Спосіб діагностики сполучної тканини та його застосування

Реферат: Винахід належить до медицини і може бути використаний для оцінки стану дерми пацієнтів. Спосіб включає отримання колоній фібробластів шкіри в умовах, що забезпечують формування дискретних колоній, придатних для візуалізації та визначення параметра ефективності колонієутворюваня фібробластів як такого, що характеризує регенераторний потенціал популяції фібробластів, визначення процентних часток щільних та дифузних колоній в культурі фібробластів як параметра, що характеризує проліферативний потенціал клітин або визначення показника проліферації як процентної частки щільних, дифузних та змішаних колоній в культурі клітин як параметра, що характеризує проліферативний потенціал фібробластів, та обробку отриманих результатів. UA 111344 C2 (12) UA 111344 C2 UA 111344 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Область застосування Винахід відноситься до медицини і може бути використаний для оцінки стану або виявлення патології сполучної тканини (і / або органу) шляхом проведення клонального аналізу субстратзалежних клітин, що входять до складу даної тканини. Зокрема винахід відноситься до естетичної медицини та може застосовуватися для оцінки стану дерми і подальшої індивідуальної корекції вікових та інших структурних змін шкіри. Пропонований спосіб оцінки клітинної популяції (зокрема, популяції фібробластів), що входять до складу сполучних тканин може бути використаний для вивчення стану, патології або яких-небудь змін, детермінованих, опосередкованих або іншим чином пов'язаних з особливостями процесів регенерації, що відбуваються в даних тканинах (і / або органах). Так само спосіб може застосовуватись для прогнозування ефективності лікування, корекції змін і патології, результат яких залежить від регенераційних процесів, їх швидкості і тривалості. Попередній рівень техніки Відомий спосіб аналізу процесу старіння клітин шляхом ідентифікації змін біологічних параметрів клітин, наприклад, характеристик клітинного метаболізму під дією факторів старіння [патент GB2395489, МПК C12N5/06]. Цей спосіб включає протеомні, геномні або транскриптомні дослідження або їх комбінації з подальшим порівнянням отриманих результатів таких досліджень для клітин, тобто взятих у молодого донора з малим числом пасажів культивування in vitro, або клітин, отриманих з тканини з мінімальною експозицією УФ-опроміненню, і клітин, отриманих від літніх донорів або клітин з великим числом пасажів in vitro або клітин з тканини, що зазнала високого ступеню впливу УФ-опромінення і клітинних культур, поміщених в тривимірний матрикс, що імітують біологічну тканину (сполучну, епітеліальну, епідермальну і т.д.). Цей спосіб пропонується використовувати для скринінгових досліджень з пошуку лікарських засобів, здатних модулювати метаболічні процеси в старіючих клітинах. До недоліків даного способу відноситься складність його виконання, що вимагає високої кваліфікації персоналу і наявність спеціального дорогого обладнання, що ускладнює рутинне застосування методу, особливо в практиці лікарів-косметологів. Крім того, даний винахід обмежується дослідженням клітин тільки in vitro і не може бути використаний для характеристики стану клітинної популяції in vivo, тобто тканини, з якої дані клітини були виділені і, отже, не може бути використаний для діагностики цієї тканини на клітинному рівні і прогнозу подальшої терапії. Відомий спосіб визначення колонієутворювальних одиниць (КУО) ендотеліальних прогеніторних клітин шляхом характеристики клітинного препарату для застосування в регенеративній медицини або клінічній трансплантології [заявка WO 2008110570, МПК G01N33/50, C12N5/06]. У заявці описаний метод аналізу ступеню впливу речовин та умов проведення аналізу на величину КУО ендотеліальних прогеніторних клітин для його подальшого використання в якості скринінгового тесту на виявлення позитивного або негативного впливу окремих речовин на проліферацію ендотеліальних прогеніторних клітин. Цей спосіб включає експлантацію вихідних клітин в підходящому середовищі з щільністю, що виключає контактне інгібування росту клітин, подальше інкубування клітин протягом декількох днів і проведення аналізу колоній, що утворилися. Аналіз колоній проводили шляхом їх фарбування, підрахунку та ранжування за розміром на дві групи - колонії клітин з високим проліферативних потенціалом (колонії більше певного порогового значення, рівного, залежно від складу середовища, 2 або 4 мм) і колонії з низьким проліферативним потенціалами (рівним або менше порогового значення). Недоліком даного способу є те, що спосіб обмежується лише аналізом ендотеліальних прогеніторних клітин (ендотеліальних клітин пупкового канатику людини (HUVEC); ендотеліальних клітин мікросудин людини). Так само цей винахід обмежується дослідженням тільки клітин in vitro і не може бути використано для характеристики стану клітинної популяції тканини in vivo, з якої дані клітини були виділені і, отже, не може бути використаний для оцінки стану тканини на клітинному рівні і прогнозу подальшої терапії. Відомий спосіб аналізу популяції фібробластів з шкірно-м'язової тканини 7-8-тижневих ембріонів людини [патент RU 2017818, МПК C12N5/02], що включає трипсинізацію клітин, їх експлантацію і інкубацію в живильному середовищі з наступним підрахунком веретеноподібних, парусоподібних і плеоморфних клітин. За допомогою даного способу досліджують постнатальні культури дермальних фібробластів на предмет мітотичної активності клітин шляхом підрахунку колоній з певною кількістю і щільністю клітин. 1 UA 111344 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 До недоліків способу слід віднести його трудомісткість, потребу у використанні спеціального інструментального забезпечення, суб'єктивний і якісний характер одержуваних результатів, що утруднює їх інтерпретацію і обмежує їх практичне застосування. Спосіб прогнозування перебігу дистракційного остеогенезу запропонований в патенті RU 2110798 МПК G01N33/48. Спосіб полягає в тому, що клітини кісткового мозку, наприклад грудини, експериментальної тварини або людини культивують у дифузійних камерах, які імплантують мишам внутрішньочеревинно. Через 7 діб камери витягують і з їх вмісту готують цитологічні препарати, в яких підраховують число кластерів і колоній моноцитарномакрофагального і фібробластного типів, і по їх співвідношенню розраховують прогностичний індекс (ПІ) і при ПІ> 1 прогнозують порушення процесів кісткоутворення. Автори заявляють, що даний спосіб є малотравматичним і дозволяє в ранні терміни більш точно виявляти порушення кісткоутворення, пов'язані з розладом імунологічної регуляції дистракційного остеогенезу. До недоліків даного способу слід віднести його вузькоспеціалізовану спрямованість (прогнозування перебігу дистракційного остеогенезу за оцінкою числа клоногенних клітин кісткового мозку), що обмежує можливість застосування методу для вивчення регенеративних процесів в інших тканинах і органах. Крім того, метод передбачає активне використання великої кількості лабораторних тварин (до 6 мишей на одне дослідження), що несе за собою, поряд з етичними проблемами, необхідність утримання спеціалізованого віварію і наявність кваліфікованого обслуговуючого персоналу, що значно здорожує і ускладнює застосування запропонованого способу. Відомий також спосіб прогнозування результату оперативного лікування хронічного остеомієліту [SU 1372216, МПК G01N1/28], що включає забір матеріалу, отримання клітин та їх культивування з наступним визначенням кількості колоній фібробластів кісткового мозку, що виросли, в якому, для підвищення точності способу, матеріал після забору з остеомієлітичного вогнища поміщають на 12-24 години в середовище 199 з антибіотиками, а підрахунок ефективності клонування стромальних клітин кісткового мозку роблять за формулою: ЕКФ = а * 100000 / n, де: ЕКФ = ефективність клонування, а - кількість колоній, що виросли; n - кількість кістково-мозкових клітин, і при значеннях ЕКФ не більше 5 прогнозують несприятливий результат післяопераційного періоду, а при значеннях 5.1-100000 - сприятливий результат. Як випливає з опису, даний винахід передбачає діагностичне використання тільки одного параметра - ефективності клонування клітин, виділених безпосередньо з кісткової тканини пацієнта. Зокрема, на відміну від методу, запропонованого в даному винаході, даний метод передбачає розгляд тільки добре помітних колоній, не беручи до уваги їх розподіл по щільності клітин і наявність не видимих неозброєним оком дифузних колоній, що може містити цінну діагностичну інформацію. Описаний вище параметр ефективності клонування в рівній мірі залежить від двох показників, що доповнюють один одного: кількості клітин, здатних при їх подальшому культивуванні утворювати колонії (так званих колонієутворювальних одиниць фібробластів, КУОф) і від проліферативної активності цих КУОф (тобто швидкості утворення колоній). Підрахунок же тільки одних добре сформованих колоній може призвести до заниження результатів і, в кінцевому рахунку, до спотворення істинної картини. Крім того, наявні експериментальні дані свідчать про сезонні коливання проліферативної активності клітин кісткового мозку, що негативно позначається на відтворюваності результатів і змушує авторів патенту використовувати додаткові заходи для забезпечення високої проліферативної активності клітин, зокрема, застосування фідера на основі клітин тварин, що зменшує технологічність і підвищує собівартість методу. Корроткий опис малюнків Фіг. 1. Принципова схема комп'ютерної системи. Фіг. 2. Електронне зображення типових колоній пацієнта (А) та результат їх комп'ютерної обробки для проведення морфометричного аналізу (Б). На Фіг. 3-5 представлені результати клонального аналізу. Графіки статистично-значимих залежностей, виявлених за допомогою кореляційного аналізу Пірсона, де R – коефіцієнт кореляції Пірсона (чим ближче до одиниці, тим сильніша залежність параметрів, що досліджуються) при рівні статистичної значимості α. Фіг. 3 Залежність частки дифузних колоній від інструментальної оцінки глибини зморщок (Visia, Proctоr&Gamble Со, США). Фіг. 4 Залежність частки щільних колоній від еластичності шкіри пацієнта (Cutometer MPA 580, Courage+Khazaka electronic GmbH, Німеччина). Фіг. 5 Залежність частки дифузних колоній від еластичності шкіри пацієнта (Cutometer MPA 580, Courage+Khazaka electronic GmbH, Німеччина). Фіг. 6 Електронне зображення колоній (А) і результат їх комп'ютерної обробки для 2 UA 111344 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проведення морфометричного аналізу (Б) (пацієнтка К, 56 років). Фіг. 7 Електронне зображення колоній (А) і результат їх комп'ютерної обробки для проведення морфометричного аналізу (Б) (пацієнтка Д, 36 років). Фіг. 8 Схема взаємодії основних функціональних блоків комп'ютерної системи. Фіг. 9 Алгоритм роботи програмного забезпечення. Розкриття винаходу В основі розробленого способу оцінки стану і / або виявлення патології сполучної тканини пацієнта лежить визначення регенераторного і проліферативного потенціалів клітин, що входять до складу даної тканини - фібробластів, що дає можливість оцінити регенераторний потенціал і самої сполучної тканини. Відомо, що темп оновлення сполучної тканини в дорослому організмі здійснюється завдяки функціонуванню стовбурових / прогеніторних (попередників) стромальних клітин, що дають потомство клітин, що диференціюються / диференційованих. За вмістом таких попередників стромальних клітин в сполучній тканині і оцінюють її регенераторний потенціал - здатність клітинної популяції даної тканини до відновлення її структурних компонентів замість втрачених (в результаті старіння і / або ушкоджень різного генезу). Т.ч. регенераторний потенціал може бути інтерпретований як параметр, що характеризує принципову здатність клітинної популяції до відновлення тканини. Однак цей параметр не охоплює такий показник, як швидкість регенеративних процесів. У цьому зв'язку другим важливим параметром для спільної характеристики ефективності регенеративних процесів в сполучних тканинах організму є проліферативний потенціал кількість поділів, які клітини можуть пройти до своєї загибелі, тобто, іншими словами, це здатність клітин до багаторазового поділу для збереження функціонально-активної клітинної популяції в тканині. Очевидно, чим вище проліферативний потенціал клітин, що складають дану тканину або орган, тим більше в них мітотично активних клітин і, отже, тим швидше будуть здійснюватися регенеративні процеси. Таким чином, обидва описаних вище параметри - регенераторний потенціал (наявність і кількість "активних центрів" регенерації) і проліферативний потенціал (кінетичні особливості регенеративних процесів) - доповнюючи один одного, характеризують ефективність процесів регенерації тканини (здатність тканини до відновлення). У цьому зв'язку процес зниження або втрати функцій того чи іншого органу / тканини може бути розглянутий з позиції порушення в них нормального перебігу регенеративних і, у свою чергу, зведений до зниження їх регенераторного і / або проліферативного потенціалів, а саме завдання по виявленню таких порушень зводиться до визначенню та інтерпретації цих параметрів. Реалізація даного винаходу дозволяє розширити арсенал сучасних методів оцінки стану сполучних тканин (і / або органів), виявлення в них порушень шляхом впровадження в широку клінічну практику простого, доступного і достовірного методу, заснованого на клональному аналізі субстрат-залежних клітин, що входять до складу даних тканин. Завданням, яке вирішується в рамках даного винаходу, є створення універсального способу діагностики тканин і органів живого організму на підставі аналізу популяції складових їх клітин (мезенхімних стромальних клітин, фібробластів). Отримані в результаті такого дослідження показники регенераторного і проліферативного потенціалів можуть бути використані з діагностичною та / або прогностичною метою в дерматології (наприклад, для оцінки стану дерми при її вікових змінах), стоматології (наприклад, при пародонтозі) при захворюваннях опорнорухового апарату (наприклад, при хронічному остеомієліті, некрозі голівки стегна та ін.) Так, при використанні даного винаходу для оцінки стану шкіри пацієнта, дані показники дозволяють зробити висновки про морфофункціональний стан популяції дермальних фібробластів і скласти індивідуальну програму корекції існуючих змін шкіри пацієнта та профілактики її старіння. Така програма може включати рекомендації по кількості процедур клітинної терапії (зокрема, інтрадермального введення культивованих аутологічних фібробластів), термінів їх проведення, а також - використанню косметологічних методів з урахуванням ступеню їх впливу на всі шари шкіри з метою досягнення стійкого естетичного результату без шкоди для популяції фібробластів. В основі теоретичного обґрунтування даного винаходу лежить добре відомий факт про те, що стромальні клітини-попередники, будучи субстрат-залежними клітинами, при культивуванні in vitro утворюють дискретні колонії, кожна з яких представляє собою потомство однієї клітини (клон). Таким чином, шляхом проведення клонального аналізу і визначення, наприклад, ефективності колонієутворення (ЕКЗ), яке представляє собою відношення числа колоній фібробластів, що виросли до кількості експлантованих (посіяних) клітин - можливе визначення вмісту клітин-попередників у зразку даної тканини або органу. ЕКЗ є величиною, яка відображає в клітинній культурі частку колонієутворювальних (клоногенних) субстрат-залежних клітин і, при 3 UA 111344 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідному перерахунку на масу біоптату - вміст прогеніторних клітин в тканині. Чим більша величина ефективності колонієутворення, тим більше в тканини клітин-попередників фібробластів, тим, відповідно, більше диференційованих (зрілих) функціонально-активних фібробластів, і, отже, вище регенераторний потенціал тканини і, навпаки. У результаті проведених досліджень нами виявлено, що при дотриманні спеціальних умов, результат формування колоній є високо відтворюваним (в межах 5-7 % помилки) як за кількістю колоній, що утворилися, так і за їх формою та морфологічними особливостями, для всіх клітин даної тканини або органу, що має подібні функції і місце розташування. Це дозволяє екстраполювати дані, отримані для колоній і складових їх клітин, на всю клітинну популяцію тканини, тканину і / або орган з метою оцінки їх стану та розробки рекомендацій для корекції у разі виявлення порушень. Таким чином, дослідження ЕКО-ф є найбільш інформативним і точним методом визначення регенераторного потенціалу популяції мезенхімальних стромальних клітин і, відповідно, досліджуваної тканини. Спосіб діагностики стану тканини і / або органу передбачає проведення 2-х етапів дослідження: 1. Етап попередніх досліджень. На даному етапі проводять визначення параметрів сполучної тканини донора, які визначають регенераторний і проліферативний потенціали субстрат-залежних клітин в нормі, що входять до її складу. При цьому визначення зазначених параметрів проводять в суворо контрольованих умовах на великій вибірці донорів із заздалегідь відомими результатами обстеження, що підтверджують відсутність у них патології. У результаті проведених досліджень отримують інтервал середніх значень параметрів, що визначають регенераторний і проліферативний потенціали субстрат-залежних клітин, які входять до їх складу, що відповідають нормальному стану даної тканини. 2. Етап діагностики. На даному етапі проводять визначення тих же параметрів тканини, що характеризують регенераторний і проліферативний потенціали клітин, які входять до її складу, що і на етапі попереднього дослідження, але вже у пацієнта, стан тканини (і / або органу) якого необхідно встановити. Після отримання значень зазначених параметрів їх порівнюють з певним раніше інтервалом середніх значень і роблять висновок про наявність чи відсутність патології. Слід зазначити, що етап попередніх досліджень не завжди є обов'язковим, оскільки діапазон середніх значень параметрів може бути відомий з літературних даних чи інших надійних джерел. У деяких випадках математична обробка результатів може не проводитися. Етап діагностики включає: I. Отримання придатних для візуалізації колоній субстрат-залежних клітин аналізованої тканини (і / або органу). Для цього проводять: 1. Відбір зразка тканини пацієнта; 2. Виділення життєздатних субстрат-залежних клітин зі зразка тканини в стандартних умовах; 3. Експлантація виділених клітин з щільністю, що дозволяє отримати колонії для статистично достовірного аналізу, на поверхню культурального пластика з використанням класичних методів культивування клітин; 4. Культивування клітин в стандартних умовах протягом контрольованого часу, достатнього для утворення сформованих дискретних клітинних колоній, придатних для візуалізації. II. Проведення статистично достовірного аналізу отриманих колоній. При цьому проводять: 1. Візуалізацію утворених колоній з використанням стандартних засобів і протоколів; 2. Аналіз зображень колоній з метою отримання ряду параметрів, що характеризують ріст і морфологічні особливості клітинних культур, по яких згодом визначають їх проліферативний і регенераторний потенціали. III. Обробка отриманих результатів. Докладний опис кожного з етапів: I. Отримання колоній субстрат-залежних клітин. 1. Забір зразку тканини (біоптату). Забір біоптату виконують в асептичних умовах із сполучної тканини органу, дослідження якого проводять в рамках даного Винаходу. Розташування та спосіб забору біоптату повинні бути суворо стандартизовані в межах однієї групи аналізів. Вибір ділянки біопсії тканини здійснюють виходячи з міркування забезпечення репрезентативної вибірки клітинного матеріалу, який максимально відображає стан тканини (органу), що цікавить та не пошкоджений факторами зовнішнього середовища. 2. Виділення життєздатних субстрат-залежних клітин. 4 UA 111344 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Виділення життєздатних клітин з біоптату тканини донора проводять в стерильних умовах по стандартних протоколах за допомогою протеолітичних ферментів - колагенази або ліберази. Метою даного етапу є вивільнення життєздатних клітин з міжклітинної матриксу тканини шляхом ферментативного розщеплення останнього. 3. Експлантація клітин. Точно відома і відтворена щільність експлантації клітин є однією з важливих умов успішного застосування запропонованого винаходу. Щільність експлантації клітин залежить від ряду факторів, у тому числі: типу клітин і числа пасажів in vitro, складу культурального середовища, умов і часу культивування, площі експлантації, характеру субстрату і т.д. і повинна бути визначена експериментально перед рутинним застосуванням (на Етапі попередніх досліджень), виходячи з наступного: - Оптимальною щільністю експлантації клітин можна вважати щільність, завдяки якій утворюються колонії, розміри яких і кількість складових їх субстрат-залежних клітин дозволяють провести статистично достовірний аналіз. При цьому кількість колоній не повинна бути занадто великою, щоб уникнути контактного гальмування проліферації клітин усередині колоній і їх злиття, що може призводити до утруднення інтерпретації результатів. Наприклад, для 2 фібробластів дерми оптимальною щільністю експлантації є: 1-2 клітини на см . - Точний підрахунок кількості експлантованих клітин проводять за допомогою стандартних методів, які можуть бути використані без обмежень в рамках даного винаходу. - Вибір пасажу експлантованої клітинної культури здійснюють згідно конкретної мети: дослідження можна проводити як на клітинах первинної культури (у разі дослідження популяції фібробластів шкіри пацієнта), так і на клітинах пізніших пасажів (у разі характеристик клітинного продукту перед проведенням терапії). Очевидно, що оптимальні умови для кожного з наведених варіантів підбираються індивідуально в ході проведення контрольних досліджень. Слід зазначити, що для отримання надійних відтворюваних результатів важливо використовувати протоколи експлантації і культивування клітин, ідентичні протоколам, встановленим на Етапі попередніх досліджень, включаючи умови культивування і набір реактивів / матеріалів. Останнє не завжди технічно можливо протягом тривалого періоду часу, наприклад, внаслідок неминучої витрати якого небудь реагенту з однієї партії. У цьому випадку, для забезпечення більш повного контролю за зазначеними умовами, даними Винаходом передбачається введення "внутрішніх клітинних стандартів" - використання культури клітин із заздалегідь відомими параметрами, що визначають регенераторний і проліферативний потенціали клітин. Даний "внутрішній клітинний стандарт" проходить всі ті ж етапи обробки та проведення аналізу, що і клітини з аналізованого зразка тканини. Потім проводять порівняння отриманих значень параметрів для "внутрішнього клітинного стандарту" з очікуваними, раніше визначеними аналогічними значеннями і, у разі їх розбіжності більш ніж на 10 %, проводять розрахунок коригуючого коефіцієнта, що враховує зміну умов проведення аналізу порівняно із стандартними. Після цього проводять розрахунок параметрів досліджуваних клітин з урахуванням коригуючого коефіцієнта. 4. Культивування клітин. Підхід до визначення оптимальної тривалості даної стадії з урахуванням умов культивування і типу використовуваних клітин аналогічний викладеному вище. При цьому визначення оптимального часу інкубування клітин у культуральному середовищі та стандартизація умов є одним з критично важливих чинників отримання відтворюваних і статистично достовірних результатів. II. Проведення статистично достовірного аналізу колоній 1. Візуалізація колоній. Основною метою даного етапу є отримання зображення колоній, що утворилися у вигляді, зручному для аналізу, в тому числі із застосуванням засобів обчислювальної техніки і морфометричного програмного забезпечення. Дозвіл одержуваного зображення, його формат, а також - засоби для отримання самого зображення вибирають виходячи з конкретних завдань та параметрів, що характеризують клітинну культуру (див. нижче). Прикладом таких зручних технічних рішень може бути використання побутових і професійних сканувальних пристроїв, цифрової фото- і відеотехніки, оптичної та електронної мікроскопії і т.д. з отриманням електронного зображення колоній високої чіткості з роздільною здатністю не менше 800 dpi. 2. Аналіз клітинних колоній з метою кількісної оцінки параметрів, що характеризують клітинну культуру. Метою даної стадії є оцінка об'єктивних кількісних / напівкількісних параметрів, що характеризують властивості клітинної культури за морфометричними ознаками колоній, що сформувалися і складових їх клітин. До таких параметрів можна віднести: 5 UA 111344 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - загальну кількість колоній, що утворилися. Відповідно до існуючої практики [1,2], слід стандартизувати мінімальну кількість клітин, що складають колонію. Такою величиною може бути, зокрема, значення як 20, так і 50 клітин. Клони, до складу яких входить менше число клітин, колоніями не вважають і, відповідно, при підрахунку не враховують. - ефективність колонієутворення. Даний параметр характеризує здатність субстратзалежних клітин утворювати колонії і представляє відношення кількості колоній, що виросли до загальної кількості експлантованих клітин. - будь-які параметри, що описують форму і розміри колоній. До таких параметрів, зокрема, можна віднести загальну площу всіх колоній, середню площу колоній, їх лінійні розміри, загальний або середній периметр колоній, розподіл їх за розмірами, частку колоній, розмір яких лежить в певному діапазоні і т.д. Наприклад, у разі введення умовних критичних величин для лінійного розміру колонії, можливий поділ колоній на "великі", "середні", "малі" та обчислення частки кожного типу таких колоній, їх співвідношення і т.п. - будь-які параметри, що описують структурні та морфологічні характеристики колоній. До таких параметрів можна віднести: - розподіл колоній за кількістю клітин, з яких вони складаються або щільність, з якою клітини розташовуються в колонії. Наприклад, у разі введення умовних середніх величин для числа клітин, з яких складаються колонії, можливий поділ колоній на "щільні", "дифузні", "змішані" і обчислення частки колоній різної щільності, їх співвідношення тощо; - частка колоній з кількістю клітин, які лежать в заданому інтервалі; - розподіл колоній за формою клітин, з яких вони складаються. Наприклад, у колоніях фібробластів шкіри розрізняють такі клітини: веретеноподібні (вузькі довгі клітини з відношенням довгої і короткої сторін більше 5), парусоподібні (великі, розміром 40 і більше мкм розпластані клітини з відношенням довгої і короткої сторін менше 3) та ін. Так, колонії, що складаються, з більш ніж 75 % веретеноподібних клітин можна позначити як "веретеноподібні", відповідно, колонії з більш 75 % парусоподібних клітин - "парусоподібні", проміжні варіанти – "змішані" колонії; - можливе також використання будь-якої комбінації перерахованих вище методів, а також похідних величин, отриманих з використанням зазначених вище параметрів. Слід зазначити, що набір можливих параметрів не обмежується наведеним вище списком і може включати будь-які інші параметри та їх комбінації, які характеризують форму, розмір, кількість, щільність розташування і т.д. як самих колоній, так і клітин, що входять до їх складу. III. Обробка отриманих результатів Даний етап передбачає проведення аналізу отриманих значень регенераторного і проліферативного потенціалів та їх інтерпретацію. Доцільно на даному етапі використовувати математичні методи, вибір алгоритму яких залежить від досліджуваного зразка, цілей дослідження і параметрів, отриманих за допомогою клонального аналізу. На даному етапі можливе зіставлення отриманих величин, що характеризують колонії, з контрольними (середніми) значеннями, що зберігаються в базі даних або пам'яті, доступних для порівняння. Метою даного етапу є оцінка параметрів, що характеризують колонії досліджуваних клітин шляхом порівняння їх значень з контрольними (середніми) величинами, отриманими на Етапі попередніх досліджень і формування висновку про стан досліджуваної клітинної популяції, тканини (органу). Проведення даної стадії передбачає використання засобів обчислювальної техніки, статистичного аналізу та математичного моделювання з метою отримання об'єктивної, статистично достовірної інформації (тобто з рівнем статистичної значущості α менше 5 % (