Європейський штам prrsv

Реферат: Винахід належить до вірусів репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV) європейського типу, який являє собою штами, депоновані в Європейській колекції клітинних культур (ECACC) під реєстраційними номерами ECACC 11012501 та ECACC 11012502. Винахід також стосується способу одержання живої ослабленої вакцини для боротьби з PRRS, яка містить заявлені віруси та саму вакцину. UA 112768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід належить до живого ослабленого штаму вірусу європейського репродуктивнореспіраторного синдрому свиней (PRRSV), способів одержання таких штамів, вакцин на їх основі і способів одержання зазначених вакцин та їх застосування для лікування свиней. Передумови створення винаходу Репродуктивно-респіраторний синдром свиней (PRRS) розглядається багатьма фахівцями як найбільш важливе захворювання, яке в даний час завдає шкоди свинарству в усьому світі. Синдром був описаний вперше в 1987 р. в Сполучених Штатах як «загадкова хвороба свиней» і він швидко поширився по всьому світу. Цей синдром викликає значні репродуктивні втрати, він асоційований з підвищеним рівнем смертності від вторинних інфекцій і пов'язаний зі зниженням конверсії корму та середнього добового приросту маси. На жаль, виявилося, що здійснення контролю вірусу, що викликає PRRS, є складним. Вірус PRRS (PRRSV) являє собою покритий оболонкою одноланцюговий РНК-овий вірус, який згідно з класифікацією належить до сімейства Arteriviridae (Cavanaugh, 1997). Він викликає широко поширене захворювання свиней, яке було вперше описано в США в 1987 р. як «загадкова хвороба свиней» (Hill, 1990). Хвороба проявляється у формі респіраторного захворювання у всіх вікових групах свиней, приводячи до загибелі деяких більш молодих свиней і до серйозних проблем, пов'язаних з репродуктивною здатністю у самок случного віку. Передача PRRSV може відбуватися і часто відбувається шляхом безпосереднього контакту між інфікованими і сприйнятливими свинями. Перенесення вірусу може відбуватися також по повітрю на дуже короткі відстані або разом зі спермою. Після зараження вірус може зберігатися в крові дорослих тварин впродовж приблизно двох тижнів, а в організмі заражених молодих свиней впродовж одного-двох місяців або більше. Заражені кнури можуть передавати вірус зі спермою впродовж більш ніж 100 днів. Такий тривалий період віремії значно підвищує можливість трансмісії захворювання. Крім того, вірус PRRS може проникати через плаценту впродовж останньої третини періоду вагітності, заражаючи поросят в матці і приводячи до народження мертвих або ослаблених поросят. Вірус PRRS може заражати стада всіх типів і розмірів, включаючи стада, що характеризуються високим або звичайним статусом здоров'я, а також утримуються в закритих приміщеннях або на відкритому повітрі. У заражених стадах можуть мати місце значні втрати репродуктивності, а також підвищені рівні поствід'ємної пневмонії, що супроводжується слабким зростанням. Репродуктивна фаза, як правило, триває впродовж двох-трьох місяців; однак проблеми в поствід'ємний період часто набувають ендемічного характеру. Репродуктивне захворювання характеризується спалахом викиднів, що вражає як свиноматок, так і підсвинок на останньому триместрі вагітності. Мають місце передчасні опороси в період приблизно з 109 по 112 день вагітності. Зростає кількість мертвонароджених плодів і випадків народження ослаблених поросят, що призводить до значного збільшення смертності в передвід'ємний період. Традиційно респіраторна фаза спостерігалася в розплідниках, насамперед у розплідниках з безперервно-потоковою системою виробництва. Однак респіраторні проблеми, викликані вірусом PRRS, можуть виявлятися також у свиней на завершальному періоді відгодівлі у формі компонента респіраторного симптомо-комплексу свиней (PRDC). Може мати місце зниження швидкості росту, збільшення відсотка нетоварних свиней і підвищення поствід'ємної смертності. Результати діагностичних досліджень свідчать про високі рівнях пневмонії, асоційованої з вірусом PRRS, а також з широким розмаїттям інших мікроорганізмів, які зазвичай виступають у ролі вторинних збудників інфекції. Бактеріальні ізоляти можуть включати серед іншого Streptococcus suis, Haemophilus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Mycoplasma hyopneumoniae и Pasteurella multocida. Вірусними агентами, що зазвичай зустрічаються в цьому випадку, є вірус свинячого грипу і респіраторний коронавірус свиней. Уражені свині рідко дають відповідь на застосовувані у високих дозах лікарські засоби, і захворювання не вдається контролювати за допомогою систем одночасного заповнення приміщення тваринами і одночасного їх видалення. Вірус PRRSV існує у вигляді двох генотипів, позначених як «US-тип» - і «EU-тип», що характеризуються приблизно 50%-ною гомологією послідовностей (Dea S. та ін, Arch Virol 145, 2000, сс. 659-688 ). Ці два генотипи можна розрізняти також по їх імунологічних властивостях. Найбільший обсяг інформації при секвенуванні різних ізолятів отримують на основі структурних білків, а саме, оболонкового білка GP5, на частку якого припадає лише приблизно 4% вірусного генома, в той час як про неструктурні білки (nsp) є дуже мало відомостей. Виділення PRRSV та отримання вакцин описано в численних публікаціях (WO 92/21375, WO 93/06211, WO93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0 676 467, EP 0 732 340, EP 0 835 930). 1 UA 112768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вакцинація являє собою метод зниження який має вирішальне значення пов'язаного з PRRS навантаження, оскільки у свиней, які одужали після PRRS-інфекції, повинна розвинутися імунна відповідь, яка в звичайних умовах має захищати їх від повторного зараження тим же штамом вірусу. Проте вірус PRRS має здатність змінюватися (за допомогою мутації або рекомбінації); і, отже, можуть виникати нові вірусні штами. У таких випадках може не мати місце перехресний захист від різних штамів і на фермах, які були інфіковані раніше, можуть відбуватися нові спалахи захворювання. Таким чином, все ще існує необхідність у розробці додаткових вакцин. Короткий виклад суті винаходу Даний винахід належить до поліпшених модифікованих живих вакцин проти PRRS на основі вірусу європейського генотипу і до нових штамів PRRSV, які можна застосовувати для приготування таких вакцин. Зокрема, винахід належить до поліпшених штамів вірусу PRRS, депонованих в Європейській колекції клітинних культур (ECACC) під реєстраційними номерами ECACC 11012501 і ECACC 11012502, кожен з яких був депонований 25 січня 2011 відповідно до Будапештського договору, або до будь-якого потомства або покоління будь-якого з вищевказаних штамів. Конкретні варіанти здійснення даного винаходи належать до вірусу репродуктивнореспіраторного синдрому свиней (PRRSV) Європейського типу, який представляє собою штам, депонований в Європейській колекції клітинних культур (ECACC) під реєстраційним номером ECACC 11012501 або реєстраційним номером ECACC 11012502. Зазначений PRRSV характеризується тим, що вірус ослаблений за допомогою здійснення щонайменше 36 пасажів в клітинній культурі, в результаті чого в тому випадку, коли модифікований вірус вводять свині або іншому ссавцю, сприйнятливому до PRRSV, він виявляється нездатним призводити до появи клінічних ознак захворювання що викликається PRRSV , але здатним індукувати імунну відповідь, який імунізує ссавець до патогенних форм PRRSV. Запропонований також спосіб отримання живого ослабленого PRRSV, депонованого в Європейській колекції клітинних культур (ECACC) під реєстраційним номером ECACC 11012502, або вірусу, отриманого шляхом ослаблення батьківського штаму, який депонований під реєстраційним номером ECACC 11012501, що полягає в тому, що здійснюють адаптацію вирощеного на клітинах лінії MA 104 PRRSV Європейського типу до клітин ссавців, які не представляють собою MA 104-клітини. Інший об'єкт винаходу стосується вакцини, призначеної для захисту свиней від інфекції PRRSV, яка містить живий ослаблений PRRSV, депонований в Європейській колекції клітинних культур (ECACC) під реєстраційним номером ECACC 11012502, або вірус, отриманий шляхом ослаблення батьківського штаму, який депонований під реєстраційним номером ECACC 11012501, і фармацевтично прийнятний носій. Така вакцина переважно може містити також один або кілька таких, що не належать до PRRSV ослаблених або інактивованих патогенів або їх антигенних компонентів. Наприклад, не відносяться до PRRSV патогени можуть бути обрані з вірусу псевдосказу, вірусу свинячого грипу, свинячого парвовіруса, вірусу інфекційного гастроентериту, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae і Actinobacillus pleuropneumoniae. В інших варіантах здійснення винаходу вакцина може містити також один або кілька додаткових штамів європейського PRRSV, вибраного (их) з групи, що складається з штаму PRRSV, депонованого під реєстраційними номерами вірусного штаму Лелістад (агент Лелістад (CDI-NL-2.91)), або інших штамів, таких як штами, депоновані під реєстраційними номерами ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, реєстраційним номером CNCM I-1140, реєстраційним номером CNCM I-1387, реєстраційним номером CNCM I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 і VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 або ECACC V93070108, або який насправді може являти собою штам USгенотипу, такий як північноамериканський вірус PRRS, pT7P129A; ATCC-депозит VR-2332, ATCC-депозит VR-2368; ATCC VR-2495; ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429 , ATCC VR 2474 і ATCC VR 2402. Мається на увазі також, що вакцина може містити носій, придатний для внутрішньошкірного або внутрішньом'язового введення. У деяких варіантах здійснення винаходу вакцина знаходиться в висушеній виморожуванням формі. У конкретних варіантах здійснення винаходу 7 вакцина містить щонайменше приблизно 10 вірусних частинок. Наступний об'єкт винаходу належить до способу одержання живої ослабленої вакцини для боротьби з PRRS, що полягає в тому, що змішують живий ослаблений вірус PRRSV, депонований в Європейській колекції клітинних культур (ECACC) під реєстраційним номером 2 UA 112768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ECACC 11012502, або вірус, отриманий шляхом ослаблення батьківського штаму, депонованого під реєстраційним номером ECACC 11012501, з фармацевтично прийнятним носієм. У таких способах живий ослаблений PRRSV переважно може додатково містити один або кілька європейських штамів PRRSV, вибраних з групи, що містить штам PRRSV, депонований під реєстраційними номерами ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, реєстраційним номером CNCM I-1140, реєстраційним номером CNCM I-1387 та реєстраційним номером CNCM I-1388. У деяких варіантах здійснення винаходу живий ослаблений PRRSV може додатково містити ад'ювант. Запропонований також спосіб імунізації свині проти репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRS), де спосіб полягає в тому, що здійснюють стадію, на якій вводять свині композицію вакцини, що включає живий вірус репродуктивно-респіраторного синдрому свиней, змішаний з фармакологічно сумісним носієм, де вірус представляє собою вірус PRRS 94881, отриманий шляхом здійснення щонайменше 36 пасажів в клітинній культурі з метою модифікації вірусу таким чином, щоб при введенні модифікованого вірусу свині або іншому ссавцю, сприйнятливому до PRRS, він не мав здатність викликати клінічні симптоми захворювання PRRS, але був здатний індукувати імунну відповідь, яку імунізує ссавець проти патогенних форм PRRS. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб здійснюють таким чином, що у свині відсутні пошкодження легень після вакцинації. В інших варіантах здійснення винаходу після вакцинації у свині мають місце менші пошкодження легень, ніж у випадку використання вакцини Porcilis. Наступний об'єкт винаходу належить до вірусу PRRS, нуклеотидна послідовність якого, щонайменше на 95% гомологічна послідовності, представленій або в SEQ ID NO: 1, або в SEQ ID NO: 10. Запропонований також вірус PRRS, який містить щонайменше одну ОРС, яка кодує білок, послідовність якого ідентична щонайменше на 98% будь-якій з послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 9 або в SEQ ID NO: 11 - SEQ ID NO: 18. Запропонований також вірус PRRS, який має нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 10, або фрагмент або SEQ ID NO: 1, або SEQ ID NO: 2, де фрагмент кодує ОРС, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 і SEQ ID NO: 18. Винахід належить також до субодиничної вакцини, призначеної для вакцинації свині, де вакцина містить один або кілька нуклеотидів, вибраних з групи, що складається з нуклеотидів, які кодують ОРС, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 і SEQ ID NO: 18. Інший об'єкт винаходу стосується субодиничної вакцини, призначеної для вакцинації свині, де вакцина містить один або кілька нуклеотидів, вибраних з групи, що складається з SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33 і SEQ ID NO: 34. Запропонована також композиція, що містить один або кілька білків, вибраних з групи, яка складається з білків, що мають послідовності SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18. Запропонована також виділена нуклеїнова кислота, що містить послідовність, яка вибрана з групи, що складається з SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34. Винахід належить також до рекомбінантного експресійного вектору і / або вакцини, яка містить такі експресійні вектори, де зазначені вектори містять нуклеотидну послідовність, що кодує одну або кілька ОРС PRRSV, яка (і) вибрана (і) з групи, що складається з SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 і SEQ ID NO: 18, функціонально пов'язану (і) з промотором. У таких варіантах здійснення винаходу нуклеїнова кислота, що кодує ОРС, краще може бути вибрана з 3 UA 112768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 групи, що містить SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33 і SEQ ID NO: 34. Короткий опис декількох аспектів креслень На кресленнях показано: на фіг. 1A: бальна оцінка кашлю, встановлена за результатами клінічних обстежень, при використанні моделі респіраторного контрольного зараження із застосуванням європейського штаму для контрольного зараження; на фіг. 1Б: загальний клінічний бал, встановлений за результатами клінічних обстежень, при використанні моделі респіраторного контрольного зараження із застосуванням європейського штаму для контрольного зараження; на фіг. 2: результати вимірювань ректальної температури при використанні моделі респіраторного контрольного зараження із застосуванням європейського штаму для контрольного зараження; на фіг. 3: результати вимірювань середнього добового приросту маси при використанні моделі респіраторного контрольного зараження із застосуванням європейського штаму для контрольного зараження; на фіг. 4: рівень PRRS-віремії за даними аналізу методом кількісної ПЛР при використанні моделі респіраторного контрольного зараження із застосуванням європейського штаму для контрольного зараження; на фіг. 5: результати серологічного аналізу PRRS методом ELISA при використанні моделі респіраторного контрольного зараження із застосуванням європейського штаму для контрольного зараження; на фіг. 6: результати макроскопічного дослідження ушкоджень легень при використанні моделі респіраторного контрольного зараження із застосуванням європейського штаму для контрольного зараження; на фіг. 7А-7В: результати гістопатологічних аналізів. На фіг. 7A представлені результати оцінки середніх макроскопічних ушкоджень; на фіг. 7Б представлені результати гістопатологічного дослідження контрольного тварини; на фіг. 7В представлені результати гістопатологічного дослідження тварини, зараженого PRRS. на фіг. 8: результати ОТ-ПЛР у реальному часі, що демонструють% віремії у тварин, вакцинованих EU PRRS 94881. на фіг. 9: паралельний процес великомасштабного одержання EU PRRS 94881. Детальний опис винаходу У даному винаході запропоновані способи лікування або зниження серйозності інфекції, спричиненої вірусом репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV), а також способи попередження інфекції, спричиненої PRRSV. У цілому спосіб призначений для лікування або зниження серйозності інфекції або коефіцієнта захворюваності, спричиненої вірусом репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV). Поняття «лікування або зниження серйозності або зустрічальності» відноситься до зниження серйозності клінічних ознак, симптомів і / або патологічних ознак, які, як правило, асоційовані з інфекцією, аж до їх припинення і включаючи попередження виникнення будь-яких таких ознак або симптомів. Поняття «патологічні ознаки» відноситься до прояву інфекції, який виявляють шляхом мікроскопічного обстеження або при аутопсії (наприклад, пошкодження легень). Спосіб, як правило, включає здійснення стадії, на якій вводять в терапевтично ефективній кількості антиген PRRSV свині певного віку або що знаходиться в певному віковому діапазоні. Наприклад, відповідно до одного з об'єктів винаходу антиген PRRSV можна вводити в одній терапевтичній кількості поросяті віком приблизно три тижні або менше, а свині віком від приблизно 3 тижнів до 4 тижнів можна вводити антиген в інших терапевтичних кількостях. Аналогічно цьому його можна вводити в абсолютно інших терапевтичних кількостях свині віком від приблизно чотирьох тижнів до шістнадцяти тижнів (або в будь-якому віці, що знаходиться в зазначеному діапазоні, наприклад, у віці від п'яти тижнів до шести тижнів, у віці від дев'яти тижнів до п'ятнадцяти тижнів, у віці від семи тижнів до десяти тижнів і т.д.), або свині старше шістнадцяти тижнів, такій, як доросла свиноматка. Конкретні варіанти здійснення даного винаходу належать до ослабленого атипового штаму PRRSV і відповідних поліпшених модифікованих живих вакцин, які забезпечують ефективний імунітет до зазначеного нового відкритого типового штаму PRRSV. Поняття «ефективний імунітет» відноситься до здатності вакцини попереджати інфекції, що викликаються PRRSV у свиней, включаючи інфекції, що викликаються атиповим PRRSV, які призводять до виражених клінічних ознаках захворювання. Слід розуміти, що імунізована свиня може мати, але може і не 4 UA 112768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 мати PRRSV-позитивний серологічний статус, але при цьому у свині не проявляються ніякі виражені клінічні симптоми. Кращі форми вакцини, запропонованої у винаході, включають живий вірус PRRS європейського типу, у якого ослаблена вірулентність. У дослідах на тваринах-господарях з використанням контрольного зараження було продемонстровано, що отриманий таким шляхом ослаблений вірус є авірулентним і забезпечує ефективний імунітет. Зазначений конкретний штам EU PRRS не має таку вірулентність, як інші, і, отже, є кращим в якості кандидата для отримання вакцини. Батьківський штам PRRSV 94881 не викликає ні серйозного атипового захворювання PRRS у вагітних самок, ні серйозних пошкоджень легень у молодих свиней. Цей штам спочатку був виділений в області Північний Рейн-Вестфалія, Німеччина, з організму поросяти 3-тижневого віку з серйозним респіраторним порушенням. Потім штам послідовно послаблювали за допомогою здійснення безперервних пасажів на клітинах лінії MA 104. Ослаблений штам був депонований фірмою Bioscreen GmbH, Mendelstrasse 11, 48149, Мюнстер, Німеччина в Європейській колекції клітинний культур (ECACC), Портон Даун, Солсбері, графство Уїлтшир, SP4 0JG, Великобританія, 25 січня 2011 р. і йому було присвоєно реєстраційний номер 11012502 . Зазначений ослаблений вірус являє собою кращий вихідний вакцинний вірус (MSV), який був підданий послідовним пасажам і перетворений на ефективну вакцину на основі PRRSV. Вірулентний батьківський штам, позначений як 94881, також був депонований відповідно до Будапештського договору фірмою Bioscreen GmbH, Mendelstrasse 11, 48149, Мюнстер, Німеччина, в Європейській колекції клітинний культур (ECACC), Портон Даун, Солсбері, графство Уїлтшир, SP4 0JG, Великобританія , 25 січня 2011 р. і йому було присвоєно реєстраційний номер 11012501. У конкретних варіантах здійснення винаходу модифіковану живу вірусну вакцину тестували, вводячи її шляхом внутрішньом'язової ін'єкції в дозі 1 мл молодим свиням і в дозі 2 мл свиноматкам, і була продемонстрована її ефективність відносно створення захисного імунітету. Пасажі вірусу з метою його ослаблення здійснювали згідно класичним вірусологічним методам. Конкретно, батьківський ізолят PRRS 94881 послаблювали in vitro за допомогою здійснення безперервних пасажів на клітинах лінії MA 104, здійснюючи максимум 108 пасажів після первісного виділення. У цілому, матеріал пересівали приблизно 1-2 рази на тиждень, 2 здійснюючи в цілому 108 пасажів в T-колбах (25 см ) або T-колбах (75 см2). Конфлюентні культури клітин лінії MA 104 в приблизно 12-30 мл мінімального підтримуючого середовища (MEM), доповненого 6% фетальної бичачої сироватки (FBS) інокулювали 100-300 мкл вірусу. Культури інкубували впродовж 3-7 днів у вологій камері при 37 º C в атмосфері, що містить 4-6% CO2. Після того, як цитопатична дія (ЦПД) культур досягала> 25%, здійснювали збір з колб шляхом екстракції супернатанта. Частину супернатанта переносили в нову колбу, а 2 мл зібраного продукту поміщали у вигляді аліквот на збереження при температурі від -60ºC до 80ºC. Фахівець у даній галузі може за допомогою стандартних методів визначати нуклеотидну послідовність, яку має ослаблений вірус, депонований в ECACC під реєстраційним номером 11012502. Таким чином, під обсяг даного винаходу підпадає також нуклеотидна послідовність, специфічна для ослабленого PRRSV 94481, депонованого в ECACC під реєстраційним номером 11012502. Краще під обсяг винаходу підпадають також нуклеотидні послідовності вірусу PRRS, які мають щонайменше 95%-ну гомологію послідовності з послідовністю, представленою в SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 10, оскільки такі віруси, мабуть, можуть мати ефективність щодо забезпечення імунітету у тварин, вакцинованих ослабленими вірусами, що містять такі гомологічні послідовності. Послідовність, представлена в SEQ ID NO: 1, є повнорозмірною послідовністю ослабленого MSV PRRS 94881 і повна довжина послідовності становить 14843 пар основ. Нижче наведено дані про ОРС з 1 по 7 для зазначеної послідовності: Номер ОРС ОРС1a ОРС1b ОРС 2 ОРС3 ОРС4 ОРС5 ОРС6 ОРС7 CDS у SEQ ID NO: 1 з 178 по 7227 з 7209 по 11600 з 11611 по 12360 з 12219 по 13016 з 12761 по 13312 з 13309 по 13914 з 13902 по 14423 з 14413 по 14799 Білок, який кодується SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 50 Послідовність, представлена у SEQ ID NO: 10, є повнорозмірною послідовністю 5 UA 112768 C2 батьківського штаму PRRSV 94881, отриманого після пасажу 5, і повна довжина послідовності становить 14843 пар основ. Нижче наведено дані про ОРС з 1 по 7 для зазначеної послідовності: Номер ОРС ОРС1a ОРС1b ОРС2 ОРС3 ОРС4 ОРС5 ОРС6 ОРС7 CDS у SEQ ID NO: 10 з 178 по 7227 з 7209 по 11600 з 11611 по 12360 з 12219 по 13016 з 12761 по 13312 з 13309 по 13914 з 13902 по 14423 з 14413 по 14799 Білок, який кодується SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Після виділення зазначеного нового ослабленого штаму європейського вірусу PRRS можна отримувати покращені вакцини проти PRRS, які містять найсучасніший штам вірусу PRRS, який відповідає вірулентним штамам PRRS, виявленим в даний час в польових умовах. Зокрема, новий ослаблений європейський вірус PRRS можна застосовувати для одержання модифікованих живих вакцин (MLV). Модифікована жива вакцина характеризується тим, що вона містить живий вірус, який може розмножуватися в організмі свиней, але який не викликає клінічного захворювання PRRS. Крім того, після введення він індукує імунологічну відповідь у свиней, яка, як правило, забезпечує значний рівень захисту від повторної інфекції, спричиненої патогенним вірусом PRRS. Вірус з такими характеристиками, зазвичай називають ослабленим вірусом. Крім того, в даному винаході представлено докладний опис послідовностей ОРС як батьківського, так і ослабленого штамів PRRSV 94881. Таким чином, передбачається, що фахівець в даній галузі може застосовувати послідовності однієї або декількох ОРС, представлених у даному описі, у субодиничній вакцині. Як зазначено вище, в цілому, ослаблений вірус можна створювати з патогенних ізолятів вірусу за допомогою здійснення повторних пасажів з використанням придатних клітингосподарів, які є пермісивними (тобто сприйнятливими до вірусу клітинами, здатними забезпечувати його репродукцію) для вірусу, до тих пір , поки вірус не отримає необхідні властивості (WO 92/21375 , WO 93/06211, WO93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0676467, EP 0732340, EP 0835930). В альтернативному варіанті його можна створювати шляхом генетичної інженерії з використанням інфекційного клону, як правило, повнорозмірного транскрипту комплементарної ДНК вірусного генома (WO 98/18933, EP 1018557, WO 03/062407, Nielsen і ін, J Virol, 77, 2003, сс . 3702-3711). Кращий варіант здійснення винаходу стосується MLV, яка містить ослаблений вірус PRRS європейського генотипу 94481, який отримано шляхом ослаблення батьківського вірусу, депонованого в ECACC під реєстраційним номером 11012501. Краща MLV містить ослаблений вірус, пропонований в даному винаході, яка зберігатиметься в ECACC під реєстраційним номером 11012502. Інший об'єкт даного винаходу належить до отримання та виділення потомства або покоління вірусу PPRS, депонованого 25 січня 2011 в Європейській колекції клітинних культур (ECACC), Портон Даун, Солсбері, графство Уїлтшир, SP4 0JG, Великобританія, під реєстраційними номерами ECACC 11012502 (ослаблений штам для MLV) і 11012501 (батьківський штам). Таким чином, винахід поширюється на штами вірусу PRRS, які виведені з депонованих штамів шляхом розмноження або мультиплікації в ідентичній або дивергентній формі, насамперед на нащадків, які мають необхідні характеристики депонованих штамів. При продовженні розмноження штами можуть набувати мутації, більшість з яких не має суттєво змінювати властивості зазначених штамів. Штами, пропоновані у винаході, можна піддавати також додатковій модифікації з метою надання їм додаткових бажаних властивостей. Це можна здійснювати за допомогою класичних методів розмноження та відбору, таких як безперервне розмноження в придатних клітинахгосподарях до отримання ослабленого фенотипу. В альтернативному варіанті штами можна генетично модифікувати шляхом здійснення спрямованої мутації нуклеотидної послідовності з генома цих штамів за допомогою придатних методів генетичної інженерії. Геном PRRSV був повністю або частково секвенований (Conzelmann та ін, 1993; Meulenberg та ін, 1993a, Murtaugh та ін, 1995), він кодує крім РНК-залежної РНК-полімерази (ОРС1a і ОРС1b), шість структурних білків, які представляють собою чотири оболонкових глікопротеїна, позначені як GP2 (ОРС2), GP3 (ОРС3), GP4 (ОРС4) і GP5 (ОРС5), неглікозильований мембранний білок M (ОРС6) і нуклеокапсидний білок N (ОРС7) (Meulenberg та ін, 1995, 1996; van Nieuwstadt та ін, 1996). 6 UA 112768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Шляхом імунологічної характеризації та нуклеотидного секвенування європейських штамів і USштамів PRRSV були виявлені невеликі антигенні відмінності в штамах PRRSV, локалізовані в структурних вірусних білках (Nelson та ін, 1993; Wensvoort та ін, 1992; Murtaugh та ін., 1995). Порівняння MSV PRRS 94881, запропонованого в даному винаході, зі штамом європейського референс-вірусу, а саме, вірусом Лелістад (LV), виявило гомології нуклеотидних послідовностей на рівні від 85,40 до 95,09 відсотків у 8 різних вірусних генів та ідентичності амінокислот на рівні від 86,39 до 97,27 відсотків між обома вірусними штамами. При порівнянні з LV можна ідентифікувати дві делеції в ОРС1a MSV 94881. Наприклад, ОРС1a MSV 94881 має 85,40%-ну гомологію нуклеотидів з вірусом Лелістад, що обумовлює ідентичність амінокислот на рівні 86,39%; ОРС1b MSV 94881 має 92,12%-ну гомологію нуклеотидної послідовності з вірусом Лелістад, що обумовлює ідентичність амінокислот на рівні 97,27%; ОРС2 MSV 94881 має 91,07%-ну гомологію нуклеотидної послідовності з вірусом Лелістад, що обумовлює ідентичність амінокислот на рівні 90,76%; ОРС3 MSV 94881 має 90,98%-ну гомологію нуклеотидної послідовності з вірусом Лелістад, що обумовлює ідентичність амінокислот на рівні 89,43%; ОРС4 MSV 94881 має 90,58%-ну гомологію нуклеотидної послідовності з вірусом Лелістад, що обумовлює ідентичність амінокислот на рівні 87,43%; ОРС5 MSV 94881 має 90,43%-ну гомологію нуклеотидної послідовності з вірусом Лелістад, що обумовлює ідентичність амінокислот на рівні 88,56%; ОРС6 MSV 94881 має 95,02%-ну гомологію нуклеотидної послідовності з вірусом Лелістад, що обумовлює ідентичність амінокислот на рівні 97,11%; ОРС7 MSV 94881 має 95,09%-ну гомологію нуклеотидної послідовності з вірусом Лелістад, що обумовлює ідентичність амінокислот на рівні 92,97%; Фактично вірус PRRS 94881, запропонований в даному винаході, може бути створений у вигляді химерного вірусу з каркасом вірусу PRRS, що має реєстраційний номер ECACC 11012502, або фактично батьківський штам, депонований під реєстраційним номером ECACC 11012501, модифікують шляхом заміни ендогенної послідовності однієї або декількох з ОРС 1a, ОРС 1b, ОРС 2, ОРС 3, ОРС 4, ОРС 5, ОРС 6 або ОРС 7 на відповідну ОРС з іншого штаму вірусу PRRS. Наприклад, інший штам вірусу PRRS може являти собою інший європейський штам, такий як штам вірусу Лелістад (агент Лелістад (CDI-NL-2.91)), або інші штами, такі як штами, депоновані під реєстраційними номерами ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704 , реєстраційним номером CNCM I-1140, реєстраційним номером CNCM I-1387, реєстраційним номером CNCM I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 і VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 або ECACC V93070108, або в дійсності він може являти собою US-штам, такий як північноамериканський вірус PRRS, pT7P129A; депозит ATCC VR-2332, депозит ATCC VR-2368; ATCC VR-2495; ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 і ATCC VR 2402. Методи рекомбінації, застосовувані для одержання модифікованих послідовностей, добре відомі фахівцям в даній галузі, і, як правило, в них застосовують конструювання повнорозмірних копій комплементарної ДНК (інфекційні клони) вірусного генома, які потім можна модифікувати за допомогою методів рекомбінації і маніпулювання ДНК (типу сайт -направленого мутагенезу і т.д.). Таким шляхом можна, наприклад, модифікувати антигенні сайти або ферментативні властивості вірусних білків. У літературі описані інфекційні клони штамів вірусу PRRS європейського та північноамериканського генотипу. Штами вірусу PRRS, запропоновані в даному винаході, які придатні для вакцин, запропонованих у винаході, можна вирощувати і збирати методами, відомими в даній галузі, наприклад, шляхом розмноження в придатних клітинах-господарях, таких як мавпяча клітинна лінія MA-104, клітини лінії Vero або свинячі альвеолярні макрофаги. PRRSV бажано вирощують в альвеолярних легеневих макрофагах (Wensvoort та ін., 1991). Кілька клітинних ліній, таких як CL2621 та інші клітинні лінії, клоновані з лінії клітин нирки мавпи MA-104 (Benfield та ін, 1992; Collins та ін, 1992; Kim та ін, 1993), також сприйнятливі до вірусу. Таким чином, вакцини, що містять будь-який з штамів PRRSV з реєстраційним номером ECACC 11012501, 11012501 реєстраційними номерами ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, реєстраційним номером CNCM I-1140, реєстраційним номером CNCM I-1387 та реєстраційним номером CNCM I-1388, а також будь-які комбінації зазначених штамів або їх нащадком, являють собою кращі варіанти здійснення даного винаходу. У конкретних варіантах здійснення винаходу вірус PRRS 94881 вирощують за допомогою способу, в якому виготовляють паралельне висівання вірусу і клітин-господарів в один і той же день в біореактор, що продемонстровано на фіг. 9. Додаткові відмітні ознаки способу отримання вірусу PRRS 94881 можуть бути такими ж, що й описані в одночасно зареєстрованій попередній заявці на патент США, під заголовком «Спосіб отримання PRRSV в комерційному масштабі », яка зареєстрована одночасно з цією заявкою під номером 61/444071. Хоча представлений один 7 UA 112768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спосіб вирощування PRRSV 94881, слід розуміти, що вірус можна розмножувати за допомогою будь-якого загальноприйнятого методу, відомого фахівцям в даній області. Бажано вакцини, запропоновані в даному винаході, являють собою модифіковані живі вакцини, що містять один або кілька зазначених живих штамів в придатному носії, але можна застосовувати також інактивований вірус для одержання вбитої вакцини (KV). Як правило, MLV 1 7 включають в препаративну форму таким чином, щоб забезпечувати введення від 10 до 10 3 5 4 5 вірусних частинок на дозу, краще від 10 до 10 частинок на дозу, найкраще від 10 до 10 частинок на дозу (4,0-5,0 log10 TCID50). KV можна включати в препаративну форму, виходячи з 3 10 титру до активації, що становить від 10 до 10 вірусних частинок на дозу. Вакцина може містити фармацевтично прийнятний носій, наприклад, фізіологічний сольовий розчин. Інфікування свиней PRRSV може здійснюватися ороназальним шляхом. У легенях вірус поглинається легеневими альвеолярними макрофагами і в цих клітинах реплікація PRRSV завершується впродовж 9 г. Впродовж 12 год PRRSV переміщається з легень в легеневі лімфатичні вузли і впродовж 3 днів у периферичні лімфатичні вузли, кістковий мозок і селезінку. У цих областях лише невелика кількість клітин дає позитивне щодо вірусного антигену забарвлення. Вірус присутній у крові щонайменше впродовж 21 дня і часто набагато довше. Через 7 днів у крові виявляють антитіла до PRRSV. Одночасна наявність вірусу і антитіла в організмі інфікованих PRRS свиней свідчить про те, що вірусна інфекція може зберігатися впродовж тривалого періоду часу, хоча і на низькому рівні, незважаючи на наявність антитіла. Впродовж щонайменше 7 тижнів популяція альвеолярних клітин у легенях відрізняється від популяції в здорових вільних від патогенів (SPF) легенях. Вакцина, запропонована в даному винаході, може перебувати у формі висушеного виморожуванням препарату живого вірусу, призначеного для відновлення за допомогою розчинника для отримання розчину для ін'єкції. Розчинник може являти собою, наприклад, воду, фізіологічний розчин або буфер, або допоміжний (ад'ювантний) розчинник. Розчинник може містити ад'юванти. Відновлену вакцину можна потім ін'єктувати свині, наприклад, шляхом внутрішньом'язової або внутрішньошкірної ін'єкції в шию. Для внутрішньом'язової ін'єкції можна використовувати об'єм 2 мл, для внутрішньошкірної ін'єкції, як правило, об'єм складає 0,2 мл. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є продукт, що представляє собою вакцину, яка містить в окремих контейнерах висушену виморожуванням композицію вірусу і розчинник для відновлення, і необов'язково додатково містить листівку або етикетку до інструкцій із застосування. Вакцина, запропонована в даному винаході, може містити не тільки один чи декілька з вищезазначених штамів, але може включати інші компоненти, що мають активність відносно PRRS або інших вірусних або бактеріальних захворювань свиней, таких як свинячий цирковірус або класичний вірус лихоманки свиней. Таким чином, винахід належить і до описаної вакцини, що відрізняється тим, що вона містить щонайменше один додатковий антиген, що має активність відносно захворювання свиней, відмінного від PRRS. Наприклад, такі додаткові антигени можуть включати Mycoplasma hyopneumoniae, PCV2, SIV, H. parasuis, E. rhusiopathiae, S. suis, A. suis, Leptospira sp. Parvovirus і т.п. Крім того, вакцина може містити певні фармацевтично прийнятні або прийнятні для ветеринарії ад'юванти. У винаході запропоновані нові композиції вакцини, насамперед вакцини проти вірусу PRRS, які містять PRRSV 94881, які додатково містять ад'ювант, що підвищують ефективність вакцини, в результаті чого при введенні комбінації ад'юванта і вакцини спостерігається краща клінічна відповідь / результат у порівнянні з введенням лише однієї вакцини. Наприклад, композиції вакцини, пропоновані у винаході, можуть містити вакцину на основі вірусу PRRSV 94881 і ад'ювант, вибраний з групи, що складається з MCP-1, α-токоферол (наприклад, α-токоферолу ацетат, прикладом якого служить варіант, який надходить у продаж під товарним знаком Diluvac Forte®), фракції Haemophilus sonmus, карбопол та їх комбінації. У деяких варіантах здійснення винаходу вірусна вакцина являє собою вакцину на основі вірусу PRRS 94881, яка може представляти собою рекомбіновану субодиничну вакцину або в альтернативному варіанті може являти собою живу ослаблену вірусну вакцину. Прикладом існуючої в даний час живої вакцини є MLV PRRS Ingelvac®, і на основі PRRS 94881 можна готувати препаративну форму методом, подібним з методом одержання MLV PRRS Ingelvac®. Імуногенні композиції, пропоновані у винаході, можуть містити крім зазначених вище і інші інгредієнти, якщо інші інгредієнти не взаємодіють з ад'ювантами або вірусною вакциною, що лежить в основі композиції. До таких інших інгредієнтів належать, наприклад, речовини, які зв’язують, барвники, десиканти, антисептики, речовини,які змочують, стабілізатори, наповнювачі, адгезиви, пластифікатори, речовини для підвищення клейкості, розпушувачі, матеріали для пластирів, мазеві основи, речовини для видалення кератину, оснóвні субстанції, 8 UA 112768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 речовини, що підсилюють абсорбцію, жирні кислоти, ефіри жирних кислот, вищі спирти, поверхнево-активні речовини, вода і забуферюючі речовини. До кращих інших інгредієнтів належать забуферюючі речовини, мазеві основи, жирні кислоти, антисептики, оснóвні субстанції і поверхнево-активні речовини. Вміст або кількість ад'ювантів, застосовуваних згідно винаходу, можна варіювати і його можна визначати, беручи до уваги, наприклад, властивості застосовуваної вакцини на основі PRRSV і форму лікарського засобу. Компонент, що представляє собою ад'ювант, може містити, наприклад, від 1 до 100 мас.%. Композиції на основі PRRSV 94881, запропоновані у винаході, отримують шляхом змішування компонента, що представляє собою ад'ювант, і компонента, що представляє собою вірусну вакцину, або індивідуально, або в поєднанні з різними іншими інгредієнтами. Композиції можуть являти собою такі композиції, в яких вірусна вакцина і ад'ювант присутні в складі однієї препаративної форми, або в альтернативному варіанті ад'ювант і вакцина присутні в складі окремих препаративних форм, які можна вводити одночасно або послідовно. Так, при введенні в організм тварин компонент, що представляє собою ад'ювант, запропонованих у винаході імуногенних композицій можна вводити окремо від вірусної вакцини. В альтернативному варіанті ад'ювант, застосовуваний відповідно до винаходу, можна вводити спільно з вірусною вакциною у формі єдиної композиції вакцини. Вірусна вакцина може являти собою будь-яку вірусну вакцину. У більш конкретних варіантах здійснення винаходу пропонується застосовувати вакцину на основі вірусу PRRS, що містить PRRSV 94881. Крім того, таку вакцину можна об'єднувати з іншими вакцинами, такими як MLV PRRS Ingelvac ® та / або Porcilis®. Це є лише одним із прикладів комбінованої вакцини на основі вірусу PRRS, можна легко готувати й інші подібні комбінації вакцин. Представлені в даному описі імуногенні композиції є найбажанішими з точки зору індукції гуморальної імунної відповіді на вірус PRRS. Введення вакцин краще має призводити до зниження серйозності одного або декількох клінічних симптомів, таких як пошкодження легень, анорексія, знебарвлення шкіри, загальмованість, респіраторні ознаки, поява муміфікованих поросят, кашель, діарея та їх комбінації, які асоційовані з зараженням PRRSV. Так, композиції бажано покращують клінічний результат для хворої тварини в порівнянні з результатом після введення тільки однієї вірусної вакцини проти PRRS. У конкретних варіантах здійснення винаходу покращений клінічний результат полягає в зниженні відсотка ушкоджень легень щонайменше на 50% в порівнянні з тваринами, яким не вводили імуногенну композицію в комбінації з вказаним ад'ювантом. В інших варіантах здійснення винаходу поліпшення клінічного результату полягає в зниженні рівня віремії у тварин щонайменше на 45% в порівнянні з тваринами, яким не вводили імуногенну композицію в комбінації з вказаним ад'ювантом. Таким чином, один з об'єктів винаходу належить до поліпшеної вакцини, більш конкретно до поліпшеної вірусної вакцини проти PRRS, де покращення полягає в тому, що здійснюють змішання вірусної вакцини з ад'ювантом, вибраним з групи, що складається з MCP-1, фракцій Haemophilus sonmus, карбополу та їх комбінацій. Крім того, композиція вакцини, запропонована у винаході, може містити фармацевтично прийнятний носій. Композиції вакцини, запропоновані у винаході, можна включати в препаративні форми будьяким методом, відомим в області приготування препаративних форм, наприклад, включати до складу рідких препаратів, суспензій, мазей, порошків, лосьйонів, емульсій типу вода-в маслі, емульсій типу масло-у воді, емульсій, кремів, катаплазмами, пластирів і гелів, і переважно їх застосовують в якості лікарських засобів. Таким чином, інший об'єкт даного винаходу належить до фармацевтичної композиції, що містить зазначену вище композицію вакцини. Композиція вакцини, запропонована в даному винаході, при її введенні в шкіру може призводити до значної індукції виробництва антитіл. Таким чином, згідно з іншим кращим варіантом здійснення даного винаходу композиція вакцини може бути приготована у вигляді препарату для черезшкірного введення. Крім того, як описано вище, відповідно до даного винаходу вірус і ад'ювант можна вводити в організм спільноу формі єдиної композиції вакцини або можна вводити ад'ювантний препарат окремо й іншим шляхом по відношенню до антигенного вірусного компоненту вакцини проти PRRS, при цьому ад'ювант діє таким чином, що кількість антитіла, продукованого в організмі у відповідь на вірусну вакцину проти PRRS, може істотно зростати в порівнянні з введенням лише однієї вірусної вакцини проти PRRS. Коли в організм вводять ад'ювант і вірусну вакцину проти PRRS, то це призводить до поліпшення клінічного результату у тварини. Звичайний фахівець у даній галузі може легко визначати ефективну кількість ад'юванта і імунологічно ефективну кількість вірусної вакцини 9 UA 112768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проти PRRS, беручи до уваги, наприклад, тип і властивості антигенної субстанції, вид організмів, вік, вагу тіла, серйозність захворювань, тип захворювань, час введення і метод введення, а також використовуючи в якості показника кількість антитіла, що виробляється в організмі проти антигенної субстанції. Вірусну вакцину проти PRRS, ад'ювант або їх комбінації можна вводити в організми будьяким придатним методом, вибраним в залежності, наприклад, від стану тварин і характеристик захворювання. Приклади таких методів включають внутрішньочеревне введення, Дермальні введення, наприклад, шляхом підшкірної ін'єкції, внутрішньом'язової ін'єкції, внутрішньошкірної ін'єкції і за допомогою пластиру, назальне введення, оральне введення, введення через слизову оболонку (наприклад, ректальне введення, вагінальне введення і введення через рогівку). Серед них кращим є внутрішньом'язове введення. Прикладом терапевтичної дози MLV PRRSV є доза об'ємом приблизно два мілілітри (2 мл). Фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що рівень дози можна варіювати залежно від породи, розміру та інших фізичних факторів індивідуальної тварини, а також від конкретної препаративної форми MLV PRRSV і шляхи введення. Краще MLV PRRSV вводять у вигляді одноразової дози; однак можна застосовувати додаткові дози. І в цьому випадку також фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що при застосуванні даного винаходу доза і кількість доз залежать від віку та фізичного стану конкретної свині, а також від інших факторів, які зазвичай враховують у промисловості, і від конкретних умов, в яких здійснюють введення MLV PRRSV. У конкретних варіантах здійснення винаходу вакцина може являти собою мультивалентну вакцину, яка містить два або більшу кількість вірусів PRRS, де щонайменше один з вірусів PRRS являє собою ослаблений вірус 94881, депонований під реєстраційним номером ECACC 11012502. Інші віруси PRRS можуть являти собою один або кілька вірусів, вибраних з групи, що складається з вірусного штаму PRRSV, що представляє собою вірус Лелістад (агент Лелістад (CDI-NL-2.91)), або інших штамів, таких як штами, депоновані під реєстраційними номерами ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, реєстраційним номером CNCM I-1140, реєстраційним номером CNCM I-1387, реєстраційним номером CNCM I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 і VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 або ECACC V93070108, чи може являти собою US-штам, такий як північноамериканський вірус PRRS, pT7P129A; депозит ATCC VR-2332, депозит ATCC VR-2368; ATCC VR-2495; ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 і ATCC VR 2402. Вакцини на основі вірусів PRRS можна застосовувати для вакцинування, як поросят, так і свиноматок. Відповідно до одного з об'єктів винаходу конкретну схему введення доз вибирають залежно від віку свині та антигену, вибраного для введення. Це дозволяє вводити свиням будьякого віку найбільш ефективну дозу. Згідно з кращим способом MLV PRRSV 94881 вводять у терапевтичній кількості свині або поросяті віком приблизно два тижні  5 днів. Вибрана кількість має змінюватись в залежності від віку свині. В альтернативному варіанті таку MLV вводять в іншій терапевтичній кількості свині або поросяті, вік якого перевищує приблизно 3 тижні, і ця кількість також має змінюватися, коли свиня, якій здійснюють вказане введення, дорослішає або стає старше. Таким чином, свиням віком приблизно чотири тижні, шість тижнів, вісім тижнів, десять тижнів, дванадцять тижнів, чотирнадцять тижнів, шістнадцять тижнів, підсвинку або свиноматці, всім потрібно вводити вакцину в різних кількостях. Призначену для застосування терапевтичну дозу слід оптимізувати в польових умовах і, як правило, її визначають у клінічних дослідах, в яких визначають мінімальну імунізуючу дозу, що забезпечує захист сприйнятливої свині від контрольного зараження вірулентним гетерологічним PRRSV. Краще, MLV PRRSV, отриману згідно зі способами, представленим в даному описі, вводять внутрішньом'язово; однакможна використовувати й інші методи введення, такі як внутрішньошкірне, інтраназальне, інтраретинальне, оральне, підшкірне введення тощо, які широко відомі і застосовуються в даній галузі. Фахівцеві в даній галузі має бути очевидно, що методи вакцинації можуть передбачати визначення відповідного графіка введення і доз для здійснення вакцинації свині від PRRSV. Такі методи, як правило, включають стадії визначення щонайменше однієї змінної, вибраної з групи, що включає вік, стан здоров'я, рівень вродженого імунітету і рівень активного імунітету свині, та регулювання стандартного рівня доз з урахуванням цих змінних. Як правило, рівень вродженого імунітету і рівень активного імунітету слід визначати шляхом зіставлення зі стандартом, що представляє собою середні рівні для популяції свиней східного віку та стану здоров'я. Згідно найбільш кращого методу всі змінні розглядають до визначення оптимального рівня доз і графіка введення. Кращі варіанти здійснення даного винаходу належать також до виділених нуклеїнових 10 UA 112768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислот, які кодують конкретні відкриті рамки зчитування ослабленого вірусу 94881, депонованого під реєстраційним номером ECACC 11012502, і батьківського вірулентного вірусу 94881, депонованого під реєстраційним номером ECACC 11012501. Наприклад, повна нуклеотидна послідовність ослабленого вірусу 94881, депонованого під реєстраційним номером ECACC 11012502 , має послідовність SEQ ID NO : 1, яка кодує представлені в SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 і SEQ ID NO : 9 білкові послідовності ОРС1a , ОРС1b , ОРС2 , ОРС3 , ОРС4 , ОРС5 , ОРС6 , ОРС7 відповідно. Повна нуклеотидна послідовність вірулентного батьківського вірусу 94881 , депонованого під реєстраційним номером ECACC 11012501 , має послідовність SEQ ID NO : 10 , яка кодує представлені в SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 і SEQ ID NO: 18 білкові послідовності ОРС1a, ОРС1b, ОРС2, ОРС3, ОРС4, ОРС5, ОРС6, ОРС7 відповідно. Вакцину на основі PRRSV 94881 можна вводити будь-яким загальноприйнятим шляхом, в деяких бажаних способах введення здійснюють внутрішньом'язово. Кращим є варіант, коли вакцина що вводиться проти PRRSV справляє свій сприятливий вплив щодо лікування або зменшення серйозності або зустрічальності інфекції PRRSV після введення одноразової дози, як це має місце у випадку Ingelvac®, однак, якщо вибирають інші антигени або комбінації, або мультивалентні вакцини, то слід мати на увазі, що їх можна вводити загальноприйнятим для їх застосування чином, що може включати введення однієї або декількох бустерних доз після введення першої дози. Фахівці в даній галузі можуть визначати відповідні рівні доз з урахуванням вибраної вакцини проти PRRSV і вікового діапазону тварини, якій потрібно вводити антиген. У конкретних представлених нижче прикладах здійснювали контрольне зараження свиней і свиноматок новим виведеним штамом європейського PRRSV, який має здатність відтвореним чином викликати респіраторне захворювання у поросят. Виведені до теперішнього часу європейські штами PRRSV не дозволяли відтворювати респіраторне захворювання при його моделюванні на поросятах і тому історично моделі, засновані на контрольному зараженні респіраторним шляхом, базувалися на використанні не-європейських штамів для зараження. У Європі внаслідок високого генетичного різноманіття існує необхідність у створенні нової вакцини на основі європейського штаму. У додаткових прикладах здійснювали контрольне зараження тварин штамом, який викликав втрату репродуктивної здатності на моделях з використанням контрольного зараження підсвинок / свиноматок. Було встановлено, що ефективність MLVвакцин на основі ослабленого вірусу 94881, депонованого під реєстраційним номером ECACC 11012502, або будь-якого вірусу, отриманого з цього штаму або з батьківського штаму, депонованого під реєстраційним номером ECACC 11012501, можна демонструвати на різноманітних моделях з використанням контрольного зараження, оскільки зазначений штам також має ефективність на інших моделях індукованого вірусом PRRS респіраторного захворювання або втрати репродуктивної здатності. Приклади Приклад 1: Опис моделі контрольного зараження PRRSV респіраторним шляхом Як зазначено вище, історично було встановлено, що штами, виведені з EU-PRRSV, не дозволяють відтворювати респіраторне захворювання на моделі, створеній на поросятах. У Європі внаслідок високого генетичного різноманіття існує необхідність у створенні нової вакцини на основі європейського штаму, і для проведення досліджень необхідна надійна відтворювана модель контрольного зараження респіраторним шляхом, створена з використанням вірулентного штаму, виведеного з Європейського PRRSV. У наведеному нижче прикладі представлені отримані при створенні винаходу дані про те, що контрольне зараження свиней європейським застосовуваним для контрольного зараження штамом, одержаним у результаті невеликої кількості пасажів (після 4-го пасажу), дозволяє надійно викликати респіраторні симптоми. У цьому дослідженні використовували 3 групи по 12 тварин, що мали вік 3 тижні на момент їх розподілу по групах і вік приблизно 10 тижнів на момент контрольного зараження: група 1: контрольна група (на кресленнях позначена як «контроль») група 2: група тварин, яких піддавали контрольному зараженню (SD 35) (на кресленнях позначена як «контр. зараж.») група 3: група тварин, яких вакцинували PRRSV Porcilis ® (SD 0) і потім піддавали контрольному зараженню (SD 35) (на кресленнях позначена як «Porcilis»). Досліди проводили впродовж 56-денного періоду; через 10 днів після контрольного зараження проводили аутопсію 6 тварин з кожної групи; аутопсію всіх інших тварин здійснювали через 21 день після контрольного зараження. Щодня оцінювали наступні параметри: ректальну 11 UA 112768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 температуру, респіраторні та інші клінічні ознаки. Інші досліджувані параметри включали: вагу тіла, смертність, віремію, сероконверсію, дані патологічного і гістологічного обстеження легень. У день -7 свиней розподіляли по групах. У день досліду 0, групу 3 вакцинували PRRSV Porcilis®. У день досліду 35 групу 2 і групу 3 піддавали контрольному зараженню європейським штамом, застосовуваним для контрольного зараження. У день 45 по 6 тварин з кожної групи піддавали аутопсії. Аутопсію інших тварин здійснювали у день 56. На фіг. 1A представлені результати оцінки кашлю у вигляді середнього балу на тварину для кожного тижня. Видно, що після контрольного зараження мало місце посилення кашлю як у групі, яка була піддана контрольному зараженню (група 2), так і в групі, обробленій Porcilis (група 3). на фіг. 1Б представлений загальний клінічний бал, який враховує задишку, кашель, виділення з носа і очей, а також поведінку. Ці дані свідчать про те, що в цілому після контрольного зараження мало місце підвищення загального клінічного балу в контрольній групі, яка була піддана контрольному зараженню, і в групі, обробленій Porcilis. Моніторинг ректальної температури тварин здійснювали до і після контрольного зараження, при цьому було встановлено, що після контрольного зараження мало місце підвищення ректальної температури в групі, яка була піддана контрольному зараженню, і в групі, обробленій Porcilis (SD (день досліду)> 35, при порівнянні груп 1 і 2 p≤ 0,001; при порівнянні груп 1 і 3 p≤ 0,001) (фіг. 2). Вимірювання середнього добового приросту маси (фіг. 3) дозволили встановити, що після контрольного зараження до здійснення першої аутопсії і до здійснення другої аутопсії величина ADWG була статистично значимо менше в групі, яка була піддана контрольному зараженню (SD35-44 p≤ 0,001 и SD35-56 p≤ 0,01), і в групі, вакцинованій Porcilis (SD35-44 p≤ 0,05 и SD35-56 p≤ 0,05). Моніторинг віремії здійснювали за допомогою ПЛР (фіг. 4) і ELISA (фіг. 5). Результати ПЛР показали, що в групі 1 (контрольна група) усі тварини зберігали негативний статус. У групі 2 всі тварини після контрольного зараження мали PRRSV-позитивний статус; в групі 3 всі тварини після вакцинації мали PRRSV-позитивний статус. Результати, отримані за допомогою ELISA, дозволили встановити, що в групі 1 всі тварини зберігали негативний статус; в групі 2 всі тварини після контрольного зараження мали позитивний статус щодо антитіл (Ат) до PRRSV; в групі 3 всі тварини після вакцинації мали позитивний статус відносно Ат до PRRSV. Проводили також макроскопічне обстеження легень (фіг. 6), при цьому в легенях оцінювали поцятковані жовтувато-коричневими цяточками області та галузі консолідації. Виявилося можливим виявити статистично значущі макроскопічні зміни в контрольній групі, яка була піддана контрольному зараженню, і в групі, обробленій Porcilis (при порівнянні груп 1 і 2 p≤0,001; при порівнянні груп 1 і 3 p ≤ 0,05), порівняно з контрольною групою. Результати гістопатологічного обстеження також продемонстрували ефективність вакцинації (фіг. 7A - фіг. 7В). Середній бал ушкоджень легень був статистично значимо вище в групі, яка була піддана контрольному зараженню, і в групі, обробленій Porcilis, в порівнянні з контрольною групою (при порівнянні груп 1 і 2 p ≤ 0,001; при порівнянні груп 1 і 3 p ≤ 0,001). Мікроскопічні пошкодження були сильнішими через 10 днів після зараження. В цілому, після контрольного зараження в контрольній групі, яка була піддана контрольному зараженню, і в групі, обробленій Porcilis, мало місце збільшення балів кашлю, загальних клінічних балів і підвищення ректальної температури. Вага тіла в контрольній групі, яка була піддана контрольному зараженню, і в групі, обробленій Porcilis, був статистично значимо (p