щоб зменшити кількість агрегату антитіла проти епірегуліну цього винаходу, зменшують гідрофобну взаємодію між молекулами, що містять важкий ланцюг та легкий ланцюг антитіла проти епірегуліну. Специфічно, відповідним чином здійснюються амінокислотні зміни, які заміщують гідрофобний залишок (гідрофобні залишки) гідрофільним залишком (гідрофільними залишками) в амінокислотній послідовності важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну, та їм подібні. У переважному необмежувальному варіанті здійснення відповідним чином здійснюються амінокислотні зміни, при яких заміщують гідрофобний залишок (гідрофобні залишки) гідрофільним залишком (гідрофільними залишками) у CDR антитіла проти епірегуліну, та їм подібні. Відомо, що амінокислоти включають гідрофільні амінокислоти та гідрофобні амінокислоти. Зазвичай, Asp (D), Glu (E), Arg (R), Lys (K), His (H), Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Asn (N), Gln (Q), та Tyr (Y) відомі як гідрофільні амінокислоти. Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Met (M), Trp (W), Phe (F), та Pro (P) відомі як гідрофобні амінокислоти. Переважно, вищезгадана амінокислотна зміна відповідним чином вибирається із заміщення (заміщень) однієї або більше амінокислот, вибраних серед вищезгаданих гідрофобних залишків, амінокислотами, вибраними серед вищезгаданих гідрофільних залишків, проте вони особливо не обмежуються специфічними амінокислотами. Необмежувальні приклади позицій, які зазнають амінокислотних змін для зменшення кількості агрегату антитіла проти епірегуліну цього винаходу, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 60 та/або 98, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 38. Необмежувальний варіант здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення переважно включає заміщення His (H), Lys (K), Thr (T), Ser (S) або Arg (R) для амінокислоти на позиції 60 та/або заміщення Ser (S) або Glu (E) для амінокислоти на позиції 98, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 38. Необмежувальний варіант здійснення важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну цього винаходу зі зниженою кількістю агрегату включає важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150. Необмежувальний варіант здійснення антитіла проти епірегуліну цього винаходу зі зниженою кількістю агрегату включає антитіла проти епірегуліну, які включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150, та легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 99, 128-130, 136 та 141. Підтвердження міжвидової реактивності для зв'язування з епірегуліном тварини, яка не є людиною, та епірегуліном людини Антитіла проти епірегуліну цього винаходу – це переважно антитіла проти епірегуліну, які демонструють міжвидову реактивність між тваринами, які не є людьми, та людьми. Більш специфічно, цей винахід пропонує антитіло проти епірегуліну, яке зв'язується з епітопом, який зв'язується з антитілом проти епірегуліну, яке включає гіперваріабельні ділянки (CDR) варіабельної ділянки важкого ланцюга за SEQ ID NO: 9, 10 та 11 та гіперваріабельні ділянки (CDR) варіабельної ділянки легкого ланцюга за SEQ ID NO: 12, 13 та 14, де антитіло характеризується тим, що його відношення значення KD для епірегуліну мавп за SEQ ID NO: 170 (cEREG KD) до значення KD для епірегуліну людини за SEQ ID NO: 34 (hEREG KD) (cEREG KD/hEREG KD) є меншим, ніж відношення cEREG KD/hEREG KD антитіла проти епірегуліну, яке включає гіперваріабельні ділянки (CDR) варіабельної ділянки важкого ланцюга за SEQ ID NO: 9, 10 та 11 та гіперваріабельні ділянки (CDR) варіабельної ділянки легкого ланцюга за SEQ ID NO: 12, 13 та 14. Більш специфічно, у цьому винаході амінокислотні послідовності CDR варіабельної ділянки важкого ланцюга за SEQ ID NO: 9, 10 та 11 та CDR варіабельної ділянки легкого ланцюга за NO: 12, 13 та 14 змінюють, щоб модифікувати активність зв'язування з епірегуліном мавпи антитіла проти епірегуліну, яке включає вищезгадані CDR. Оскільки структурні різниці між епірегуліном мавпи та епірегуліном людини не вивчено, то не було жодної рекомендації стосовно того, які амінокислотні залишки антитіла проти епірегуліну слід змінити, щоб підвищити активність зв'язування з епірегуліном мавпи. У цьому винаході було побудовано численні послідовності антитіл з заміщенням (заміщеннями) амінокислотних залишків на довільній ділянці (довільних ділянках) у гіперваріабельних ділянках. Специфічно, отримали антитіла проти епірегуліну із 26 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 заміщенням залишком Arg (R) для амінокислоти у вищезгаданих послідовностях CDR. На диво, антитіла проти епірегуліну із заміщенням залишком Arg (R) для амінокислоти у послідовностях CDR мали підвищену активність зв'язування з епірегуліном мавпи. Тобто, заміщення залишком Arg (R) для амінокислоти у послідовностях CDR антитіла проти епірегуліну було спроможним надавати міжвидової реактивності зв'язування з епірегуліном тварини, яка не є людиною, та епірегуліном людини. Значення KD для епірегуліну мавпи за SEQ ID NO: 170 (cEREG KD) можна розрахувати за способом, описаним у вищезгаданому розділі стосовно "зв'язувальної активності". Епірегулінзв'язувальну активність антитіла проти епірегуліну можна вимірювати за допомогою способів, відомих фахівцям у галузі, та умови вимірювання відповідним чином зможуть визначити фахівці у галузі. Епірегулін-зв'язувальну активність антитіла проти епірегуліну можна визначити як KD (константа дисоціації), видима KD (константа видимої дисоціації), kd, яка є швидкістю дисоціації (константа швидкості дисоціації), видима kd (константа видимої дисоціації) та їм подібне. Їх можна вимірити за способами, відомими фахівцям у галузі, та можна застосовувати, наприклад, Biacore (GE healthcare), графік Scatchard, FACS та їм подібне. Відношення значення KD для епірегуліну мавпи (cEREG KD) до значення KD для епірегуліну людини (hEREG KD) (cEREG KD/hEREG KD) можна визначити, поділивши це значення KD на значення KD для епірегуліну людини за SEQ ID NO: 34. У цьому винаході cEREG KD/hEREG KD становить переважно менш ніж 40. Крім того, у необмежувальному варіанті здійснення cEREG KD/hEREG KD становить переважно менш ніж 10. В іншому необмежувальному варіанті здійснення cEREG KD/hEREG KD становить переважно менш ніж 6, та в іншому необмежувальному варіанті здійснення cEREG KD/hEREG KD становить переважно менш ніж 4. Необмежувальні приклади позиції (позицій), де амінокислота (амінокислоти) змінюють, щоб надати міжвидової реактивності для зв'язування з епірегуліном тварини, яка не є людиною, та епірегуліном людини, запропонованим цим винаходом, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 33, 51, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 65, 96, 97 та/або 98, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 38. Крім того, необмежувальні приклади позиції (позицій), де амінокислота (амінокислоти) змінюють, щоб надати міжвидової реактивності для зв'язування з епірегуліном тварини, яка не є людиною, та епірегуліном людини, запропоновані цим винаходом, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 24, 93 та/або 94, згідно з нумерацією за Kabat, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за SEQ ID NO: 29. Переважний приклад амінокислотної зміни включає заміщення Arg (R) для однієї або більше вищезгаданих амінокислот. Приклади необмежувального варіанта здійснення важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну цього винаходу з наданою міжвидовою реактивністю включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150. Приклади необмежувального варіанта здійснення легкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу з наданою міжвидовою реактивністю включають легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 128-130, 136 та 141. Приклади необмежувального варіанта здійснення антитіла проти епірегуліну цього винаходу, якому було надано міжвидової реактивності, включають антитіла проти епірегуліну, які включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 98, 115-127, 131135, 137-140 та 142-150, та легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO: 29, 128-130, 136 та 141. Нейтралізуюча активність Антитіло проти епірегуліну цього винаходу – це переважно антитіло, яке має нейтралізуючу активність. Зазвичай, термін "нейтралізуюча активність" означає активність інгібувати біологічну активність ліганду, такого як віруси або токсини, стосовно клітин. Більш специфічно, вираз "речовини, що мають нейтралізуючу активність" означає речовини, які зв'язуються з лігандом або з рецептором, який зв'язується з лігандом, та інгібують зв'язування між лігандом та цим рецептором. Коли зв'язування рецептора з лігандом блокується завдяки нейтралізуючій активності, тоді опосередкована рецептором біологічна активність не виявляється. Антитіла, які мають таку нейтралізуючу активність, зазвичай називаються нейтралізуючими антитілами. Нейтралізуючу активність можна вимірити шляхом порівняння біологічної активності у присутності та відсутності випробуваної речовини, нейтралізуючу активність якої слід оцінити, у присутності ліганду, який представляє інтерес. У цьому винаході зв'язування ліганду з рецептором EGF, який вважають головним рецептором епірегуліну, спричиняє димеризацію рецептора та активацію внутрішньоклітинного 27 UA 115046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 домену тирозинкінази рецептора. Активована тирозинкіназа утворює фосфориловані пептиди, що містять тирозин, шляхом аутофосфорилування, та ці пептиди асоціюються з різними допоміжними молекулами сигнальної трансдукції. Вони є здебільшого PLCγ (фосфоліпаза Cγ), Shc, Grb2 та їм подібним. З цих допоміжних молекул дві попередні далі фосфорилуються тирозинкіназою рецептора EGF. Головний шлях сигнальної трансдукції від рецептора EGF – це шлях, у якому відбувається трансдукція фосфорилування у порядку Shc, Grb2, Sos, Ras, Raf/MAPK кіназа/MAP кіназа. Крім того, вважають, що існує альтернативний шлях, який утворює ряд від PLCγ до PKC. Оскільки такі внутрішньоклітинні сигнальні каскади змінюються залежно від типу клітин, то придатні молекули можна націлити у клітину-мішень, яка представляє інтерес, та цільові молекули не обмежуються вищезгаданими факторами. Можна придатним чином застосовувати комерційно доступні набори для вимірювання in vivo активації сигналу (наприклад, систему аналізу активності С протеїнкінази (GE Healthcare Bio-Sciences)). Крім того, активацію сигнального шляху in vivo можна виявити, застосовуючи як показник ефект індукування транскрипції на гені-мішені, присутньому праворуч від сигнального каскаду in vivo. Зміни у транскрипційній активності можна помітити на основі принципу аналізу по генурепортеру. Більш специфічно, ген-репортер, такий як білок зеленої флюоресценції (GFP) або люцифераза, розташовується праворуч від транскрипційного фактору або промоторної ділянки гена-мішені, та вимірюється активність гена-репортера. Зміну у транскрипційній активності можна вимірити на основі активності гена-репортера. Крім того, оскільки рецептор EGF зазвичай сприяє проліферації клітин, то активацію сигнального шляху in vivo можна визначити шляхом вимірювання активності проліферації клітин-мішеней. У цьому винаході нейтралізуюча активність нейтралізуючого антитіла цього винаходу визначається шляхом оцінки активності проліферації клітин. Проте, цей винахід не обмежується цим способом, та нейтралізуючу активність можна визначити, придатним чином застосувавши вищезгадані способи до вибраних клітин-мішеней. Специфічно, наприклад, шляхом визначення нижчезгаданої активності проліферації клітин, можна оцінити або вимірити нейтралізуючу активність антитіла проти епірегуліну. Наприклад, застосовується спосіб, за допомогою якого вимірюється включення живими клітинами доданого 3 до середовища [ H]-міченого тимідину, як показника спроможності реплікації ДНК. Як більш традиційний спосіб застосовується спосіб витиснення барвника, при якому під мікроскопом вимірюється спроможність клітини вивільняти барвник, такий як трипановий блакитний, назовні клітини, або спосіб МТТ. При останньому способі застосовується спроможність живих клітин перетворювати 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифеніл тетразолу бромід (МТТ), який є сіллю тетразолу, у продукт блакитного формазану. Більш специфічно, антитіло тесту додають до культурального розчину клітини тесту та після певного періоду часу розчин МТТ додають до культурального розчину та залишають настоюватися протягом певного періоду часу, щоб МТТ включився в клітину. Внаслідок цього МТТ, який є сполукою жовтого кольору, перетворюється у сполуку блакитного кольору внаслідок дії сукцинат дегідрогенази в мітохондріях клітини. Після розчинення цього блакитного продукту для забарвлення вимірюють абсорбцію та застосовують як індикатор для ряду життєздатних клітин. Окрім МТТ реагенти, такі як MTS, XTT, WST-1 та WST-8, є комерційно доступними (Nacalai Tesque та йому подібні) та їх можна придатним чином застосовувати. Крім того, відомі способи, за допомогою яких оцінюють активність проліферації клітин, застосовуючи як індикатор клітинний АТФ або імпеданс клітинної культури. Для вимірювання активності зв'язувальне антитіло, яке має такий самий ізотип, як і антитіло проти епірегуліну, проте не має нейтралізуючої активності, можна застосовувати як контрольне антитіло таким самим чином, як і антитіло проти епірегуліну, та можна визначити, що активність існує, коли антитіло проти епірегуліну має більш сильну нейтралізуючу активність порівняно з контрольним антитілом. Цитотоксичність Антитіло, що застосовується у цьому винаході, - це переважно антитіло, яке має цитотоксичність. У цьому винаході цитотоксичність включає, наприклад, активність антитіло-залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (ADCC) та активність комплемент-залежної цитотоксичності (СDC). У цьому винаході активність CDC означає цитотоксичну активність, опосередковану системою комплементу. Між цим, активність ADCC означає активність руйнування клітини-мішені, коли специфічне антитіло приєднується до антигену на її клітинній поверхні. Клітина, що утримує рецептор Fcγ (імуноцит або йому подібне), зв'язується з частиною Fc антитіла за допомогою рецептора Fcγ , та клітина-мішень руйнується. Антитіло, яке застосовується у цьому винаході, може бути антитілом, що має активність CDC або 28