Композиція очищеного арабіногалактан-протеїну (agp)

1. Композиція очищеного арабіногалактанпротеїну (AGP), що має діапазон значень середньої молекулярної ваги від 10 кДа до 150 кДа, виділена з листя та/або стебел рослини Аrgеmоnе техісаnа, яку одержують способом, що включає стадії: і) екстракції 1 ваг. ч. листя та/або стебел рослини Аrgеmоnе техісаnа за допомогою 1-10 ваг. ч. води, С1-3-спирту або їхньої суміші для одержання водного екстракту; та часткового чи повного концентрування або ліофілізації екстракту; іі) проведення послідовно іонообмінної хроматографії водного екстракту, частково концентрованого водного екстракту або водного розчину повністю концентрованого чи ліофілізованого екстракту, одержаного на стадії (і), для одержання нейтрального водного екстракту; ііі) фракціонування нейтрального водного екстракту, одержаного на стадії (іі), н-бутанолом та розділення водної та н-бутанольної фаз; iv) змішування та перемішування водних фаз, одержаних на стадії (ііі), з метанолом або етанолом та виділення твердого осаду для одержання нерозчинної фракції; і v) проведення послідовно гель-хроматографії та ексклюзійної хроматографії нерозчинної фракції, одержаної на стадії (iv), для одержання композиції очищеного арабіногалактан-протеїну (AGP). 2 (19) 1 3 86986 4 го водного екстракту або водного розчину повніс22. Фармацевтична композиція за п. 21, яка додаттю концентрованого/ліофілізованого екстракту, ково включає щонайменше один з нетоксичних одержаного на стадії (і), для одержання нейтральсумісних наповнювачів, зв'язуючих, розпушувачів, ного водного екстракту; буферів, консервантів, антиоксидантів, змащуваііі) фракціонування нейтрального водного екстракльних речовин або смакових агентів. ту, одержаного на стадії (іі), за допомогою н23. Фармацевтична композиція за п. 21, у якій фабутанолу та розділення водної та н-бутанольної рмацевтично прийнятний ексципієнт вибирають з фаз; цукрів, крохмалів, целюлози та її похідних, фосфаiv) змішування та перемішування водних фаз, тів кальцію, сульфату натрію; сульфату кальцію; одержаних на стадії (ііі), з метанолом чи етанолом, полівінілпіролідону; полівінілового спирту; стеарита виділення твердого осаду для одержання ненової кислоти; рослинних олій; неіонних, катіонних розчинної фракції; і та аніонних поверхнево-активних речовин; етиленv) проведення послідовно гель-хроматографіїї та глікольних полімерів; b -циклодекстрину; жирних ексклюзійної хроматографії нерозчинної фракції, спиртів або гідролізованої сухої барди. одержаної на стадії (iv), для одержання композиції 24. Очищений арабіногалактан-протеїн (AGP), що очищеного арабіногалактан-протеїну (AGP). має діапазон значень середньої молекулярної 12. Спосіб за п. 11, у якому С1-3-спирт вибирають з ваги від 10 кДа до 150 кДа, виділений з листя метанолу, етанолу, 1-пропанолу або 2-пропанолу. та/або стеблин рослини Аrgеmоnе техісаnа. 13. Спосіб за п. 11, у якому іонообмінна хроматог25. Фармацевтична композиція, яка включає терарафія є катіонообмінною хроматографією з наступевтично ефективну кількість очищеного арабінопною аніонообмінною хроматографією. галактан-протеїну (AGP) за п. 24 та фармацевтич14. Спосіб за п. 11, у якому іонообмінна хроматогно прийнятний ексципієнт. рафія є аніонообмінною хроматографією з наступ26. Застосування очищеного арабіногалактанною катіонообмінною хроматографією. протеїну (AGP) за будь-яким з пп. 1-10, 24 у приго15. Спосіб за п. 13 або 14, у якому катіонообмінну туванні лікарського засобу для лікування псоріазу, хроматографію проводять на сульфонованих полізапального розладу, автоімунної хвороби, алергії, стирольних сильнокислотних катіонообмінниках екземи або злущуваних сверблячих плям, або заабо слабокислотних катіонообмінниках типу кархворювань шкіри у ссавців. бонових кислот. 27. Застосування композиції за будь-яким з пп. 2116. Спосіб за п. 13 або 14, у якому аніонообмінну 23 або 25 у приготуванні лікарського засобу для хроматографію проводять на слабоосновних аніолікування псоріазу, запального розладу, автоімуннообмінниках типу аліфатичних амінів або сильноної хвороби, алергії, екземи або злущуваних сверосновних аніонообмінниках. блячих плям, або захворювання шкіри у ссавців. 17. Спосіб за п. 11, у якому гель-хроматографію 28. Застосування за п. 26 або 27, у якому розлад проводять на полімерному адсорбенті Amberlite. вибирають з групи, що складається з дерматиту; 18. Спосіб за п. 11, у якому ексклюзійну хроматогсклеродерми; екземи; псоріатичного артриту, реврафію проводять на матеріалі Sephacryl. матоїдного артриту, хвороби Крона, розсіяного 19. Спосіб за п. 11, у якому гель-хроматографію склерозу, хвороби подразненого кишечнику, анкіпроводять на полімерних адсорбентах Amberlite, лозивного спондиліту, червоного системного воввибраних з XAD-2, XAD-4 та XAD-7. чака, синдрому Шегрена та злущуваних свербля20. Спосіб за п. 11, у якому ексклюзійну хроматогчих плям. рафію проводять на матеріалі Sephacryl, вибра29. Застосування за п. 26 або 27, у якому зазначеному з Sephacryl S-100, Sephacryl S-200 HR та на алергія є астмою або хронічною обструктивною Sephacryl S-300 HR. легеневою хворобою. 21. Фармацевтична композиція, яка включає тера30. Застосування за пп. 26 або 27, у якому зазнапевтично ефективну кількість очищеного арабіночений псоріаз вибирають з групи, що складається галактан-протеїну (AGP) за будь-яким з пп. 1-10 та з бляшкового псоріазу, краплеподібного псоріазу, фармацевтично прийнятний ексципієнт. пустульозного псоріазу та псоріазу нігтів. Даний винахід стосується композиції очищеного арабіногалактан-протеїну (AGP), виділеного селективним методом з листя та/або стеблин рослини Argemоnе mехісаnа. Даний винахід також стосується композиції очищеного арабіногалактан-протеїну (AGP), виділеного з листя та/або стеблин рослини Argemоnе mехісаnа, яка виявляє один чи більше з таких ефектів: імуносупресія, інгібування лімфопроліферації, модуляція цитокінів, така як інгібування IL-2, інгібування IFN-g або індукція IL-10; інгібування проліферації кератиноцитів, кератолітична актив ність та інгібуюча активність у вушному алерготесті на мишах (MEST). Опис використовуваних тут абревіатур/позначень Арабіногалактан-протеїн : AGP Високомолекулярний арабіногалактан-протеїн : AGP-HM Низькомолекулярний арабіногалактан-протеїн : AGP-LM Стислий опис фігур Фіг.1. є схемою, що описує селективний процес виділення композиції очищеного AGP. 5 86986 6 Фіг.2: зображує гадану структуру композиції вияви псоріазу переважно спричинені епідермальAGP. ними змінами, то хвороба традиційно вважалася Фіг.3: зображує вплив композиції AGP на індуспричинюваною надлишковою проліферацією кекцію IL-10. ратиноцитів та аномальним диференціюванням. Фіг.4: зображує вплив композиції AGP на проСучасні дані дозволяють припустити, що епідерцент інгібування IL-2. мальні зміни при псоріазі спричинені дією ТФіг.5: зображує вплив композиції AGP на пролімфоцитів у шкірних ураженнях і тим, що Тлімфоцити індукують або підтримують хвороблицент інгібування IFNg. вий процес. Псоріаз описується як автоімунна хвоФіг.6: зображує вплив композиції AGP на інгіроба, при якій активовані Т-лімфоцити, що продубування GMCSF. кують численні цитокіни, спричинюють вторинні Фіг.7: зображує вплив композиції AGP на інгіепітеліальні аномалії. Дерегульовані лімфоцити бування людського TNFa. продукують цитокіни, що стимулюють проліфераФіг.8: показує вплив композиції AGP на NGFцію апоптоз-стійких кератиноцитів. Псоріатичні індуковану проліферацію кератиноцитів людини. шкірні ураження характеризуються запаленням, Фіг.9: показує вплив композиції AGP на NGFпричому Т-клітини та нейтрофіли інфільтрують як індуковану проліферацію кератиноцитів людини. дерму, так і епідерміс, а надлишкове злущування Фіг.10: показує вплив композиції AGP на товпов'язане з епідермальною гіперпроліферацією та щину шкіри у PPD-провокованих морських свинок. аберантним диференціюванням кератиноцитів Фіг.11: показує вплив композиції AGP на інгібу[Reich К., Garbe С, Blaschke V., Maurer С, Middel P., вання товщини епідермісу індукованої ТРА (12-ОWesthai G., Lippert U., and Neumann C, J. Invest. тетрадеканоїлфорбол-13-ацетат) у Balb/c мишей. Dermatol., 2001, 116, 319]. Фіг.12: зображує вплив композиції AGP на Автоімунні розлади є хворобами, спричинениDNFB-індукований вушний алерготест у самок ми продукуванням організмом імунної відповіді мишей С 57/BL 6. проти його власних тканин. Причина автоімунних Відомий рівень техніки хвороб є невідомою, але здається, що існує спадПсоріаз є шкірним розладом, який характерикова схильність у багатьох випадках розвитку авзується запаленням та аномальною гіперпроліфетоімунної хвороби. рацією епідермальних кератиноцитів, що призвоПри декількох типах автоімунної хвороби (тадить до гіперплазії, стовщення епідермісу та кої як ревматична лихоманка), бактерії або віруси присутності червоних злущуваних бляшок. Хронічвикликають імунну відповідь, і антитіла або Тний шкірний стан визначається за властивими йоклітини атакують нормальні клітини, тому що вони му клінічними симптомами, що характеризуються мають у своїй структурі деяку частину, що нагадує вогнищевими червоними бляшками, покритими частину структури інфікуючого мікроорганізму. білими лусками, які створюють сверблячу лускату Автоімунні розлади належать до двох загальшкіру. Псоріаз є дуже помітною хворобою та часто них типів: ті, що ушкоджують багато органів (сисвражає обличчя, шкіру голови, тіла та кінцівок. темні автоімунні хвороби), і ті, при яких автоімунУраження при цій хронічній хворобі типово дають ний процес безпосередньо ушкоджує лише один ремісії та загострення. орган або тканину (локалізовані). Деякі з найбільш Хоч псоріаз виявляється як шкірний розлад, не поширених типів автоімунних розладів наведені прив'язуючись до будь-якої теорії, вважається, що нижче: він є хворобою порушеного або дефектного клітинно-медійованого імунітету. Оскільки клінічні Системні автоімунні хвороби Ревматоїдний артрит (суглоби; рідше легені, шкіра) Вовчак [системний червоний вовчак] (шкіра, суглоби, нирки, серце, мозок, червоні кров'яні клітини, інші) Склеродерма (шкіра, кишечник, рідше легені) Синдром Шегрена (слинні залози, слізні залози, суглоби) Синдром Гудпасчера (легені, нирки) Гранулематоз Вегенера (сінуси, легені, нирки) Запальний процес включає ряд подій, які можуть бути викликані численними стимулами (наприклад, інфекційними агентами, ішемією, взаємодіями антиген-антитіло та термальним чи іншим фізичним ушкодженнями). Кожний тип стимулу провокує характерну модель відповіді, яка є відносно незначною варіацією загального типу. На макроскопічному рівні, відповідь звичайно супроводжується добре розрізнюваними клінічними ознаками еритеми, набряку, болісності та болю. Локалізовані автоімунні хвороби Мукровий діабет типу 1 (панкреатичні острівці) Тиреоїдит Хашимото, хвороба Грейвза (зоб) Глютенова хвороба, хвороба Крона, неспецифічний виразковий коліт (шлунково-кишковий тракт) Розсіяний склероз*, синдром Гійєна-Барре (мозок) Адисонова хвороба (надниркова залоза) Первинний біліарний склероз, склерозивний холангіт, автоімунний гепатит (печінка) Симптоми, спостережувані у псоріатичних пацієнтів, включають гіперплазію та аномальне зроговіння епідермальних клітин, приписувані надлишковому обміну речовин клітин за рахунок гіперметаболізму, астенію запальної відповіді в епідермальному шарі, вазодилатацію і міграцію та інфільтрацію лейкоцитів в епідермальні клітинні шари. Однак, зараз визнається, що епідермальна гіперплазія є реакцією активації імунної системи на локальних ділянках шкіри, яка, в свою чергу, меді 7 86986 8 юється CD8+ та CD4+ Т-лімфоцитами, що накопичної нормальної шкіри при їхньому локальному чуються у хворій шкірі. Дійсно, псоріаз зараз ввананесенні на псоріатичні ушкодження [British Naжається найбільш поширеною запальною хвороtional Formulary (BNF), March 2001, No. 41]. бою людей, медійованою Т-клітинами. Застосування фототерапії (опромінювання Симптомами псоріазу, таким чином, є, очевидно, ультрафіолетовим випромінюванням) або фотонадмірно швидкий ріст кератиноцитів та злущухемотерапії, яка полягає в зовнішньому чи внутрівання лусочок з поверхні шкіри. У псоріатичних шньому введенні псораленів та експозиції довгоушкодженнях, час життєвого циклу кератиноцитів хвильовими ультрафіолетовими променями зменшується приблизно у 8 разів (36 проти 311 ураженої частини, асоційоване з недоліками, тагодин у нормальній шкірі), а число клітин, що дікими як можливість прискореного старіння чи пігляться, подвоюється, призводячи до гіперпластичментації шкіри та індукування канцерогенезу [Britного епідермісу. Лікарська терапія спрямована на ish National Formulary (BNF), March 2001, No. 4]. уповільнення цього процесу. Зовнішнє застосування вугільного дьогтю, хоч і Було знайдено, що PUVA-терапія виснажувала асоційоване з меншими побічними ефектами у лімфоцити у сполученні з поліпшенням хвороби. порівнянні зі стероїдами, є, однак, неохайним, а Ці дані узгоджуються з роллю Т-клітин в патогенейого недоліки включають сильний запах, забрудзі. Було знайдено, що відомий імунодепресант нення шкіри і т.д. У деяких випадках він може вициклоспорин виявляє сильний ефект на перебіг кликати стимульований дерматит. хвороби. Оскільки циклоспорин має значний інгіМетотрексат, хоч і є рекомендованим лікарсьбуючий ефект на активацію Т-клітин, почали з'явким засобом для лікування псоріатичних станів, лятися аргументи про те, що псоріаз є фундаменпотребує уважного контролю, тому що може витально запальною хворобою. кликати ушкодження печінки та/або знизити продуТ-лімфоцити повинні інфільтрувати дерму, а кування червоних кров'яних клітин, що переносять потім прилипнути до кератиноцитів для утворення кисень, білих кров'яних клітин, що борються з інпсоріатичної бляшки. Через це, молекули, що рефекцією, та тромбоцитів, що посилюють згортугулюють адгезію та переміщення Т-клітин, стають вання. Довготривале застосування псораленів та логічними терапевтичний мішенями, і їхня роль у метотрексату значно підвищує ризик плоскокліпатофізіології має велике значення. Події внутріштинної карциноми у пацієнтів з псоріазом [Stern ньосудинної адгезії можуть бути інгібовані шляхом R.S., and Laird N., Cancer, 1994, 73, 2759]. блокування ініціювання хемокінів або блокування Ретиноїди, такі як етретинат, приймаються зв'язування інтегрину (LFA-1 з ІСАМ-1). Блокада усередину пацієнтами, які страждають від невиліінтегрину або зменшення його поверхневої ексковного псоріазу; однак, він є тератогенним та, пресії може бути важливою подією при переміімовірно, накопичується в організмі протягом трищенні лімфоцитів, що є корисним при антипсоріавалого часу і тому є протипоказаним у випадку тичній терапії. вагітності [Stem R.S., and Laird N., Cancer, 1994, Відомо, що імуносупресія, інгібування лімфоп73, 2759]. роліферації, модуляція цитокінів, така як інгібуВикористання макроциклічних імунодепресивних агентів, таких як циклоспорин, такролімус та вання IL-2, інгібування IFN-g або індукція IL-10; аскоміцин, може порушити ниркову функцію або інгібування проліферації кератиноцитів, кератоліспричинити гіпертензію. Можливі побічні ефекти тична активність та інгібуюча активність в MEST, поліурії включають анемію та зниження білих кропов'язані з антипсоріатичною активністю. в'яних клітин та тромбоцитів. Число різних, інколи, токсичних курсів лікуванКальципотриол, синтетичний аналог вітаміну ня, використовуваних для поліпшення стану псоріD3, став одним з лікарських засобів, найчастіше азу, свідчить про резистентний характер цієї хвопризначуваних для лікування псоріазу. Однак, він роби. спричинює значно сильніше подразнення шкіри, Оскільки більшість (90%) псоріатичних пацієнніж сильні місцеві кортикостероїди. Звичайні нетів мають обмежені форми хвороби, може бути бажані ефекти включають подразнення в місцях використане локальне лікування, що включає дитушкоджень чи навколо них, подразнення шкіри ранол, препарати дьогтю, кортикостероїди та необличчя чи голови, або загострення псоріазу щодавно розроблені аналоги вітаміну D3 (кальци[Ashcroft D.M., Wan Po A.L., Williams H.С. and Grifпотриол, кальцитриол). Меншість (10%) fiths С.Ε.Μ., BMJ, 2000, 320, 963]. псоріатичних пацієнтів мають більш серйозний Сучасні біотехнологічні підходи до лікування стан, для якого доступний ряд системних терапевпсоріазу пов'язані з прямою фармацевтичнотичних способів впливу. Специфічні системні темедійованою атакою на проліферацію клітин або рапії включають UVB, PUVA, метотрексат, похідні на імунний компонент хвороби. Відомі імунодепревітаміну А (ацитретин) та імунодепресанти, такі як сивні імунобіологічні засоби, такі як Clenoliximab, циклоспорин А. Ефективність циклоспорину та FKMEDI-507, ІСМ3, IDEC-114, SMART Anti-CD3, 506 при лікуванні псоріазу надає докази на користь Zenapax, Amavive, Hul 134, Xanelim, HuMaxCD4, гіпотези про Т-клітини як першопричину хвороби. IC747, IDEC-114, IDEC-131, Nuvion, DAB389IL-2, Місцеве застосування кортикостероїдів ослабONTAK та Etarnercept, що блокують імунні відповілює симптоми псоріазу. Однак їхнє введення проді на різних стадіях, знаходяться зараз на різних тягом тривалого періоду часу, потрібне при такому стадіях клінічних випробувань. лікуванні, спричинює тахіфілаксію, внаслідок чого Однак, жодне з вищезгаданих лікувань не є треба або підвищувати дозу, або використовувати універсально безпечним та ефективним. Величина сильніші лікарські засоби, що приводить до атровтрат від псоріазу є близькою до показників для фії та ахромазії або втрати пігментації перифери 9 86986 10 інших хвороб, таких як депресія, гіпертензія та пін, коптизин, сангуїнарин, дигідросангуїнарин, застійна серцева недостатність. Вартість лікуваннорсангуїнарин, 6-ацетонілдигідросангуїнарин, ня хвороби складає у середньому 800 доларів на дигідрохелеритрин, хелеритрин, норхелеритрин, пацієнта за рік у США, і хвороба може спричинити 6-ацетонілдигідрохелеритрин, (-)-хейлантіфолін, (значну втрату продуктивності [Feldman S.R., )-b-скулерин метогідроксид, (-)-a-стилопін, (-)-a- та American Academy of Dermatology, August 2000]. b-стилопін метогідроксиди, (-)-хейлантіфолін, 6Крім того, хвороба, через свій спорадичний ацетонілдигідросангуїнарин, (-)-aперебіг, дає змінну відповідь на лікування, яке мотетрагідропальматин метогідроксид, ретикулін, же також мати небажані ефекти. Отже, цю хворобу таліфолін, мурамін, аргемонін, нораргемінін, аргеважко лікувати. Руйнівний характер псоріазу підмексикаїн А, аргемексикаїн В, Nкреслюється величиною побічних ефектів, які подеметилоксисангуїнарин; (+)-1,2,3,4-тетра-гідро-1годжуються терпіти хворі пацієнти для досягнення (2-гідроксиметил-3,4-диметоксифенілметил)-6,7ремісії хвороби, що, як вони знають, рано чи пізно метилендіоксіізохінолін, гелеритрин та оксигідрасдасть рецидив. тинін; На додаток, крім клінічних виявів та незручноіі) Флавоноїди, такі як ізорамнетин, ізорамнесті, психологічний вплив хвороби на життя пацієнтин-3-глюкозид; ізорамнетин-3-О-глюкозид, ізората є величезним. Псоріаз є складним станом, який мнетин-3,7-диглюкозид; 3-метоксикверцетин, охоплює всі аспекти емоційного та фізичного 5,3',4'-триметиловий ефір кверцетину; лутеолін, ослаблення пацієнта і в значній мірі знижує якість аргемекситин та еріодиктіол; життя мільйонів людей в усьому світі. Більш того, ііі) Жирні кислоти, такі як пальмітинова, стеаоскільки він часто є добре помітним, уражені люді ринова, рахінова, олеїнова, лінолева, лауринова, страждають від вираженого розладу, незручності бегенова, лігноцеринова, гексадеценова, рицинота дискомфорту [Fortune D.G., Richards H.L., Main леїнова, 11-оксотриакантоноєва та 11C.J., and Griffiths С.Ε.Μ., J. Am. Acad. Dermatol., окситриакантоноєва; 1998, 39, 196]. iv) Амінокислоти, такі як гістидин, лізин, глутаКомпозиція, одержана з рослинного джерела, мінова кислота, гліцин, аланін, лейцин, валін, феяка забезпечує безпечне, добре переносиме та нілаланін, тирозин, треонін, аргінін, серин, аспараефективне лікування псоріазу, і яка, крім того, догін, цистеїн, метіонін, триптофан, гідроксипролін, лає недоліки та обмеження відомих засобів лікупролін, L-глутамін, гідроксипролін, b-аланін та асвання, була розкрита в нашій публікації патентної парагінова кислота; заявки США № 2003/0194456 А1. ν) Вуглеводи, такі як глюкоза та фруктоза, і Патентна заявка США № 2003/0194456 А1 глікозиди; розкриває корисні in vitro та in vivo імунологічні та νί) Органічні кислоти, такі як бурштинова, лифармакологічні активності лікарського засомонна, винна, малеїнова та яблучна; і бу/композиції, що включає екстракт, одержаний з (vii) Інші сполуки, такі як цериловий спирт, bлистя та/або стеблин рослини Аrgеmоnе mехісаnа, ситостерол, нітрат калію, фосфат кальцію та сунеобов'язково, в комбінації з екстрактом, одержальфат кальцію. ним з плодів рослини Сuminum сumіnаm, для лікуБуло знайдено, що екстракт, одержаний з лисвання і профілактики псоріазу та інших розладів. тя та/або стебел рослини Аrgеmоnе mехісаnа за Екстракт, який може бути водним, етанольним чи допомогою процесу екстракції, наприклад, мацеводно-етанольним екстрактом, крім виявлення рації та проціджування, з використанням води, корисної імунологічної та фармакологічної активетанолу та їхніх сумішей, розкритого в публікації ності, забезпечує значне зниження величини бапатентної заявки США № 2003/0194456 А1, вклюльного показника індексу площі та тяжкості псоріачає по суті всі вищезгадані сполуки. Іншими слозу (PASI) з кращою стерпністю в діапазоні вами, екстракт складається з усіх сполук, присутнормально допустимих меж. На підтвердження ніх у частинах рослини, використовуваних для концептуальних досліджень, що проводилися на екстракції, тобто, він складається із суміші алкалопацієнтах з хронічним псоріазом бляшкового типу, їдів, флавоноїдів, жирних кислот, органічних кисбуло знайдено, що композиція, яка включає вищелот, амінокислот, цукрів та солей. вказаний екстракт, при пероральному введенні Було знайдено, що одержані таким чином експриводить до зниження бального показника PASI з тракти відповідно до процесу, описаного в публі6,33±2,84 до 0,90±1,27, причому у деяких пацієнтів кації патентної заявки США № 2003/0194456 А1, після 8 тижнів лікування спостерігався здоровий виявляють in vitro та in vivo імунологічну та фармастан. кологічну активність, наприклад, імуносупресію, Патентна заявка США № 2003/0194456 А далі інгібування лімфопроліферації, модуляцію цитокіповідомляє, що гостра токсичність (LD50) екстракнів, таку як інгібування IL-2, інгібування IFNg та ту, одержаного з листя та/або стеблин рослини індукція IL-10; інгібування проліферації кератиноАrgеmоnе mехісаnа, визначена на мишах та пацюцитів, кератолітичну активність, інгібування проліках при оральному та внутрішньовенному (i.v.) ферації ендотеліальних клітин, інгібування експрешляхах введення, становила >1000 мг/кг ваги тіла сії молекул клітинної адгезії, таких як ІСАМ-1, тварини при 50% смертності. інгібування MEST, та інгібування ферментів, таких Тут можна згадати, що рослина Аrgеmоnе як p60src тирозинкіназа, що, як відомо, беруть mехісаnа містить різні сполуки, які включають, поучасть в антипсоріатичній активності. між інших; Крім того, публікація патентної заявки США № і) Алкалоїди, такі як протопін, протопін-нітрат, 2003/0194456 А1 вказує, що вищезгадані екстракберберин, берберин-нітрат, криптопін, алокриптоти листя та/або стебел рослини Аrgеmоnе 11 86986 12 mехісаnа можуть бути фракціоновані за допомовуглеводів з порівняно меншою часткою білків, гою спиртових розчинників, таких як н-бутанол та звичайно, менше 10 білків, хоч відомі також AGP, метанол, і одержані при цьому фракції також вищо мають більш високий вміст білків. AGP широко являють in vitro та in vivo імунологічну та фармапоширені у більшості вищих рослин, таких як Echiкологічну активність, включаючи антипсоріатичну nacea purpurea, Nicotiana alata, Vitis vinifera, активність. Diospyros kaki, Gladiolus gandavensis, Lolium multiПроцедура фракціонування водних екстрактів florum [Anderson, R.L., Clarke, A.E., Jermyn, M.A, листя та/або стебел рослини Аrgеmоnе mехісаnа, Knox, R.B. and Stone, B.A., Australian J. Plant описана в публікації патентної заявки № Physiol., 1977, 4, 143-158], Phaseolus vulgaris 2003/0194456 А1, досягалася методом багатоста[Hawes, G.B., Adams, G.A, Phytochemistry, 1972, дійної, рідинно-рідинної роздільної хроматографії, 11, 1461-1465] та Acacia arabica [Classen, В., осадження та сушіння екстрактів і дозволяє одерWitthohn, К., and Blaschek, W., Carbohydrate жати фракції, що містять як головні компоненти по Research, 2000, 327, 497-504]. суті різні класи сполук. AGP мають адгезивні та водоутримувальні Наприклад, відповідно до методу, описаного в властивості і реагують на поранення та інфекції публікації патентної заявки США № 2003/0194456 рослин. Вони визначають клітинну ідентичність та А1, розчинна в н-бутанолі фракція була одержана специфічні взаємодії. Вони також також грають шляхом додавання н-бутанолу до водного екстрапевну роль у диференціюванні клітин та тканин, а кту листя та/або стебел рослини Аrgеmоnе також у контролі соматичного ембріогенезу. Вони mехісаnа, відокремлення н-бутанольного шару від також ціняться за різні біологічні активності [WO водної фази, з наступним промиванням н01/00682 А1, 2001]. Існують два типи AGP, а саме, бутанольного шару водою та випаровування розAGP І та AGP II. Останній, тобто, AGP II, містить чинника при зниженому тиску з одержанням розгалактозне ядро і є сильно розгалуженим, звичайчинної в н-бутанолі фракції у вигляді в'язкої маси. но містить менш ніж 10% білків і має бічні ланцюги Водний шар змішують з метанолом, що приводить з високим ступенем заміщення арабінофуранозидо осадження твердої маси. Тверду масу відокрельними залишками і, інколи, іншими цукрами, тамлюють і цю масу розчиняють у воді та ліофілізукими як рамноза, глюкоза, маноза і т.п. Повідомють, одержуючи нерозчинну в метанолі фракцію. лялося також про присутність уронових кислот та Фільтрат, одержаний після відокремлення нероззаміщених похідних. чинного в метанолі осаду з метанол-водної суміші Як згадувалося вище, хоч були проведені хіміпри випаровуванні, дає розчинну в метанолі фракчні дослідження всіх частин Аrgеmоnе mехісаnа, цію у вигляді твердої маси. однак, жодне з досліджень не було спрямоване на Типово, рослина Аrgеmоnе mехісаnа містить виділення, характеризацію та розуміння біологічприблизно 3-4,5% розчинної в н-бутанолі фракції; них властивостей AGP, присутніх в певних части46-54% розчинної в метанолі фракції, що має занах рослини. гальне лужне число в інтервалі значень 290-340; і Суть винаходу 24-30% нерозчинної в метанолі фракції, що має Даний винахід пропонує селективний метод загальне лужне число в інтервалі значень 350-380. виділення AGP з екстракту, одержаного з листя В тому значенні, що використовується тут, лужне та/або стеблин рослини Аrgеmоnе mехісаnа, в число позначає кількість кислоти, потрібну для очищеній формі, яка виявляє значно кращу антинейтралізації усіх лужних компонентів, присутніх в псоріатичну активність та інші корисні імунологічні 1 г зразка. та фармакологічні активності у порівнянні з екстЯк згадувалося вище, ці три фракції суттєво рактом та фракціями з листя та/або стеблин росвідрізняються по складу сполук, що до них вхолини Аrgеmоnе mехісаnа, розкритими в публікації дять. Було знайдено, що розчинна в н-бутанолі патентної заявки США № 2003/0194456 А1. Зокрефракція містить алкалоїди, флавоноїди та інші ма, знайдено, що значно краща антипсоріатична низькомолекулярні сполуки; розчинна в метанолі активність, що виявляється очищеним AGP, одерфракція містить амінокислоти, органічну кислоту жаним селективним методом, є дуже корисною та солі; і нерозчинна в метанолі фракція містить при виготовленні фармацевтичної композиції, що цукри, органічні кислоти та солі. його містить, і тому забезпечує безпечне, ефектиОднак, незважаючи на те, що обширні хімічні вне та добре переносиме лікування та утворює дослідження, які проводилисяпротягом років з основу даного винаходу. різними частинами рослини Аrgеmоnе mехісаnа, Таким чином, аспект даного винаходу проподозволили виділити ряд алкалоїдів, флавоноїдів, нує селективний метод виділення композиції очиамінокислот, органічних кислот, жирних кислот і щеного арабіногалактан-протеїну (AGP) у високот.д., не було проведено та описано ніяких системчистій формі з листя та/або стебел рослини них досліджень з виділення та ідентифікації інших Аrgеmоnе mехісаnа. складових частин, присутніх у рослині. В іншому аспекті, даний винахід пропонує Однією з таких складових, широко поширених композицію очищеного арабіногалактан-протеїну у рослинному світі, є арабіногалактан-протеїни (AGP), що має діапазон значень середньої моле(AGP), які по суті є макромолекулами полісахарикулярної ваги від 10 кДа до 150 кДа, виділену з дів, у яких вуглевод асоційований з або зв'язаний з листя та/або стеблин рослини Аrgеmоnе mехісаnа. білками. AGP складається переважно з арабінозІнший аспект даного винаходу передбачає анних та галактозних залишків. Вони зустрічаються у типсоріатичну композицію та лікування псоріазу, рослинах як полісахариди, асоційовані з різними одержану з листя та/або стеблин рослини кількостями білків, і загалом мають високий вміст Аrgеmоnе mехісаnа, яка є не лише високобезпеч 13 86986 14 ною, ефективною і добре переносимою, але й, ня з використанням розчинників, таких як вода, крім того, долає недоліки та обмеження сучасної етанол або їхні суміші при кімнатній температурі терапевтичної схеми. для одержання відповідних екстрактів, що склаІншим аспектом даного винаходу є створення даються з алкалоїдів, флавоноїдів, амінокислот, композиції очищеного арабіногалактан-протеїну органічних кислот, цукрів та солей. Ці екстракти (AGP), виділеного селективним методом з листя можуть бути використані як такі або піддані ліофіта/або стеблин рослини Аrgеmоnе mехісаnа, яка лізації з одержанням ліофілізованої маси, причому виявляє корисні імунологічні та фармакологічні в обох випадках вони використовуються для фравластивості, такі як одну чи більше з імуносупресії, кціонування; інгібування лімфопроліферації, модуляції цитокііі) фракціонування екстракту, як він був одержаний, або розчину ліофілізованої маси у воді, нів, такої як інгібування IL-2, інгібування IFN-g або одержаного на стадії (і), н-бутанолом, та відокреіндукція IL-10; інгібування проліферації кератиномлення н-бутанольного шару від водної фази, з цитів, кератолітична активність та інгібування наступним промиванням н-бутанольного шару MEST. водою та випаровуванням розчинника при знижеЩе іншим аспектом даного винаходу є ствоному тиску, з одержанням в'язкої маси розчинної в рення композиції очищеного арабіногалактанн-бутанолі фракції, що складається переважно з протеїну (AGP), виділеного селективним методом алкалоїдів, флаваноїдів та інших низькомолекуляз листя та/або стеблин рослини Аrgеmоnе рних сполук; mехісаnа для лікування чи профілактики одного чи ііі) змішування та перемішування водного шабільше розладів, таких як дерматит; склеродерма; ру зі стадії (іі) з приблизно шістьма-сімома об'ємаекзема; запальні розлади та інші автоімунні хвоми метанолу і фільтрацію/центрифугування тверроби, такі як псоріатичний артрит, ревматоїдний дого осаду та сушіння з одержанням нерозчинної в артрит, хвороба Крона, розсіяний склероз, хворометанолі фракції, що складається переважно з ба подразненого кишечнику, анкілозивний спондиполісахаридів, органічних кислот та солей. Цей літ, червоний системний вовчак та синдром Шегматеріал розчиняють у воді та ліофілізують, одеррена; та/або алергій, таких як астма та хронічна жуючи ліофілізований порошок; і обструктивна легенева хвороба. iv) концентрування фільтрату, тобто, водноЩе іншим аспектом даного винаходу є ствометанольного розчину зі стадії (ііі), при зниженому рення фармацевтичної композиції, що може бути тиску з одержанням твердої маси розчинної в мевикористана для лікування та/або профілактики танолі фракції, що складається переважно з амівищезгаданих хвороб та станів, яка включає комнокислот, органічних кислот та неорганічних сопозицію очищеного арабіногалактан-протеїну лей. (AGP), виділеного селективним методом з листя Нерозчинна в метанолі фракція, одержана та/або стеблин рослини Аrgеmоnе mехісаnа. відповідно до способу, розкритого в публікації паДокладний опис винаходу тентної заявки США № 2003/0194456 А1, була виЯкщо не визначено інше, всі технічні та наукоділена з виходом приблизно 33%. Хоч в описі згаві терміни мають значення, загальноприйнятні для дується, що ця фракція складається з цукрів, пересічних фахівців в області техніки, до якої наорганічних кислот та солей, однак, ці компоненти лежить цей винахід. не були тоді охарактеризовані. В тому значенні, що використовується тут, Проведені зараз дослідження показали, що фраза "композиція очищеного арабіногалактаннерозчинна в метанолі фракція, одержана відповіпротеїну (AGP)" позначає композицію, що склададно до способу, розкритого в публікації патентної ється по суті лише з арабіногалактан-протеїнів, які заявки США № 2003/0194456 А1, складається з можуть включати слідову кількість інших компонеприблизно 3% мас. AGP (по відношенню до воднонтів, одержаних шляхом екстракції зі стебел та/або го екстракту), а решта компонентів є органічними листя рослини Аrgеmоnе mехісаnа відповідно до кислотами, амінокислотами та неорганічними соданого винаходу. Композиція очищеного AGP відлями, тобто, нерозчинна в метанолі фракція, одерізняється від фармацевтичної композиції, що ржана відповідно до способу, розкритого в публівключає композицію AGP, тому що композиція кації патентної заявки США № 2003/0194456 А1, очищеного AGP не включає жодних фармацевтичскладається з AGP в суміші з іншими компонентано прийнятних ексципієнтів. ми. Нерозчинна в метанолі фракція містить AGP, В нашій публікації патентної заявки США № хоч і в низькій концентрації та в сильно забрудне2003/0194456 А1 був розкритий процес одержання ній формі. екстракту з листя та/або стеблин рослини Автори даного винаходу знайшли, що AGP Аrgеmоnе mехісаnа та фракціонування екстракту може бути виділений в очищеній формі з виходом н-бутанолом та метанолом з одержанням, відповіприблизно 0,06% по відношенню до стебел та/або дно, розчинної в н-бутанолі, розчинної в метанолі листя Аrgеmоnе mехісаnа або приблизно 1% по та нерозчинної в метанолі фракцій. відношенню до ліофілізованого водного екстракту, Спосіб приготування різних фракції стебел виготовленого з нього високоселективним спосота/або листя рослини Аrgеmоnе mехісаnа, розкрибом, і що виділений AGP виявляє значно кращу тий у публікації патентної заявки США № антипсоріатичну активність порівняно з продукта2003/0194456 А1, включає стадії: ми, одержаними у спосіб, розкритий в публікації і) приготування екстракту стебел та/або листя патентної заявки США № 2003/0194456 А1. рослини Аrgеmоnе mехісаnа за допомогою ряду процедур екстракції, однак, краще, шляхом багатостадійної послідовної мацерації та проціджуван 15 86986 16 Селективний спосіб виділення AGP в очищеній філізують, висушений екстракт або ліофілізований формі з листя та/або стеблин рослини Аrgеmоnе порошок може бути знов розчинений в 12-50 ваг.ч. mехісаnа включає стадії: води на одну ваг.ч. висушеної/ліофілізованої маси a) екстракції 1 вагової частини (ваг.ч.) листя перед іонообмінною хроматографією. та/або стебел рослини Аrgеmоnе mехісаnа за доВ кращому варіанті втілення, ліофілізований помогою 1-10 ваг.ч. води, С1-С3-спирту чи їхньої водний екстракт розчиняють в 12 об'ємах води суміші з одержанням водного екстракту, який може перед іонообмінною хроматографією. бути, необов'язково, частково або повністю концеРозчин частково концентрованого екстракту нтрованим чи ліофілізованим; або водний розчин концентрованого чи ліофілізоb) видалення основних та кислотних компоневаного матеріалу, одержаного при повному концентів з водного екстракту, частково концентрованонтруванні вихідного екстракту, потім піддають пого екстракту, водного розчину повністю концентрослідовній іонообмінній хроматографії на ваного екстракту або ліофілізованого екстракту, катіонообмінній смолі з наступною хроматографіодержаного на стадії (а), шляхом проведення іоєю на аніонообмінній смолі або, в іншому варіанті нообмінної хроматографії частково концентровавтілення, іонообмінній хроматографії на аніонообного екстракту або водного розчину концентровамінній смолі з наступною хроматографією на катіного екстракту з одержанням нейтрального онообмінній смолі з одержанням нейтрального водного екстракту; водного екстракту. c) фракціонування нейтрального водного екстКатіоно- та аніонообмінні смоли використовуракту, одержаного на стадії (b), н-бутанолом, з ють в пропорції від 1 до 50 ваг.ч. до використовуодержанням розчинної в н-бутанолі фракції; ваного об'єму екстракту. d) змішування та перемішування водних проПридатні катіонообмінні смоли, що можуть бумивних розчинів зі стадії (с) з метанолом або етати застосовані, включають сульфоновані полістинолом та виділення твердого осаду для одержанрольні сильнокислотні катіонообмінники та слабо ня нерозчинної в метанолі чи етанолі фракції; і кислотні катіонообмінники типу карбонових кислот. e) проведення послідовно гель-хроматографії Придатні катіонообмінні смоли включають, без та ексклюзійної хроматографії нерозчинної в меобмеження, комерційно доступні та звичайно витанолі чи етанолі фракції, одержаної на стадії (d), користовувані сульфоновані полістирольні сильнодля одержання очищеного арабіногалактанкислотні катіонообмінники, такі як AG 50W (Bioпротеїну (AGP). Rad, USA), Amberlite IR-20 (Rohm and Haas, USA), Селективний спосіб виділення очищеного AGP Dowex 50W (Dow Chemical Co., USA), Duolite 225 представлений на Фіг.1. Для екстракції можуть (Bia-Prosim Ltd.), Permutit RS (Permutit AG, Gerбути використані листя, стеблини чи обидві ці часmany) та Permutite C50D (Philips and Painтини рослини Аrgеmоnе mехісаnа. Краще, викориVermoreL France); та слабокислотні катіонообмінстовують свіже листя, стеблини чи обидві ці часники типу карбонових кислот, такі як Amberlite IRCтини, і подрібнюють їх до грубої чи тонкої пасти 50 (Rohm and Haas, USA), Bio-Rex 70 (Bio-Rad, перед екстракцією. USA), Chelax 100 (Bio-Rad, USA), Duolite 436 (DiaУ варіанті втілення винаходу, одну ваг.ч. свіProsim Ltd), Permutit С (Permutit AG, Germany) і жорозмеленого листя та/або стеблин Аrgеmоnе Permutit Η та Н-70 (Permutit Co., USA). mехісаnа екстрагують 1-10 ваг.ч. води, C1-3-спирту, Придатні аніонообмінні смоли, що можуть бути або їхньою сумішшю 2-4 рази і об'єднані екстракти застосовані, включають слабколужні аніонообмінпроціджують протягом 2-20 годин при температурі ники типу аліфатичних амінів та сильнолужні аніов інтервалі від 20 °С до 45°С. нообмінники. Аніонообмінні смоли включають, без В іншому варіанті втілення, одну ваг.ч. свіжообмеження, комерційно доступні та звичайно вирозмеленого листя та/або стебел Аrgеmоnе користовувані слабколужні аніонообмінники типу mехісаnа екстрагують 1-3 ваг.ч. води, C1-3-спирту, аліфатичних амінів, такі як Amberlite IR-45 та IRAабо їхньою сумішшю 2-4 рази і об'єднані екстракти 67 (Rohm and Haas, USA), Dowex 3 (Dow Chemical проціджують протягом 2-16 годин при температурі Co., USA), Permutit Ε (Permutit AG, Germany), в інтервалі від 20°С до 45°С. Permutit A 240A (Philips and Pain-Vermorel, France); В іншому варіанті втілення, одну ваг.ч. свіжота сильнолужні аніонообмінники, такі як AG 2x8 розмеленого листя та/або стеблин Аrgеmоnе (Bio-Rad, USA), Amberlite IRA-400 (Rohm and Haas, mехісаnа екстрагують 1-1,5 ваг.ч. води, C1-3USA), Dowex 2x8 (Dow Chemical Co., USA), Duolite спирту, або суміші води та C1-3-спирту, 2-4 рази і 113 (Dia-Prosim Ltd.), Permutit ESB (Permutit AG, об'єднані екстракти проціджують протягом 16 гоGermany), та Permutite 330D (Philips and Painдин при кімнатній температурі. Vermorel, France). С1-С3-спирт вибирають з метанолу, етанолу, 1Одержаний у такий спосіб нейтральний водпропанолу та 2-пропанолу, краще, етанолу. ний екстракт може бути ліофілізований і ліофілізоПісля проціджування, екстракт фільтрують або вана маса може бути розділена між н-бутанолом центрифугують і фільтрат може бути частково та водою для наступної стадії фракціонування. концентрований до певного об'єму від вихідного Альтернативно, нейтральний водний екстракт мооб'єму екстракту або може бути сконцентрований же бути використаний як такий для фракціонувандо сухої речовини або може бути ліофілізований. ня н-бутанолом. З погляду на співвідношення варЯкщо екстракт частково концентрують, то його тість-ефективність, краще, використовують розчин концентрують до об'єму, що складає від 1/5 до нейтральної фракції, одержаний після пропускання 1/10 від вихідного об'єму екстракту. Якщо вихідний через катіоно- та аніонообмінні смоли, як такий екстракт концентрують до сухої речовини або ліодля фракціонування н-бутанолом. 17 86986 18 Типово, вищезгадану ліофілізовану масу нейтаких як випаровування, ліофілізація, розпилюватрального екстракту розподіляють у суміші води та льне сушіння, сушіння виморожуванням і т.д. н-бутанолу на 1 частину ліофілізованої маси. РозБуло знайдено, що одержаний у такий спосіб чин залишають відстоятися і н-бутанольний шар очищений AGP має діапазон значень середньої відокремлюють від водної фази. Стадію повторюмолекулярної ваги від 10 кДа до 150 кДа. Знайдеють 2-4 рази і об'єднані водні шари використовуно, що він виявляє один чи більше з таких ефектів: ють для подальшого фракціонування метанолом імуносупресія, інгібування лімфопроліферації, моабо етанолом. дуляція цитокінів, така як інгібування IL-2, інгібуУ прикладі винаходу 1 об.ч. розчину нейтральвання IFN-g, індукція IL-10, інгібування проліфераної водної фракції, одержаної після пропускання ції кератиноцитів, кератолітична активність та через катіоно- (Amberlite IR 120) та аніоноінгібування MEST. Відомо, що вони мають відно(Amberlite IRA 400) обмінні смоли, додають до шення до запальних розладів, автоімунних хвороб приблизно 10 об.ч. н-бутанолу. Фази змішують, та алергій. Відомо також, що вони мають віднодозволяють відстоятися і н-бутанольний шар відошення до антипсоріатичної активності, дерматиту, кремлюють від водної фази. Стадію повторюють 2склеродерми, екземи та сверблячих злущуваних 4 рази і об'єднані водні шари використовують для плям. Запальні розлади та автоімунні хвороби подальшого фракціонування метанолом або етавключають псоріатичнй артрит, ревматоїдний артнолом. рит, хворобу Крона, розсіяний склероз, хворобу Об'єднані водні фази, одержані на вищезгадаподразненого кишечнику, анкілозивний спондиліт, ній стадії, змішують з метанолом чи етанолом та червоний системний вовчак, синдром Шегрена. перемішують для осадження нерозчинної в метаТипи псоріазу включають бляшковий псоріаз, кранолі/етанолі фракції. Типово, метанол або етанол плеподібний псоріаз, пустульозний псоріаз та псовикористовують в пропорції 1-20 об'ємів на 1 об'єм ріаз нігтів. Алергії включають астму та хронічну водного екстракту. обструктивну легеневу хворобу. Індукція IL-10 є Твердий осад, що містить AGP, виділяють також корисною при інших хронічних, рецидивних звичайними методами, такими як декантація, фіта інших захворюваннях шкіри, пов'язаних зі шкірльтрація, центрифугування і т.д., а потім висушуними лімфоцитарними антигенами або шкірними ють, одержуючи коричнюватий аморфний поролейкоцитарними антигенами. шок. Композиція очищеного арабіногалактанОдержаний у такий спосіб твердий AGP, що протеїну (AGP) виявляє чудову антипсоріатичну містить AGP-HM та AGP-LM, далі піддають посліактивність in vitro та in vivo, медійовану шляхом довно гель-хроматографії та ексклюзійній хромаіндукції IL-10. тографії з одержанням очищених AGP-HM та AGPОчищений AGP за даним винаходом (який є LM. водорозчинним), одержаний після ексклюзійної Гель-хроматографію проводять з використанхроматографії, наприклад, на матеріалі Sephacryl, ням звичайних методик та полімерних адсорбенскладається з кількох фракцій різної молекулярної тів, таких як адсорбенти Amberlite, наприклад, ваги. Такі фракції мають середню молекулярну XAD-2, XAD-4 або XAD-7, краще, XAD-7. Неочивагу від високої, що сягає 115-150 кДа, до низької, щений твердий AGP наносять вузькою смужкою у від 10 до 15 кДа. AGP, що має високу молекулярну верхній частині потрібної колонки і промивають вагу, позначений як AGP-HM, а низьку молекуляррухомою фазою, яка є водою. Збирають фракції, ну вагу - AGP-LM. Типова композиція AGP, таким що містять AGP. чином, складається з AGP-HM та AGP-LM в змінЕлюат, що містить неочищений AGP, далі підних пропорціях. Слід розуміти, що вищезгаданий дають ексклюзійній хроматографії з використанAGP утворюється біогенетичним шляхом, при яконям звичайних методик. Для одержання очищених му вуглеводи/моносахариди постійно шукають AGP, AGP (НМ) та AGP (LM) за даним винаходом білок для утворення ковалентного зв'язку, що приможе бути використаний Sephacryl (1:25 - 1:50). водить в остаточному підсумку до утворення низьМожуть бути використані комерційно доступні комолекулярного (AGP-LM) та високомолекулярSephracyl S-100, S-200 HR та S-300 HR, краще, Sного (AGP-HM) AGP. Таке утворення ковалентного 200 HR. Sephracyl може використовуватися у співзв'язку постійно поширюється, і одержання в одвідношенні 1-2 ваг.ч. на 25-250 об.ч. розчину AGP, ному конкретному методі AGP-LM із середньою одержаного після гель-хроматографії. молекулярною вагою менш ніж 10 кДа або AGPУ варіанті втілення, сировий AGP (100 мг) розHM із середньою молекулярною вагою більше 150 чиняють у воді та завантажують на Sephacryl SкДа буде залежати від кількох факторів, деякими з 200 (25 мл). Колонку елююють при витраті 0,5 яких є характер використовуваних частин рослини, мл/хв. і збирають п'ятдесят фракцій. Всі фракції тобто, чи було використане для екстракції свіже контролюють методом HPLC-ELSD. Фракції 10-20 листя чи стеблини рослини Аrgеmоnе mехісаnа, об'єднують на основі даних HPLC (ВЕРХ), одерстан листя при збиранні, тобто, чи воно збиралося жуючи AGP-HM, і фракції 25-35 також об'єднують, у дощовий сезон і т.д. Отже, при використанні споодержуючи AGP-LM, причому компоненти компособу за даним винаходом можливе одержання зиції AGP мають діапазон значень середньої мокомпозицій очищеного AGP, що має середню молекулярної ваги від 10 кДа до 150 кДа. лекулярну вагу за межами діапазону від 10 кДа до Після ексклюзійної хроматографії, очищений 150 кДа, у залежності від вищезгаданих факторів. AGP за даним винаходом може бути виділений з З урахуванням вищевказаного, композиція AGP із водного розчину за допомогою звичайних методик, середньою молекулярною вагою за межами інтервалу від 10 кДа до 150 кДа також буде входити до 19 86986 20 обсягу винаходу. Прикладами таких композицій рин, 6-ацетоніл дигідросангуїнарин, дигідрохелеAGP є ті, що мають нижчу межу середньої молекуритрин, хелеритрин, норхелеритрин, 6-ацетоніл лярної ваги 9 кДа або композиції AGP з верхньою дигідрохелеритрин, (-)-хейлантіфолін, (-)-bмежею середньої молекулярної ваги до 155 кДа. скулерин метогідроксид, (-)-a-тілопін метогідрокОсновна частина AGP, одержаного у спосіб за сид, 6-ацетоніл дигідросангуїнарин, (-)-aданим винаходом, складається з вуглеводів, з нететраідропальматин метогідроксид, ретикулін, великою часткою білків. Вуглеводними компоненталіфолін, мурамін, аргемонін, нораргемінін, гелетами AGP є арабіноза, рамноза, метильована уроритрин та оксигідрастинін), флавоноїдів (таких як нова кислота, маноза, галактоза, глюкоза та інші ізорамнетин, ізорамнетин-3-глюкозид та ізорамненеідентифіковані цукри, зв'язані з білковим компотин-3,7-диглюкозид) та інших низькомолекулярних нентом, що складається з різних амінокислот, ідесполук; нтифікованих як аспарагін, глутамін, гідроксипроРозчинна в метанолі фракція містить амінокилін, серин, гліцин, гістидин, аргінін, треонін, аланін, слоти (такі як гістидин, лізин, глутамінова кислота, пролін, тирозин, валін, метіонін, ізолейцин, лейгліцин, аланін, лейцин, валін, фенілаланін, тироцин, лізин, фенілаланін і т.д., як видно з Таблиць І зин, треонін, аргінін, серин, аспарагін, цистеїн, та II опису. метіонін, триптофан, гідроксипролін, пролін та асВідзначається, що не лише глікозильний склад парагінова кислота), цукри та деякі солі; і AGP-HM та AGP-LM є подібним, тобто, вони мають Нерозчинна в метанолі фракція містить деякі близькі значення величини співвідношення моноорганічні кислоти (такі як бурштинова, лимонна, сахаридів та білків, що входять до їхнього складу, винна та яблучна), моносахариди, полісахариди, але й глікозильні зв'язки в обох випадках також є протеоглікани (включаючи AGP) та солі. подібними. У варіанті втілення винаходу, композиція AGP Далі, відзначається, що біологічна активність містить менш ніж 1% мас. інших компонентів екстобох компонентів з різною молекулярною вагою є ракту рослини. порівняною і не виявляє значних розбіжностей. Це Знайдено, що композиція очищеного AGP, виозначає, що очищений AGP-LM, який має молекуділена методом за даним винаходом, є чудовим лярну вагу 10 кДа, виявляє один чи більше ефекіндуктором IL-10 в СоnА-активованих мононуклеатів з імуносупресії; інгібування лімфопроліферації; рних клітинах периферичної крові (РВМС) людини. модуляції цитокінів, такої як інгібування IL-2, інгіВона створює індукцію приблизно 371% у конценбування IFN-g та індукція IL-10; інгібування пролітрації 200 мкг/мл, що набагато перевищує величиферації кератиноцитів, кератолітична активність, ну приблизно 171%, яка спостерігається для неінгібування MEST, і, найважливіше, антипсоріазну розчинної в метанолі фракції, одержаної у спосіб, активність, порівнянну з тією, що виявляється розкритий в публікації патентної заявки США № очищеним AGP-HM, який має молекулярну вагу 2003/0194456 А1, при такій саме концентрації, рів150 кДа. ній 200 мкг/мл. Композиція AGP за даним винаходом складаБільш конкретно, виділена композиція AGP ється з AGP (обох AGP-HM та AGP-LM), що по суті відрізняється тим, що вона виявляє індукцію IL-10, не містить інших компонентів, присутніх в екстракті рівну чи більшу за ту, що виявляється нерозчинрослини, який є сумішшю алкалоїдів, флавоноїдів, ною в метанолі фракцією, одержаною у спосіб, органічних кислот, амінокислот, цукрів, полісахарозкритий в публікації патентної заявки США № ридів, білків, протеогліканів (за винятком AGP) та 2003/0194456 А1, навіть у дуже низькій концентрасолей. В тому значенні, що використовується тут, ції від 0,2 до 2,0 мкг/мл. термін "по суті не містить" має охоплювати компоПорівняння ефекту концентрації AGP за даним зиції AGP, що містять від приблизно 0,0001% мас. винаходом на індукцію IL-10 ConA-індукованими до приблизно 10% мас. інших компонентів екстраРВМС людини з показниками для нерозчинної в кту рослини. метанолі фракції, одержаної у спосіб, описаний в н-Бутанольна фракція містить суміш алкалоїпатентній заявці США № 2003/0194456 А1, наведів (таких як протопін, протопін нітрат, берберин, дене в Таблиці-ІА. берберин нітрат, криптопін, алокриптопін, коптизин, сангуїнарин, дигідросангуїнарин, норсангуїна 21 86986 22 Таблиця ІА Порівняння ефекту композиції AGP за даним винаходом на індукцію IL-10 ConA-індукованими РВМС людини з даними для нерозчинної в метанолі фракції, одержаної у спосіб, описаний в патентній заявці США № 2003/0194456 А1 № 01 02 03 04 05 06 07 Концентрація композиції AGP заданим винаходом (пг/мл) 200,00 20,00 2,00 0,20 0,02 0,002 0,0002 Середній процент індукції 371,40 303,80 237,30 137,20 114,30 106,00 102,60 Концентрація нерозчинної в метанолі фракції, одержаної у спосіб за заявкою США № 2003/0194456 А1 200,00 20,00 2,00 0,20 0,02 0,002 0,0002 Середній процент індукції (як наведено в Таблиці 8 заявки США№2003/0194456 А1 171,10 162,10 98,30 24,60 -4,00 -5,00 * Значення наведені в процентах збільшення від базальних порівняно з контролем. ** Середній % індукції, що виявляється нерозчинною в метанолі фракцією, одержаною у спосіб, розкритий в патентній заявці США № 2003/0194456 А1, становив 171% при концентрації 200 мкг/мл. Така дуже сильна активність, що виявляється AGP, одержаним описаним вище методом, дозволяє вводити його в суттєво зменшеній концентрації, рівній від 1/100 до 1/1000 дози, потрібної для введення при застосуванні екстрактів/фракцій, одержаних у спосіб, розкритий в патентній заявці США № 2003/0194456 А1, тим самим забезпечуючи економічно ефективне, дієве та добре переносиме лікування псоріазу та інших розладів. Даний винахід пропонує фармацевтичні композиції, які включають ефективну кількість композиції очищеного арабіногалактан-протеїну (AGP), що має діапазон значень середньої молекулярної ваги від 10 кДа до 150 кДа, виділеного з листя та/або стеблин рослини Аrgеmоnе mехісаnа селективним методом, описаним вище, в суміші з фармацевтично прийнятними ексципієнтами. Композиції за даним винаходом є безпечними, ефективними та добре стерпними. Фармацевтичні композиції, придатні для використання в даному винаході, включають композиції, що містять активні інгредієнти в кількості, ефективній для досягнення її бажаної мети. Термін "ефективна кількість" означає таку кількість композиції AGP, що викликає біологічну або медичну відповідь тканини, клітини, системи, тварини, нелюдиноподібного ссавця або людиноподібного ссавця, якої намагаються досягти. Це має стосуватися ситуацій, коли може спостерігатися уповільнення, припинення, зупинення або переривання розвитку хвороби та/або станів, описаних тут, але не вказує обов'язково на повне знищення всіх симптомів хвороби та станів, і при цьому включає профілактичне лікування хвороби та/або станів. Композиція AGP за даним винаходом може бути сформульована у вигляді придатної дозованої форми в суміші з одним чи більше фармацевтично прийнятним ексципієнтом, таким як носії, розріджувачі, наповнювачі і т.п. Придатні дозовані форми є формами, придатними для перорального введення або місцевого введення. Необмежувальними прикладами таких дозованих форм є рідини, сухий порошок або порошкоподібний концентрат, капсула, таблетка, пресовані гранули, гранули, гелі, рідкі мазі, креми, емульсії, суспензії, дисперсії, лосьйони, пілюлі і т.п. Загалом типова фармацевтична композиція для перорального введення включає композицію AGP як активний інгредієнт у кількості в діапазоні значень 50-5000 мг, краще, 200 мг. Загалом типова фармацевтична композиція для місцевого введення включає композицію AGP як активний інгредієнт у кількості в діапазоні значень 0,1-10% мас, краще, 2% мас. Профілактична або терапевтична доза композиції AGP або композиції, що містить композицію AGP, становить від 50 мг до 5000 мг на добу, краще, доза 200 мг на добу. Доза може бути введена як разова або як кратні дози. Однак, точний склад композиції, шлях введення та доза можуть бути вибрані пацієнтом або працівником охорони здоров'я з урахуванням стану пацієнта та того, чи є пацієнт зараз ураженим хворобою чи станом або лікування є профілактичним. Профілактична доза може бути введена пацієнту, який має ризик розвитку хвороби чи стану. Фактори ризику включають, без обмеження, генетичні та екологічні фактори ризику. Краще, фармацевтичну композицію вводять в дозі, яка створюватиме бажаний результат, без викликання непотрібних побічних ефектів. В тому значенні, що використовується тут, термін "пацієнт" означає тварину, не-людиноподібного ссавця, або людиноподібного ссавця. Можуть бути виготовлені придатні дозовані форми для перорального введення та місцевого введення, що включають композицію AGP за даним винаходом в суміші з фармацевтично прийнятними носіями. 23 86986 24 Форми, придатні для перорального введення, для пацієнтів, які очікують на, або яким було провключають таблетки, капсули, порошкоподібний ведено, трансплантацію органу. концентрат, сиропи, еліксири або суспензії. Форми, Структурний аналіз та характеризація компопридатні для місцевого введення, включають рідкі зиціїAGP мазі, креми, лосьйони, масла або системи трансВизначення вмісту вуглеводів композиції AGP дермальної доставки лікарських засобів. Загальний вміст вуглеводів композиції AGP за Придатні фармацевтично прийнятні ексципієнданим винаходом визначали фенолти включають цукри, такі як лактоза, сахароза, сірчанокислотним методом з використанням Dманіт, сорбіт та ксиліт; крохмалі, такі як кукурудзягалактози як стандарту. Композицію AGP, AGP-HM ний крохмаль, маніоковий крохмаль та картоплята AGP-LM розчиняють окремо до концентрації ний крохмаль; целюлозу та її похідні, такі як натрі0,16 мг/мл у дистильованій воді. До 1 мл кожного з єва сіль карбоксиметилцелюлози, етилцелюлоза трьох розчинів, узятих окремо, додають 1 мл 5% та метилцелюлоза; фосфати кальцію, такі як дифенольного розчину та 10 мл сірчаної кислоти. кальційфосфат та трикальційфосфат; сульфат Суміші перемішують вортексом, дозволяють охонатрію; сульфат кальцію; полівінілпіролідон; полілонути до кімнатної температури. Вимірюють повініловий спирт; стеаринову кислоту; рослинні олії, глинання при 480 нм. Було знайдено, що вміст такі як арахісова олія, бавовняна олія, кунжутна вуглеводів композиції AGP знаходиться в інтервалі олія, оливкова олія та кукурудзяна олія; неіонні, 45-98%, відповідно, у порівнянні з галактозним катіонні та аніонні поверхнево-активні речовини; стандартом. Визначення вмісту білка композиції AGP етиленгліколеві полімери; b-циклодекстрин; жирні Загальний вміст білка композиції AGP за даспирти; гідролізовану барду із зернових; а також ним винаходом визначають методом Бредфорда інші нетоксичні сумісні наповнювачі, зв'язуючі, (Bradford). Вміст білка композиції AGP, AGP-HM та розпушувачі, буфери, консерванти, антиоксиданAGP-LM становив 2-20%. Амінокислотні складові ти, змащувальні речовини, смакові агенти і т.д. композиції AGP були ідентифіковані як аспарагін, Композиції за даним винаходом виготовляють глутамін, гідроксипролін, серин, гліцин, гістидин, відповідно до звичайних методів, відомих фахіваргінін, треонін, аланін, пролін, тирозин, валін, цям. метіонін, ізолейцин, лейцин, лізин та фенілаланін, Композиції є фармацевтично прийнятними, що за допомогою амінокислотного аналізатора з виозначає, що вони є придатними для застосування користанням стандартів. людьми та/або тваринами. Ідентифікація вмісту глікозилу та амінокислот Композиція AGP та фармацевтичні композиції композиції AGP шляхом гідролізу та ТШХ за даним винаходом є придатними для лікування Беруть 20 мг нейтральної фракції, одержаної та/або профілактики хвороб та станів, описаних після ексклюзійної хроматографії, та гідролізують тут. 2М трифтороцтовою кислотою (TFA, 200 мкл) у Композиція AGP за даним винаходом або фазакритому флаконі. Флакон нагрівають до 100°С рмацевтична композиція, що містить композицію протягом 1 год., концентрують та ліофілізують. AGP за даним винаходом, може бути використана Проводять тонкошарову хроматографію (ТШХ) у лікуванні та/або профілактиці псоріатичних засуміші зі стандартними зразками цукру та амінокихворювань шкіри, таких як псоріаз, включаючи слот. Одержані результати показують присутність бляшковий псоріаз, краплеподібний псоріаз, пусмоносахаридів, таких як арабіноза, галактоза, глютульозний псоріаз та псоріаз нігтів, які включають коза, рамноза та маноза. Були також виявлені амівведення ссавцю, що потребує такого лікування, нокислоти, такі як валін, фенілаланін, серин, або ссавцю з ризиком псоріатичних захворювань GABA, ізолейцин та гістидин. шкіри, ефективної кількості композиції AGP або Ідентифікація вмісту глікозилу в композиції фармацевтичної композиції, що містить терапевAGP тично ефективну кількість композиції очищеного Аналіз композиції на глікозил проводять метоарабіногалактан-протеїну (AGP). дом комбінованої газової хроматографії/масКомпозиція AGP або фармацевтична композиспектрометрії (GC/MS) пер-О-триметилисилільних ція, що містить композицію AGP, може бути вико(TMS) похідних моносахаридних метилглікозидів, ристана в лікуванні або профілактиці запальних одержаних з AGP-HM та AGP-LM кислотним метарозладів; автоімунних хвороб, таких як псоріатичнолізом. ний артрит, ревматоїдний артрит, хвороба Крона, Метилглікозиди спочатку одержують із сухого розсіяний склероз, хвороба подразненого кишечзразка AGP метанолізом в 1М НСІ у метанолі при нику, анкілозивний спондиліт, червоний системний 80°С (18-22 годин), з наступним pe-Nвовчак та синдром Шегрена; алергій, таких як астацетилюванням піридином та оцтовим ангідридом ма та хронічна обструктивна легенева хвороба. у метанолі (для детектування аміноцукрів). Зразки Лікування або профілактика включає введення потім пер-О-триметилсилілюють шляхом обробки ссавцю, що потребує такого лікування, або ссавцю Tri-Sil (Pierce) при 80°С (0,5 години). Ці процедури з ризиком розвитку або із спостережуваним початпроводять, як було раніше описано York, W.S., ком одного з цих розладів або хвороб, ефективної Darvill, A.G., McNeil, M., Stevenson, T.T., and Alberкількості композиції AGP або фармацевтичної sheim, P., Methods Enzymol., 1985, 230, 1-15, та композиції, що містить терапевтично ефективну Methods Enzymol., 1985, 118, 3-40. кількість композиції очищеного арабіногалактанАналіз методом GC/MS TMS-метилглікозидів протеїну (AGP). Композиції за даним винаходом, проводять за допомогою приладу HP 5890 GC, які спричинюють імуносупресію, є також корисними спряженого з 5970 MSD, з використанням капіляр 25 86986 26 ної колонки з плавленого кварцу All Tech EC-1 (30 лізують методом газової хроматографії-масспектрометрії (GC-MS), як було описано раніше м ´ 0,25 мм внутрішній діаметр (ID)). [York, W.S., Darvill, A.G., McNeil, M., Stevenson, Глікозильні компоненти композиції AGP навеТ.Т., and Albersheim, P., Methods Enzymol., 1985, дені у Таблиці І. 230, 1-15; York, W.S., Darvill, A.G., McNeil, M., Stevenson, T.T., and Albersheim, P., Methods Enzymol., Таблиця І 1985, 118, 3-40]. Спочатку, аліквоту зразка перметилюють [за Глікозильні компоненти композиції AGP методом Ciukanu and Kerek, Carhohydr. Res., 1984, 131, 209-217] шляхом обробки гідросидом натрію Композиція та метилйодидом у сухому ДМСО. ПерметилюКомпоненти AGP вання повторюють двічі для забезпечення повного (% мол.) метилювання полімеру. Після доопрацювання зраАрабіноза (Аrа) 34,00 зка, перметильований матеріал гідролізують за Рамноза (Rha) 3,40 допомогою 2М трифтороцтової кислоти (2 год. у Метильована уронова кислота 5,00 герметизованій пробірці при 121°С), відновлюють (MUA) NaBD4 та ацетилюють за допомогою оцтового анМаноза (Man) 2,20 гідриду/піридину. Одержані РМАА аналізують за Галактоза (Gal) 48,90 допомогою приладу Hewlett Packard 5890 GC, Глюкоза (Glc) не знайдено спряженого з 5970 MSD (мас-селективний детекНеідентифіковані цукри 6,50 тор, режим іонізації електронним ударом); розділення проводять за допомогою капілярної колонки Визначення глікозильних зв'язків у композиції з плавленого кварцу, 30 м, Supelco 2330 зі зв'язаAGP ною фазою. Метод NaOH: Для аналізу глікозильних зв'язків Глікозильні зв'язки із зазначенням процентної зразок композиції AGP перметилюють, деполімечастки наведені у Таблиці II. ризують, відновлюють та ацетилюють; і одержані частково метильовані альдитацетати (РМАА) анаТаблиця II Глікозильні зв'язки у композиції AGP Глікозильний залишок термінальний рамнопіранозильний залишок (t-Rhap) термінальний арабінофуранозильний залишок (t-Araf) термінальний арабінопіранозильний залишок (t-Arap) Суміш 3-рамнопіранозильний залишок (3-Rhap) 4-рамнопіранозильний залишок (4-Rhap) термінальний глюкопіранозильний залишок (t-Glcp) термінальний галактопіранозильний залишок (t-Galp) 5-зв'язаний арабінофуранозильний залишок (5-Агаf) 2-зв'язаний манопіранозильний залишок (2-Маnр) 2-зв'язаний глюкопіранозильний залишок (2-Glcp) 3-зв'язаний галактопіранозильний залишок (3-Galp) 4-зв'язаний галактопіранозильний залишок (4-Galp) 6-зв'язаний глюкопіранозильний залишок (6-Glcp) 6-зв'язаний галактопіранозильний залишок (6-Galp) 3,6-зв'язаний глюкопіранозильний залишок (3,6-Glcp) 3,6-зв'язаний галактопіранозильний залишок (3,6-Galp) Визначення молекулярної ваги композиції AGP Композицію AGP, AGP-HM та AGP-LM аналізують з використанням інструменту для водної гель-проникної хроматографії (GPC) Waters, Model Alliance 2690, обладнаного інтегрованим блоком керування розчинником та зразком та детектором показника заломлення, що включає термічно екрановану проточну кювету та оптику з протитечійним теплообмінником для кращої стабільності базової лінії. Хроматографічна робоча станція включає програмне забезпечення для збирання та контролю даних і програмне забезпечення Millenium для обробки даних. Колонки GPC були одержані від фірми Tosoh Corporation (типу TSK-GEL Процент вмісту в композиції AGP 3,00 22,00 1,00 1,00 3,00 5,00 5,00 сліди сліди 16,00 1,00 2,00 8,00 2,00 31,00 PW) і містили гідрофільний полімер на основі напівжорсткого гелю. Межа молекулярної ваги виключення для полісахаридів (декстран) становить від 1000 до 7000. Ці колонки призначені для аналітичного та препаративного розділення синтезованих водорозчинних полімерів, олігомерів та біологічних речовин, таких як полісахариди, нуклеїнові кислоти, білки, пептиди і т.д. Пулулановий набір складається з полісахаридних зразків різної молекулярної ваги для калібрування колонки. Метод GPC був розроблений з використанням різних аналітичних умов, таких як різна пористість колонки, концентрація та природа рухомої фази, об'ємна витрата, чутливість детектора і т.д. Опти 27 86986 28 3,74 та 3,57 були віднесені до Н-2 протонів 4мальне розділення полісахаридного зразка одержували при використанні 0,2М розчину нітрату зв'язаного, 3-зв'язаного та термінального a-Lнатрію і наведені далі аналітичні умови були приRhap, відповідно. датними для характеризації молекули лікарського Н-3 протони: Сигнал при d 4,03 був віднесений засобу на основі полісахариду. до термінального та 5-зв'язаного a-L-Araf залишМолекулярну вагу композиції AGP визначали ків. Далі, сигнал при d 3,81 був віднесений до тершляхом порівняння часу елюювання з використанмінального та 6-зв'язаного b-D-Galp. Аналогічно, ням ексклюзійної хроматографії. На основі порівсигнал при d 4,31 був віднесений до 3- та 3,6няння було знайдено, що діапазон значень середзв'язаного b-D-Galp фрагментів. Сигнали при d ньої молекулярної ваги композиції AGP складає 3,93, 3,63 та 3,57 були віднесені до 4-зв'язаного, від 10 кДа до 150 кДа. термінального та 3-зв'язаного a-L-Rhap, відповідМолекулярні ваги AGP-LM та AGP-HM також но. були визначені аналогічним способом. На основі Н-4 протони: Сигнал при d 4,22 був віднесений порівняння було знайдено, що середня молекулядо термінального та 5-зв'язаного a-L-Araf. Сигнал рна вага компонентів становить 13 кДа та 115кДа, при d 3,63 був віднесений до 3- та 6-зв'язаного bвідповідно. D-Galp залишків. Далі, сигнали при d 3,86 та 4,03 Спектр ІЧ-перетворення Фур'є (FT-IR) компобули віднесені до термінального та 3,6-зв'язаного зиції AGP b-D-Galp, відповідно. Аналогічно, сигнали при d ІЧ спектр AGP-HM за даним винаходом, вимі3,63, 3,09 та 2,82 були віднесені до 4-зв'язаного, 3ряний за допомогою ІЧ-Фур'є спектрометра 8201 зв'язаного та термінального a-L-Rhap фрагментів. PC Shimadzu, з використанням ступки Nujol, в КВr Н-5 протони: Сигнал при d 3,81 був віднесений таблетках, має широку смугу поглинання при 3400 см-1, що вказує на присутність гідроксильних груп, до 6- та 3,6-зв'язаного b-D-Galp. Аналогічно, сигта при 2850-2960 см-1, що вказує на валентні колинал при d 4,03 був віднесений до термінального та вання СН зв'язків. 3-зв'язаного b-D-Galp. Сигнали при d 3,91 та 3,93 h) Спектр 1Н ядерного магнітного резонансу були віднесені до термінального та 5-зв'язаного aкомпозиції AGP L-Araf, відповідно. Сигнали при d 4,22, 4,03 та 3,09 Спектр 1Н ЯМР AGP за даним винаходом ребули віднесені до Н-5 термінального, 4-зв'язаного єстрували у D2O при 500 МГц за допомогою ЯМРта 3-зв'язаного a-L-Rhap. Сигнали при d 4,03, 3,45 спектрометра Bruker DRX 500. та 4,03 можуть бути віднесені до Н-5 3-зв'язаного Було проведено докладне віднесення протонів b-D-Galp та термінального b-D-Galp залишків, відусіх основних типів зв'язків, детектованих шляхом повідно. 1 аналізу метилювання. У спектрі Н ЯМР були деН-6 протони: Сигнал при d 3,93 був віднесений тектовані Н-1 сигнали що відповідають b-D-Gal-p до 6- та 3,6-зв'язаного b-D-Galp. Сигнали при d залишкам (d 4,22-4,47) та a-L-Ara-f залишкам (d 3,91 та 3,81 були віднесені до термінального та 35,17-5,33). Спостерігалися численні сигнали d зв'язаного b-D-Galp, відповідно. Метильні протони, 3,53-4,22, які відповідають Н-2 - Н-6 b-D-Gal-p защо спостерігалися при d 1,03, 1,34 та 1,40, були лишків, Н-2 - Н-5 a-L-Ara-f залишків та Н-2 - Н-5 віднесені до 3-зв'язаного, 4-зв'язаного та термінамалих залишків глюкози, рамнози та манози. Для льного a-L-Rhap фрагмента. розрізнення та віднесення цих сигналів до конкреНаведені вище віднесення були додатково тних залишків були проведені 2D гомо- та гетеропідтверджені шляхом проведення експериментів нуклеарні експерименти. Віднесення різних типів HOMOCOSY. зв'язків до кожної зі спінових систем, ідентифікоАмінокислотні залишки: Метильна група аміваних на 2D-спектрах, підтверджувалося як данинокислот валіну, лейцину та ізолейцину спостеріми про зв'язки, наведеними в Таблиці II, так і порігалася при d 1,03, у той час як метили, віднесені внянням з даними ЯМР, описаними в літературі до треоніну та аланіну, були розташовані при d для інших AGP. 1,34 та 1,40, відповідно. Аномерні протони: Аномерні протони, що споСa, Cb (C-H, СН2), Сg (СН2) та Сd (СН2) протостерігаються при d 5,33 та d 5,17, були віднесені ни аргініну, аспарагіну, глутаміну, ізолейцину, лейдо термінального та 5-зв'язаного a-L-Аrаfцину, лізину, метіоніну, проліну та валіну спостерізалишків, відповідно. Сигнал при d 5,17 був також галися в інтервали значень d 1,3-2,8. віднесений до термінального a-L-Rhap, а при d C-b (СН2, СН), Сg, Сd протони аспарагіну, гіс5,10 - до 4-зв'язаного a-L-Rhap. Аналогічно, сигнал тидину, фенілаланіну та тирозину спостерігалися в при d 4,61 був віднесений до 3-зв'язаного a-Lдіапазоні значень d 2,8-3,5. Rhap. Сигнал при d 4,56 був віднесений до 6Сa протони аланіну, аргініну, глутаміну, гліцизв'язаного b-D-Galp. Сигнал при d 4,61 був віднену, ізолейцину, лейцину, лізину, метіоніну, треонісений до 3-зв'язаного b-D-Galp, а сигнали при d ну та валіну спостерігалися в діапазоні значень d 4,56 та 4,57 були віднесені до термінального b-D3,5-3,9. Galp та 3-,6-зв'язаного b-D-Galp. Сa протони аспарагіну, гістидину, фенілаланіН-2 протони: Сигнали при d 4,31 та 4,22 були ну, проліну, серину, тирозину та Cb протони серивіднесені до Н-2 термінального та 5-зв'язаного aну і треоніну спостерігалися в діапазоні значень d L-Araf залишків, відповідно. Далі, сигнал при d 3,45 3,90-4,2. був віднесений до термінального b-D-Galp, а сигнал при d 3,74 був віднесений до 3-, 6-та 3,6зв'язаних b-D-Galp залишків. Сигнали при d 4,03, 29 86986 30 d 69,17, у той час як 3-зв'язаний та термінальний Слабкі сигнали у низькопольній області d 6,67,5 були віднесені до Ν-Η та ароматичних протонів сигнали спостерігалися при d 60,93 та 61,25, відфенілаланіну і тирозину. повідно. Сигнал, що належить С-6 у b-D-GIcp заі) Спектр 13С ядерного магнітного резонансу лишку, для термінальної групи спостерігався в композиції AGP інтервалі значень d 60-62, а сигнал при d 70,1 спо13 Аномерні атоми вуглецю: В спектрі С ЯМР стерігався для 6-зв'язаної групи. сигнали при d 109,10 та 107,37 були віднесені до Метильні групи: Сигнали, що спостерігалися аномерних атомів вуглецю термінального та 5при d 16,7, 19,9 та 22,2, були віднесені до метилзв'язаного a-L-Araf фрагмента. Сигнали в діапазоні ьних груп a-L-Rhap. значень d 103-102 були віднесені до аномернх Наведені вище віднесення були додатково атомів вуглецю термінального, 3-зв'язаного, 6підтверджені шляхом проведення експериментів зв'язаного та 3,6-зв'язаного b-D-Galp залишків. HETCOR. Такі ж перекривні сигнали в інтервалі d 103-102 Амінокислоти: Сигнал при d 16,70 був віднесебули віднесені до аномерних атомів вуглецю 4ний до Сg та Сd метильних груп валіну, Cb метилзв'язаного b-D-Glup, 4-зв'язаного b-D-Xylp, терміьної групи аланіну та Сd метильної групи метіонінального b-D-GIcp та 3-зв'язаного a-L-Rhap. ну. Сигнал при d 19,97 був віднесений до Сg С-2: Сигнали при d 81,97 були віднесені до 5метильної групи треоніну. Сигнал при d 22,22 був зв'язаного a-L-Araf фрагмента. Сигнали С-2, що віднесений до Сg (СН2), Сg (С-Н) аргініну, лейцину, спостерігалися при d 72,94 та 72,72, були віднесені ізолейцину, лізину та до Сd і Сe метилних груп до термінального та 6-зв'язаного b-D-Galp залишлейцину. ків, відповідно. Сигнал при d 72,56 був віднесений Сигнал при d 31,01 був віднесений до Cb (CH2) до 3- та 3,6-зв'язаного b-D-Galp залишку. Аналогіаргініну, метіоніну, лізину, проліну та Сg (СН2) глучно, С-2 сигнали, віднесені до термінального та 6таміну. зв'язаного b-D-GIcp, спостерігалися при d 74,81, Сигнал при d 38,05 був віднесений до Cb (СН2) 74,60 та 73,33, відповідно. С-2 сигнали a-L-Rhap, аспарагіну, лейцину, фенілаланіну, тирозину, Сa віднесені до термінального, 3-зв'язаного та 4гліцину та Сd (СН2) аргініну та лізину. Сигнал при d зв'язаного залишків, спостерігалися при d 80,02, 48,45 був віднесений до Сa протону аланіну, ас76,55 та 70,68, відповідно. Сигнал при d 81,24 був парагіну, лейцину та Сd проліну. віднесений до 2-зв'язаного b-D-Manp залишку. Сигнал при d 59,81 був віднесений до СaС-3: Сигнал при d 76,55 був віднесений до тепротонів аргініну, цистину, глутаміну, гістидину, рмінального та 5-зв'язаного a-L-Araf. Сигнал при d ізолейцину, лізину, метіоніну, фенілаланіну, сери74,81 був віднесений до термінального та 6ну та тирозину. Сигнал при d 60,9 був віднесений зв'язаного b-D-Galp. Далі, сигнал при d 81,97 був до Сa-протону валіну та треоніну, тоді як сигнал віднесений до 3- та 3,6-зв'язаного b-D-Galp залишпри 61,25 був віднесений до Сa-протону проліну ку. Сигнали при d 76,55 та 74,81 були віднесені до та Cb-протону серину. термінального, 4-зв'язаного та 6-зв'язаного b-DСигнал при d 68,38 був віднесений до Cb (CH) GIcp фрагментів. Аналогічно, сигнали при d 80,02, треоніну. 76,55 та 70,6 були віднесені до термінального, 3Сигнали в діапазоні значень d 108-140 були зв'язаного та 4-зв'язаного a-L-Rhap фрагментів, віднесені до олефінових протонів гістидину та ароматичних протонів фенілаланіну. відповідно. Сигнал при d 155,64 був віднесений до Сe арС-4: Сигнал при d 83,85 був віднесений до тегініну та С-4 тирозину, у той час як карбонільний рмінального та 5-зв'язаного a-L-Araf фрагмента. сигнал при d 166,19 був віднесений до глутаміну. Сигнал при d 70,15 був віднесений до термінальВ низькопольній області, сигнали, що спостеріного b-D-Galp залишку. Сигнал при d 70,68 був галися в діапазоні значень d 171-175, були відневіднесений до 3- та 6-зв'язаного b-D-Galp залишку. сені до карбонільних груп амінокислот аланіну, Сигнал при d 73,33 був віднесений до 3,6аргініну, аспарагіну, глутаміну, гліцину, гістидину, зв'язаного b-D-Galp залишку. Сигнали при d 80,02, ізолейцину, лейцину, лізину, метіоніну, фенілала70,68 та 70,15 були віднесені до С-4 6-зв'язаного ніну, проліну, серину, треоніну та тирозину. та термінального b-D-GIcp фрагмента, відповідно. На закінчення, відзначимо, що структура AGPСигнали при d 81-83 були віднесені до С-4 3HM складається з 6-зв'язаної галактопіранози та зв'язаного, 4-зв'язаного та термінального a-L-Rhap 3,6-зв'язаної галактопіранози як головного ланцюфрагмента. га та арабінофуранозильного, арабінопіранозильС-5: Сигнал, що належить С-5 5-зв'язаного aного, рамнопіранозильного, глюкопіранозильного L-Araf, спостерігався при d 69,17, у той час як сигта галактопіранозильного залишків в термінальних нал термінального a-L-Araf спостерігався при d положеннях. AGP далі містить 3-зв'язаний, 461,25. С-5 сигнали, що належать 3-зв'язаному, 6зв'язаний рамнопіранозильний, 2-зв'язаний манозв'язаному та термінальному b-D-Galp залишку, піранозильний, 2-зв'язаний глюкопіранозильний, 3спостерігалися в діапазоні значень d 74-77, тоді як зв'язаний, 4-зв'язаний галактопіранозильний, 6С-5 сигнали, що належать термінальній групі, спозв'язаний-, 3,6-зв'язаний глюкопіранозильний та 4стерігалися при d 75-76 у випадку b-D-GIcp фрагзв'язаний ксилопіранозильний залишки, разом з мента. метилуроновою кислотою. С-6: С-6 сигнали, що належать 6- та 3,6Амінокислотні компоненти композиції AGP бузв'язаному b-D-Galp залишкам, спостерігалися при ли ідентифіковані як аспарагін, глутамін, гідрокси 31 86986 32 пролін, серин, гліцин, гістидин, аргінін, треонін, Імунологічні та фармакологічні властивості аланін, пролін, тирозин, валін, метіонін, ізолейцин, композиції AGP Цитокінові тести, такі як IL-2, IFN-g, лейцин, лізин та фенілаланін. Однак, сайти приєдIL-10, та інші in vivo активності, такі як гіперчутлинання амінокислот не були визначені. AGP-LM вість уповільненого типу (DTH), на морських свинтакож має подібну структуру, але відрізняється ках описані нижче. Порівняння біологічної активмолекулярною вагою. На основі наведених вище ності водного екстракту, одержаного у спосіб, даних була запропонована така структура компорозкритий в публікації заявки США № зиції AGP (Фіг.2). Як AGP-HM, так і AGP-LM мають 2003/0194456 А1, та композиції AGP за даним виподібну біологічну активність, отже, композиція находом наведено в Таблиці III. AGP використовувалася в усіх біологічних дослідженнях. Таблиця III Порівняльна біологічна ефективність водного екстракту (1), одержаного згідно зі способом, розкритим у публікації заявки США № 2003/0194456 А1, та композиції AGP за даним винаходом (2) № 1 2 3 4 5 6 7 8 Параметри Індукція IL-10 (ЕС50 в мкг/мл) Інгібування IL-2 (% інгібування при 20 нг/мл) Інгібування IFNg (% інгібування при 20 нг/мл) Інгібування TNFa (% інгібування при 2 мкг/мл) Інгібування GMCSF (% інгібування при 200 нг/мл) ТРА-індукована гіперплазія шкіри (ED50 мг/кг) Модель DTH (ED50 мг/кг) MEST (ED50 мг/кг) Токсикологічні дослідження композиції AGP Гостру токсичність (LD50) композиції AGP оцінювали на мишах та пацюках при введенні оральним та внутрішньовенним (i.v.) шляхами. Групам з десяти (10) тварин кожного виду на шлях введення на дозу вводили лікарський засіб і результати обчислювали на день 15. Для композиції AGP спостерігалися такі значення: LD0 мишей перорально (р.о.): >5000 мг/кг ваги тіла, LD0 мишей внутрішньовенно (i.v.): >1000 мг/кг ваги тіла, LD0 пацюків р.о.: >5000 мг/кг ваги тіла, LD50 пацюків i.v.: > 250 мг/кг ваги тіла. Біологічні аналізи композиції AGP Опис методів оцінки продукування IL-10 людини З метою оцінки ефективності композиції AGP для визначення її терапевтичного потенціалу при псоріазі, оцінюють її роль в in vitro індукції IL-10 методом тесту на продукування IL-10 СоnАіндукованими РВМС [Raychudhuri S.P., Farber Ε.Μ., Raychudhuri S.K., Int. J. Immunopharmacol., 1999, 21, 609]. Стисло, людські РВМС (мононуклеарні клітини периферичної крові) виділяють та стимулюють 10 мкг/мл СоnА разом з різними концентраціями композиції AGP та інкубують протягом 48 годин при 37°С в СО2-інкубаторі з 5% СО2. Надосадні Водний екстракт (1) 254 29,32±5,26 33,27±6,52 44,34±6,64 35,57±9,45 36,3 4,34 14,0 Композиція AGP (2) 1,075 51,10+4,33 54,50±4,00 60,68±9,03 43,28±6,21 2,31 0,58 6,43 рідини збирають та заморожують при -70°С до проведення кількісних вимірів методом ELISA. Для детектування IL-10 в надосадній рідині культур були придбані набори людського IL-10 для ELISA у фірми R and D System. Процент індукції обчислюють порівняно з контролем. Результати наведені в Таблиці IV. Композиція AGP, виділена з Аrgеmоnе mехісаnа, виявляла збільшення продукування IL10 у ConA-активованих людських РВМС в діапазоні значень від 0,0002 мкг/мл до 200 мкг/мл (Фіг.3). Було знайдено, що IL-10 є регуляторним цитокіном при лікуванні псоріазу і, як добре відомо, індукує антипсоріатичну терапію. Індукція IL-10 є корисною при лікуванні та/або профілактиці псоріазу, дерматиту, склеродерми, запальних розладів та інших автоімунних хвороб, таких як псоріатичний артрит, бляшковий псоріаз, краплеподібний псоріаз, ревматоїдний артрит, хвороба Крона, розсіяний склероз, хвороба подразненого кишечнику, анкілозивний спондиліт, червоний системний вовчак, синдром Шегрена, алергій, таких як астма, хронічна обструктивна легенева хвороба, та споріднених станів, таких як екзема та злущувані сверблячі плями. Індукція IL10 є також корисною при інших хронічних, рецидивних та інших захворюваннях шкіри, пов'язаних зі шкірними лімфоцитарними антигенами або шкірними лейкоцитарними антигенами. 33 86986 34 Таблиця IV Ефект композиції AGP на індукцію IL-10 ConA-індукованими РВМС людини Концентрація екстракту (кг/мл) 200 20 2 0,2 0,02 0,002 0,0002 Середній % індукції 371,40 303,80 237,30 137,20 114,30 106,00 102,60 *3начення наведені в процентах збільшення від базальних порівняно з контролем Опис методів оцінки продукування IL-2 та IFN-g людини З метою оцінки ефективності композиції AGP для визначення її терапевтичного потенціалу при псоріазі, оцінювали її роль в in vitro модулюванні IL-2 та IFN-g шляхом тесту на інгібування продукування IL-2 та IFN-g з фітогемаглютин (РНА)індукованими РВМС [Brynskov J, Tvede N., Gut., 1990, 31(7), 795]. Метою цих досліджень була оцінка ефекту AGP на РНА-індуковане продукування IL-2 та IFN-g лімфоцитами людини. Стисло, одержують від здорових осіб мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС). Один мільйон РВМС на мл стимулюють РНА (5 мкг/мл) разом з різними концентраціями композиції AGP, виділеної з Аrgеmоnе mехісаnа, протягом 48 годин при 37°С в СO2-інкубаторі з 5% СО2. Надосадні рідини збирають та заморожують при -70°С. Для детектування IL-2 та IFN-g в надосадній рідині культур використовують набори IL-2 людини та IFN-g людини для ELISA фірми R and D System. Процент інгібування обчислюють порівняно з контролем. Було знайдено, що композиція AGP, виділена з листя та/або стебел Аrgеmоnе mехісаnа, інгібує мітоген-індуковане продукування IL-2 в інтервалі концентрацій від 0,002 мкг/мл до 20 мкг/мл (Фіг.4). Відомо, що ця інгібуюча активність по відношенню до спричинюваного мітогенами продукування IL-2 є імунодепресивною і, як добре встановлено, корисною при лікуванні та/або профілактиці псоріазу. Результати наведені в Таблиці V. Таблиця V Вплив композиції AGP на продукування IL-2 РНА-індукованими РВМС людини Концентрація композиції AGP (мкг/мл) 20,00 2,00 0,20 0,02 0,002 0,0002 0,00002 Середній % інгібування 54,53 54,49 53,97 51,10 30,56 10,87 3,75 *3начення наведені в процентах інгібувань і порівняно з контролем Було знайдено, що композиція AGP, виділена з Аrgеmоnе mехісаnа, інгібує мітоген-індуковане продукування IFNg в інтервалі концентрацій від 0,0002 мкг/мл до 2 мкг/мл (Фіг.5). Відомо, що ця інгібуюча активність по відношенню до мітоген індукованого продукування IFN-g є імунодепресивною і, як добре встановлено, корисною у лікуванні та/або профілактиці псоріазу. Результати наведені в Таблиці VI. 35 86986 36 Таблиця VI Вплив композиції AGP on продукування IFN-g РНА-індукованими РВМС людини Концентрація композиції AGP (мкг/мл) 20,00 2,00 0,20 0,02 0,002 0,0002 0,00002 Середній % інгібування 55,19 57,07 53,69 54,50 38,62 15,34 4,04 *3начення наведені в процентах інгібування порівняно з контролем Опис методів оцінки продукування GMCSF та TNF-альфа людини З метою оцінки ефективності композиції AGP за даним винаходом для визначення її терапевтичного потенціалу при псоріазі, оцінювали її роль в in vitro модуляції гранулоцитарномакрофагально колонієстимулюючого фактора (GMCSF) та TNF-a методом тесту на інгібування продукування GMCSF та TNFg РВМС, стимульованими СоnА та LPS. Стисло, виділяють РВМС з крові здорових добровольців, стимулюють 10 мкг/мл СоnА разом з різними концентраціями композиції AGP, та інкубують протягом 48 годин при 37°С в СО2інкубаторі з 5% СО2. Додають 5 мкг/мл LPS та інкубують протягом 24 годин в таких саме умовах. Надосадні рідини збирають та заморожують до проведення кількісних вимірів цитокіни методом ELISA. Процент інгібування обчислюють порівняно з контролем. Було знайдено, що композиція AGP, виділена з Аrgеmоnе mехісаnа, інгібує мітоген-індуковане продукування GMCSF в інтервалі концентрацій від 0,02 мкг/мл до 2 мкг/мл (Фіг.6). Відомо, що ця інгібуюча активність по відношенню до мітогеніндукованого продукування GMCSF є імунодепресивною і, як добре встановлено, корисною при лікуванні та/або профілактиці псоріазу. Результати наведені в Таблиці VII. Таблиця VII Вплив композиції AGP на продукування GMCSF СоnА- та LPS-індукованими РВМС людини Концентрація композиції AGP (мкг/мл) 2,00 0,20 0,02 Середній % інгібування 32,31 43,28 35,41 *3начення наведені в процентах інгібування і порівняно з контролем Було знайдено, що композиція AGP, виділена з Аrgеmоnе mехісаnа, інгібує мітоген-індуковане продукування TNF-a в інтервалі концентрацій від 0,002 мкг/мл до 2 мкг/мл (Фіг.7). Відомо, що ця інгібуюча активність по відношенню до виклика ного мітогенами продукування TNF-a є імунодепресивною і, як добре встановлено, корисною при лікуванні та/або профілактиці псоріазу. Результати наведені в Таблиці VIII. Таблиця VIII Вплив композиції AGP на продукування TNF-a ConA- та LPS-індукованими РВМС людини Концентрація композиції AGP (мкг/мл) 2,00 0,20 0,02 0,002 Середній % інгібування 60,68 46,18 22,02 10,30 *3начення наведені в процентах інгібування порівняно з контролем. Ефект композиції AGP на проліферацію NGFіндукованих кератиноцитів людини Кератиноцити були придбані у фірми GIBCO (USA) і утримувалися в середовищі для кератиноцитів, що не містить сироватки (GEBCO, # 37 86986 38 10744-019), з добавкою факторів росту. Приблизнг/мл NGF (фактор росту нервів). Середовище но 150 мкл KGM (середовище для вирощування видаляють після 8 днів інкубації. Клітини промикератиноцитів), що містить 2000 клітин, поміщавають фосфатно-сольовим буфером (PBS). Доють до кожної лунки 96-лункового плоскодонного дають LDH (лактатдегідрогеназа) проявний лізипланшета. Наступного дня середовище замінясний розчин та інкубують протягом 10 хв. при ють на 1:2 об'єм KGM:KBM (базальне середови37°С. Вимірюють оптичну густину (OD) за допоще для кератиноцитів). Тридцять мікролітрів розмогою зчитувача для ELISA при довжині хвилі веденої композиції AGP додають до кожної лунки 492 нм. Обчислюють процент проліферав трьох паралельних вимірах, за винятком лунок ції/інгібування. Результати наведені в Таблиці IX. контрольних клітин. Додають до кожної лунки 100 Таблиця IX Вплив композиції AGP на проліферацію NGF-індукованих кератиноцитів людини Композиція AGP (мкг/мл) 40,00 8,00 1,60 0,32 0,064 0,0128 0,0025 0,0005 0,0001 Середній % інгібування 79,15 74,53 71,49 66,78 55,75 26,78 15,36 6,18 3,03 *3начення наведені в процентах інгібування порівняно з контролем Було знайдено, що композиція AGP, виділена з Аrgеmоnе mехісаnа, інгібує проліферацію NGFіндукованих кератиноцитів людини в діапазоні концентрацій від 0,0001 мкг/мл до 40 мкг/мл (Фіг.8 та 9). Відомо, що ця інгібуюча активність по відношенню до проліферації NGF-індукованих кератиноцитів людини є імунодепресивною і, як добре встановлено, корисна при лікуванні та/або профілактиці псоріазу. Опис методів оцінки in vivo імуносупресії шляхом визначення гіперчутливості уповільненого типу у морських свинок Ця стандартна процедура використовувалася для оцінки in vivo ефективності композиції AGP при визначенні її здатності інгібувати індуковану очищеними білковими похідними (PPD) гіперчутливість уповільненого типу у морських свинок. Стисло, морських свинок сенсибілізували за допомогою 100 мкг PPD інтрадермально з повним ад'ювантом Фрейнда. Дві наступні бустерні дози по 100 мкг PPD з неповним ад'ювантом Фрейнда вводили з інтервалом в тиждень. Композицію AGP вводили перорально раз на добу протягом 28 днів. Тварин провокували за допомогою 100 мкг PPD інтрадермально на 28-й день та різницю в товщині шкіри між контрольними тваринами та тваринами, що одержали ін'єкцію PPD, вимірю вали через 24 години після провокаційної проби за допомогою кронциркуля Варн'є. Різницю в товщині шкіри обчислювали, віднімаючи товщину шкіри таких саме морських свинок, яким було зроблено ін'єкцію сольового розчину. Процент інгібування обчислювали порівняно з тваринами, сенсибілізованими сольовим розчином. Було знайдено, що композиція AGP, виділена з Аrgеmоnе mехісаnа, була імунодепресивною по відношенню до PPD-сенсибілізованих та PPDпровокованих морських свинок в діапазоні значень 20-65,89 % інгібування при дозі 0,10-100 мг/кг перорально (р.о.). Було знайдено, що ефективна доза, яка спричинює 50% інгібування (ED5o) збільшення товщини шкіри у PPDпровокованих морських свинок, становить 0,508 мг/кг р.о. (Фіг.10). Сильна імунодепресивна дія є добре встановленою і корисною для антипсоріатичного лікування. Імуносупресія на моделі DTH є корисною моделлю для декількох хвороб, при яких потрібна імуносупресія, таких як псоріаз, дерматит, склеродерма, запальні розлади та інші автоімунні хвороби, такі як псоріатичний артрит, бляшковий псоріаз та краплеподібний псоріаз. Результати наведені в Таблиці X. 39 86986 40 Таблиця X Ефект композиції AGP на товщину шкіри у морських свинок, провокованих за допомогою PPD Концентрація композиції AGP, мг/кг 0,01 0,10 1,00 10,00 30,00 100,00 Опис методів оцінки ТРА Мишей Balb/C рандомізували та акліматизували у клітках протягом 5 днів перед експериментом. Волосся видаляли шляхом місцевого застосування препарату Anne French та добре очищали. Створювали групи, що складалися з шести мишей у кожній. Групу ацетонового контролю та контрольні групи ТРА (12-Отетрадеканоїлфорбол-13-ацетат) створювали разом з групами тестування лікарського засобу. Композицію AGP розчиняють в рекомендованому носії (ацетон) і вводять тваринам дози перораль Процент відповіді 0,000 20,000 62,680 67,930 61,510 65,880 но протягом 4 днів раз на добу. Двадцять мікролітрів 100 нМ ТРА наносять на другий день на очищену поверхню шкіри та дозволяють всмоктатися. Тварин умертвляють через 72 години після нанесення ТРА. Шматки шкіри фіксують у 10% формаліні протягом 3 днів. Гістопатологічні слайди готують такими стандартними методами. Епідермальну товщину вимірюють на щонайменше 10 різних ділянках за допомогою окулометра і результати виражають в процентах інгібування (Фіг.11). Результати наведені в Таблиці XI. Таблиця XI Ефект композиції AGP на модель ТРА Групи Група ацетонового контролю Контрольна група ТРА Композиція AGP Доза (мг/кг, р.о.) 30,00 10,00 3,00 1,00 0,30 0,10 Збільшення товщини епідермісу (мкм) 23,08 52,88 25,38 29,67 35,63 50,08 52,63 52,67 % інгібування 0,00 92,30 77,89 57,90 9,37 0,84 0,70 *3начення наведені в процентах інгібування порівняно з контрольною групою ТРА. Опис методів оцінки in vivo імуносупресії з використанням мишачого вушного алерготесту (MEST) Ця стандартна процедура використовувалася для оцінки in vivo ефективності композиції AGP при визначенні її здатності інгібувати DNFBіндуковану гіперчутливість уповільненого типу у мишей [Comacoff J.B, House R.V, Dean J.H., Fundam. Appl. Toxicol., 1988, 10(1), 40; Fundam. Appl. Toxicol., 1992, 19(1), 157]. Стисло, для тестування використовують мишей C57/BL6. Мишей сенсибілізують за допомо гою 0,2% DNFB (в 1:4 оливковій олії та ацетоні) на спині мишей. Роблять три бустерні введення DNFB кожного третього дня. Мишей провокують за допомогою 0,2% DNFB (в 1:4 оливковій олії та ацетоні) на вушній раковині. Товщину вуха в центрі вуха вимірюють через 24 години за допомогою штангенциркуля Варн'є. Проводять аналіз шляхом обчислення процента інгібування по відношенню до негативного контролю при введенні перорально в різних дозах, Результати наведені в Таблиці XII. 41 86986 42 Таблиця XII Вплив композиції AGP на DNFB-індукований мишачий вушний алерготест на самках мишей C57/BL6 № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Курс лікування Вода Milli Q, 10 мл/кг, р.о. Негативний контроль для композиції AGP 2% Твін 80, 10 мл/кг, р.о. Негативний контроль для циклоспорину Композиція AGP - 0,1 мг/кг, р.о. Композиція AGP - 1 мг/кг, р.о. Композиція AGP - 3 мг/кг, р.о. Композиція AGP -10 мг/кг, р.о. Композиція AGP - 30 мг/кг, р.о. Композиція AGP - 100 мг/кг, р.о. Циклоспорин 25 мг/кг, р.о. Процент інгібування 0,00 0,00 0,00 18,00 33,05 43,62 58,52 69,51 65,16 Дані наведені як процент інгібування; кожне значення є середнім для 7-12 тварин. Композицію AGP порівнювали з групою, що одержувала воду Milli Q, а циклоспорин порівнювали з тваринами, які одержували 2% Твін 80. Було знайдено, що композиція AGP з листя та/або стебел Аrgеmоnе mехісаnа є імунодепресивною по відношенню до DNFBсенсибілізованих мишей C57/BL6. Величина ED50, визначена для композиції AGP, дорівнює 6,43 мг/кг (Фіг.12). Сильна імунодепресивна активність є добре встановленою і корисною для лікування чи профілактики псоріазу. Імуносупресія на моделі MEST є корисною для оцінки ефекту при декількох хворобах, при яких потрібна імуносупресія, таких як псоріаз, дерматит, склеродерма, запальні розлади та інші автоімунні хвороби, такі як псоріатичний артрит, бляшковий псоріаз, краплеподібний псоріаз, ревматоїдний артрит, хвороба Крона, розсіяний склероз, анкілозивний спондиліт, червоний системний вовчак, синдром Шегрена, алергії, такі як астма, хронічна обструктивна легенева хвороба, та споріднені стани, такі як екзема, лускаті сверблячі плями. Винахід далі ілюструється наступними необмежувальними прикладами. Приклад 1 Виділення композиції AGP, AGP-HM та AGPLM 10 кг свіжого листя Аrgеmоnе mехісаnа розмелюють та екстрагують демінералізованою водою (15 літрів). Дисперсію центрифугують та водний екстракт концентрують при температурі нижче 40°С під вакуумом. Концентрований матеріал ліофілізують, одержуючи 0,54 кг сухої твердої речовини. 500 г висушеного водного екстракту розчиняють в 6 літрах води, центрифугують та декантують. Надосадну рідину завантажують на катіонообмінну колонку (5 літрів) з витратою 10 мл/хв. Елюат (7,5 літрів) збирають, концентрують (2,5 літри) та завантажують на аніонообмінну колонку (5 літрів). Елюат (3 літри) концентрують до приблизно 1,5 літрів. Експеримент повторюють з іншими 0,5 кг матеріалу (водного екстракту). Об'єднані елюати (1,5 літра) перемішують та концентрують до 2,5 літрів і завантажують на катіонообмінну колонку. Елюат (3 літри) концентрують до 1,2 літрів та завантажують на аніонооб мінну колонку. Елюат (1,5 літра) ліофілізують, одержуючи 42,39 г порошку. 42 г вищевказаного порошку розчиняють у 600 мл води та розподіляють між н-бутанолом (3x400 мл) та водою. н-Бутанольний шар викидають. 3 літри метанолу виливають у водний шар (600 мл), після чого утворюється твердий осад. Розчин центрифугують та надосадну рідину декантують. Надосадну рідину концентрують до об'єму приблизно 300 мл. Знов наливають метанол (1 літр) для осадження нерозчинних в метанолі речовин. Розчин центрифугують та надосадну рідину декантують. Твердий осад з обох експериментів ліофілізують (8,75 г). Сухі матеріали розчиняють у воді та двічі пропускають через колонку XAD-2. Водний елюат ліофілізують, одержуючи 6,10 г композиції AGP. Її далі піддають хроматографії на Sephacryl, одержуючи 5 мг AGP-HM та 10,3 мг AGP-LM. Приклад 2 Виділення композиції AGP, AGP-HM та AGPLM 22 кг свіжого листя Argemone mexicana розмелюють та екстрагують демінералізованою водою (36 літрів). Дисперсію центрифугують та водний екстракт концентрують при температурі нижче 40°С під вакуумом. Концентрований матеріал ліофілізують, одержуючи 1,25 кг сухої твердої речовини. 1,2 кг висушеного водного екстракту розчиняють у 12 літрах води, центрифугують та декантують. Надосадну рідину завантажують на катіонообмінну колонку (5 літрів) з витратою 10 мл/хв. Елюат (15,5 літрів) збирають, концентрують (5,5 літрів) та завантажують на аніонообмінну колонку (5 літрів). Елюат (6,25 літра) концентрують до приблизно 3,2 літра. Елюат (3,2 літра) концентрують до 2,6 літра та завантажують на катіонообмінну колонку. Елюат (4 літри) концентрують до 1,5 літрів та завантажують на аніонообмінну колонку. Елюат (1,6 літра) ліофілізують, одержуючи 54 г порошку. 40 г вищевказаного порошку розчиняють у 700 мл води та розподіляють між н-бутанолом (3x500 мл) та водою. н-Бутанольний шар вики 43 86986 44 дають. 4 літри метанолу виливають у водний шар жаний таким чином сухий матеріал розчиняють у (675 мл), після чого утворюється осад твердої воді та двічі пропускають через колонку XAD-2. речовини. Розчин центрифугують та надосадну Водний елюат ліофілізують одержуючи 5,5 г комрідину декантують. Надосадну рідину концентрупозиції AGP. Її далі піддають хроматографії на ють до 400 мл. Знов наливають метанол (3 літри) Sephacryl, одержуючи 4,5 мг AGP-HM та 12,4 мг для осадження нерозчинних в метанолі речовин. AGP-LM. Розчин центрифугують і надосадну рідину деканПриклад 3 тують. Твердий осад ліофілізують (7,3 г). ОдерТаблиця XIII Формули разових доз для композицій капсул, що включають AGP за даним винаходом та фармацевтично прийнятні носії № Інгредієнт 01 AGP 02 Мікрокристалічна целюлоза USNF (Avicel PH 102) 03 Кроскармелози натрієва сіль USNF (Ac-Di-SOL) 04 Колоїдний діоксид силіцію USNF (Aerosil 200) 05 Стеарат магнію USNF Загалом 06 Тверда желатинова капсула Кількість (мг/капсула) 50 39 200 39 10 10 0,5 0,5 0,5 0,5 100 250 1 1 (розмір "2" з оранжевим корпусом (розмір "00" з оранжевим корпусом та оранжевим ковпачком) та червоним ковпачком) Вищезгадані інгредієнти, наведені в Таблиці XIII, можуть бути змішані до однорідного стану, а потім використані для заповнення твердих желатинових капсул розміру "00". На виробничій ділянці ідеально підтримують відносну вологість (RH) 40±5% та температуру 18-22°С. Типовий процес приготування композиції за винаходом описаний нижче: Активний інгредієнт, мікрокристалічну целюлозу, кроскармелози натрієву сіль, магнію стеарат та колоїдний діоксид силіцію перемішують до однорідного стану. Сумішшю заповнюють тверді желатинові капсули розміру "00". На виробничій ділянці ідеально підтримують відносну вологість (RH) 40±5% та температуру 18-22°С. При місцевому введенні, кількість рослини Аrgеmоnе mехісаnа змінюється в інтервалі від 0,1% до 10% мас. екстракту. Формула разової дози для рідкої мазі для місцевого введення, що включає AGP та носії, наведена в Таблиці XIV. Таблиця XIV Формула разової дози для рідкої мазі для місцевого введення, що включає AGP та фармацевтично прийнятні носії № 01 02 03 Інгредієнт AGP Вода Гідроксипропілметилцелюлоза Типовий процес приготування рідкої мазі для місцевого введення включає повільне перемішування всіх інгредієнтів до стану однорідного гелю Кількість 1,0 г 100 мл 4,0 г звичайними методами та заповнення нею тюбиків. 45 86986 46 47 86986 48 49 86986 50 51 Комп’ютерна верстка В. Мацело 86986 Підписне 52 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601